制造环状骨移植替代物的方法

摘要

提供一种制造环状骨移植替代物的方法。所述制造环状骨移植替代物的方法包括：可生物降解聚合物提供步骤，提供可生物降解聚合物；模制材料提供步骤，提供其中所述可生物降解聚合物与骨材料混合的模制材料；模制材料注射步骤，将所述模制材料注射到环状模具中使得在其中心处形成洞；以及环状骨移植替代物模制步骤，在低于预定参考温度的温度下冷冻干燥已被注射到所述环状模具中的所述模制材料，从而将所得物模制成环状骨移植替代物。

说明书

技术领域

本发明概念涉及一种制造环状骨移植替代物的方法，且更具体来说，涉及一种可显著缩短植入物治疗周期、并且具有足以牢固固定植入物螺钉的强度的制造环状骨移植替代物的方法。

背景技术

骨移植替代物（bone grafting substitute，BGS）是一种移植替代物，所述移植替代物用于填充骨组织中的空间，并通过替代骨组织中由于各种牙科疾病或创伤、疾病引起的退化或其他组织损失而产生的缺失部分来促进新骨的形成。

详细来说，当在植入物治疗期间骨的品质差或骨量不足时，或者当牙槽骨由于牙周炎而被破坏或丧失时，可能无法立即放置植入物，因此增加牙槽骨的治疗是必要的。因此，当有必要进行骨生成（骨组成）时，可实行引导骨再生（guided bone regeneration，GBR）或骨移植（bone grafting）。

BGS可包括骨衍生BGS及合成BGS。骨衍生BGS可包括自体骨、同种异体骨及异种骨。自体骨的缺点在于不方便实行手术且吸收太快。相比之下，同种异体骨移植有可能引起免疫反应以及病毒和疾病感染。对于人工制造的合成骨的情况来说，虽然不存在病毒及疾病感染的可能性，但与骨衍生骨相比，骨再生性降低且吸收过快。为了解决上述缺点，使用了从具有类似于人骨结构的动物骨中衍生的异种BGS。

当通过上述GBR完成牙槽骨再生时，通过二次手术放置植入物，在所述二次手术中切割牙龈并插入植入物螺钉。由于牙槽骨的再生需要约6个月来完成，并且植入物放置是在二次手术中实行的，因此从牙槽骨再生到植入物放置需要很长时间。

为了解决上述问题，需要一种方法，所述方法可通过将植入物插入到首先插入的螺钉中而无需进行二次治疗来显著缩短实行植入物治疗的时间，这不同于通过以下方式进行的实行二次手术的传统方法：从口腔的牙周组织移除牙齿，将BGS放置在移除了牙齿的牙周组织的空腔中，将植入物螺钉插入其中，然后通过在上面用膜覆盖植入物螺钉来缝合空腔，并且当牙槽骨再生完成时，切割牙龈并将植入物螺钉插入其中。

发明内容

技术问题

本发明概念提供了一种制造环状骨移植替代物的方法，其中骨移植替代物具有环形形状，使得通过同时实行骨移植替代物的植入及植入物的放置，可显著缩短植入物治疗周期，并且骨移植替代物可具有足以牢固固定植入物螺钉的强度。

技术解决方案

根据本发明概念的方面，一种制造环状骨移植替代物的方法包括：可生物降解聚合物提供步骤，提供可生物降解聚合物；模制材料提供步骤，通过将所述可生物降解聚合物与骨材料混合来提供模制材料；模制材料注射步骤，将所述模制材料注射到具有环形（ring）形状的环状模具（mold）中以在中心处形成洞（hole）；以及环状骨移植替代物模制步骤，通过在低于预定参考温度的温度下，冷冻干燥注射到所述环状模具中的所述模制材料来模制具有环形形状的环状骨移植替代物。

所述方法可在所述环状骨移植替代物模制步骤之后，还包括环状骨移植替代物热空气干燥步骤，所述步骤通过使用热空气来干燥已被完全模制的所述环状骨移植替代物。

所述方法可在所述环状骨移植替代物热空气干燥步骤之前，还包括：环状骨移植替代物切割步骤，以单元大小切割所述环状骨移植替代物；以及脱水（dehydration）步骤，移除所述环状骨移植替代物中包含的水分。

