一种顶空气色谱法在测定鸡肉中低浓度三甲胺的应用

摘要

本发明属于三甲胺检测的技术领域，具体涉及一种顶空气色谱法在测定鸡肉中低浓度三甲胺的应用。所述顶空气色谱法可用于检测鸡肉中低浓度三甲胺的含量，应用于生鲜肉、冷藏肉和长期储存鸡肉样品的检测。所述顶空气色谱法的检测方法包括如下步骤：包括碱液、三氯乙酸溶液、三甲胺标准储备液以及三甲胺标准工作液的配制，三甲胺标准曲线的绘制以及样品提取液的检测。通过优化顶空气相色谱法中的碱液浓度、顶空平衡温度和载气流量等参数，有效改善检测物质峰形，提高检测的灵敏度及重复性；本发明适用于鸡肉中三甲胺含量的测定，尤其对低浓度含量具有精确的测定效果，平衡时间短，准确性高，适用于生鲜肉、冷藏肉和长期储存鸡肉等各种样品的检测。

说明书

技术领域

本发明属于三甲胺检测的技术领域，具体涉及一种顶空气色谱法在测定鸡肉中低浓度三甲胺的应用。

背景技术

中国是世界上家禽饲养量最大的国家，鸡肉产量位居世界第二。以往以鲜活肉鸡消费为主，但由于近年“H7N9”等事件的频发给养鸡业造成的重创，加之政府决策的界入，我国肉鸡产业面临着巨大变革，为了推进肉鸡产业健康可持续发展和禽类产品质量与安全，集中屠宰、生鲜上市成为家禽行业发展必由之路。

肉类和水产品中含有氧化三甲胺[(CH

研究者先后采用有机酸滴定法、微量扩散法、苦味酸盐比色法、有机溶剂提取后气相色谱法或顶空气相色谱法等方法检测食品中TMA含量。其中分光光度法、气相色谱法等尤其常用于鱼、虾、蟹等水产品以及猪肉、火腿肠中三甲胺含量检测，然而鸡肉中TMA检测尚无相关报道。

鸡肉到达消费者餐桌前经过屠宰、包装、存储、配送、加工等环节，这些环节中微生物与肉样接触，均为三甲胺的形成提供了有利条件。如何保障鸡肉产品的新鲜与安全成为消费者关注的重点问题，亦是养鸡从业者力图优化解决的重点问题。已公开的技术无法有效检测鸡肉中低浓度三甲胺含量，因此需针对性开发建立肉鸡中低浓度TMA检测方法。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种顶空气色谱法在测定鸡肉中低浓度三甲胺的应用，克服现有技术所存在的问题，准确测定鸡肉中的低浓度三甲胺。

本发明的技术内容如下：

本发明提供了一种顶空气色谱法在测定鸡肉中低浓度三甲胺的应用，应用于生鲜肉、冷藏肉和长期储存鸡肉样品的检测。

所述顶空气色谱法可用于检测鸡肉中低浓度三甲胺的含量。

所述顶空气色谱法的检测方法包括如下步骤：

1)试剂配制：包括碱液、三氯乙酸溶液、三甲胺标准储备液以及三甲胺标准工作液的配制；

2)三甲胺标准曲线的绘制：取三甲胺标准工作液与碱液混合于顶空瓶中，经水浴平衡后用进样针抽取顶空瓶内气体，注入气相色谱仪分析多组标样溶液，将得到的峰面积与相应的三甲胺标样浓度绘制出标准曲线；

3)样品提取液的检测：取样品溶液与碱液混合于顶空瓶中，样品加入碱液后快速封盖，避免试样与碱液反应后三甲胺泄漏，保证测定的准确性；

经水浴平衡后用进样针抽取顶空瓶内气体，注入气相色谱仪分析样品溶液，得到三甲胺的峰面积，将峰面积带入标样曲线的回归方程，得到试样三甲胺含量，从而推算出肉样中三甲胺含量。

