sGC刺激剂治疗线粒体障碍的用途

摘要

本公开涉及用于治疗线粒体障碍的方法、用途、药物组合物，该药物组合物包含sGC刺激剂或其药学上可接受的盐，单独或与一种或多种另外的治疗剂组合。

说明书

相关申请

本申请要求根据35U.S.C.§119(e)的2018年7月11日提交的美国临时申请62/696,582和2018年7月13日提交的美国临时申请62/697,671的申请日。上述每个申请的全部内容通过引用并入本文。

技术背景

线粒体是通过氧化磷酸化以产生三磷酸腺苷(ATP)，从而为细胞产生能量的细胞器，这是正常细胞功能所必需的。因此，适当的线粒体功能对于维持健康和生命至关重要。

线粒体障碍是由线粒体功能障碍引起的一组障碍。线粒体障碍可能是由线粒体DNA或编码线粒体成分的核基因的突变(获得性或遗传性)引起的。它们也可能是由于药物、感染或其他环境原因引起的获得性线粒体障碍的结果。这些疾病可能在出生时出现或在以后的生活中发展出来。

除了线粒体障碍中的ATP产生减少外，由于丙酮酸转化为乙酰辅酶A的减少而引起的乳酸酸中毒、导致NO缺陷的一氧化氮(NO)合成的减少，以及也观察到由于活性氧含量升高和血管反应性降低引起的细胞损伤增加。它们会导致身体虚弱、发育和认知受损，并伴有包括生长不良在内的症状；失去肌肉协调性；肌肉无力和疼痛；癫痫；视力和/或听力损失；肠胃问题；学习障碍；和器官衰竭。预期寿命大大降低。据估计，每4,000人中就有1人患有线粒体障碍。线粒体障碍通常是渐进性的，没有治愈方法或获批的治疗剂。

需要开发治疗线粒体障碍方法。

发明总述

一个方面，本发明提供了治疗线粒体障碍的方法，其包括将治疗有效量的sGC刺激剂或其药学上可接受的盐单独或与治疗有效量的一种或多种另外的治疗剂组合施用于有该需要的患者。

另一方面，本发明提供了包含sGC刺激剂或其药学上可接受的盐的药物组合物，其用于在需要其的患者中治疗线粒体障碍。

另一方面，本发明提供了包含sGC刺激剂或其药学上可接受的盐以及一种或多种另外的治疗剂的药物组合物，其用于在需要其的患者中治疗线粒体障碍。

附图说明

图1A、1B和1C为PGC1α在(A)ZSF1大鼠的白色脂肪组织(WAT)、(B)ZSF1大鼠的肝脏组织和(C)饮食诱发的肥胖(DIO)小鼠的下丘脑中的基因表达水平的图。

图2A、2B和2C为(A)DIO小鼠的eWAT中的AMPKα1，(B)DIO小鼠的eWAT组织中的Pparα和(C)四氯化碳(CCl4)大鼠肝脏组织中的Pparα的基因表达水平的图。

图3A、3B和3C为显示了化合物E与DETA的组合显著活化LHON患者细胞GM 11605(A)和GM 10742(B)和利氏病患者(Leigh patient)细胞GM13740(C)中的cGMP形成的图，证实了这些患者细胞中sGC的功能性表达。

图4A、4B、4C和4D为显示了LHON患者细胞GM11605和GM10742以及利氏病患者细胞GM13740中的ATP水平显著低于健康细胞GM00333中的ATP水平的图(A)；用化合物E(单独或与DETA组合)刺激GM11605和GM13740显著提高ATP水平的图(B)；用化合物B(单独或与DETA组合)刺激GM11605和GM13740增加ATP水平的图(C)。还在另一个LHON患者细胞GM 10742中测试了化合物B，观察到与GM11605类似的结果(数据未显示)；用化合物D(单独或与DETA组合)刺激GM13740细胞显著增加ATP水平的图(D)。

图5A和5B为显示化合物B对(A)TFAM和(B)LHON患者细胞GM11605中的DDAH2基因的表达水平的影响的图。

图6A和6B为显示化合物B对(A)TFAM和(B)利氏病患者细胞GM13740中的DDAH2基因的表达水平的影响的图。

发明详述

现在将详细参考本发明的某些实施方案，其示例在所附的结构和式中示出。尽管将结合所列举的实施方案描述本发明，但是应当理解，它们并不旨在将本发明限制于那些实施方案。而是，本发明旨在覆盖可包括在如权利要求所限定的本发明的范围内的所有替代，修改和等同形式。本发明不限于本文描述的方法和材料而是包括可以在本发明的实践中使用的与本文描述的那些相似或等同的任何方法和材料。如果一个或多个并入的文献参考、专利或类似材料与本申请不同或相矛盾，包括但不限于所定义的术语、术语用法、所描述的技术等，则以本申请为准。本文描述的化合物可以通过其化学结构和/或化学名称来定义。如果化合物的化学结构和化学名称同时被提及，并且所述化学结构和化学名称存在冲突时，则由化学结构将决定化合物的身份。

最近发现，一氧化氮(NO)可增强线粒体的生物发生和功能。在细胞中，NO是通过各种一氧化氮合成酶(NOS)和依次还原无机硝酸盐从精氨酸和氧中合成的。可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)是体内NO的主要受体或靶标。sGC可以通过NO依赖(NO-dependent)性和非NO依赖(NO-independent)性机制活化。响应于该激活，sGC将鸟苷三磷酸(GTP)转化为次级信使环鸟苷单磷酸(cGMP)。cGMP水平的升高随即调节了下游效应子，包括蛋白激酶、磷酸二酯酶(PDE)和离子通道的活性。

与其他类型的sGC调节剂相比，非NO依赖性、血红素依赖性sGC刺激剂具有几个重要的区别特征，包括其活性严重依赖于经还原的修复性血红素部分的存在，与NO结合时强烈的协同酶活化作用以及通过不依赖NO直接刺激sGC来刺激cGMP的合成。

治疗方法

一方面，本发明提供了治疗线粒体障碍的方法，该方法包括向需要的患者施用治疗有效量的sGC刺激剂或其药学上可接受的盐，其单独或与治疗有效量的一种或多种另外的治疗剂组合。

另一方面，本发明提供了包含sGC刺激剂或其药学上可接受的盐的药物组合物，其用于在需要其的患者中治疗线粒体障碍。

另一方面，本发明提供了包含sGC刺激剂或其药学上可接受的盐以及一种或多种其他的治疗剂的药物组合物，用于在需要其的患者中治疗线粒体障碍。

如本文所用，术语“障碍”是指自任何身体部位、器官或系统的正常结构或功能的任何偏离或中断，表现为一组特征性症状和体征，并且其病因、病理学和预后是已知的或未知的。术语“障碍”包括其他相关术语，例如疾病和病症(或医学病症)以及综合征，它们被定义为由单一原因或者通常一起出现以构成表征临床表现的原因引起的症状的组合。在一些实施方案中，所述术语障碍是指线粒体障碍。

“线粒体障碍”涉及影响线粒体(身体每个细胞中负责产生能量的结构)的一组病症。所述障碍可以在任何年龄出现并几乎影响任何器官，包括大脑、肌肉、心脏、肝脏、神经、眼睛、耳朵和肾脏。一些障碍仅影响一个器官或组织，许多障碍可能涉及多个器官系统，包括大脑、肌肉、心脏、肝脏、神经、眼睛、耳和/或肾脏。

在一些实施方案中，所述线粒体障碍是线粒体疾病，其是由线粒体基因突变或由线粒体或核DNA编码的蛋白质突变、线粒体DNA缺失或线粒体DNA耗竭导致的，结果由于ATP缺乏和活性氧种类(ROS)的过量产生导致线粒体功能障碍(Renkema GH等人2017humangenetics；Chinnery PF和Hudson G，2013british medical bulletin；Iizuka 2005,Pitkanen 1996,Esposito 1999)。线粒体疾病的表现主要是由于细胞ATP的慢性丧失，其导致各种临床表型和症状学(Chinnery PF和Hudson G，2013british medical bulletin)。因此，已在多种线粒体疾病中描述了ATP缺乏症，例如MERFF(Chang JC等人2013)、KSS(MahatoB等人2011)、MELAS(Seo KS等人2018；Uittenbogaard M等人2019)、Leber遗传性视神经病变(LHON)(Van Bergen NJ等人2015；Zhang J等人2016和Uittenbogaard M等人2019)、复合体II缺陷(Mbaya E等人2010)、复合体III缺陷(Tegelberg,S等人2017)、线粒体脑脊髓炎(Gai,X等人2013,americal journal of human genetics)、巴斯综合征(Barth Syndrome)(Dudek,J等人2013stem cell research)、NARP(Rak,M等人2007,JBC)、利氏综合征(Leighsyndrome)和复合体I缺陷(Moran,M等人2010Biochimica et Biophysica Acta；Barca,E等人2018Human molec genetics)。增加ATP水平被认为可改善这些疾病的疾病症状(Webb M等人2019)。用sGC刺激剂(单独或联合使用DETA)治疗ATP缺乏的线粒体疾病患者细胞会增加不同线粒体疾病患者细胞中的ATP水平(图4A-D)。

除ATP危象外，线粒体呼吸链功能障碍还导致过多的ROS产生和增加的氧化应激，从而导致细胞损伤(Iizuka等人2005、Pitkanen等人1996、Esposito等人1999，Blankenberg，FG 2012Molecular genetics and metabolism，Turrens JF等人1997)。谷胱甘肽(GSH)在保护细胞免受氧化应激中起关键作用(Forman等人2008PMID 18796312)并且GSH或GSH：GSSG(还原型谷胱甘肽：氧化型谷胱甘肽)比率的降低为氧化应激的指标(Enns等人2017,J,Clin Medicine)。在患有以下各种线粒体疾病的患者的血细胞中发现低水平的iGSH(其为系统性氧化应激的指标)，例如：4tRNALeu3243AG、4复合体I缺陷、2复合体IV缺陷、2组合的复合体I/III缺陷、1组合的复合体I/IV缺陷(tRNALeu3243AT)、1组合的复合体II/III缺陷、1复合体III缺陷、1mtDNA缺失综合征、1mtDNA耗竭综合征(TK2缺陷)以及3复合体缺陷伴随不确定的疾病，但临床特征包括利氏综合征或多器官系统受累(multiorgansystem involvement)，以及与线粒体疾病一致的生化检查结果(Atkuri,KR等人2009)。因此，各种线粒体疾病涉及氧化应激，并且对于线粒体疾病患者而言，需要保护性抗氧化应激的治疗剂(Webb M等人2019)。通过sGC刺激剂治疗，增加了TFAM mRNA的水平，所述TFAMmRNA编码通过以非序列特异性方式与mtDNA结合而保护mtDNA免受氧化应激的蛋白质(Kanki等人，2004)(图5A和6A)。此外，用sGC刺激剂处理线粒体疾病患者的细胞会增加DDAH2 mRNA的水平。预期DDAH途径的上调降低线粒体疾病患者中的ADMA水平并降低这些患者中氧化应激的有害作用(图5B和6B)。

如上所述，线粒体基因障碍可能是由线粒体DNA或核DNA中的突变(其导致线粒体功能障碍和细胞ATP产生不足)引起的。这些线粒体DNA突变引起的障碍是通过母系遗传传播的，而核DNA突变引起的障碍可能是常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传或遗传的X关联模式。(参见：https://rarediseases.info.nih.gov/diseases/7048/mitochondrial-genetic-disorders，上次访问时间为2018年7月10日，其内容通过引用并入本文)。

