一种2型糖尿病患者肺腺癌诊断标志物PZP及其ELISA试剂盒

摘要

本发明涉及临床诊断技术领域，具体是PZP蛋白在制备2型糖尿病患者肺腺癌诊断试剂盒中的应用。本发明通过SWATH/DIA质谱筛选、PRM靶向质谱验证和ELISA验证，首次证实了PZP可以作为在2型糖尿病患者中诊断肺腺癌的血清标志物。因此，可以制备PZP蛋白的ELISA检测试剂盒，通过检测血清中的PZP蛋白浓度在来2型糖尿病患者中早期诊断肺腺癌。本技术以血清为检测对象，取样方便、易于检测，且具有敏感性、特异性较高等优点，适于临床应用。

说明书

技术领域

本发明涉及临床诊断技术领域，具体的说，一种2型糖尿病患者肺腺癌诊断标志物PZP及其ELISA试剂盒。

背景技术

作为一种常见的慢性非传染性疾病，糖尿病的发病率逐年上升，尤其是2型糖尿病(type 2diabetes，T2DM)，仅次于恶性肿瘤与心脑血管疾病。国际糖尿病联盟全球糖尿病地图(第8版)报告显示：2017年，全球约4.25亿成人患糖尿病，预计到2040年，全球糖尿病患者可达6.29亿。我国成人糖尿病患者约为1.21亿，占总人口的11.6％，1994至2017年，我国糖尿病患病率增长了近4.6倍(2.5％增至11.6％)。

目前，越来越多的研究发现T2DM患者伴有包括肺癌在内多种恶性肿瘤高发的风险。进一步研发在T2DM人群中早期常见肿瘤的筛查技术可以显著改善T2DM合并恶性肿瘤患者的预后，具有非常重大的临床价值。越来越多的学者关注到T2DM和恶性肿瘤间的关系，其中肺癌作为目前世界上发病率最高的恶性肿瘤，且T2DM患者相对于健康人群具有更高罹患肺癌的风险。通过对无锡市人民医院2015年1月至2020年7月住院的T2DM合并恶性肿瘤的患者进行分析，肺癌是T2DM人群中合并最多的恶性肿瘤(表1)，其中大部分为肺腺癌(表2)。早期发现肺癌是提高肺癌治愈率的关键。国内外研究初步证实低剂量螺旋CT扫描是筛查早期肺癌有效手段，具有低辐射、高分辨力、无创、快速等特点。尽管如此，但低剂量螺旋CT扫描仍存在费用高、反复检查存在辐射等缺点。且由于CT设备体积庞大，筛查阅片需大量的专业技术人员支持，故在社区糖尿病人群体检中广泛推广存在一定困难。

表1.无锡人民医院2015年1月1日至2020年6月30日T2DM合并恶性肿瘤患者部位分布

表2.无锡人民医院2015年1月1日至2020年6月30日T2DM合并肺癌患者病理类型分布

肿瘤标志物的研究涉及多种技术和平台，其中基于质谱的研究方法无论在肿瘤标志物的发现还是确证过程中都有着广泛的应用。蛋白质组学届巨擘Ruedi Aebersold教授开创了基于质谱的生物样本数字化的SWATH/DIA技术，帮助蛋白质组学迈向下一时代。通过他创立的Biognosys提供的整体解决方案，科研工作者可以轻松地实行大规模样本的组学定量流程。DIA技术融合了传统蛋白质组学“鸟枪法”和质谱绝对定量“金标准”选择反应监测/多反应监测(SRM/MRM)技术的优势和特点。另外，DIA技术将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口，高速、循环地对每个窗口中癿所有离子迚行选择、碎裂、检测，从而无遗漏、无差异地获得样本中所有离子的全部碎片信息。越来越多基于SWATH/DIA技术的肿瘤标志物被成功鉴定。但是，基于SWATH/DIA技术筛选T2DM患者罹患肺腺癌血清诊断标志物的研究尚未被开展。

发明内容

技术问题：为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种在T2DM人群中筛查早期肺腺癌的新技术。具体的来说，是将PZP蛋白在制备2型糖尿病患者肺腺癌诊断试剂盒中的应用。

技术方案：本发明提供了一种2型糖尿病患者肺腺癌诊断标志物PZP及其ELISA试剂盒。

具体来说，本发明提供了PZP蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体在制备2型糖尿病患者肺腺癌诊断试剂盒中的应用。

优选地，试剂盒检测的样本为血清。

优选地，试剂盒为ELISA试剂盒。

优选地，试剂盒为人妊娠区蛋白/PZP ELISA试剂盒。

优选地，所述试剂盒包括PZP蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体，还包括96孔板、标准品、样本稀释液、洗涤液和终止液。

本发明还提供了一种检测2型糖尿病患者血清中PZP浓度的方法，包括以下步骤：

(1)96孔板中每孔加入100μL稀释后的样品或标准品，用封板膜覆盖并在室温下孵育2小时；

(2)重复抽吸/冲洗3次；

(3)在每个孔中加入100μL稀释的PZP蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体，盖上新的封板膜并在室温下孵育2小时；