所述可生物降解聚合物可包含胶原，所述胶原包括来自猪韧带的胶原，并且提供所述胶原的胶原提供步骤可包括：猪韧带预处理步骤，对所述猪韧带进行预处理，以从所述猪韧带获得胶原；胶原团状物模制步骤，将经预处理的猪韧带模制为胶原团状物；均质化步骤，将所述胶原团状物溶解在溶剂中以产生均质化的胶原溶液；以及胶原过滤步骤，从所述均质化的胶原溶液中过滤胶原。

所述猪韧带预处理步骤可包括：从所述猪韧带至少移除血管及脂肪的步骤；将至少移除了血管及脂肪的所述猪韧带溶解在10%异丙醇（iso-propyl alcohol，IPA）水溶液中的步骤；通过使溶液固化而提供固化的猪韧带的步骤，其中所述猪韧带在低于预定参考温度的温度下溶解；以及将所述固化的猪韧带切割成预定大小的步骤。

所述胶原团状物模制步骤可包括：将所述经预处理的猪韧带加入到溶解有胃蛋白酶（pepsin）的3%乙酸水溶液中、并使用斯蒂芬混合器（stephan mixer）混合（mixing）所得物的步骤；通过向混合溶液中加入3%乙酸水溶液并搅拌所述所得物5到7分钟来提供第一混合物的步骤；通过使用压力机从通过所述搅拌获得的所述第一混合物中移除液体来提供第一团状物的步骤；通过将所述第一团状物加入到通过将Na

所述胶原过滤步骤可包括：对所述均质化的胶原溶液进行离心的步骤；以及通过移除在所述离心后产生的上清液而获得胶原的步骤。

所述可生物降解聚合物可包含胶原，所述胶原包括来自猪皮的胶原，并且提供所述胶原的胶原提供步骤包括：猪皮预处理步骤，对所述猪皮进行预处理以从所述猪皮中获得胶原；均质化步骤，将所述经预处理的猪皮溶解在溶剂中以产生均质化的胶原溶液；以及胶原过滤步骤，从所述均质化的胶原溶液中过滤胶原。

所述猪皮预处理步骤可包括：将冷冻猪皮切割成预定大小的步骤；通过将切割的猪皮加入丙酮（acetone）中并搅拌所述所得物来移除脂肪的步骤；以及通过用蒸馏水洗涤移除了脂肪的猪皮来移除丙酮的步骤。

所述胶原过滤步骤可包括：对所述均质化的胶原溶液进行离心的步骤；将从所述离心产生的沉淀物溶解在HCL水溶液中的步骤；以及通过减压过滤上清液获得胶原的步骤，所述上清液是通过对将所述沉淀物溶解在所述HCL水溶液中获得的溶液进行离心而产生的。

所述胶原可包含交联胶原，所述交联胶原被交联以具有交联结构，且所述方法还可在所述胶原过滤步骤之后包括：原纤化缓冲液混合步骤，提供通过将从所述胶原过滤步骤获得的所述胶原与原纤化缓冲液（fibrillation buffer）混合而获得的混合溶液，所述原纤化缓冲液相对于100重量份的水具有20到30重量份的氯化钠（sodium chloride）、1到3重量份的氢氧化钠（sodium hydroxide）、以及3到5重量份的磷酸氢二钠二水合物（di-sodium hydrogen phosphate dihydrate）；凝胶（gel）状态改变步骤，通过将所述混合溶液与γ-PGA混合并将所述所得物放入孔板（well plate）中以在培养箱中改变为凝胶状态来提供凝胶状态的混合物；交联反应处理步骤，通过将所述凝胶状态混合物与交联溶液（crosslinking solution）混合以诱发交联反应来形成交联胶原；洗涤步骤，洗涤在所述交联反应处理步骤中混合的所述交联溶液；交联处理后均质化步骤，将所述交联胶原溶解在溶剂中以产生均质化的交联胶原溶液；以及交联胶原过滤步骤，从所述均质化的交联胶原溶液中过滤交联胶原。

所述洗涤步骤可包括：通过将所述交联胶原撕裂成小片并将所述所得物加入15%乙醇水溶液中来提供第一混合物的步骤；通过搅拌所述第一混合物并减压过滤所述所得物来提供滤液的步骤；通过将所述滤液撕裂成小片并将所述所得物加入15%乙醇水溶液中来提供第二混合物的步骤；以及搅拌所述第二混合物并减压过滤所述所得物的步骤。