可以通过施用本发明的sGC刺激剂(例如，sGC刺激剂或其药学上可接受的盐)治疗和/或预防的具体的线粒体疾病包括但不限于：

阿尔珀斯病、常染色体显性视神经萎缩(ADOA)、巴斯综合征/LIC(致命性小儿心肌病)、β-氧化缺陷、全身性原发性肉碱缺乏症、长链脂肪酸运输缺陷、肉碱棕榈酰转移酶缺陷、肉碱/酰基肉碱转位酶缺陷、肉碱棕榈酰转移酶I(CPT I)缺陷、肉碱棕榈酰转移酶II(CPT II)缺陷、超长链脂酰辅酶A脱氢酶缺陷(VLCAD)、长链脂酰辅酶A脱氢酶缺陷(LCAD)、长链3-羟基脂酰辅酶A脱氢酶缺陷(LCHAD)、多种脂酰辅酶A脱氢酶缺陷(MAD/戊二酸血症II型)、线粒体三功能蛋白缺陷、中链脂酰辅酶A脱氢酶(MCAD)缺陷、短链脂酰辅酶A脱氢酶缺陷(SCAD)、戊二酸血症II型、(SCHAD)缺陷、短/中链3-羟基脂酰辅酶A脱氢酶(S/MCHAD)、中链3-酮基脂酰辅酶A硫解酶缺陷、2,4-二烯酰辅酶A还原酶缺陷、线粒体烯酰辅酶A还原酶蛋白相关的神经变性(MEPAN)、肉碱缺陷、肌酸缺陷综合征、辅酶Q10缺陷、复合体I、II、III、IV、V缺陷、慢性进行性外眼肌麻痹(CPEO)、弗里德希共济失调(Friedreich’s Ataxia)、卡恩斯塞尔综合征(Kearns-Sayre syndrome)、脑白质营养不良、利氏病或综合征、LHON、LHONPlus、勒夫特病(Luft Disease)、MELAS(线粒体肌病、脑肌病、乳酸酸中毒、中风样症状)、肌阵挛性癫痫伴蓬毛样红纤维(MERRF)、线粒体隐性共济失调综合征(MIRAS)、线粒体细胞病、线粒体DNA耗竭症、线粒体脑病、线粒体肌病、多线粒体功能障碍综合征、MNGIE(肌源性胃肠道脑病)、NARP(神经病、共济失调、色素性视网膜炎和上睑下垂)、皮尔逊综合征(PearsonSyndrome)、丙酮酸羧化酶缺陷、丙酮酸脱氢酶缺陷或丙酮酸脱氢酶复合物缺陷(PDCD/PDH)和POLG突变。

在一个实施方案中，所述线粒体疾病选自阿尔珀斯病、肉碱-酰基-肉碱缺陷、肉碱缺陷、复合体I、II、III、IV缺陷、CPEO、CPT II缺陷、肌酸缺陷综合征、KSS、LCHAD、利氏综合征、脑白质营养不良、LHON、MELAS、MEPAN、MERRF、MIRAS、线粒体DNA耗竭症、MNGIE、NARP、皮尔逊综合征和POLG突变。

在上述方法和用途的一些实施方案中，在所述患者中充分发展出线粒体功能障碍或病症(或疾病)的症状之前施用sGC刺激剂。在上述方法和用途的其他实施方案中，在所述患者中发展出线粒体障碍(或疾病)的一种或多种症状之后施用sGC刺激剂。

另一方面，本发明还提供了一种在有需要的受试者中治疗线粒体障碍(或疾病)的方法，其包括向受试者单独或以组合疗法施用治疗有效量的sGC刺激剂或其药学上可接受的盐。

如本文所用，在一些实施方案中，术语“需要其的患者”是指患有上述线粒体障碍(或疾病)之一的患者。

在一些实施方案中，所述“需要其的患者”是患有线粒体障碍(或疾病)的患者或者已经被诊断出患有该疾病的患者或者遗传上倾向于患有所述障碍发展的患者。在其他实施方案中，需要其的患者是经过基因测试并发现具有使他或她倾向于患上所述障碍(或疾病)的基因突变，即使该人可能还没有表现出任何障碍(或疾病)的身体症状。在其他实施方案中，“需要其的患者”显示出障碍(或疾病)的症状，即使尚未做出正式诊断。线粒体障碍(或疾病)最常见的体征和症状包括：生长不良、肌肉协调能力丧失、肌肉无力、疲劳、锻炼不耐受、乳酸酸中毒、癫痫发作、认知受损、精神疲劳、自闭症、视力和/或听力问题、发育迟缓、学习障碍、心脏、肝脏和/或肾脏疾病、胃肠道障碍、糖尿病、感染风险增加、甲状腺和/或肾上腺异常、自主神经功能障碍和痴呆。

在一些实施方案中，线粒体障碍是由非线粒体疾病引起的线粒体功能障碍。在一些实施方案中，所述需要其的患者是具有线粒体功能障碍但却患有非线粒体疾病的患者。在一些实施方案中，所述需要其的患者是具有由非线粒体疾病引起的线粒体功能障碍的患者。在某些实施方案中，所述非线粒体疾病是可以在患有这种疾病的一些患者中导致线粒体功能障碍的疾病。在某些实施方案中，所述非线粒体疾病选自，例如，ALS、杜兴氏(Duchenne)肌肉营养不良症、慢性疲劳综合征、心肌疾病、肌少症、恶病质、共济失调障碍、老化和衰老、镰状细胞病、阿尔茨海默氏病、帕金森疾病、亨廷顿氏病、癌症、多发性硬化症、海马硬化/癫痫、癫痫、青光眼、哈丁(Harding’s)综合征、糖尿病(1型和II型)、糖尿病与耳聋(DAD)、痴呆、双相障碍、精神分裂症、焦虑症、心血管疾病、半乳糖唾液酸贮积症、偏头痛、中风、神经性疼痛、短暂性脑缺血发作、冠状动脉疾病、纤维肌痛、色素性视网膜炎、丙型肝炎、原发性胆汁性肝硬化和X-肾上腺脑白质营养不良。(参见Experimental and MolecularPathology第83卷，第1期，2007年8月，第84-92页，其教导通过引用并入到本文中。)

因此，本发明的一方面是治疗患有以下疾病的患者：ALS、杜兴氏肌肉营养不良症、慢性疲劳综合征、心肌疾病、肌少症、恶病质、共济失调障碍、老化和衰老、镰状细胞病、阿尔茨海默氏病、帕金森疾病、亨廷顿氏病、癌症、多发性硬化症、海马硬化/癫痫、癫痫、青光眼、哈丁综合征、糖尿病(I型和II型)、糖尿病与耳聋(DAD)、痴呆、双相障碍、精神分裂症、焦虑症、心血管疾病、半乳糖唾液酸贮积症、偏头痛、中风、神经性疼痛、短暂性脑缺血发作、冠状动脉疾病、纤维肌痛、色素性视网膜炎、丙型肝炎、原发性胆汁性肝硬化和X-肾上腺脑白质营养不良，其中所述患者具有线粒体功能障碍，其包括将治疗有效量的sGC刺激剂或其药学上可接受的盐单独或与治疗有效量的一种或多种另外的治疗剂组合给予需要其的患者。

如本文所用，术语“治疗有效量”是指引起研究人员，兽医，医生或其他临床医生所寻求的在组织、系统、动物或人中引起生物学或医学反应的活性化合物或药剂的量。所述化合物的治疗有效量将由以下考虑决定，并且是其实现以下方面所必需的最小量：缓解、治愈或治疗所述障碍或其一种或多种症状，或预防或显著减少获得障碍或症状的可能，或在获得之前或症状进一步或完全发展之前减轻所述障碍或其一种或多种症状的严重程度。在上述方法、用途和组合物的一些实施方案中，需要其的患者是成人。在其他实施方案中，所述患者是儿童。在其他实施方案中，需要其的患者是婴儿。

在上述方法、用途和组合物的一些实施方案中，单独或与另一种治疗剂组合施用sGC刺激剂或其药学上可接受的盐引起可测量的身体或生理参数或两者的改善。

如本文所用，术语“受试者”和“患者”可互换使用。术语“受试者”和“患者”是指动物(例如，禽诸如鸡、鹌鹑或火鸡，或哺乳动物)，特别是“哺乳动物”包括非灵长类(例如，牛、猪、马、绵羊、兔子、豚鼠、大鼠、猫、狗和小鼠)和灵长类动物(例如猴子、黑猩猩和人类)，更具体地说是人类。在一些实施方案中，所述受试者是非人类动物，例如农场动物(例如马、牛、猪或绵羊)，或伴侣动物或宠物(例如狗、猫、小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠、豚鼠或兔子)。在一些实施方案中，所述受试者是人。

本发明还提供了用于在受试者中治疗上述线粒体障碍之一的方法，其包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的sGC刺激剂或其药学上可接受的盐。或者，本发明提供了sGC刺激剂或其药学上可接受的盐在需要治疗的受试者中治疗这些线粒体障碍之一中的用途。本发明中还包括sGC刺激剂或其药学上可接受的盐在制备用于治疗需要治疗的受试者中的上述线粒体障碍之一的药物中的用途。本发明进一步提供了制备或制造可用于治疗这些线粒体障碍之一的药物的方法，其包括使用sGC刺激剂或其药学上可接受的盐。

本文所述的化合物和药物组合物可单独使用或联合使用，以治疗由sGC、cGMP和/或NO介导、调节或影响的线粒体障碍。

在其他实施方案中，本发明提供了增加生物样品中线粒体功能的方法，其包括使所述生物样品与本发明的化合物或组合物接触。在生物样品中使用sGC刺激剂可用于本领域技术人员已知的多种目的。此类目的的实例包括但不限于生物学测定和生物学样本存储。

如本文所用，术语“生物样品”是指体外或离体样品，并且包括但不限于细胞培养物或其提取物；取自哺乳动物的活检材料或其提取物；血液、唾液、尿液、粪便、精液、眼泪、淋巴液、眼液、玻璃体液(vitreous humour)、脑脊液(CSF)或其他体液或其提取物。

关于障碍的“治疗”(“Treat”、“treating”或“treatment”)是指减轻或消除疾病的原因和/或作用。在一个实施方案中，术语“治疗”是指减少或改善障碍的进展、严重程度和/或持续时间，或改善一种或多种疾病的症状(即，“管理”而不“治愈”疾病)。在具体的实施方案中，术语“治疗”是指改善障碍的至少一个可测量的身体参数。在其他实施方案中，术语“治疗”是指通过身体上(例如通过稳定可辨别的症状)，或通过生理上(例如通过稳定生理参数)或通过身体上和生理上共同来抑制障碍的进展。在一些实施方案中，术语“治疗”是指延迟症状或一组症状或临床表现的发作或延迟某些身体机能丧失的发作。

在一些实施方案中，治疗线粒体障碍的至少一个可测量的身体参数的改善。在其他实施方案中，治疗引起线粒体障碍的减少、抑制或减慢，其或者通过身体上(例如通过稳定可测量的症状或症状组)或通过生理上(例如通过稳定可测量的参数)或通过身体上和生理上共同来实现。线粒体障碍的患者大脑中可测量的身体参数包括发育迟缓、头痛、偏头痛、癫痫、痴呆、自闭症特征、非典型性脑瘫、神经精神障碍、智力低下、脑损伤、脑神经代谢物(neuromatalobite)(例如NAA、氨基酸和乳酸盐)变化的发作频率或严重程度、中风样发作频率或严重程度、脑血流量、脑血管反应性、氧摄取指数、认知和脑疲劳。患有线粒体障碍的患者的神经系统中可测量的身体参数包括虚弱(可为间歇性的)、昏厥、缺乏反射、神经性疼痛、自主神经功能异常(dysautonomia)、温度不稳定。患有线粒体障碍的患者肌肉中可测量的身体参数包括疲劳、耐力、虚弱、运动协调、共济失调、肠易激综合征、胃食管反流、痉挛、腹泻或便秘、肌张力低下、胃肠道问题、假性梗阻和动力障碍。患有线粒体障碍的患者肾脏中的可测量身体参数包括肾小管酸中毒或消瘦。患有线粒体障碍的患者心脏中的可测量身体参数包括心脏传导缺陷(心脏传导阻滞)和心肌病。患有线粒体障碍的患者肝脏中可测量的身体参数包括低血糖和肝衰竭。患有线粒体障碍的患者血浆中可测量的身体参数包括一氧化氮和乳酸水平。患有线粒体障碍的患者的CSF(脑脊液)中可测量的身体参数包括乳酸和氨基酸水平。技术人员将能够使用常规手段(例如，包括但不限于实验室测试、身体检查、认知测试)来确定可测量的身体参数或一组身体参数的改善。