所述碱液为氢氧化钠或氢氧化钾的水溶液，优选氢氧化钠溶液；

所述碱液浓度为5～20mol/L，优选为15mol/L；

所述样品溶液为0.45μm水相滤膜过滤并定容至50mL；

所述顶空瓶中样品溶液加入量为2～5mL，优选为2.5mL，碱水加入量为2～5mL，优选为2.5mL，迅速密封震荡，使溶液使总体积为5mL；

所述顶空气相色谱中水浴平衡温度为40～70℃，优选为60℃；平衡时间为30～50min，优选为30min；

所述进样针抽取顶空瓶内气体量为250～500μL，优选为500μL，注入GC-FID中测定；

所述顶空气相色谱参数为：进样口温度为180～250℃，优选为220℃；

顶空气相色谱柱采取程序升温，初始温度为40℃保持3min，以30℃/min升温至220℃，保持1min；

色相气谱仪中的检测器温度为220℃～250℃，优选为220℃；载气为N

分流比为(2:1)～(8:1)，优选为2:1。

本发明的有益效果如下：

本发明所采用的顶空气相色谱法用于准确测定鸡肉中低浓度三甲胺的含量，通过优化顶空气相色谱法中的碱液浓度、顶空平衡温度和载气流量等参数，有效改善检测物质峰形，提高检测的灵敏度及重复性；

本发明适用于鸡肉中三甲胺含量的测定，尤其对低浓度含量具有精确的测定效果，平衡时间短，准确性高，适用于生鲜肉、冷藏肉和长期储存鸡肉等各种样品的检测。

附图说明

图1为低浓度三甲胺盐酸盐标样GC-FID色谱图；

图2为试样三甲胺GC-FID色谱图；

图3为三甲胺盐酸盐标准曲线；

图4为鸡肉样品中三甲胺GC-FID色谱图；

图5为国标法检测标样的GC-FID色谱图；

图6为实施例方法检测标样的GC-FID色谱图；

图7为国标法检测肉样的GC-FID色谱图；

图8为实施例方法检测肉样的GC-FID色谱图；

图9为NaOH浓度对三甲胺释放的影响对比图；

图10为平衡温度对三甲胺释放的影响对比图；

图11为柱载气流量对三甲胺释放的影响对比图。

具体实施方式

以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。

若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。

实施例1

一种利用顶空气相色谱法测定鸡肉中低浓度三甲胺的方法：

1)试剂配制：

15mol/L碱液：准确称取碱性物质并溶于水中，配制一定浓度的碱液；

5％三氯乙酸溶液：称取25g三氯乙酸溶于水中，并定容为500mL。

2)样品前处理以及样品溶液的获得：准确称取已搅碎的鸡肉组织10g，分别经20mL、15mL、10mL的5％三氯乙酸溶液提取，充分沉淀组织中的蛋白质，并过滤取上清、定容；

3)标准储备液配制：准确称取0.1622g三甲胺盐酸盐标准品，经5％三氯乙酸溶液溶解并定容至100mL，浓度为1000μg/mL

4)标准工作液的配制：取上述配制好的三甲胺标准储备液，用5％三氯乙酸溶液逐级稀释成浓度分别为40.0μg/mL、20.0μg/mL、10.0μg/mL、5.0μg/mL、2.0μg/mL和1.0μg/mL的三甲胺标准工作液；

5)标准曲线绘制：取三甲胺标准工作液与碱液混合于顶空瓶中，经水浴平衡后用进样针抽取顶空瓶内气体，注入气相色谱仪分析多组标样溶液，将得到的峰面积与相应的三甲胺标样浓度绘制出标准曲线；

6)检测样品溶液：取样品溶液与碱液混合于顶空瓶中，经水浴平衡后用进样针抽取顶空瓶内气体，注入气相色谱仪分析样品溶液，得到三甲胺的峰面积，将峰面积带入标样曲线的回归方程，得到试样三甲胺含量，从而推算出肉样中三甲胺含量。

