一种杂交捕获试剂盒及利用该试剂盒进行杂交捕获的方法

摘要

本发明公开了一种杂交捕获试剂盒及利用该试剂盒进行杂交捕获的方法，属于目标区域杂交捕获技术领域。所述试剂盒包括封闭试剂、RNA Inhibitor、杂交缓冲液、洗脱试剂及PCR扩增试剂；其中，封闭试剂包括市售Human Cot‑1 DNA、Salmon DNA及接头序列封闭试剂，本发明得到的杂交捕获试剂盒成本低廉，捕获效率高，能够满足靶向测序的使用要求，具有良好的市场应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种杂交捕获试剂盒及利用该试剂盒进行杂交捕获的方法，属于目标区域杂交捕获技术领域。

背景技术

目前二代测序在鉴定癌症相关的遗传改变、研究疾病的遗传易感性等领域得到广泛应用。基于二代测序的杂交捕获技术已经十分成熟，主要包括多重PCR捕获技术、固相芯片技术、液相探针捕获技术及分子倒置捕获技术。其中，液相杂交捕获技术是基于固相探针合成方法的改进。液相杂交捕获技术通过在溶液中使目标DNA片段和带有生物素标记的探针直接杂交，再通过生物素及磁珠上链霉亲和素的反应，使目标DNA片段得到有效富集。利用液相杂交捕获技术获得的目标DNA片段具有良好的均一性及重复性，从而得到广泛应用。

目前使用液相杂交捕获技术的市售试剂盒种类繁多，但仍存在诸多不足。例如，目前的市售试剂盒价格高昂，捕获效率普遍偏低，这使得样本的有效数据量降低，无形中增加了单个样本的试剂成本，难以满足目前的靶向测序的需求。因此，需要一种新的成本低廉、捕获效率更高的杂交捕获试剂盒。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种杂交捕获试剂盒及利用该试剂盒进行杂交捕获的方法，成本低廉，捕获效率高。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种目标区域杂交捕获的试剂盒，所述试剂盒包括封闭试剂、RNAInhibitor、杂交缓冲液、洗脱试剂及PCR扩增试剂；其中，封闭试剂包括市售Human Cot-1DNA、Salmon DNA及接头序列封闭试剂。

进一步地，洗脱试剂包括洗脱试剂I、洗脱试剂II及洗脱试剂III，洗脱试剂I由NaCl、Tris-Cl和EDTA组成，洗脱试剂II和洗脱试剂III均由SSC和SDS组成。

进一步地，所述接头序列封闭试剂为TS Mix。

进一步地，所述试剂盒还包括Nuclease-free water。

本发明还提供了一种利用上述试剂盒进行杂交捕获的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)封闭接头和重复序列：向待杂交的文库中加入TS Mix以封闭接头序列，加入Human Cot-1 DNA及Salmon DNA以封闭重复DNA序列；(2)RNA探针与目标区域的结合；(3)杂交后文库的捕获；

(4)捕获后文库的洗脱；

(5)洗脱后文库的PCR富集及磁珠纯化。

进一步地，所述步骤1中，封闭的反应体系如下：

在PCR仪中进行如下反应程序：

进一步地，所述步骤2具体是：当反应程序进行到第三步65℃，PAUSE时，向文库混合液中加入含有RNA探针的Hybridization Mix，控制第五步65℃，HOLD的时间在8-12h，实现探针与目标区域的特异性结合；Hybridization Mix的配制体系如下：

进一步地，所述步骤(3)包括：用洗脱试剂I清洗Dynabeads Myone SreptavidinT1磁珠；用洗脱试剂I重新悬浮磁珠；加入杂交产物，放置在四维混匀仪上，室温混匀30min；目的是使带有链霉亲和素的T1磁珠与生物素标记的杂交产物充分结合。

进一步地，所述步骤(4)是用洗脱试剂II及洗脱试剂III对捕获后的文库进行洗脱，目的是去掉未与探针结合的核酸片段及杂质，得到结合有探针及目的序列的T1磁珠。

本发明有益的技术效果在于：

本发明提供了一种杂交捕获试剂盒及利用该试剂盒进行杂交捕获的方法，与利用Agilent靶向捕获试剂盒得到的文库相比，使用本发明的方法得到的文库重复率高很多，但去除重复后的捕获效率明显提高，约1倍左右；同时，有效测序深度也明显增加。说明本发明提供的方法可以满足目前靶向测序的使用需求。

具体实施方式

如背景技术中所述，现有的市售杂交捕获试剂盒不仅价格高昂，而且在捕获目标区域范围较小时，捕获效率不理想。发明人为了解决上述问题，开发了一种新的用于目标区域杂交捕获的试剂盒。

在下述实施例中，重复DNA序列的封闭使用Invitrogen的Human Cot-1 DNA及UltraPure Salmon Sperm DNA Solution，接头序列的封闭使用IDT公司的