所述可生物降解聚合物可包括选自纤维蛋白原、脱乙酰壳多糖、明胶、纤维素、透明质酸、葡聚糖、交联胶原、交联纤维蛋白原、交联脱乙酰壳多糖、交联明胶、交联纤维素、交联透明质酸、交联葡聚糖中的任何一者，所述成分被交联以具有交联结构、聚己内酯、聚乳酸、聚乙醇酸以及乳酸及乙醇酸的共聚物。

所述骨材料可包括选自牛骨、马骨及猪骨中的任何一种异种骨。

所述骨材料可包括人工合成的合成骨。

在所述模制材料提供步骤中，可将所述骨材料与所述可生物降解聚合物混合使得骨材料/可生物降解聚合物的重量比为60/40到95/5。

所述可生物降解聚合物可包含胶原，并且所述骨材料与所述胶原可混合使得骨材料/胶原的重量比为80/20到95/5。

在所述环状骨移植替代物中，所述环形形状可具有2 mm到4 mm的厚度。

在所述环状骨移植替代物中，所述中心处的所述洞可具有3 mm到8 mm的直径及4mm到10 mm的高度。

有利效果

根据本发明概念的实施例，由于模制了环状骨移植替代物，骨移植替代物的植入及植入物的放置可同时实行。因此，可显著缩短无需进行二次手术操作的植入物治疗周期。

此外，由于通过混合胶原及骨材料来模制环状骨移植替代物，因此可制造强度足以牢固固定植入物螺钉的环状骨移植替代物。

附图说明

图1是根据本发明概念实施例的环状骨移植替代物的透视图。

图2是根据本发明概念实施例的使用环状骨移植替代物的骨植入手术过程。

图3是依序示出根据本发明概念第一实施例的制造环状骨移植替代物的方法的流程图。

图4是依序示出根据本发明概念第一实施例的从猪韧带提供胶原的胶原提供步骤的流程图。

图5是依序示出图4的胶原团状物模制步骤的流程图。

图6是依序示出根据本发明概念第二实施例的从猪皮提供胶原的胶原提供步骤的流程图。

图7是依序示出根据本发明概念交联胶原的第三实施例的提供交联胶原的胶原提供步骤的流程图。

具体实施方式

为了充分理解本发明概念的操作优点及通过实施本发明概念实现的目标，参考了例示本发明概念的优选实施例及附图中描述的内容的附图。

在下文中，将通过参照附图解释本发明概念的优选实施例来详细描述本发明概念。附图中相同的参考编号指示相同的元件。

图1是根据本发明概念实施例的环状骨移植替代物的透视图。

图2是根据本发明概念实施例的使用环状骨移植替代物的骨植入手术过程。

如图所示，根据本发明概念的实施例的环状骨移植替代物1在其中心处具有直径为R的洞，并且具有环形形状，其中环形形状的厚度为T并且高度为H。

由于环状骨移植替代物1被模制成具有环形形状（不同于通过以下方式进行的实行二次手术操作的传统方法：将环状骨移植替代物1放置在口腔中的牙周组织取出牙槽（从其取出牙齿的牙周组织的空腔）中，将植入物螺钉插入环状骨移植替代物1的中心洞中，用膜覆盖牙槽并缝合空腔，并且当牙槽骨再生完成时，切割牙龈以插入植入物螺钉），通过将植入物插入已被插入的植入物螺钉中，可显著缩短植入物治疗的时间，而无需进行二次手术操作。

在此来说，参照图2，在步骤（a）中，在取出牙齿之后，将根据本发明概念的实施例制造的环状骨移植替代物1插入牙槽骨被破坏的洞中；在步骤（b）中，将植入物螺钉2插入并固定在环状骨移植替代物1的中心洞中；在步骤（c）中，用膜3覆盖手术部位；在步骤（d）中，缝合牙龈以完成治疗；且在步骤（e）中，在牙槽骨再生完成后，将植入物插入螺钉部分中，从而完成治疗。

因此，当通过使用环状骨移植替代物实行骨植入手术时，骨移植替代物的植入及植入物螺钉的放置可同时实行，因此不需要用于放置植入物螺钉的二次手术操作，从而显著缩短了植入物治疗周期。

在这种状态下，环状骨移植替代物1的厚度T可以是1.5 mm到5 mm。当厚度小于1.5mm时，可能无法保持环形性状。由于在植入物周围没有产生具有适当厚度的骨，因此可能无法放置植入物。