在其他实施方案中，如通过至少一个可测量参数(例如，身体或生理参数)所示，治疗导致线粒体疾病的进展减少、抑制或减慢。可测量的参数包括但不限于血浆、血液、大脑和CSF中的一个或多个中乳酸的减少；血浆和CSF中ADMA水平的正常化；大脑中的NAA水平增加；CSF中的丙酮酸减少；CSF中5-甲基四氢叶酸增加；中风样发作(SLE)和/或癫痫发作的严重程度和/或频率降低；肌阵挛和癫痫事件的严重程度和频率降低；患有SLE或癫痫的患者的MRI异常的分辨率得到改善；脑损伤的程度、严重程度和进展降低；精神疲劳减轻和认知功能改善或保持；头痛/偏头痛和癫痫发作的频率和严重程度降低；脑血流量、氧摄取分数、脑血管反应性和外周血管反应性的正常化；运动功能改善或运动异常(例如肌肉无力、肌肉疲劳、共济失调、痉挛或肌阵挛)减少；视敏度丧失改善或减少；以及患者的生活质量改善。在具体的实施方案中，所述治疗是针对患有选自以下的线粒体疾病的患者：阿尔珀斯病、肉碱-酰基-肉碱缺陷、肉碱缺陷、复合体I、II、III、IV缺陷、CPEO、CPT II缺陷、肌酸缺陷综合征、KSS、LCHAD、利氏综合征、脑白质营养不良、LHON、MELAS、MEPAN、MERRF、MIRAS、线粒体DNA耗竭症、MNGIE、NARP、皮尔逊综合征和POLG突变。

sGC刺激剂

本文通过其化学结构和/或化学名称定义本发明的化合物。如果化合物的化学结构和化学名称同时被提及，并且化学结构和化学名称存在冲突，则由化学结构将决定化合物的身份。

本文公开的化合物可以任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基例如以下一般性说明的，或以本发明的具体类别、亚类和种类举例说明的。短语“任选取代的”与短语“取代或未取代的”可互换使用。通常，术语“取代的”是指将给定结构中的一个或多个氢替换为指定取代基的基团。除非另有说明，否则任选取代的基团可在该基团的每个可取代位置上具有取代基。当给定结构中的一个以上的位置可以被选自指定组的一个以上的取代基取代时，除非另有说明，否则该取代基在每个位置上可以相同或不同。对本领域普通技术人员显而易见的是，诸如-H、卤素、-NO

如本文所使用的，短语“最多”涉及零或等于或小于短语后面的数字的任何整数。例如，“最多3个”表示0、1、2或3中的任何一个。如本文所述，原子的指定数量范围包括其中的任何整数。例如，具有1-4个原子的基团可以具有1、2、3或4个原子。当任何变量在任何位置出现多次以上时，其每次出现的定义独立于其他每次出现。

本公开所涉及的取代基和组合的选择仅是导致形成稳定或化学上可行的化合物的那些。这样的选择和组合对于本领域普通技术人员将是显而易见的，并且可以在没有过度实验的情况下确定。如本文所用，术语“稳定的”是指在经受允许其生产、检测以及在一些实施方案中，其回收、纯化和用于一种或多种本文公开的目的时，基本上没有改变的化合物。在一些实施方案中，稳定的化合物是在没有水分或其他化学反应条件下在25℃或更低的温度至少一周保持基本上不会改变的化合物。化学上可行的化合物是可以由本领域技术人员基于本公开的内容(必要时补充本领域的相关知识)制备的化合物。

除非仅特别画出或命名一种异构体，否则本文所述的结构还意在包括该结构的所有立体异构体(例如对映异构体、非对映异构体、阻转异构体和顺反异构体)形式。例如，每个不对称中心的R和S构型、每个不对称轴的Ra和Sa构型，(Z)和(E)双键构型以及顺式和反式构象异构体。因此，本发明化合物的单一立体化学异构体以及外消旋体，以及对映异构体、非对映异构体和顺反异构体(双键或构象)的混合物均在本公开的范围内。除非另有说明，否则本公开的化合物的所有互变异构形式也在本发明的范围内。

如本文所用，术语“脂族基”或“脂族基团”是指完全饱和或包含一个或多个不饱和单元的直链(即，无支链)或支链、取代或未取代的烃链。除非另有说明，否则脂族基团包含1-20个脂族碳原子。在一些实施方案中，脂族基团包含1-10个脂族碳原子。在其他实施方案中，脂族基团包含1-8个脂族碳原子。在其他实施方案中，脂族基团含有1-6个脂族碳原子。在其他实施方案中，脂族基团含有1-4个脂族碳原子，而在其他实施方案中，脂族基团含有1-3个脂族碳原子。合适的脂族基团包括但不限于直链或支链、取代或未取代的烷基、烯基或炔基。脂族基团的具体实例包括但不限于：甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、异丁基、乙烯基、仲丁基、叔丁基、丁烯基、炔丙基、乙炔基等。为了完全清楚，术语“脂族链”可以与术语“脂族基”或“脂族基团”互换使用。

如本文所用，术语“烷基”是指饱和的直链或支链单价烃基。除非另有说明，否则烷基含有1-20个碳原子(例如1-20个碳原子、1-10个碳原子、1-8个碳原子、1-6个碳原子、1-4个碳原子或1-3个碳原子)。烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基等。

术语“烯基”是指具有至少一个不饱和位点，即碳-碳sp

术语“炔基”是指具有至少一个不饱和位点，即碳-碳sp叁键的直链或支链一价烃基。除非另有说明，否则炔基包含2-20个碳原子(例如2-20个碳原子、2-10个碳原子、2-8个碳原子、2-6个碳原子、2-4个碳原子或2-3个碳原子)。实例包括但不限于乙炔基、丙炔基等。

术语“脂环族”(或“非芳族碳环”、“非芳族碳环基、“非芳族碳环基团”)是指完全饱和或包含一个或多个不饱和单元但不是芳族，并且与分子的其余部分具有单连接点的环烃。除非另有说明，否则脂环族基团可以是单环、双环、三环、稠合、螺接或桥连的。在一个实施方案中，术语“脂环族”是指单环C

术语“脂环族”还包括多环系统，其中非芳族碳环可与一个或多个芳族或非芳族碳环或杂环或其组合“稠合”，只要其连接基团或连接点在非芳族碳环上。

如本文所用，“环烷基”是指其中完全饱和并且具有与分子的其余部分连接的单点的环系统。除非另有说明，否则环烷基可以是单环、双环、三环、稠合、螺接或桥连的。在一个实施方案中，术语“环烷基”是指单环C

如本文所用，“杂环”(或“杂环基”或“杂环的”)是指环系统，其中一个或多个环成员是独立选择的杂原子，其完全饱和或包含一个或多个不饱和，但不是芳族的，并且与分子其余部分具有单连接点的单元。除非另有说明，否则通过本公开，杂环被用作“非芳族杂环”的同义词。在某些情况下该术语可以用在短语“芳族杂环”中，在这种情况下，它是指如下所定义的“杂芳基”。术语杂环还包括稠合、螺接或桥连的杂环系统。除非另有说明，否则杂环可以是单环、双环或三环的。在一些实施方案中，所述杂环具有3-18个环成员，其中一个或多个环成员是独立地选自氧、硫或氮的杂原子，并且系统中的每个环均包含3至7个环成员。在其他实施方案中，杂环可以是具有3-7个环成员(2-6个碳原子和1-4个杂原子)的单环或具有7-10个环成员(4-9个碳原子和1-6个杂原子)的双环。双环杂环系统的实例包括但不限于：金刚烷基、2-氧杂双环[2.2.2]辛基、1-氮杂双环[2.2.2]辛基。

如本文所用，术语“杂环”还包括其中所述杂环与一个或多个芳族或非芳族碳环或杂环或其组合稠合的多环系统，只要连接基团或连接点在所述杂环上。

杂环的实例包括但不限于以下单环：2-四氢呋喃基、3-四氢呋喃基、2-四氢噻吩基、3-四氢噻吩基、2-吗啉代、3-吗啉代、4-吗啉代、2-硫代吗啉代、3-硫代吗啉代、4-硫代吗啉代、1-吡咯烷基、2-吡咯烷基、3-吡咯烷基、1-四氢哌嗪基、2-四氢哌嗪基、3-四氢哌嗪基、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、1-吡唑啉基、3-吡唑啉基、4-吡唑啉基、5-吡唑啉基、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-哌啶基、2-噻唑烷基、3-噻唑烷基、4-噻唑烷基、1-咪唑啉烷基、2-咪唑烷基、4-咪唑烷基、5-咪唑烷基；和以下双环：3-1H-苯并咪唑-2-酮、3-(1-烷基)-苯并咪唑-2-酮、二氢吲哚基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、苯并硫杂环戊烷、苯并二硫杂环己基和1,3-二氢-咪唑-2-酮。

如本文所用，术语“芳基”(如在“芳基环”或“芳基基团”中)，单独使用或作为较大部分的一部分，如在“芳烷基”、“芳烷氧基”、“芳氧基烷基”中使用，是指碳环系统，其中所述系统中的至少一个环是芳族的，并且与分子的其余部分具有单连接点。除非另有说明，否则芳基可以是单环、双环或三环的并且含有6-18个环成员。该术语还包括多环系统，其中芳基环与一个或多个芳族或非芳族碳环或杂环或其组合稠合，只要连接基团或连接点在芳环上。芳基环的实例包括但不限于苯基、萘基、茚满基、茚基、四氢萘、芴基和蒽基。

术语“芳烷基”是指具有被亚烷基取代的芳环的基团，其中亚烷基的开放端允许芳烷基与化合物的另一部分键合。所述亚烷基为二价的直链或支链的饱和烃基。如本文所用，术语“C7-12芳烷基”是指其中芳基环和亚烷基结合的碳原子总数为7至12的芳烷基基团。“芳烷基”的实例包括但不限于被C1-6亚烷基取代的苯基环，例如苄基和苯乙基和被C1-2亚烷基取代的萘基。

单独或作为如“杂芳烷基”或“杂芳基烷氧基”的较大部分中的一部分使用的术语“杂芳基”(或“杂芳族”或“杂芳基团”或“芳族杂环”)是指这样的环系统，其中在该系统中的至少一个环是芳香族的并且包含一个或多个杂原子，其中系统中的每个环包含3至7个环成员，并且与分子的其余部分具有单连接点。除非另有说明，否则杂芳基环系统可以是单环、双环或三环的，并且具有总共五至十四个环成员。在一个实施方案中，杂芳基系统中的所有环是芳族的。在该定义中还包括这样的杂芳基，其中杂芳基环与一个或多个芳族或非芳族碳环或杂环或其组合稠合，只要该连接基团或连接点在杂芳基环上。例如，本文所用的双环6,5杂芳族系统是与另一个五元环稠合的六元杂芳族环，其中连接基团或连接点在六元环上。

杂芳基环包括但不限于以下单环：2-呋喃基、3-呋喃基、N-咪唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、5-咪唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噁唑基、4-噁唑基、5-噁唑基、N-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、哒嗪基(例如3-哒嗪基)、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、四唑基(例如5-四唑基)、三唑基(例如2-三唑基和5-三唑基)、2-噻吩基、3-噻吩基、吡唑基(例如2-吡唑基)、异噻唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,3-三唑基、1,2,3-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、1,2,5-噻二唑基、吡嗪基、1,3,5-三嗪基和以下双环：苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并吡嗪基、苯并吡喃基、吲哚基(例如2-吲哚基)、嘌呤基、喹啉基(例如2-喹啉基、3-喹啉基、4-喹啉基)和异喹啉基(例如1-异喹啉基、3-异喹啉基或4-异喹啉基)。

如本文所用，“环”(cyclo)(或“环状的”(cyclic)或“环部分”)涵盖单环、双环和三环系统，包括脂环族、杂环、芳基或杂芳基，其每一个均已在前面定义。

“稠合”的双环系统包含两个环，两个环共享两个相邻的环原子。

“桥连”双环系统包含两个共享三个或四个相邻环原子的环。如本文所用，术语“桥”是指连接分子的两个不同部分的原子或原子链。通过桥连接的两个原子(通常但不总是两个叔碳原子)被称为“桥头”。除桥外，两个桥头还通过至少两个单独的原子或原子链连接。桥连双环系统的实例包括但不限于金刚烷基、降冰片基、双环[3.2.1]辛基、双环[2.2.2]辛基、双环[3.3.1]壬基、双环[3.2.3]壬基、2-氧杂双环[2.2.2]辛基、1-氮杂双环[2.2.2]辛基、3-氮杂双环[3.2.1]辛基和2,6-二氧杂三环[3.3.1.03,7]壬基。“螺接”双环系统在两个环之间仅共享一个环原子(通常为季碳原子)。

术语“环原子”是指诸如C、N、O或S的原子，其为芳族环、脂环族环、杂环或杂芳基环的环的一部分。“可取代的环原子”是键合至至少一个氢原子的环碳或氮原子。氢可以任选地被合适的取代基取代。因此，术语“可取代的环原子”不包括当两个环稠合时共享的环氮或碳原子。另外，结构显示环碳或氮原子已经与除氢以外的一个或多个部分连接并且没有氢可用于取代时，“可取代的环原子”不包括所述环碳或氮原子。

“杂原子”是指氧、硫、氮、磷或硅中的一种或多种，其包括氮、硫、磷或硅的任何氧化形式、任何碱性氮的季铵化形式，或杂环或杂芳基环的可取代氮，例如N(如在3,4-二氢-2H-吡咯基中)、NH(如在吡咯烷基中)或NR

