南方白甲鱼线粒体基因组序列测定分析及白甲鱼属系统发育研究

摘要

线粒体DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）是一种双链闭合DNA分子，独立于核基因组之外，存在于细胞质中，因结构简单、容易分离和提取、编码效率高、进化速率快等特点，现已成为进行系统进化发育分析最有效的分子标记之一，并且广泛应用于鱼类种群遗传学研究。南方白甲鱼（Onychostoma gerlachi）属鲤科，鲃亚科，白甲鱼属，是一种广泛分布于长江中上游水系的重要经济鱼类。本研究通过参考南方白甲鱼的近缘属光唇鱼属的线粒体基因组序列，根据引物设计原则共设计18对引物，进行大量反应条件优化、设置温度梯度进行PCR，最终测定南方白甲鱼线粒体基因组的全序列，并结合NCBI中已公布的9种白甲鱼属线粒体基因组、D-loop区域、Cytb及ND4基因序列，采用三种不同的系统重建方法构建白甲鱼属的系统发育树。
　　本研究主要内容包括：⑴测定南方白甲鱼线粒体基因组全长为16601 bp，其基因组成和排列顺序与大多数鱼类mtDNA一致，由37个编码基因（13个蛋白编码基因、22个tRNA基因及2个rRNA基因）和2个非编码区（D-loop及轻链复制起始区）组成。⑵南方白甲鱼线粒体基因组具有A/T偏向性，全序列碱基组成为A31.38％、T24.24%、C28.29%、G16.09%，A+T含量为55.62%，呈现一定程度的A/T偏倚，且D-loop区域、tRNA基因、rRNA基因、蛋白质编码基因均为表现不同程度的A/T偏倚，其中D-loop区A+T%含量最高为67.45%。⑶南方白甲鱼线粒体基因组13个蛋白质编码基因的起始密码子分为两种：特殊密码子GTG和常用密码子ATG，只有少数以GTG起始。终止密码子也分两种：正常的完全终止密码子TAA、TAG及缺少一个或者两个碱基的不完全终止密码子。⑷南方白甲鱼线粒体基因组编码的22个tRNA基因中，除了tRNASer(AGY)基因，其他21个tRNA基因均可形成典型的三叶草结构,且存在一定碱基错配现象，以G-U错配为主。⑸通过对4种不同基因或区域，采用3种不同的系统重建方法得到较一致的结论，可将白甲鱼属分为三个单系群：I（粗须白甲鱼、方氏白甲鱼、小口白甲鱼、多鳞白甲鱼、台湾白甲鱼）、II（高体白甲鱼、卵形白甲鱼、稀有白甲鱼）、III（白甲鱼和南方白甲鱼），且I群和II群互为姐妹群。⑹与传统形态学对白甲鱼属的系统分类学进行比较，得到同样的结论：白甲鱼属是一个复系群，而非单系群。

目录

声明

第一章 绪论

1.1 线粒体概述

1.1.1 线粒体简介

1.1.2 线粒体基因组的大小和组成

1.2 线粒体基因组的特征

1.2.1 线粒体基因组的结构特征

1.2.2 线粒体基因组的遗传特征

1.2.3 线粒体基因组的进化特征

1.3线粒体基因组组成

1.3.1蛋白质编码基因（PCGs）

1.3.2 tRNA基因（tRNA Genes）

1.3.3 rRNA基因（rRNA Genes）

1.3.4非编码区

1.4 线粒体基因组研究方法

1.4.1 线粒体基因组DNA的获取

1.4.2 线粒体基因组的拼接

1.4.3 线粒体基因组的注释

1.4.4 线粒体基因组分析

1.5线粒体DNA在鱼类分子系统学中的应用

1.5.1 mtDNA在鱼类分子系统进化中的应用

1.5.2 mtDNA在鱼类系统地理学中的应用

1.5.3 系统发育关系的重建

1.6 白甲鱼属

1.6.1 白甲鱼属简介

1.6.2 研究物种——南方白甲鱼简介

1.6.3 白甲鱼属的系统发育研究现状

1.7 研究目的和意义

第二章 南方白甲鱼线粒体基因组全序列的测定分析

2.1 材料与方法

2.1.1 样品采集

2.1.2 实验仪器

2.1.3 实验试剂

2.1.4 生物信息学软件

2.2 实验方法

2.2.1 基因组总DNA的抽提

2.2.2 基因组总DNA的检测

2.2.3 PCR的引物设计

2.2.4 PCR的扩增、检测、回收纯化及测序

2.2.5 序列拼接、注释及分析

2.3 结果与分析

2.3.1 南方白甲鱼总DNA的提取结果

2.3.2 南方白甲鱼PCR扩增结果分析

2.3.3 南方白甲鱼线粒体DNA结构

2.3.4 碱基组成及偏向性分析

2.3.5 蛋白质编码基因密码子的使用

2.3.6 蛋白质编码基因氨基酸组成

2.3.7 tRNA基因二级结构预测

2.3.8 讨论

第三章 白甲鱼属10个种的系统发育进化树的构建

3.1 材料与方法

3.1.1 外类群的选择

3.1.2 数据的采集

3.2 实验方法

3.2.1邻接法构建系统发育树

3.2.2 最大似然法构建系统发育树

3.2.3 贝叶斯法构建系统发育树

3.3 结果与分析

3.3.1 基于线粒体全序列mtDNA的系统发育树

3.3.2 基于D-loop区域的系统发育进化树

3.3.3 基于Cytb基因的系统发育树

3.3.4 基于ND4基因的系统发育树

3.4 讨论

总结

参考文献

致谢

附 录 攻读硕士期间发表的论文