此外，当厚度为5 mm或大于5 mm时，移植替代物的大小过大，使得在使用期间可能出现不便。

因此，环状骨移植替代物1的环形形状的厚度T根据取出牙槽的形状及深度来模制。根据本实施例，环形形状的厚度T可以是2 mm到4 mm。

环状骨移植替代物1的中心洞的直径R可以是3 mm到8 mm。当直径R小于3 mm时，可能无法插入植入物螺钉，并且当直径R为8 mm或大于8 mm时，可能无法保持环状骨移植替代物1的强度，使得可能无法固定植入物螺钉。

因此，环状骨移植替代物1的中心洞的直径R可根据所使用的植入物螺钉的厚度使用牙科切割工具来调整。根据本实施例，中心洞的直径R可以是3 mm到8 mm。

环状骨移植替代物1的高度可根据取出牙槽的形状及深度进行调整。根据本实施例，环状骨移植替代物1的高度可以是4 mm到10 mm。

图3是依序示出根据本发明概念第一实施例的制造环状骨移植替代物的方法的流程图。

图4是依序示出根据本发明概念第一实施例的从猪韧带提供胶原的胶原提供步骤的流程图。

图5是依序示出图4的胶原团状物模制步骤的流程图。

如图所示，根据本发明概念第一实施例的制造环状骨移植替代物的方法M1可包括胶原提供步骤S100a、模制材料提供步骤S200、模制材料注射步骤S300、环状骨移植替代物模制步骤S400、环状骨移植替代物切割步骤S500、脱水步骤S600及环状骨移植替代物热空气干燥步骤S700。

首先，在胶原提供步骤S100a中，提供将作为模制材料与下文描述的骨材料混合的胶原。

胶原是可生物降解聚合物中的一种，例如可对其使用胶原、纤维蛋白原、脱乙酰壳多糖、明胶、纤维素、透明质酸、葡聚糖等、交联胶原、交联纤维蛋白原、交联脱乙酰壳多糖、交联明胶、交联纤维素、交联透明质酸、交联葡聚糖，所述成分被交联以具有交联结构、聚己内酯、聚乳酸、聚乙醇酸以及乳酸及乙醇酸的共聚物等。

在本发明概念的实施例中，主要描述了使用胶原的情况。然而，本公开不限于此，且除了胶原之外，可使用以上举例说明的其他可生物降解聚合物。

作为构成人体组织及器官的结构蛋白质，胶原是结缔组织的主要组分，且指由例如甘氨酸、脯氨酸等约18种氨基酸构成的动物纤维蛋白质。对人类来说，胶原是一种特殊结构蛋白质，在构成人体的5,000种蛋白质中，其占比最多达35%。

具体来说，胶原存在于皮肤、骨及肌腱中，并且具有各种氨基酸以多肽的形式结合并扭曲成三股的形状，并且其分子量非常大，约为300,000。

根据动物的种类、部位及类型，有各种类型的胶原，并且各种胶原不仅具有不同的特性，而且具有不同的生物分子或构成蛋白质的成分等。因此，可使用必然适合于人体的胶原。

源自猪的胶原可用作这种胶原。

源自猪的胶原是指从例如猪皮等组织中取出的胶原。猪没有疯牛病等问题的危险，且猪的基因序列与人类相似，因此猪被用作各种替代物材料。当使用源自猪的胶原中具体来说来源于猪韧带的胶原时，所述胶原表现出优异的机械特性，例如拉伸强度等。

源自猪的胶原可由猪的皮肤（skin）、肌腱（tendon）、尾巴（tail）等制造而成，且具体来说，可由1,3型（type 1,3）胶原构成，所述1,3型胶原没有气味及颜色并且具有类似于人体的结构。

此外，源自猪的胶原可安全地抵抗致病性病原体（pathogenic infectiousagent），例如其他动物（疯牛病、EBS等）、人类尸体（艾滋病（Acquired Immune DeficiencySyndrome，AIDS）病毒）等。源自猪的胶原可具有约7.0的酸碱度（pH值）、约2000的分子量以及优于现有材料的拉伸强度及伸长率。此外，源自猪的胶原的总蛋白质量可具有99.9%的纯度、25 mps或大于25 mps的粘度及0.35到0.39的比重。

源自猪的胶原可包括来自猪韧带的胶原、来自猪皮的胶原及交联以具有交联结构的交联胶原。根据本发明概念的第一实施例，来自猪韧带的胶原可使用从猪韧带提供胶原的方法来提供。以下在其他实施例中描述了从猪皮中提供胶原及提供交联胶原的方法。