如本文所用，术语“烷氧基”或“烷硫基”是指通过氧(“烷氧基”，即-O-烷基)或硫(“烷硫基”，即-S-烷基)原子与分子或另一链或环连接的如上定义的烷基。

如本文所用，术语“卤素”或“卤代”是指F、Cl、Br或I。

术语“卤代烷基”、“卤代烯基”、“卤代脂族基”和“卤代烷氧基”，视情况可以是，指被一个或多个卤素原子取代的烷基、烯基、脂族基或烷氧基。例如，C

如本文所用，术语“氰基”是指-CN或-C≡N。

术语“氰基烷基”、“氰基烯基”、“氰基脂族基”和“氰基烷氧基”，视情况可以是，指被一个或多个氰基取代的烷基、烯基、脂族基或烷氧基。例如，C

如本文所用，“氧代”是指＝O，其中氧代通常但不总是与碳原子相连(例如，它也可以与硫原子相连)。脂族链可以任选地被羰基中断或可以任选地被氧代基取代，并且两个表达均指相同的情况：例如，-CH

在上述方法、用途和药物组合物的一些实施方案中，所述sGC刺激剂选自专利申请公开中描述的那些。

WO2013101830(例如，化合物1至122中的任何一个)、WO2012064559(例如，化合物I-1至I-68中的任何一个)、WO2012003405(例如，化合物I-1至I-312中的任何一种)、WO2011115804(例如，化合物I-1至I-63中的任何一种)、WO2014047111(例如，化合物I-1至I-5中的任何一种)、WO2014047325(例如，化合物I-1至I-10中的任何一个)；WO2014144100(例如，化合物I-1至I-634中的任何一个)；WO2015089182(例如，化合物I-1至I-72中的任何一个)、WO2016044447(例如，化合物1至217中的任何一个)、WO2016044446(例如，化合物I-1至I-94中的任何一个)、WO2016044445(例如，化合物I-1至I-39中的任何一个)、WO2016044441(例如，化合物I-1至I-20中的任何一个)、WO2018/009596(例如，化合物I-1至I-5中的任何一个)、WO2018045276(例如，化合物I-1至I-72中的任何一个)、WO2018/089328(例如，化合物I-1至I-16中的任何一个)、WO2018/089330(例如，化合物I-1至I-135中的任何一个)、WO2019/126354(例如，化合物I-1至I-16中的任何一个)，或其药学上可接受的盐。

在上述方法、用途和药物组合物的其他实施方案中，所述sGC刺激剂是以下一个或多个公开中所述的化合物：

WO2012165399和WO2014084312。

在上述方法、用途和药物组合物的其他实施方案中，所述sGC刺激剂是以下一个或多个公开中所述的化合物：

WO9816507、WO9823619、WO9816223、WO2003004503、WO2003095451、WO2004009589、WO2004009590、WO2007124854、WO2008031513、WO2007128454、WO2008061657、WO2010078900、WO2010079120、WO2011147809、WO2011147810、WO2013104598、WO2012004259、WO2012059549、WO2012143510、WO2012004258、WO2012152629、WO2012152630、WO2012010577、WO2012028647、WO2013104597、WO2013131923、WO2013104703、WO2013004785、WO2013030288、WO2014068095、WO2014068099、WO2009025888、WO2014068104、WO2014131741、WO2014131760、WO2011064156、WO2011073118、WO1998023619、WO2000006567、WO2000006569、WO2000021954、WO2000066582、WO2001083490、WO2001083490、WO2002042300、WO2002042301、WO2002042302、WO2002092596、WO2003097063、WO2004031186、WO2004031187、WO2014195333、WO2015018814、WO2015082411、WO2015124544、WO0006568、WO2001017998、WO2001047494、WO2002036120、WO2011064171、WO2014128109、WO2012010578、WO2013076168、WO2015124544、WO2015150366、WO2015150364、WO2015150363、WO2015150362、WO2015140199、WO2015150350和WO2015140254。

在上述方法、用途和药物组合物的其他实施方案中，所述sGC刺激剂是以下一个或多个公开中所述的化合物：

WO2009032249、WO2015088885、WO2015088886、WO2010065275、WO2009094242、WO2010099054、WO2010065275、WO2011119518、WO2011149921和WO2012058132。

在上述方法、用途和药物组合物的其他实施方案中，所述sGC刺激剂是WO2013086935中描述的化合物。

在上述方法、用途和药物组合物的一些其他实施方案中，所述sGC刺激剂是一个或多个以下公开中描述的化合物：WO2000006568、WO2001017998、WO2001047494和WO2002036120。

在上述方法、用途和药物组合物的一些进一步的实施方案中，所述sGC刺激剂是一个或多个以下公开中描述的化合物：US20110131411、WO2011064156和WO2011073118。

在上述方法、用途和药物组合物的一些其他实施方案中，所述sGC刺激剂是一个或多个以下公开中描述的化合物：US20140315926、WO2013076168、WO2003095451、WO2011064171、WO2013086935和WO2014128109。

在上述方法、用途和药物组合物的一些进一步的实施方案中，所述sGC刺激剂是一个或多个以下公开中描述的化合物：WO2011147809、WO2011147810、WO2012010578、WO2012059549和WO2013076168。

在上述方法、用途和药物组合物的一些实施方案中，所述sGC刺激剂是根据式IA的化合物或其药学上可接受的盐，

其中：

X选自N、CH、C(C

环B为苯基或含1或2个环氮原子的6元杂芳基环，或环B为噻吩；

n为0或选自1到3的整数；

每个J

每个R

J

J

R

或者，R

或者，J

其中Y不存在或为C

每个R

每个R

其中每个R

其中每个R

R

每个R

每个R

连接至R

每个R

每个R

当R

每个R

每个R

当R

p为选自0、1或2的整数；

环C为包含最多4个选自N、O或S的环杂原子的单环的5元杂芳基环；其中所述单环的5元杂芳基环不是1,3,5-三嗪基环；

每个J

在上述方法、用途和组合物的其他实施方案中，所述sGC刺激剂为具有式IB的化合物或其药学上可接受的盐，

其中J

R

每个R

每个R

连接至由R

或者，R

R

每个R

每个R

当R

每个R

每个R

或者，连接至R

R”为氢或C

在上述方法、用途和组合物的一些实施方案中，所述sGC刺激剂为式IC的化合物或其药学上可接受的盐：

其中J

R

R

在上述方法、用途和组合物的一些实施方案中，所述sGC刺激剂为下式的化合物或其药学上可接受的盐：

其中变量如对式IC的定义。

在一些实施方案中，对于式IC、式IC-a或式IC-b的化合物，R

在一些实施方案中，对于式IC、式IC-a或式IC-b的化合物，R

在上述方法、用途和组合物的一些实施方案中，所述sGC刺激剂为选自以下所述的化合物或其药学上可接受的盐：

在上述方法、用途和组合物的一些实施方案中，所述sGC刺激剂为以下式的化合物或其药学上可接受的盐：

其中：

Y独立地为N或C；

环B为苯基或5或6元杂芳基环，其含有1或2个独立地选自N、O或S的环杂原子；

n为选自0到3的整数；并且每个J

其中每个为C

每个R

每个R

Z选自氢、–P(O)(OH)

m为0或1；

R

R

两个R

J

p为1、2或3；并且

每个J

在上述方法、用途和组合物的一些实施方案中，所述sGC刺激剂为式IIA的化合物或其药学上可接受的盐：

对于ⅡA，所有变量的定义与对式Ⅱ的定义相同。

在上述方法、用途和组合物的一些实施方案中，所述sGC刺激物为式IIIA、式IIIB、式IVA、式IVB、式VA、式VB、式VIA或式VIB的化合物或其药学上可接受的盐：

其中变量的定义与对式II的描述相同。

在上述方法、用途和组合物的一些实施方案中，所述sGC刺激物为式II的化合物并选自下表所列的那些。

在上述方法、用途和组合物的一些实施方案中，所述sGC刺激剂为以下式的化合物或其药学上可接受的盐：

其中，

X选自–P(O)(OH)

每个J

m选自0或1；

n选自0、1、2、3或4；

R

R

R

R

两个R

R

在上述方法、用途和组合物的一些实施方案中，所述sGC刺激剂为式LA或LB的化合物或其药学上可接受的盐：

其中R

在上述方法、用途和组合物的一些实施方案中，所述sGC刺激剂为式LL、LLA、LLB、LLL、LLLA或LLLB的化合物或其药学上可接受的盐：

且变量的值如对式L所定义的。

在上述方法、用途和组合物的一些实施方案中，所述sGC刺激物为式II的化合物并选自下表所列的那些。

在上述方法、用途和组合物的一些实施方案中，所述sGC刺激物为式XZ的化合物或其药学上可接受的盐：

其中：

W为以下两者之一

i)不存在，且J

ii)环B，其选自苯基、含有1或2个独立地选自N、O和S的环杂原子的5或6元杂芳基环、C

其中当W为环B时

每个J为氢；

n为0或选自1、2或3的整数；

每个J

每个R

每个R

每个R

环D中的Z

每个J

J

每个R

每个R

每个R

每个R

当J

当J

当J

当J

当J

每个R

连接至J

每个R

每个R

分别连接至R

每个R

连接至R

每个R

连接至J

每个R

每个R

每个R

分别与R

连接至R

连接至R

Y不存在或为C

Y

当Y

当Y

每个R

每个R

每个R

每个R

每个R

每个R

每个R

每个R

每个J

在上述方法、用途和组合物的一些实施方案中，所述sGC刺激剂为式XY的化合物或其药学上可接受的盐：

n为0或选自1到3的整数；

每个J

每个R

每个J

R

R

在式XY的某些实施方案中，n为1或2。在一些实施方案中，n为1。

在式XY的某些实施方案中，每个J

在式XY的某些实施方案中，存在一个或两个J

在式XY的某些实施方案中，R

在式XY的某些实施方案中，R

在式XY的某些实施方案中，所述化合物为

Vericiguat

在一些实施方案中，所述sGC刺激剂选自：

在一些实施方案中，所述sGC刺激剂是式A中的一个或其药学上可接受的盐：

其中：

每个Y独立地选自N、NJ

每个X是N、NJ

其中X和Y中的最多3个同时为N或NJ

J

每个J

n为0、1、2或3；

R

q为或1；

R

R

R

在一些实施方案中，所述sGC刺激剂为式B中的一个或其药学上可接受的盐：

其中：

Y为N或CH；

每个J

n为0、1、2或3；

R

R

R

在一些实施方案中，所述sGC刺激剂为式C中的一个或其药学上可接受的盐：

其中：

Y为N或CH；

每个J

n为0、1、2或3；

R

R

R

在式A、B和C的一些实施方案中，R

在一些实施方案中，所述sGC刺激剂为式A、B或C，并且为以下中的一个：

在一些实施方案中，式A、B或C的化合物为中性形式或为药学上可接受的盐。

在上述方法、用途和药物组合物的一些实施方案中，所述sGC刺激剂为以下化合物：

利奥西呱(BAY 63-2521，

neliciguat(BAY 60-4552，描述于WO 2003095451)：

vericiguat(BAY 1021189)：

BAY 41-2272(描述于DE19834047和DE19942809):

BAY 41-8543(描述于DE19834044):

etriciguat(描述于WO 2003086407)：

以下描述的化合物之一描述在US20130072492(WO 2011149921)中：

药学上可接受的盐

在所述方法、用途和药物组合物的一些实施方案中，所述sGC刺激剂可以以下的形式提供(i)化合物本身(例如，作为游离碱)；(ii)化合物的药学上可接受的盐；或(iii)药物组合物的一部分。在上述方法、用途和药物组合物的一些实施方案中，所述另外的治疗剂可以以下形式提供：(i)化合物本身(例如，作为游离碱)；(ii)化合物的药学上可接受的盐；(iii)或药物组合物的一部分。

本文描述的化合物的“药学上可接受的盐”包括当与无机或有机酸或碱混合时衍生自所述化合物的那些。在一些实施方案中，所述盐可以在化合物的最终分离和纯化过程中原位制备。在其他实施方案中，所述盐可以在单独的合成步骤中由化合物的游离形式制备。上述药学上可接受的盐和其他典型药学上可接受的盐的制备更全面地描述于Berg等人，"Pharmaceutical Salts,"J.Pharm.Sci.,1977:66:1-19，其通过引用并入本文。所述sGC刺激剂的药学上可接受的盐是那些可用于药物中的盐。但是，药学上不可接受的盐可用于制备sGC刺激剂或其药学上可接受的盐。

当sGC刺激剂为酸性时，合适的“药学上可接受的盐”是指由药学上可接受的无毒碱，包括无机碱和有机碱制备的盐。衍生自无机碱的盐包括以下：铝、铵、钙、铜、铁、亚铁、锂、镁、锰、亚锰、钾、钠、锌等。具体的实施方案包括铵、钙、镁、钾和钠盐。衍生自以下的药学上可接受的有机无毒碱的盐，所述碱包括：伯、仲和叔胺的盐、取代的胺(包括天然存在的取代胺)、环胺、精氨酸、甜菜碱的盐、咖啡因、胆碱、N,N