所述碱的水溶液为氢氧化钠或氢氧化钾的水溶液；

所述碱的水溶液浓度为5～20mol/L，优选为15mol/L；

所述样品溶液为0.45μm水相滤膜过滤并定容至50mL；

所述顶空瓶中样品溶液加入量为2～5mL，优选为2.5mL，碱水加入量为2～5mL，优选为2.5mL，迅速密封震荡，使溶液使总体积为5mL。

所述顶空气相色谱中水浴平衡温度为40～70℃，优选为60℃；平衡时间为30～50min，优选为30min。

所述进样针抽取顶空瓶内气体量为250～500μL，优选为500μL，注入GC-FID中测定。

所述顶空气相色谱参数为：进样口温度为180～250℃，优选为220℃；

色谱柱柱温采取程序升温，初始温度为40℃保持3min，以30℃/min升温至220℃，保持1min；

色谱仪检测器温度为220℃～250℃，优选为220℃；载气为N

在上述优选的条件下，如图1为低浓度三甲胺盐酸盐标样GC-FID色谱图，其中左为原图，右为三甲胺信号放大图，由图1可见，在1.8min-2min出现三甲胺信号峰，且检测峰型对称，没有明显拖尾现象；

如图2为试样(所述鸡肉试样与带鱼等海产品共同冷冻存储)三甲胺GC-FID色谱图，其中左图为原图，右图为三甲胺信号放大图，由图可见，1.8min-2min出现三甲胺信号峰，峰面积为142.34且检测峰型对称。

实施例2

一种利用顶空气相色谱测定鸡肉中低浓度三甲胺的方法：

1.试剂配制：

1)15mol/L碱液：准确称取60g氢氧化钠，溶于水中，并定容为100mL；

2)5％三氯乙酸溶液：称取25g三氯乙酸溶于水中，并定容为500mL；

3)三甲胺标准储备液的配制：准确称取0.1622g三甲胺盐酸盐标准品，经5％三氯乙酸溶液溶解并定容至100mL，浓度为1000μg/mL的三甲胺标准储备液，4℃保存；

4)三甲胺标准工作液的配制：取一定体积的三甲胺标准储备液，用5％三氯乙酸溶液逐级稀释成浓度分别为40.0μg/mL、20.0μg/mL、10.0μg/mL、5.0μg/mL、2.0μg/mL和1.0μg/mL的三甲胺标准工作液。

2.标准曲线绘制：

取三甲胺标准工作液2.5mL，加入2.5mL 15mol/L的氢氧化钠溶液，迅速压盖密封、混匀，在60℃条件下水浴平衡30min；

用进样针抽取顶空瓶内气体500μL，注入GC-FID中测定标样溶液，将得到的峰面积与相应的三甲胺标样的量，绘制出标准曲线。

3.样品提取液检测：

取样品提取液2.5mL，加入2.5mL 15mol/L的氢氧化钠溶液，迅速压盖密封、混匀，在60℃条件下水浴平衡30min。用进样针抽取顶空瓶内气体500μL，注入GC-FID中测定样品溶液，检测结果如图4所示，图4为鸡肉样品(新鲜鸡肉)中三甲胺GC-FID色谱图，其中左图为原图，右图为三甲胺信号放大图，图中三甲胺的峰面积为28.15，得到三甲胺的峰面积，将峰面积带入标准曲线的回归方程，得到三甲胺的含量，从而推算出肉样三甲胺含量。

4.GC-FID检测条件：

a)CP-Volamine毛细管色谱柱：30m(长)×0.32mm(内径)或相当者；

b)载气：高纯氮气；

c)进样口温度：220℃；

d)分流比：2:1；

e)升温程序：初始温度为40℃保持3min，以30℃/min升温至220℃，保持1min；

f)流量为6.5mL/min；

g)检测器温度220℃；

h)尾吹气(氮气)流量：35mL/min；

i)氢气流量：40mL/min；

j)空气流量：400mL/m；

将标样逐个按照上述条件进样分析，将得到的三甲胺峰面积于相应的三甲胺浓度绘制出标样曲线，计算得到标样曲线回归方程，如图3，回归方程为y＝12.665x-4.870，R