在下述实施例中，杂交缓冲液由以下组分组成：其中CaCl

在下述实施例中，洗脱试剂I由以下组分组成，其中NaCl的工作浓度为1M，Tris-HCl的工作浓度为10mM，EDTA的工作浓度为1mM；洗脱试剂II由以下组分组织，其中SSC的共奏浓度为1X，SDS的工作浓度为0.1％(v/v)；洗脱试剂III由以下试剂组成，SSC的工作浓度为0.1X，SDS的工作浓度为0.1％(v/v)。以上三种洗脱试剂可由不同浓度的母液进行稀释配置后使用。

下述实施例涉及到一例血浆游离DNA及一例白细胞基因组DNA样本，分别使用QIAGEN的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(ref:55114)及天根血液基因组DNA提取试剂盒(cat#DP304-02)进行提取，文库构建使用KAPA Hyper Prep Kit(ref：KK8504)进行。文库构建完成后，同时使用Agilent SureSelect XT Target Enrichment Kit(cat#5190-7334)进行杂交捕获，作为对照组。

实施例1

1.杂交文库的浓缩

取待杂交的文库550-600ng在浓缩仪上进行浓缩，温度低于45℃，最大体积不超过5μl。

2.封闭接头和重复序列

向浓缩后的文库中依次加入以下试剂：

吹吸混匀，短暂离心后，放入PCR仪，并开始以下程序：

3.RNA探针与目标区域的结合

按照下表配制杂交试剂Hybridization Mix

当PCR反应程序进行到第三步(65℃，PAUSE)时，暂停反应程序，保持文库混合液在65℃条件下，将13μl的Hybridization Mix加入到文库混合液中，用枪上下吹吸混匀8-10次，短暂离心后再放到PCR仪上，继续下一步反应，并保证最后一步(65℃，Hold)的反应时间在8-12h。

4.杂交后文库的捕获

(1)提前30min将链霉亲和素磁珠Dynabeads Myone Sreptavidin T1beads置于室温平衡；

(2)每个杂交反应取50μl Dynabeads Myone Sreptavidin T1到1.5ml的PCR管中；

(3)加入500μl洗脱试剂I，震荡混匀，短暂离心，置于磁力架上，至溶液澄清后吸取上清；

(4)重复步骤上述步骤两次，并用200μl洗脱试剂I重新悬浮磁珠；

(5)将杂交产物加入上述溶液中，颠倒混匀3-5次，放置在四维混匀仪上，室温混匀30min。

5.文库的洗脱

(1)将上述离心管放在磁力架上，静置至溶液澄清，吸除上清；

(2)加入500μl洗脱试剂II，震荡混匀；短暂离心后，把离心管放在磁力架上，静置至溶液澄清，吸除上清；

(3)加入500μl经过65℃预热的洗脱试剂III，震荡混匀，在PCR仪上65℃温浴5min后；将离心管置于磁力架上，静置至溶液澄清，吸除上清；

(4)重复上述步骤两次后，加入37μl的Nuclease-Free Water，用枪吹打混匀让磁珠重新悬浮。

6.PCR富集

按照下表配制PCR扩增反应体系：

将反应体系在PCR仪运行以下程序：

6.磁珠纯化

(1)将AMPure XP beads室温放置至少30min，充分混匀AMPure XP beads悬浮液；

(2)在1.5ml EP管中加入1.8倍体积(90μl)混匀的AMPure XP beads悬浮液和经过扩增的DNA样本，吹吸混匀10次以上，室温放置5min；

(3)短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置大约3-5min至溶液变澄清；在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不能碰到磁珠；

(5)在磁力架上，在每个管中分别加入500μl 80％乙醇，放置30s，并颠倒摇晃，然后吸除乙醇；

(6)重复步骤(5)一次，并使管中残留的乙醇完全蒸发，此时磁珠表面不反光，呈磨砂状；

(7)加入21μl Nuclease-free water，吹吸混匀10次以上，室温放置5min；

(8)短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置大约2-3min至溶液变澄清；取大约20μl上清到一个新的1.5ml离心管中，得到杂交后的文库。

7.文库的定量上机

对上述文库用Agilent 2100和Roche 480进行定量检测，并于Illumina NextSeq500测序平台进行上机测序。

8.测序结果分析

本发明同时采用了Agilent公司的SureSelect XT Target Enrichment Kit对上述两个样本进行目标区域杂交捕获，用于评估本发明提供的目标区域杂交捕获方法。

上述获得的四个文库使用Illumina NextSeq500测序平台进行上机测序，每个样本的数据量为2G，分析四个文库的捕获效率(rmdup)、重复率及平均有效测序深度。四个文库测序结果(表1)显示，与利用Agilent靶向捕获试剂盒得到的文库相比，使用本发明的方法得到的文库重复率高很多，但去除重复后的捕获效率明显提高，约1倍左右；同时，有效测序深度也明显增加。说明本发明提供的方法可以满足目前的使用需求，并可以得到较高的捕获效率。

表1文库测序结果

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。