当sGC刺激剂为碱性时，可以从药学上可接受的无毒酸，包括无机酸和有机酸制备盐。这样的酸包括乙酸盐、乙酸、酸式柠檬酸盐、酸式磷酸盐、抗坏血酸盐、苯磺酸(benzenesulfonic)、苯磺酸盐(benzenesulfonate)、苯甲酸(benzoic)、苯甲酸盐(benzoate)、溴化物、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、樟脑磺酸、氯化物、柠檬酸盐(citrate)、柠檬酸(citric)、乙磺酸盐(ethanesulfonate)、乙磺酸(ethanesulfonic)、甲酸、富马酸盐(fumarate)、富马酸(fumaric)、龙胆酸盐(gentisinate)、葡萄糖酸盐、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、谷氨酸盐(glutamate)、谷氨酸(glutamic)、氢溴酸、盐酸、碘化物、羟乙基磺酸、异烟酸盐、乳酸盐(lactate)、乳酸(lactic)、马来酸盐(maleate)、马来酸(maleic)、苹果酸、扁桃酸(mandelic)、甲磺酸(methanesulfonic)、甲磺酸盐(methanesulfonate)、粘酸(mucic)、硝酸盐(nitrate)、硝酸(nitric)、油酸、草酸盐、扑酸(pamoic)、扑酸盐(pamoate)(即，1,1'-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐)、泛酸(pantothenic)、泛酸盐(pantothenate)、磷酸盐(phosphate)、磷酸(phosphoric)、蔗糖、水杨酸盐、琥珀酸(succinic)、琥珀酸盐(succinate)、硫酸(sulfuric)、硫酸盐(sulfate)、单宁酸盐(tannate)、酒石酸盐(tartrate)、酒石酸(tartaric)、对甲苯磺酸盐(p-toluenesulfonate)、对甲苯磺酸(p-toluenesulfonic)等。具体的实施方案包括柠檬酸、氢溴酸、盐酸、马来酸、磷酸、硫酸和酒石酸。

除sGC刺激剂外，它们的药学上可接受的盐也可以用于组合物中以治疗或预防本文确定的障碍。

药物组合物和施用方法

本文公开的化合物及其药学上可接受的盐可以配制成药物组合物或“制剂”。

典型的制剂通过将sGC刺激剂或其药学上可接受的盐与载体、稀释剂或赋形剂混合来制备。合适的载体、稀释剂和赋形剂是本领域技术人员众所周知的，并且包括诸如碳水化合物、蜡、水溶性和/或可溶胀聚合物、亲水或疏水材料、明胶、油、溶剂、水等。所使用的具体载体、稀释剂或赋形剂将取决于配制sGC刺激剂的方式和目的。通常基于本领域技术人员公认对哺乳动物施用安全(GRAS-通常视为安全)的溶剂来选择溶剂。通常，安全的溶剂是无毒的水性溶剂，例如水和其他可溶于水或与水混溶的无毒溶剂。合适的水性溶剂包括水、乙醇、丙二醇、聚乙二醇(例如，PEG400、PEG300)等，以及它们的混合物。所述制剂还可以包括其他类型的赋形剂，例如一种或多种缓冲剂、稳定剂、抗粘剂、表面活性剂、湿润剂、润滑剂、乳化剂、粘合剂、助悬剂、崩解剂、填充剂、吸附剂、包衣(例如肠溶或缓释)防腐剂、抗氧化剂，不透明剂、助流剂、加工助剂、着色剂、甜味剂、加香剂、调味剂和其他已知的添加剂以提供药物(即sGC刺激剂或其药物组合物)优雅的外观或帮助制造药品(即药物)。

可接受的稀释剂、载体、赋形剂和稳定剂是指在使用的剂量和浓度下对接受者无毒的那些，其包括缓冲剂(例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸)；抗氧化剂(包括抗坏血酸和蛋氨酸)；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲铵氯化物；苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、苄索氯铵(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；蛋白质(例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；亲水性聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)；氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸)；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂(例如EDTA)；糖(例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇)；成盐的抗衡离子(例如钠)；金属络合物(例如Zn-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂(例如TWEEN

所述制剂可以使用常规的溶解和混合操作来制备。如本文所用，术语“治疗有效量”是指研究人员、兽医、医生或其他临床医生所寻求的在组织、系统、动物或人中引起生物学或医学反应的活性化合物或药剂的量。化合物的所述治疗有效量将由所述这些考虑因素决定，并且是其实现以下方面所必需的最小量：改善、治愈或治疗所述障碍或其一种或多种症状。

关于本发明的化合物、组合物或剂型的术语，“施用”(“administer”、“administering”或“administration”)是指将所述化合物引入需要治疗的受试者或患者的系统中。当本发明的化合物与一种或多种其他活性剂组合提供时，“施用”及其变体应理解为包括同时和/或顺序引入所述化合物和所述其他活性剂。

本文所述的组合物可以全身或局部施用，例如，口服(包括但不限于固体剂型，包括硬或软胶囊(例如明胶胶囊)、片剂、丸剂、散剂、舌下片剂、锭剂(troches)、糖锭剂(lozenges)和颗粒剂；以及液体剂型，包括但不限于药学上可接受的乳剂、微乳剂、水溶液或油溶液、悬浮液、糖浆和酏剂(elixirs)、通过吸入(例如，使用气雾剂、气体、吸入剂，雾化剂等)、耳(例如，使用滴耳剂)、局部(例如使用乳膏、凝胶、吸入剂、搽剂、洗剂、软膏、贴剂、糊剂、粉剂、溶液、喷雾剂、透皮贴剂等)、眼部(例如，滴眼剂、眼用凝胶、眼药软膏)、直肠(例如使用灌肠剂或栓剂)、经鼻、颊、阴道(例如使用冲洗器、宫内节育器、阴道栓剂、阴道环或片剂等)、经滴耳剂、经植入储库等，或胃肠外，其具体取决于所治疗障碍的严重程度和类型。本文所用的术语“肠胃外”包括但不限于皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。优选地，所述组合物口服、腹腔内或静脉内施用。

用于口服的化合物的制剂可以根据本领域已知的用于制备药物组合物的任何方法制备。

在固体剂型中，将活性化合物与至少一种惰性的、药学上可接受的赋形剂或载体混合，所述赋形剂或载体为例如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或a)填充剂或增量剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸，b)粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶，c)保湿剂，例如甘油，d)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠，e)溶液阻滞剂，例如石蜡，f)吸收促进剂，例如季铵化合物，g)湿润剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯，h)吸收剂，例如高岭土(kaolin)和膨润土(bentonite)，i)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、硫酸月桂酸钠及其混合物。片剂可以是未包衣的或可以通过已知技术包衣，所述已知技术包括微囊化以掩盖令人不快的味道或延迟胃肠道中的崩解和吸收，从而在较长的时间内提供持续的作用。例如，可以使用延时材料，例如单独或与蜡一起使用的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。可以使用水溶性掩味材料，例如羟丙基-甲基纤维素或羟丙基-纤维素。

除活性化合物外，所述液体剂型可包含本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(尤其是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及它们的混合物。除惰性稀释剂外，口服组合物还可包含佐剂，例如湿润剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、调味剂和增香剂。

口服组合物(固体或液体)还可以包含赋形剂和佐剂，例如分散剂或湿润剂，例如天然存在的磷脂(例如，卵磷脂)、亚烷基氧化物与脂肪酸的缩合产物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)、环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物(例如，十七乙烯氧基鲸蜡醇，heptadecaethyleneoxycetanol)、环氧乙烷与脂肪酸和己糖醇酐衍生的偏酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯)；乳化剂和悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、交联羧甲基纤维素、聚维酮(povidone)、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶；甜味剂、调味剂和加香剂；和/或一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丁酯、一种或多种着色剂、一种或多种调味剂和一种或多种甜味剂，例如蔗糖或糖精。

所述药物组合物也可以通过鼻喷雾剂或通过吸入施用。此类组合物是根据药物制剂领域中众所周知的技术制备，并且可以使用苄醇或其他合适的防腐剂、增强生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物和/或其他常规的增溶或分散剂，制成盐溶液。适用于肺内或鼻腔施用的制剂的粒度例如在0.1至500微米的范围内(包括在0.1和500微米之间的范围内的，增量为例如0.5、1、30、35微米等的颗粒)，其通过鼻腔快速吸入或通过口腔吸入以到达肺泡囊来施用。

本文所述的药物组合物也可以局部给药，尤其是当治疗的靶标包括局部施用容易达到的区域或器官时，其包括眼、耳、皮肤或下肠道的障碍。针对这些区域或器官中的每一个合适的局部制剂是容易制备。将活性成分在无菌条件下与药学上可接受的载体和可能需要的任何所需的防腐剂或缓冲剂混合。

对于局部应用，可以将所述药物组合物配制成合适的包含悬浮或溶解在一种或多种载体中的活性成分的软膏剂。用于局部施用本发明化合物的载体包括但不限于矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙烯乙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，可以将所述药物组合物配制成含有悬浮或溶解在一种或多种药学上可接受的载体中的活性成分的合适的洗剂或乳膏剂。合适的载体包括但不限于矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨酯60、鲸蜡酯蜡(cetyl esters wax)、鲸蜡硬脂醇(cetearyl alcohol)、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。

或者，可以将活性成分与水包油乳膏基质一起配制成乳膏。如果需要，乳膏基质的水相可以包括多元醇，即具有两个或更多个羟基的醇，例如丙二醇、丁烷1,3-二醇、甘露醇、山梨糖醇、甘油和聚乙二醇(包括PEG 400)及其混合物。所述局部制剂可视需要包括增强活性成分通过皮肤或其他受影响区域的吸收或渗透的化合物。这种皮肤渗透促进剂的实例包括二甲基亚砜和相关类似物。

使用sGC刺激剂制备的乳液的油相可以由已知成分以已知方式构成。尽管该相可以仅包含乳化剂(emulsifier，也称为乳化剂(emulgent))，但是期望地包含至少一种乳化剂与脂肪或油或与脂肪和油的混合物。可以将亲水性乳化剂与作为稳定剂的亲脂性乳化剂一起包括在内。在一些实施方案中，所述乳化剂包括油和脂肪。以及，具有或不具有稳定剂的乳化剂构成了所谓的乳化蜡，并且该蜡与油和脂肪一起构成了所谓的乳化软膏基料(emulsifying ointment base)，其形成乳膏制剂的油性分散相。适用于sGC刺激剂制剂的乳化剂和乳化稳定剂包括Tween

另外，本发明考虑了透皮贴剂的使用，透皮贴剂具有提供化合物向身体的受控递送的附加优点。这样的剂型可以通过将化合物溶解或分配在适当的介质中来制备。吸收促进剂也可用于增加化合物穿过皮肤的流量。速率可以通过提供速率控制膜或通过将化合物分散在聚合物基质或凝胶中来控制。

对于眼科用途，可以将所述药物组合物配制成等渗的微粉化悬浮液、pH调节的无菌盐水，或者优选配制成等渗的、具有pH调节的无菌盐水中的溶液，可以含有或不含例如苄扎氯铵的防腐剂。或者，对于眼科用途，可以将所述药物组合物配制成软膏例如凡士林。为了治疗眼睛或其他外部组织，例如嘴和皮肤，可以将所述制剂作为局部软膏剂或乳膏剂，其包含活性成分的量，例如，为0.075至20％w/w。当制成软膏剂时，所述活性成分可与油基基质、石蜡基基质或与水混溶的软膏基质一起使用。

用于直肠或阴道施用的组合物优选是栓剂，其可以通过将本文所述的化合物与合适的非刺激性赋形剂或载体例如可可脂、蜂蜡、聚乙二醇或栓剂蜡混合而制备，所述栓剂在环境温度下为固体但在身体温度上为液体并因此在直肠或阴道腔中融化并释放出活性化合物。适合阴道施用的其他制剂可以子宫托(pessaries)、棉塞、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾剂的形式提供。