首先，从猪韧带提供胶原的胶原提供步骤S100a可包括如在图4及图5中详细例示的猪韧带预处理步骤S110a、胶原团状物模制步骤S120、均质化步骤S130a及胶原过滤步骤S140a。

作为预处理猪韧带以从猪韧带获得胶原的步骤，猪韧带预处理步骤S110a可包括：从猪韧带中至少移除血管及脂肪的步骤S111a；将至少移除了血管及脂肪的所述猪韧带溶解在10%异丙醇（IPA）水溶液中的步骤S112a；通过使溶液固化而提供固化的猪韧带的步骤S113a，其中所述猪韧带在低于预定参考温度的温度下溶解；以及将所述固化的猪韧带切割成预定大小的步骤S114a。

作为将经预处理的猪韧带模制成胶原团状物的步骤的胶原团状物模制步骤S120可包括：将所述经预处理的猪韧带加入到溶解有胃蛋白酶的3%乙酸水溶液中、并使用斯蒂芬混合器混合所得物的步骤S121；通过向混合溶液中加入3%乙酸水溶液并搅拌所述所得物5到7分钟来提供第一混合物的步骤S122；通过使用压力机从通过所述搅拌获得的所述第一混合物中移除液体来提供第一团状物的步骤S123；通过将所述第一团状物加入到通过将Na

在作为将胶原团状物溶解在溶剂中以获得均质化的胶原溶液的步骤的均质化步骤S130a中，均质化的胶原溶液可通过使用斯蒂芬混合器用10%乙醇水溶液搅拌从胶原团状物模制步骤S120获得的胶原团状物并使用微流化器（microfluidizer）均质化所得物来获得。

作为从均质化的胶原溶液过滤胶原的步骤的胶原过滤步骤S140a可包括对所述均质化的胶原溶液进行离心的步骤S141a、以及通过移除在所述离心后产生的上清液而获得胶原的步骤S142a。

模制材料提供步骤S200是通过在胶原中混合骨材料来提供模制材料的步骤。

在这种状态下，骨材料可以是选自牛骨、马骨及猪骨中的任何一种异种骨，并且可使用由基于陶瓷（ceramic）等的材料人工合成的合成骨。

在通过混合胶原及骨材料来提供模制材料时，待混合的胶原及骨材料的重量比与环状骨移植替代物的抗压强度有关。

当包含上述胶原的可生物降解聚合物与骨材料混合时，骨材料与可生物降解聚合物可混合使得骨材料/可生物降解聚合物的重量比为60/40到95/5，并且当可生物降解聚合物是胶原时，骨材料与胶原可混合使得骨材料/胶原的重量比为80/20到95/5。

表1示出以实验方式获得的、骨移植替代物根据骨材料及胶原的重量比的抗压强度。如表所示，当骨材料/胶原的重量比为90/10时，抗压强度最强。

[表1]

因此，根据本发明概念，由于通过调整骨材料与胶原的重量比来混合骨材料及胶原以模制环状骨移植替代物，因此可制造强度足以牢固固定植入物螺钉的环状骨移植替代物。

在这种状态下，已通过胶原过滤步骤S140a的胶原是使用离心方法获得的沉淀物，并且处于固态，并且所述胶原被加入到10% IPA水溶液中，使用均化器（homogenizer）搅拌，然后与骨材料混合，从而提供模制材料。

模制材料注射步骤S300是将模制材料注射到具有环形形状的环状模具中以在其中心处形成洞的步骤。

环状骨移植替代物模制步骤S400是通过在低于预定参考温度冷冻干燥的温度下冷冻干燥注射到环状模具中的模制材料来模制具有环形形状的环状骨移植替代物的步骤。

环状骨移植替代物切割步骤S500是以单元大小切割环状骨移植替代物1的步骤。

当通过改变环状模具的形状将环状模具模制成在环状骨移植替代物1的高度H方向上为长时，可通过以期望高度H的单元大小来切割环状模具而模制多个环状骨移植替代物1，并且可模制各自具有不同高度H的多个环状骨移植替代物1。

脱水步骤S600是移除环状骨移植替代物1中包含的水分的步骤。在这种状态下，通过使用90%乙醇实行脱水，可通过冷冻干燥移除存留在环状骨移植替代物模制步骤S400中的任何水分。