采用现行的国标《食品安全国家标准食品中三甲胺的测定》方法与实施例1中测定方法，分别检测标样和鸡肉样品中的三甲胺含量，对比实验结果如下所示：

1)实验方法参数数据

表1实验方法参数表

说明：国标中50％氢氧化钠溶液配制：称取100g氢氧化钠，溶于20-30℃的100mL水中，此溶度无法保证氢氧化钠的完全溶解，并且常温下无法准确吸取。故均采用本发明优选的15mol/L的氢氧化钠碱液。

采用国标法与本实施例的方法检测标样和肉样的GC-FID的检测结果如图5～图8所示，由图5、7可知国标法获得的三甲胺峰型均存在一定程度的拖尾现象，其目标峰对称因子不理想，尤其在样品三甲胺含量浓度较低时，不能有效精准测定。由图6、8可知采用本发明中实施例的方法获得的三甲胺峰型对称，易于精准测定，且能有效测定样品中低浓度的三甲胺，可应用于生鲜肉、冰鲜肉和长期储存肉样三甲胺浓度的测定。

对于本发明利用顶空气相色谱测定鸡肉中低浓度三甲胺的方法中的参数优化实验：

(1)碱液加入量优化：

准确吸取标样2.5mL于20mL顶空瓶中，随后准确移取5mol/L、10mol/L、15mol/L、20mol/L的NaOH溶液于顶空瓶中，快速压盖密封。将制备好的试样在60℃的水浴锅中平衡:40min。用进样针抽取顶空瓶内液上气体500μL，注入GC-FID中进行测定，检测结果为图9所示：

图9A：不同NaOH浓度条件下标样中三甲胺的峰面积；

图9B：不同NaOH浓度条件下标样中三甲胺GC-FID色谱图；

由图可见，随着NaOH加入量的增加，标样峰面积随之呈线性增加，GC信号越大，即检测的灵敏度越高。考虑≥20mol/LNaOH溶液常温下溶解情况以及高浓度的NaOH溶液粘度太大容易造成移取过程中实验的人为误差。因此，选用15mol/L的NaOH溶液用于三甲胺检测。

(2)平衡温度的优化：

准确吸取标样2.5mL于20mL顶空瓶中，随后准确移取2.5mL15mol/L NaOH溶液于顶空瓶中，快速压盖密封。将制备好的试样混匀置于40℃、50℃、60℃、70℃水浴锅中平衡30min。在上述色谱条件下，用进样针抽取顶空瓶内液上气体500μL，注入GC-FID中进行测定，检测结果见图10：

图10A：不同平衡温度条件下标样中三甲胺的峰面积；

图10B：不同平衡温度条件下标样中三甲胺GC-FID色谱图；

由图7可知，水浴温度对三甲胺盐酸盐与氢氧化钠反应生成三甲胺气体的检测有很大影响，随着水浴温度升高，三甲胺气相检测信号增大。但当温度达到70℃时，出现杂峰且温度高时水蒸气分压增加，同时为了避免手动取样时温度变化造成的误差，故水浴平衡反应温度为优选60℃。

(3)柱载气流量的优化：

准确吸取标样2.5mL于20mL顶空瓶中，随后准确移取2.5mL15mol/L NaOH溶液于顶空瓶中，快速压盖密封。将制备好的试样混匀置于60℃的水浴锅中平衡30min。在上述色谱条件下，分别设置柱载气流量为2.5mL/min、4.5mL/min、6.5mL/min和8.5mL/min，用进样针抽取顶空瓶内液上气体500μL，注入GC-FID中进行测定，检测结果见图11：

图11A：不同载气流量条件下标样中三甲胺的峰面积；

图11B：不同平衡温度条件下标样中三甲胺GC-FID色谱图；

由图11可知，随着柱流量的增加标样峰面积先呈线性增加，当流量达到8.5mL/min时，标样三甲胺峰面积下降，因此流量优选6.5mL/min。