本文所述的组合物的无菌注射形式(例如用于肠胃外给药)可以是水性或油性悬浮液。这些悬浮液可以根据本领域已知的技术，使用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂(包括前段中所述的那些)来配制。所述无菌注射制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如在1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的媒介物和溶剂为水、林格氏(Ringer's)溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发油通常用作溶剂或悬浮介质。为此，可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸，例如油酸及其甘油酯衍生物可用于制备注射剂，其为天然药学上可接受的油，例如植物油，例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油，尤其是在它们的聚氧乙烯化形式，或在矿物油(如液体石蜡)中。这些油溶液或悬浮液也可以包含长链醇稀释剂或分散剂，例如羧甲基纤维素或类似的分散剂，其通常用于配制药学上可接受的剂型，包括乳剂和悬浮液。为了注射制剂的目的，也可以使用其他通常使用的表面活性剂，例如吐温，司盘(Spans)和其他乳化剂或生物利用度增强剂(通常用于制造药学上可接受的固体、液体或其他剂型)。所述油性悬浮液可包含增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以添加诸如上述的甜味剂和调味剂以提供可口的口服制剂。这些组合物可以通过添加抗氧化剂例如丁基化羟基茴香醚或α-生育酚(tocopherol)来保存。

在另一方面，可以将sGC刺激剂或其药学上可接受的盐配制在包含兽用载体的兽用组合物中。兽医载体是用于施用所述组合物的材料，并且可以是惰性的固体、液体或气体材料。在兽医领域与活性成分相容。这些兽医用组合物可以肠胃外、口服或通过任何其他所需途径施用。

组合疗法

如本文所用，术语“组合”或“共同施用”可互换使用以指代使用不止一种治疗剂(例如，sGC刺激剂和一种或多种另外的治疗剂)。该术语的使用并不限制对受试者施用的治疗剂(例如sGC刺激剂和另外的治疗剂)的顺序。

在一些实施方案中，在开始用另一种治疗剂治疗之前、同时或之后，施用所述sGC刺激剂。

在上述方法和用途的一些实施方案中，所述另外的治疗剂和sGC刺激剂同时施用。在上述方法和用途的其他实施方案中，所述另外的治疗剂和sGC刺激剂被顺序地或分开地施用。

在一些实施方案中，上述药物组合物包含(a)如上所述的sGC刺激剂或其药学上可接受的盐，和(b)药学上可接受的载体、媒介物或佐剂。在一些实施方案中，所述药物组合物包含(a)如上所述的一种或多种另外的治疗剂或其药学上可接受的盐，以及(b)药学上可接受的载体、媒介物或佐剂。在一些实施方案中，所述药物组合物包含(i)如上所述的sGC刺激剂或其药学上可接受的盐，(ii)一种或多种如上所述的另外的治疗剂或其药学上可接受的盐，以及(iii)药学上可接受的载体、媒介物或佐剂。

本文所述的sGC刺激剂和药物组合物可以与一种或多种另外的治疗剂用于组合疗法。对于与一种以上活性剂的组合治疗，该另外的活性剂可以是相同的剂型或分开的剂型。其中所述另外的活性剂以分开的剂型存在，所述活性剂可以分开施用或与sGC刺激剂联合施用。另外，一种药剂的施用可以在另一种药剂的施用之前、同时或之后。

当用于与其他药剂的组合疗法时，所述sGC刺激剂和其他一种或多种药物的“治疗有效量”将取决于所用药物的类型。合适的剂量对于获批的药剂是已知的，并且可以由技术人员根据受试者的病症、所治疗的病症的类型以及本文所述化合物的量进行调整。在没有明确注明用量的情况下，应采用有效量。

在一些实施方案中，共同施用或组合疗法涵盖以基本上同时的方式施用第一和第二量的化合物，例如以单一药物组合物的形式，例如具有第一和第二量的固定比例的胶囊或片剂，或针对每一种药物以多个单独的胶囊或片剂形式。此外，这种共同施用还涵盖以任一顺序依次使用每种化合物。

当共同施用涉及分别施用第一量的sGC刺激剂和第二量的另外的治疗剂时，应在时间上足够近地施用所述化合物以具有所需的治疗效果。例如，可导致期望的治疗效果的每次施用之间的时间间隔的范围可从数分钟到数小时不等，并且可以通过考虑每种化合物的性质(例如效力、溶解性、生物利用度、血浆半衰期和动力学曲线)确定。例如，sGC刺激剂与第二治疗剂可以在彼此约24小时内、彼此约16小时内、彼此约8小时内、彼此约4小时内，彼此约1小时内或彼此约30分钟内以任何顺序施用。

可以与sGC刺激剂或其药学上可接受的盐组合使用的另外的治疗剂(分别施用或以相同药物组合物的形式)包括但不限于：

(1)内皮源释放因子(EDRF)或NO气体。

(2)NO供体，例如亚硝基硫醇、亚硝酸盐、斯德亚胺(sydnonimine)、偶氮鎓二醇盐(NONOate)、N-亚硝胺、N-羟基亚硝胺、亚硝胺、硝基酪氨酸、二氮杂环丁烯二氧化物、噁三唑5-亚胺、肟、羟胺、N-羟基胍、羟基脲或氧化呋咱环(furoxan)。这些类型的化合物的一些例子包括：甘油三硝酸酯(也称为GTN、硝酸甘油和三硝基甘油)、甘油的硝酸酯；硝普钠(SNP)，其中一氧化氮分子与铁金属配位形成四方双锥体络合物；3-吗啉代斯德亚胺(SIN-1)，吗啉和斯德亚胺结合形成的两性离子化合物；S-亚硝基-N-乙酰青霉胺(SNAP)，具有亚硝基硫醇官能团的N-乙酰化氨基酸衍生物；二亚乙基三胺/NO(DETA/NO)，与二亚乙基三胺共价连接的一氧化氮化合物；乙酰水杨酸的间-硝基氧甲基苯酯。这些NO供体类别中的一些更具体的例子包括：经典的硝基血管扩张剂，例如有机硝酸盐和亚硝酸酯，包括硝化甘油、亚硝酸戊酯、二硝酸异山梨糖醇、异山梨糖醇5-单硝酸酯和尼可地尔(nicorandil)；异山梨糖醇

(3)其他提高cGMP浓度的物质，如原卟啉IX、花生四烯酸和苯肼衍生物。

(4)一氧化氮合酶底物：例如，基于L-精氨酸、N-羟基胍的类似物，例如N[G]-羟基-L-精氨酸(NOHA)、1-(3,4-二甲氧基-2-氯亚苄基氨基)-3-羟基胍和PR5(1-(3,4-二甲氧基-2-氯亚苄基氨基)-3-羟基胍)；L-精氨酸衍生物(例如homo-Arg、homo-NOHA、N-叔丁氧基-和N-(3-甲基-2-丁烯基)氧基-L-精氨酸、刀豆氨酸、ε-胍基-癸酸(carpoic acid)、胍丁胺、羟基-胍丁胺和L-酪氨酰基-L-精氨酸)；N-烷基-N’-羟基胍(例如，N-环丙基-N’-羟基胍和N-丁基-N’-羟基胍)、N-芳基-N’-羟基胍(例如N-苯基-N’-羟基胍及其带有–F、-Cl、-甲基、-OH取代基的对位取代衍生物)；胍衍生物，例如3-(三氟甲基)丙基胍。

(5)增强eNOS转录的化合物。

(6)NO依赖性、非血红素依赖性sGC活化剂，包括但不限于：

BAY 58-2667(描述于专利公开DE19943635)；HMR-1766(阿他西呱钠(ataciguatsodium)，描述于专利公开WO2000002851)；S 3448(2-(4-氯-苯基磺酰基氨基)-4,5-二甲氧基-N-(4-(硫吗啉-4-磺酰基)-苯基)-苯甲酰胺(描述于专利公开DE19830430和WO2000002851)；并且

HMR-1069(Sanofi-Aventis)。

(7)血红素依赖性非NO依赖性sGC刺激剂包括但不限于：

YC-1(参见专利公开EP667345和DE19744026)；利奥西呱(riociguat)(BAY 63-2521，

其他sGC刺激剂描述于以下公开之一：US20090209556、US8455638、US20110118282(WO2009032249)、US20100292192、US20110201621、US7947664、US8053455(WO2009094242)、US20100216764、US8507512、(WO2010099054)US20110218202(WO2010065275)、US20130012511(WO2011119518)、US20130072492(WO2011149921)、US20130210798(WO2012058132)和Tetrahedron Letters(2003),44(48):8661-8663；以及

IW-1973和IW1701。

(8)抑制cGMP和/或cAMP降解的化合物，例如：

PDE1抑制剂、PDE2抑制剂、PDE-3抑制剂，例如，氨力农(amrinone)、米力农(milrinone)、依诺昔酮(enoximone)、维司力农(vesnarinone)、匹莫苯(pimobendan)和奥普力农(olprinone)、PDE4抑制剂，例如，rolumilast、PDE5抑制剂，例如，西地那非(sildenafil)

(9)下列类型的钙通道阻滞剂：

二氢吡啶类钙通道阻滞剂例如，氨氯地平(amlodipine)

苯基烷基胺钙通道阻滞剂如维拉帕米(verapamil)

苯并硫氮杂

非选择性钙通道抑制剂，例如咪拉地尔(mibefradil)、苄普地尔(bepridil)、氟司必林(fluspirilene)和芬地林(fendiline)。

(10)内皮素受体拮抗剂(ERA)，例如双(ET

(11)前列环素衍生物或类似物，例如asprostacyclin(前列腺素I

(12)降高血脂药，例如以下类型：

胆汁酸螯合剂，例如考来烯胺(cholestyramine)、考来替泊(colestipol)、考来替兰(colestilan)、考来维纶(colesevelam)或司维拉姆(sevelamer)；

他汀类药物包括阿托伐他汀(atorvastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、罗素伐他汀(rosuvastatin)和普伐他汀(pravastatin)；

胆固醇吸收抑制剂，例如依泽替米贝(ezetimibe)；

其他降脂剂，例如二十碳五烯酸乙酯、ω-3酸乙酯、Reducol；

纤维酸衍生物，例如氯贝丁酯(clofibrate)、苯扎贝特(bezafibrate)、克利贝特(clinofibrate)、吉非罗齐(gemfibrozil)、氯烟贝特(ronifibrate)、必尼妥明(binifibrate)、非诺贝特(fenofibrate)、环丙贝特(ciprofibrate)、胆碱非诺贝特(choline fenofibrate)；

烟酸衍生物，例如阿西莫司(acipimox)和烟酸；

他汀类药物、烟酸和肠道胆固醇吸收抑制补充剂(依泽替米贝(ezetimibe)及其他)和贝特类(fibrates)的组合；以及

抗血小板治疗剂，例如硫酸氢氯吡格雷(clopidogrel bisulfate)。

(13)抗凝剂，例如以下类型：

香豆素(维生素K拮抗剂)，例如华法林(warfarin)

肝素及其衍生物，例如低分子量肝素，磺达肝素(fondaparinux)和艾卓肝素(idraparinux)；

直接凝血酶抑制剂，例如阿加曲班(argatroban)、重组水蛭素(lepirudin)、比伐卢定(bivalirudin)、达比加群(dabigatran)和希美加群(ximelagatran)

组织纤溶酶原活化剂，用于溶解血栓和疏通动脉，例如阿替普酶(alteplase)。

(14)抗血小板药物，例如topidogrel、噻氯匹定(ticlopidine)、双嘧达莫(dipyridamole)和阿司匹林。

(15)ACE抑制剂，例如以下类型：

含巯基的试剂，例如卡托普利(captopril)

含二羧酸盐的试剂，例如依那普利(enalapril)

含膦酸酯的试剂，例如福辛普利(fosinopril)；

天然存在的ACE抑制剂，例如casokinins和lactokinins，其为酪蛋白和乳清的分解产物，是摄入乳制品(尤其是酸牛乳)后自然产生的；

还具有ACE抑制和降压功能的产自益生菌瑞士乳杆菌或衍生自酪蛋白的乳三肽Val-Pro-Pro和Ile-Pro-Pro；

其他ACE抑制剂，例如阿拉普利(alacepril)、地拉普利(delapril)、西拉普利(cilazapril)、咪达普利(imidapril)、群多普利(trandolapril)、替莫普利(temocapril)、莫西卜里(moexipril)和pirapril。

(16)补氧疗法。

(17)β阻滞剂，例如以下类型：

非选择剂，例如阿普洛尔(alprenolol)、布新洛尔(bucindolol)、卡替洛尔(carteolol)、卡维地洛(carvedilol)、拉贝洛尔(labetalol)、纳多洛尔(nadolol)、喷布洛尔(penbutolol)、吲哚洛尔(pindolol)、oxprenonol、醋丁洛尔(acebutolol)、索他洛尔(sotalol)、甲吲洛尔(mepindolol)、塞利洛尔(celiprolol)、阿罗洛尔(arotinolol)、特他洛尔(tertatolol)、氨磺洛尔(amosulalol)、尼普洛尔(nipradilol)、普萘洛尔(propranolol)和噻吗洛尔(timolol)；