环状骨移植替代物热空气干燥步骤S700是通过使用热空气干燥已被完全模制的环状骨移植替代物的步骤。在本实施例中，步骤S700在70℃下实行约18小时，但本公开不限于此，并且所述温度及时间可根据干燥条件而变化。

在以下说明中，描述了通过根据本发明概念第一实施例的制造环状骨移植替代物的方法来制造环状骨移植替代物的工艺，所述方法包括上述步骤。

在阐述1 kg的猪韧带作为标准时，首先通过修剪（trimming）移除血管、脂肪等，并将猪韧带浸入3.45 kg的65% IPA水溶液中达5分钟，用3.35 kg的纯水洗涤，并在-80℃下固化。用切片机（slicer）切割固化的韧带，使得完成猪韧带的预处理。

接下来，将3 kg的3%乙酸水溶液（其中溶解了2 g胃蛋白酶）及切割的韧带放入斯蒂芬混合器中并搅拌6分钟，将3,500 kg的3%乙酸水溶液放入其中并搅拌6分钟，并用压力机对混合物进行了按压，从而从中移除液体。

将获得的团状物与通过将53.6 g Na

接下来，将胶原团状物与5.5 kg的10%乙醇水溶液一起放入斯蒂芬混合器中，搅拌6分钟，并通过微流化器均质化。

接下来，将3.5 kg的10% IPA水溶液加入到通过移除离心后的上清液获得的胶原中，通过均化器搅拌混合物，并将130 g的骨材料与混合物混合，从而提供模制材料。

接下来，将模制材料倒入环状模具中，然后冷冻干燥，使得骨移植替代物可模制为环形形状。

接下来，根据期望的高度H切割冷冻干燥的环状骨移植替代物，用90%乙醇脱水，用70℃的热空气干燥了18小时，因此完成了制造环状骨移植替代物的工艺。

因此，根据本实施例，由于模制了具有环形形状的环状骨移植替代物，骨移植替代物的植入及植入物的放置可同时实行，因此不必要进行用于植入物放置的二次手术操作，使得可显著缩短植入物治疗周期。

此外，由于通过混合胶原及骨材料而模制了环状骨移植替代物，因此可制造强度足以牢固固定植入物螺钉的环状骨移植替代物。

图6是依序示出根据本发明概念第二实施例的从猪皮提供胶原的胶原提供步骤的流程图。

根据依据本发明概念第二实施例的制造环状骨移植替代物的方法M2，当与第一实施例比较时，在胶原提供步骤S100b中的不同之处在于提供来自猪皮的胶原而不是来自猪韧带的胶原。由于在制造环状骨移植替代物的其他步骤中没有区别，因此主要描述胶原提供步骤S100b。

从猪皮提供胶原的胶原提供步骤S100b可包括如在图6中详细例示的猪皮预处理步骤S110b、均质化步骤S130b及胶原过滤步骤S140b。

作为预处理猪皮以从猪皮获得胶原的步骤的猪皮预处理步骤S110b可包括将冷冻猪皮切割成预定大小的步骤S111b、通过将切割的猪皮加入丙酮并搅拌所得物来移除脂肪的步骤S112b、以及通过用蒸馏水洗涤移除了脂肪的猪皮来移除丙酮的步骤S113b。

在本实施例中，在将冷冻的猪皮解冻并切成2 cm×2 cm的正方形后，将切好的皮片（skin piece）放入丙酮中，搅拌两小时，所述搅拌进行两次以移除脂肪，并用蒸馏水洗涤五次以移除丙酮。

均质化步骤S130b是将预处理的猪皮溶解在溶剂中以产生均质化的胶原溶液的步骤。在本实施例中，经预处理的猪皮片通过被放入3 mm HCl （pH 2.7）水溶液中到3%而被均质化。

作为从均质化的胶原溶液中过滤胶原的步骤的胶原过滤步骤S140b可包括对均质化的胶原溶液进行离心的步骤S141b、将从所述离心产生的沉淀物溶解在HCL水溶液中的步骤S142b、以及通过减压过滤上清液获得胶原的步骤S143b，所述上清液是通过对将所述沉淀物溶解在HCL水溶液中获得的溶液进行离心而产生的。