(4)重复抽吸/冲洗3次；

(5)向每个孔中加入100μL链霉亲和素-HRP的工作稀释液，盖好板并在室温下遮光孵育20分钟；

(6)重复抽吸/冲洗3次；

(7)向每个孔中添加100μL底物溶液，在室温下遮光孵育20分钟；

(8)向每个孔中添加50μL终止溶液，充分混匀；

(9)使用设置波长为450nm及570nm的酶标仪立即确定每个孔的光密度，用450nm波长的读数减去570nm波长的读数作为校正吸光度值；

(10)绘制标准曲线，计算每个样本的PZP检测浓度。

有益效果：本发明通过SWATH/DIA质谱筛选、PRM靶向质谱验证和ELISA验证，首次证实了PZP可以作为在2型糖尿病患者中诊断肺腺癌的血清标志物。由此，本发明提供了以血清为检测对象，PZP蛋白作为在T2DM患者中诊断肺腺癌的血清标志物，还提供了一种用于检测该蛋白的试剂盒，该方法取样方便、易于检测，且具有敏感性、特异性较高等优点，适于临床应用。

本发明通过对无锡市人民医院2015年1月至2020年6月住院的T2DM合并恶性肿瘤的患者进行分析，发现肺癌是T2DM人群中合并最多的恶性肿瘤，其中肺腺癌占比最高；进而收集5例分别来自健康体检者、T2DM患者、早期肺腺癌患者、T2DM合并早期肺腺癌患者的外周血并分离血清，通过SWATH/DIA质谱技术分析四组的血清蛋白质谱，成功筛选到13个在T2DM合并早期肺腺癌患者血清中特异表达的蛋白，其中7个在T2DM和T2DM合并早期肺腺癌两组间有表达差异。进一步的，在验证队列中(T2DM组：20例，T2DM合并早期肺腺癌组：20例)通过靶向质谱PRM技术成功检测并验证2个标志物(PZP、IGFBP3)。为了便于临床检测，我们采用ELISA法对PZP、IGFBP3的含量进行检测，最后确认PZP可以作为T2DM患者诊断肺腺癌的血清标志物，其敏感性和特异性均为80.00％。

附图说明

图1为临床常用的肿瘤标志物(CEA、AFP、CA199、CA125)在T2DM患者和T2DM合并早期肺腺癌患者的血清含量图；可见在T2DM患者诊断早期肺腺癌的效率较低，没有显著的临床价值。

图2为对来自健康体检者(NC)、T2DM患者、早期肺腺癌患者、T2DM合并早期肺腺癌患者的血清标本进行SWATH/DIA质谱分析图，鉴定到13个T2DM合并早期肺腺癌组的特异差异蛋白。

图3为采用PRM技术对差异血清蛋白进行验证结果图，成功鉴定到PZP、IGFBP3为候选标志物，ROC曲线分析结果表明二者的效率较好。

图4为采用ELISA技术对PZP、IGFBP3进行验证结果。结果表明PRM和ELISA两种技术测定PZP水平关联性较好，PZP在两组中含量差异明显，ROC曲线分析结果表明PZP的效率较好，敏感性、特异性均为80.00％。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

1.研究对象

本发明共收集两个研究队列：

队列一：分别收集5例于2019年6月-2020年1月就诊于南京医科大学附属无锡人民医院的健康体检者、T2DM患者、早期肺腺癌(TNM分期为1期)患者、T2DM合并早期肺腺癌患者的外周血标本。

队列二：收集于2019年6月-2020年1月就诊于内分泌科确诊T2DM并排除各种恶性肿瘤(入院查肿瘤标志物在正常范围内且胸、腹部CT等影像学检查无明显异常)的患者血液标本20例(T2DM组，其中5例来源于队列一)；就诊于南京医科大学附属无锡人民医院的健康体检者胸外科，既往已确诊T2DM，且本次经病理学确诊为原发性早期肺腺癌的患者血液标本20例(T2DM+肺腺癌组，其中5例来源于队列一)。

收集血液于分离胶促凝管内，低温离心机离心后，立即将上层血清收集到无菌离心管后保存于-80℃冰箱。队列一样本用于SWATH/DIA质谱分析，队列二样本用于PRM靶向质谱验证和ELISA验证。患者一般资料和肿瘤标志物检测结果通过回顾性查阅病历获得。本研究受南京医科大学附属无锡人民医院伦理委员会审查并批准准予实施，入组患者均签署书面知情同意书。首先通过对队列二患者初诊时检测的肿瘤标志物(CEA、AFP、CA199、CA125)血清含量进行分析，如图1所示，可见常用肿瘤标志物在T2DM患者中诊断早期肺腺癌的效率较低，没有显著的临床价值。这表明有必要进一步筛选、鉴定更精准、更可靠的肿瘤标志物。