β

β

(18)抗心律失常药，例如以下几种类型：

I型(钠通道阻滞剂)，例如奎尼丁(quinidine)、利多卡因(lidocaine)、苯妥英(phenytoin)、普罗帕酮(propafenone)；

III型(钾通道阻滞剂)，例如胺碘酮(amiodarone)、多非利特(dofetilide)和索他洛尔(sotalol)；以及

V型，例如腺苷和地高辛(digoxin)。

(19)利尿剂，例如噻嗪类利尿剂，例如，氯噻嗪、氯噻酮和氢氯噻嗪、苄氟噻嗪(bendroflumethiazide)、环戊噻嗪、甲氯噻嗪、聚噻嗪、喹噻酮(quinethazone)、氯磺水杨胺(xipamide)、美托拉宗(metolazone)、吲达帕胺(indapamide)、西氯他宁(cicletanine)；袢利尿剂，例如呋塞米(furosemide)和toresamide；保钾利尿剂，例如氨氯吡脒(amiloride)、安体舒通(spironolactone)、坎利酸钾(canrenoate potassium)、依普利酮(eplerenone)和氨苯蝶啶(triamterene)；这些药剂的组合；其他利尿剂，例如乙酰唑胺(acetazolamid)和卡培立肽(carperitide)。

(20)直接作用的血管扩张药，例如盐酸肼苯哒嗪、二氮嗪、硝普钠、卡屈嗪(cadralazine)；其他血管扩张剂，例如异山梨糖醇二硝酸盐和异山梨糖醇5-单硝酸盐。

(21)外源性血管扩张药，例如

(22)α-1-肾上腺素受体拮抗剂，例如哌唑嗪、吲哚拉明(indoramin)、乌拉地尔(urapidil)、布那唑嗪(bunazosin)、特拉唑嗪(terazosin)和多沙唑嗪(doxazosin)；心房利钠肽(ANP)、乙醇、组胺诱导剂、四氢大麻酚(THC)和罂粟碱。

(23)以下类型的支气管扩张剂：

短效β2激动剂，例如albutamol或沙丁胺醇(albuterol)

长效β2激动剂(LABAs)，例如沙美特罗(salmeterol)和福莫特罗(formoterol)；

抗胆碱能药，例如pratropium和噻托溴铵(tiotropium)；以及

茶碱(theophylline)、支气管扩张剂和磷酸二酯酶抑制剂。

(24)皮质类固醇，例如倍氯米松(beclomethasone)、甲基强的松龙(methylprednisolone)、倍他米松(betamethasone)、强的松(prednisone)、泼尼松龙(prednisolone)、曲安西龙(triamcinolone)、地塞米松(dexamethasone)、氟替卡松(fluticasone)、氟尼缩松(flunisolide)、氢化可的松(hydrocortisone)和皮质类固醇类似物如布地奈德(budesonide)。

(25)膳食补充剂，例如ω-3油；叶酸、烟酸、锌、铜、高丽红参根(Korean redginseng root)、银杏、松树皮、蒺藜(Tribulus terrestris)、精氨酸、燕麦、角质山羊杂草(horny goat weed)、秘鲁人参根(maca root)、榥木(muira puama)、锯棕榈(sawpalmetto)和瑞典花粉；维生素C、维生素E、维生素K2；睾丸激素补充剂、睾丸激素透皮贴剂；zoraxel、纳曲酮(naltrexone)、布雷默浪丹(bremelanotide)和美拉诺坦II(melanotanII)。

(26)PGD2受体拮抗剂。

(27)免疫抑制剂，例如环孢霉素(环孢霉素A，

(28)非甾体类抗哮喘药，例如β2-激动剂如特布他林(terbutaline)、奥西那林(metaproterenol)、非诺特罗(fenoterol)、新异丙肾上腺素(isoetharine)、沙丁胺醇(albuterol)、沙美特罗(salmeterol)、比托特罗(bitolterol)和吡布特罗(pirbuterol)；β2-激动剂-糖皮质激素组合，例如沙美特罗(salmeterol)-氟替卡松(fluticasone)

(29)非甾体类抗炎药(NSAID)，例如丙酸衍生物，阿明洛芬(alminoprofen)、苯噁洛芬(benoxaprofen)、布氯酸(bucloxic acid)、卡洛芬(carprofen)、苯布芬(fenbufen)、非诺洛芬(fenoprofen)、氟洛芬(fluprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、布洛芬、吲哚洛芬(indoprofen)、酮洛芬(ketoprofen)、咪洛芬(miroprofen)、萘普生(naproxen)、奥沙普嗪(oxaprozin)、吡洛芬(pirprofen)、普拉洛芬(pranoprofen)、舒洛芬(suprofen)、噻洛芬酸(tiaprofenic acid)和硫噁洛芬(tioxaprofen)；乙酸衍生物，例如吲哚美辛(indomethacin)、阿西美辛(acemetacin)、阿氯芬酸(alclofenac)、环氯茚酸(clidanac)、双氯芬酸(diclofenac)、芬氯酸(fenclofenac)、芬克洛酸(fenclozic acid)、芬替酸(fentiazac)、呋罗芬酸(furofenac)、异丁芬酸(ibufenac)、伊索克酸(isoxepac)、oxpinac、舒林酸(sulindac)、硫平酸(tiopinac)、托美汀(tolmetin)、齐多美辛(zidometacin)和佐美酸(zomepirac)；芬那酸衍生物，例如氟芬那酸、甲氯芬那酸、甲芬那酸、尼氟灭酸(niflumic acid)和托芬那酸；联苯羧酸衍生物，例如二氟尼柳(diflunisal)和氟苯柳(flufenisal)；昔康类(oxicams)，例如伊索昔康(isoxicam)、吡罗昔康(piroxicam)、舒多昔康(sudoxicam)和替诺昔康(tenoxican)；水杨酸盐，例如乙酰水杨酸和柳氮磺吡啶；以及吡唑酮类，例如羟布宗(apazone)、bezpiperylon、非普拉宗(feprazone)、莫非布宗(mofebutazone)、氧苯丁酮(oxyphenbutazone)和苯基丁氮酮。

(30)环氧合酶2(COX-2)抑制剂，例如塞来昔布(celecoxib)

(31)抗糖尿病药，例如胰岛素和胰岛素模拟物；磺脲类，例如格列本脲(glyburide)、优降糖(glybenclamide)、格列吡嗪(glipizide)、格列齐特(gliclazide)、格列喹酮(gliquidone)、格列美脲(glimepiride)、meglinatide、甲苯磺丁脲(tolbutamide)、氯磺丙脲(chlorpropamide)、醋磺环已脲(acetohexamide)和olazamide；双胍类，例如二甲双胍

(32)HDL胆固醇增加剂，例如安塞曲匹(anacetrapib)和达塞曲匹(dalcetrapib)。

(33)减肥药包括盐酸甲基苯丙胺、盐酸安非拉酮

(34)血管紧张素受体阻滞剂，例如氯沙坦(losartan)、缬沙坦(valsartan)、坎地沙坦(candesartan)、cilexetil、eprosaran、厄贝沙坦(irbesartan)、替米沙坦(telmisartan)、奥美沙坦酯(olmesartran medoxomil)、阿齐沙坦酯(azilsartanmedoxomil)。

(35)肾素抑制剂，例如aliskiren hemifumirate。

(36)中枢作用的α-2-肾上腺受体激动剂，例如甲基多巴(methyldopa)，可乐定(clonidine)和胍法辛(guanfacine)。

(37)肾上腺素能神经元阻滞剂，例如胍乙啶和胍那决尔(guanadrel)。

(38)咪唑啉I-1受体激动剂，例如利美尼定(rimenidine)磷酸二氢盐和莫索尼定(moxonidine)盐酸水合物。

(39)醛固酮拮抗剂，如安体舒通(spironolactone)和依普利酮(eplerenone)。

(40)钾通道活化剂，如吡那地尔(pinacidil)。

(41)多巴胺D1激动剂，例如甲磺酸非诺多泮(fenoldopam mesilate)；其他多巴胺激动剂，例如异波帕胺(ibopamine)，多培沙明(dopexamine)和卡多巴胺(docarpamine)。

(42)5-HT2拮抗剂，例如酮色林(ketanserin)。

(43)加压素拮抗剂，例如托伐普坦(tolvaptan)。

(44)钙通道敏化剂，例如左西孟旦(levosimendan)，或活化剂，例如尼可地尔(nicorandil)。

(45)腺苷酸环化酶活化剂，如达普酸考福辛盐酸盐(colforsin dapropatehydrochloride)。

(46)正性肌力药，例如地高辛(digoxin)和甲地高辛(metildigoxin)；代谢性强心药，例如泛癸利酮(ubidecarenone)；脑钠尿肽(brain natriuretic peptides)，例如奈西立肽(nesiritide)。

(47)用于治疗勃起功能障碍的药物，例如前列地尔(alprostadil)、阿肽地尔(aviptadil)和甲磺酸酚妥拉明(phentolamine mesilate)。

(48)用于治疗肥胖症的药物，包括但不限于盐酸甲基安非他命

(49)用于治疗阿尔茨海默氏病和痴呆的药物，例如以下类型：

乙酰胆碱酯酶抑制剂，包括加兰他敏(galantamine)

(50)精神科药物，例如以下类型：

齐拉西酮(ziprasidone)(Geodon

多巴胺D4受体拮抗剂，例如氯氮平；

多巴胺D2受体拮抗剂，例如奈莫必利(nemonapride)

多巴胺D1/D2受体混合拮抗剂，如珠氯噻醇(zuclopenthixol)；

GABA A受体调节剂，如卡马西平(carbamazepine)；

钠通道抑制剂如拉莫三嗪(lamotrigine)；

单胺氧化酶抑制剂，例如吗氯贝胺(moclobemide)和茚洛秦(indeloxazine)；以及

普马色林(primavanserin)和哌罗匹隆(perospirone)。

(51)用于治疗动力障碍或症状的药物，例如以下类型：

儿茶酚-O-甲基转移酶抑制剂，例如恩他卡朋(entacapone)；

单胺氧化酶B抑制剂，例如司来吉兰(selegiline)；

多巴胺受体调节剂，如左旋多巴(levodopa)；

多巴胺D3受体激动剂，例如普拉克索(pramipexole)；

脱羧酶抑制剂，例如卡比多巴(carbidopa)；

其他多巴胺受体激动剂，例如培高利特(pergolide)、匹尼罗(ropinirole)、卡麦角林(cabergoline)；

ritigonide、伊曲茶碱(istradefylline)、他利克索(talipexole)；唑尼沙胺(zonisamide)和沙芬酰胺(safinamide)；以及

突触囊泡胺转运蛋白抑制剂如丁苯那嗪(tetrabenazine)。

(52)用于治疗情绪或情感障碍或强迫症的药物，例如以下类型：

三环抗抑郁药，例如阿米替林(amitriptyline)

选择性血清素再摄取抑制剂(SSRIs)，例如帕罗西汀(paroxetine)

多塞平(doxepin)

选择性去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SNRI)，例如文拉法辛(venlafaxine)、瑞波西汀(reboxetine)和阿托莫西汀(atomoxetine)；多巴胺能抗抑郁药，例如丁氨苯丙酮(bupropion)和安咪奈丁(amineptine)。

(53)用于增强突触可塑性的药物，例如以下几种：

烟碱样受体拮抗剂，例如美加明(mecamylamine)；以及

混合型5-HT、多巴胺和去甲肾上腺素受体激动剂，例如鲁拉西酮(lurasidone)。

(54)用于治疗多动症的药物，例如安非他命；5-HT受体调节剂，例如vortioxetine和α-2肾上腺受体激动剂，例如可乐定(clonidine)。

(55)中性内肽酶(NEP)抑制剂，例如sacubitril、奥马曲拉(omapatrilat)；以及亚甲基蓝(MB)。

(56)一氧化氮合酶辅助因子，例如：四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin)、二氢生物蝶呤(dihydrobiopterin)和沙丙蝶呤(sapropterin)

(57)线粒体障碍的治疗药物，包括但不限于维生素和补充剂，包括辅酶Q10；B复合维生素，尤其是硫胺素(B1)和核黄素(B2)；α-硫辛酸；L-肉碱(Carnitor)；肌酸；瓜氨酸和L-精氨酸。

(58)癫痫或癫痫发作的治疗剂包括但不限于苯妥英(phenytoin)

包装和试剂盒

所使用的药物组合物(或制剂)可以根据用于施用的方法以各种方式包装。通常，用于分配的制品包括在其内以适当形式放置有药物制剂的容器。合适的容器是本领域技术人员众所周知的，并且包括诸如瓶(塑料和玻璃)、药囊、安瓿、塑料袋、金属圆筒等之类的材料。容器还可以包括防干扰装置(tamper-proof assemblage)，以防止不慎接触包装的内容物。另外，所述容器在其上放置有描述容器内容物的标签。所述标签上还可包含适当的警告。