在本实施例中，将均质化的水溶液在4℃下搅拌1天，并将通过在40,000 g的条件下在4℃下离心1小时获得的沉淀物放入3 mm HCl中。

接下来，将溶液在4℃下搅拌3天，并在27,000 g的条件下在4℃下离心了1小时，然后用滤纸（filter paper）减压过滤上清液，从而获得胶原。

此后，将通过减压过滤获得的来自猪皮的胶原与骨材料混合，因此以与第一实施例相同的方式制造了环状骨移植替代物。

图7是依序示出根据本发明概念交联胶原的第三实施例的提供交联胶原的胶原提供步骤的流程图。

根据依据本发明概念第三实施例的制造环状骨移植替代物的方法M3，本实施例与第一实施例及第二实施例的不同之处在于在胶原提供步骤S100c中提供交联胶原。由于制造环状骨移植替代物的其他步骤是相同的，因此主要描述胶原提供步骤S100c。

当使用具有交联结构的交联胶原时，可获得具有例如拉伸强度等优异机械特性的环状骨移植替代物。

如图7中详细所示，在本发明概念的第一实施例的胶原提供步骤S100a之后，提供交联胶原的胶原提供步骤S100c还可包括原纤化缓冲液混合步骤S151、凝胶状态改变步骤S152、交联反应处理步骤S153、洗涤步骤S154、交联处理后均质化步骤S155及交联胶原过滤步骤S156。

然而，本公开不限于此，并且原纤化缓冲液混合步骤S151、凝胶状态改变步骤S152、交联反应处理步骤S153、洗涤步骤S154、交联处理后均质化步骤S155及交联胶原过滤步骤S156可在本发明概念的第二实施例的胶原提供步骤S100b之后进一步提供。

换句话说，在提供选自来自猪韧带的胶原及来自猪皮的胶原中的任何一种胶原之后，可通过实行交联反应处理来获得交联胶原。

首先，在原纤化缓冲液混合步骤S151中，通过将从胶原过滤步骤S140a或S140b获得的胶原与原纤化缓冲液混合而获得混合溶液，所述原纤化缓冲液相对于100重量份的水具有20到30重量份的氯化钠、1到3重量份的氢氧化钠、以及3到5重量份的磷酸氢二钠二水合物。

接下来，在凝胶状态改变步骤S152中，将混合溶液与γ-PGA混合并放入孔板中以在培养箱中改变为凝胶状态，从而提供凝胶状态的混合物。在这种状态下，温度保持在4℃或小于4℃，同时保持真空状态，并保持1到2小时的脱气（degassing）状态。

接下来，在交联反应处理步骤S153中，将凝胶状态混合物与交联溶液混合以诱发交联反应，从而形成交联胶原。

接下来，作为洗涤在交联反应处理步骤中混合的交联溶液的步骤的洗涤步骤S154可包括：通过将交联胶原撕裂成小片并将所述所得物加入15%乙醇水溶液中来提供第一混合物的步骤S154a；通过搅拌所述第一混合物并减压过滤所得物来提供滤液的步骤S154b；通过将所述滤液撕裂成小片并将所述所得物加入15%乙醇水溶液中来提供第二混合物的步骤S154c；以及搅拌所述第二混合物并减压过滤所得物的步骤S154d。

根据洗涤步骤的结果，洗涤步骤S154可重复两次或更多次。

接下来，在交联处理后均质化步骤S155中，将交联胶原溶解在溶剂中以产生均质化的交联胶原溶液，将15%乙醇水溶液放入混合器中，将已通过洗涤步骤S154的减压过滤过滤的滤液撕裂成小片并放入混合器中，快速实行搅拌达10分钟，并且通过微流化器均质化混合物液体，从而获得均质化的交联胶原溶液。

接下来，在作为从均质化的交联胶原溶液中过滤交联胶原的步骤的交联胶原过滤步骤S156中，将从交联处理后均质化步骤S155获得的均质化的交联胶原溶液离心以移除上清液，从而获得交联胶原。

此后，将通过离心获得的交联胶原与骨材料混合，从而以与第一实施例及第二实施例相同的方法制造环状骨移植替代物。

如此一来，虽然已参照本公开的优选实施例具体示出并描述了本公开，但所属领域中的普通技术人员应理解，在不脱离由所附权利要求书界定的本发明概念的精神及范围的情况下，可在形式及细节上进行各种改变。优选实施例应仅被认为是描述性的，而不用于限制目的。因此，本发明概念的范围不由本发明概念的详细描述来界定，而是由所附权利要求书来界定，并且所述范围内的所有差异都将被解释为包括在本发明概念中。

工业实用性

本发明概念可用于医疗行业，特别是牙科行业。