2.SWATH/DIA质谱分析

对每份血清样本进行SWATH/DIA质谱分析以获得差异血清蛋白，主要步骤包括：

(1)蛋白提取和FASP酶解，采用C18 Cartridge对肽段迚行脱盐，肽段冻干后加入40μL0.1％甲酸溶液复溶，肽段定量。

(2)High PH RP分级：取所有样品的肽段混合物，采用Agilent 1260infinity IIHPLC系统进行分级，将样品冻干后用0.1％甲酸水溶液复溶合并为12个Fraction。

(3)DDA质谱建库：从各Fraction中取出6ul加入2ul 10×iRT肽段，混合后进样2ul，用nano-LC分离，经在线电喷雾串联质谱分析。整套实验系统为串联Waters AcquityUPLC(Waters Corporation,MA,USA)系统的Orbitrap Q Exactive HF质谱仪(ThermoFisher Scientific,MA,USA)。质谱原始数据通过Spectronaut Pulsar X(version 12,Biognosys AG)合并分析搜库并建立谱图数据库。

(4)DIA分析：各样品取出6ul加入2ul 10×iRT肽段，混合后进样2ul，用nano-LC分离，经在线电喷雾串联质谱分析。

整套实验系统为串联Waters Acquity UPLC系统的Orbitrap Q Exactive HF质谱仪。通过对健康体检者、T2DM患者、早期肺腺癌患者、T2DM合并早期肺腺癌患者的血清标本进行SWATH/DIA质谱分析。

如图2所示，共鉴定到13个T2DM合并早期肺腺癌组的特异差异蛋白，其中7个在T2DM和T2DM合并早期肺腺癌两组间有表达差异(表3)。

表3.13个糖尿病并发肺腺癌患者特异的差异血清蛋白在健康体检者、2型糖尿病患者和糖尿病合并肺腺癌患者中的表达分析。

3.PRM靶向质谱分析

对每份血清样本进行PRM靶向质谱分析以验证获得的候选血清标志物，主要步骤包括：

(1)去血清高丰度样品处理法蛋白提取和FASP酶解，采用C18 Cartridge对肽段迚行脱盐，肽段冻干后加入40μL 0.1％甲酸溶液复溶，肽段定量。

(2)质谱分析：取等质量各样品肽段混合经Easy nLC系统(Thermo FisherScientific,MA,USA)色谱分离。样品经色谱分离后用Orbitrap Q Exactive HF质谱仪进行质谱分析。

(3)PRM母离子筛选：使用Proteome Discoverer 2.1(Thermo FisherScientific,MA,USA)软件将质谱仪产生的原始图谱文件转化为.mgf文件，通过软件内置的工具提交到MASCOT2.6服务器进行数据库检索。筛选待测蛋白质的Unique肽段，并获得其质荷比、带电荷数、以及保留时间等信息。

(4)PRM检测：各样品进样2μg，用nano-LC分离，经在线电喷雾串联质谱分析。整套实验系统为串联Easy nLC系统的Orbitrap Q Exactive HF质谱仪。

结果如图3所示，成功鉴定到PZP、IGFBP3为候选标志物，ROC曲线分析结果表明二者的效率较好。

4.ELISA检测

从R&D system购买PZP ELISA试剂盒的必要组分(DY8280-05)并制作96孔板用于血清PZP蛋白含量的检测，样本按照1：2进行稀释。

检测步骤按照说明书进行，具体包括：

(1)每孔100μL稀释后的样品或标准品。用封板膜覆盖并在室温下孵育2小时。

(2)重复抽吸/冲洗3次。

(3)在每个孔中加入100μL稀释的检测抗体。盖上新的封板膜并在室温下孵育2小时。

(4)重复抽吸/冲洗3次。

(5)向每个孔中加入100μL链霉亲和素-HRP的工作稀释液。盖好板并在室温下遮光孵育20分钟。

(6)重复抽吸/冲洗3次。

(7)向每个孔中添加100μL底物溶液。在室温下遮光孵育20分钟。

(8)向每个孔中添加50μL终止溶液，充分混匀。

(9)使用设置波长为450nm及570nm的酶标仪立即确定每个孔的光密度。用450nm波长的读数减去570nm波长的读数作为校正吸光度值。

(10)绘制标准曲线，计算每个样本的PZP检测浓度。

结果如图4所示，PRM和ELISA两种技术测定PZP水平关联性较好，PZP在两组中含量差异明显，ROC曲线分析结果表明PZP的效率较好，敏感性、特异性均为80.00％。

5.统计学方法

数据分析及图像可视化采用R 3.6.3、SPSS 25.0和GraphPad Prism 8软件。正态分布计量资料以

显而易见，对于本领域一般技术人员而言，以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明的应用，可以根据实际情况进行各种等同替换或变形。只要不脱离本发明的精神，所有这些替换或变形均应属于本发明所附的权利要求的保护范围。