本文所述的化合物和药物制剂可以包含在试剂盒中。所述试剂盒可包括单剂量或多剂量的两种或多种药剂，各自分别包装或配制，或单剂量或多剂量的两种或多种药剂组合包装或配制。因此，一种或多种试剂可以存在于第一容器中，并且所述试剂盒可以任选地在第二容器中包括一种或多种试剂。所述一个或多个容器放置在包装内，并且所述包装可任选地包括施用或剂量说明。试剂盒可包括另外的成分，例如注射器或其他用于施用试剂的装置以及稀释剂或其他用于配制的手段。因此，试剂盒可包括：a)包含本文所述化合物和药学上可接受的载体、媒介物或稀释剂的药物组合物；和b)容器或包装。所述试剂盒可任选地包含说明，其描述了在本文所述的一种或多种方法中使用药物组合物的方法的说明书(例如，预防或治疗本文所述的一种或多种障碍)。所述试剂盒可任选地包含第二药物组合物，其包含一种或多种本文所述的用于联合治疗的另外的试剂、药学上可接受的载体、媒介物或稀释剂。包含本文所述化合物的药物组合物和试剂盒中包含的第二药物组合物可以任选地组合在同一药物组合物中。

实施例

实施例1.体内模型

过氧化物酶体增殖剂活化受体c共活化因子1α(PGC1α)是线粒体生物发生的主要调节剂，并且是代谢和线粒体功能的介质(参见Journal of Cell Science 125(21)4964-4971和Cardiovascular Research(2008)79,208–217，其教导通过引用并入本文)。此外，PGC1α对PPARα和PPARγ等下游效应子产生影响以在多种生理条件下改变线粒体能量代谢(参见Journal of Clinical Investigation(2006)116(3):615-622)。当ATP与AMP的比率发生变化时，AMPK被活化并磷酸化下游靶标，从而将代谢重新导向增加的分解代谢和减少的合成代谢。AMPK充当针对能量应激和线粒体损伤的细胞反应的中心介质，并协调自噬和线粒体生物学的多种特征(参见Nature Reviews Molecular Cell Biology volume 19,第121–135页(2018))。在线粒体疾病和线粒体功能障碍相关疾病中，线粒体密度和/或功能降低。

在三种线粒体功能障碍动物模型中评估了sGC刺激剂对线粒体生物发生(PGC1α)和功能(AMPK，PPARα和PPARγ)的生物标志物的作用，所述三种模型为ZSF1大鼠(参见JASN(2007)18(11 2945-2952)、饮食诱发的肥胖(DIO)小鼠(参见PLoS ONE(2013)8(12):e81870)、四氯化碳(CCl

给动物喂食物或高脂饮食(Research Diets)。瘦小鼠保持标准的日常饮食。对肥胖小鼠,从6周龄开始进行60％高脂饮食(HFD)。允许所有动物自由饮水和吃食。该研究始于小鼠12周龄，并在4周(16周龄)后结束。肥胖对照组维持HFD。向接受化合物治疗的组喂食含有90mg化合物A/kg饮食(大约6mg/kg的剂量)或45mg vericiguat/kg饮食(大约3mg/kg的剂量)的HFD。每周两次测定体重，每天测量食物摄入量，持续28天。在最后一天(28天)，收集白色脂肪组织(WAT)和肝脏，称重并在液氮中速冻以进行进一步分析。

在DIO小鼠模型的另一项研究中，对肥胖小鼠进行了HFD治疗，其在饮食中含不同剂量的化合物B(38.8mg、128.6mg或386.2mg/kg饮食，约0.05mg/kg、3mg/kg和10mg/kg剂量)。在最后一天，收集下丘脑，将其速冻在液氮中以进行进一步分析。

研究设计中有4组动物：

1.ZSF1瘦-媒介物(n＝6)

2.ZSF1肥胖-媒介物(n＝9)

3.ZSF1肥胖–化合物A 10mg/kg/天(n＝9)

4.ZSF1肥胖-依那普利3mg/kg/天+化合物A 10mg/kg/天(n＝9)

将第4组的动物放在含有依那普利的饮用水上，并以Purina 5008啮齿动物食物(C13000)饲养。将1-3组的动物用Purina 5008啮齿动物食物和饮用水饲养。依那普利)开始治疗后10天，第3组和第4组分别以10mg/kg/天的剂量接受化合物A，分别持续11周(单一疗法)。从第10天开始，第3组和第4组的动物除依那普利外还接受10mg/kg/天的化合物A，再持续11周(组合疗法)。

在另一项针对ZSF1大鼠的研究中，按照与上述用化合物A的研究相同的方案，对肥胖大鼠单独用化合物D治疗(单一疗法)或用与依那普利(enalapril)的组合进行治疗(组合疗法)。

模型3：四氯化碳(CCl

在研究期间(8周)，向雄性Sprague-Dawley大鼠口服给药用玉米油稀释的0.25ml/kg的CCl

B-DNA测定

为了进行基因表达分析，将来自ZSF1大鼠肝脏、CCl

体内动物模型的结果

通过B-DNA测定进行的基因表达谱分析表明，PGC1α(调节参与能量代谢的基因的“主开关”)在ZSF1大鼠和DIO小鼠的疾病病症中显著降低(图1)。用sGC刺激剂即10mg/kg的化合物A或30mg/kg的化合物D与3mg/kg的依那普利(enalapril)组合治疗ZSF1肥胖大鼠分别增加了白色脂肪组织(WAT)和肝脏中PGC1α的基因表达水平(图1A和1B)。另外，化合物B显著增加在DIO小鼠下丘脑中的PGC1α表达(图1C)。

除PGC1α外，DIO小鼠和CCl

实施例2-

LHON患者的淋巴母细胞(GM11605和GM10742)和利氏病患者的淋巴母细(GM13740)胞购自Coriell研究所，并根据供应商推荐的生长条件进行培养。培养基RPMI-1640(ATCC，Catalog#30-2006)含有15％胎牛血清(Corning Catalog#35-015-CV)。

在测定当天，将Coriell细胞以每孔200,000个细胞于100ul培养基中的密度接种在96孔V型底培养皿(Corning Catalog#3894)上。即将测定之前，通过在台式离心机(Beckman Model#TJ-25)中以300g离心5分钟将细胞快速离心，除去培养基，并用200μL含Ca

将Corielll细胞以每孔200,000个细胞于含有2％FBS的90ul RPMI-1640培养基的密度接种在96孔V型底培养皿中。三小时后，以每孔10μL将在含2％FBS的RPMI-1640培养基中稀释的10x化合物(以最终浓度)添加到细胞中，并在37℃下孵育24小时。第二天，使用ATPlite试剂盒(PerkinElmer Cat#6016943)测量细胞中的ATP水平。

将Coriell细胞以每孔200,000个细胞于含2％FBS的90ul RPMI-1640培养基的密度接种在96孔V型底培养皿中。三小时后，以每孔10μL将在含2％FBS的RPMI-1640培养基中稀释的10x化合物(最终浓度)添加到细胞中，并在37℃下孵育24小时。第二天，通过在台式离心机(Beckman型号TJ-25)中以300g离心5分钟将细胞快速离心，除去培养基，并用QuantiGene样品处理试剂盒(Affymetrix catalog#QS010)提供的溶解混合物以100μL/孔溶解细胞沉淀物。根据制造商的方案，使用QuantiGene 2.0Plex分析试剂盒(Affymetrixcatalog#QP1013)和多重基因板(Thermo/Fisher，plex set#QGP-150-M19022101)测量细胞溶解物中的基因表达。使用Luminex MAGPIX

用化合物E与DETA的组合刺激LHON和利氏病患者的细胞，这显著活化了cGMP的形成，证实了sGC在这些细胞中的功能性表达，以及化合物E充当sGC的刺激剂。(图3A-C)

LHON患者细胞GM11605和GM 10742以及利氏病患者细胞GM13740中的ATP水平显著低于健康细胞GM 00333中的ATP水平(图4A)。用化合物E(单独或与DETA组合)刺激GM11605和GM13740显著增加了ATP产生(未测试GM10742)(图4B)。用化合物B(单独或与DETA组合)刺激GM11605、GM10742和GM13740增加了ATP的产生(图4C)。仅在GM13740细胞中测试了化合物D，它显著提高了ATP水平(图4D)。这些结果表明sGC刺激剂能够改善这些患者细胞中的ATP危象。PF-06409577是AMPK活化剂，在测定中作阳性对照。FCCP为电子转运链(ETC)的化学解偶联剂，在测定中作阴性对照。

通过B-DNA测定的基因表达谱分析确定了LHON患者细胞(GM11605，图5A-B)和利氏病患者细胞(图6A-B)中多个线粒体基因(包括TFAM和DDAH2)的表达水平。这些基因编码线粒体中负责ATP产生的基本成分。

TFAM是存在于线粒体中的表达丰富的蛋白，其是线粒体转录和调节mtDNA的拷贝数所必需的，因此对于维持ATP的生产非常重要(Alvarez，V等人，2008，引言)。TFAM还通过以非序列特异性方式与mtDNA结合来保护mtDNA免受氧化应激(Kanki等人，2004)。过去的实验发现，在包含G11778A LHON突变的细胞株中引入重组TFAM的会增加基础呼吸(Iyer，S等人2009Mitochondrion)。此外，在一项体内研究中，Iyer等人将重组TFAM注射到成年小鼠的尾静脉中，并分析了运动耐力和线粒体呼吸的增加。在治疗的小鼠中观察到脑和肌肉线粒体中线粒体复合体I呼吸的显著增加(Iyer S等人，2009)。

线粒体疾病中氧化应激增加的后果之一是DDAH2活性的抑制(El-Hattab AW等人2012review molecular genetics第107卷)，该酶可降解不对称二甲基精氨酸(ADMA)。ADMA的增加可导致线粒体功能障碍(Sud N等人2008)，并且发现线粒体疾病患者中ADMA的水平升高(El-Hattab，AW等人2012Mol Genet metabolism第105卷)。DDAH2的抑制进一步加重了这些患者的线粒体疾病。

通过B-DNA测定的基因表达谱分析表明，在LHON患者细胞(GM11605)(图5A-B)和利氏病患者细胞(GM13740)(图6A-B)中，两个线粒体基因TFAM和DDAH2的表达水平显著降低。

在LHON患者细胞系中(图5A)和利氏病患者细胞系(图6A)中，在DETA存在下通过化合物B的刺激增加了TFAM。

在LHON患者细胞系中(图5B)和利氏病患者细胞系(图6B)中，在DETA存在下通过化合物B的刺激增加了DDAH2。

结论

sGC刺激剂增加患者细胞中的TFAM mRNA水平。图5A和6A显示在利氏和LHON患者细胞中TFAM mRNA降低，而用sGC刺激剂治疗增加了这些细胞中TFAM mRNA的水平。在用sGC刺激剂治疗过的患者细胞中测到TFAM mRNA的增加，这表明sGC刺激剂可以增加线粒体疾病患者细胞中TFAM的水平，并可改善线粒体的呼吸作用。这些数据表明增加的TFAM可以改善线粒体呼吸并减轻代表线粒体疾病的能量危象(即，ATP危象)。

sGC刺激剂增加患者细胞中DDAH2 mRNA的水平。图6B和6B显示在线粒体疾病患者细胞中，sGC刺激剂治疗增加DDAH2 mRNA的水平。DDAH途径的上调有望降低线粒体疾病患者的ADMA水平并降低在这些患者中氧化应激的有害作用。sGC刺激剂praliciguat(化合物A)的临床研究结果表明，用praliciguat治疗糖尿病患者降低了循环的ADMA的水平(HanrahanJP等人，Fourteen-day study of praliciguat,a soluble guanylate cyclasestimulator,in patients with diabetes and hypertension.Diabetes.2018年7月；67(增刊1)，摘要编号74-OR)。

其他实施方案

本公开中提及的所有公开(publications)和专利都以相同的程度通过引用并入本文，就好像每个单独的公开或专利申请均被具体地和单独地指示通过引用并入一样。如果通过引用并入的任何专利或公开中的术语的含义与本公开中使用的术语的含义相抵触，则以本公开中的术语的含义为准。此外，前述讨论仅公开和描述了本发明的示例性实施方案。本领域技术人员将从这样的讨论以及从附图和权利要求书中容易地认识到，可以在其中进行各种改变、修改和变化，而不背离如所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。多个实施方案已经被描述。然而，将可理解的，可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下进行各种修改。