菜豆金属蛋白酶PvFtsH2基因及其编码蛋白和应用

摘要

菜豆金属蛋白酶PvFtsH2基因及其编码蛋白和应用，涉及基因工程领域，具体涉及一种植物金属蛋白酶PvFtsH2基因及其编码蛋白和应用。本发明提供一种菜豆FtsH类金属蛋白酶PvFtsH2基因及其编码蛋白和应用。PvFtsH2基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明通过植物生理学和分子生物学方法，证实PvFtsH2基因在光抑制响应过程中发挥作用，该基因的突变导致光抑制条件下FV/FM值下降，叶绿素含量减少，D1蛋白积累。本发明在通过提高光能利用率增加菜豆产量方面具有重要的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种植物金属蛋白酶PvFtsH2基因及其编码蛋白和应用。

背景技术

菜豆生产是群体生产，菜豆产量也是指群体产量。提高菜豆产量的途径主要有两方面：一是提高根系的吸收作用，强大的根系和庞大的吸收表面积是维持地上茎、叶、花、果等器官所需要的水分和养分的根本；二是提高光合作用，豆科作物产量的90％来自光合作用，光合作用速率和效率的高低直接决定着到作物的产量，长期以来高光效育种都是作物光合研究和育种领域关注的热点。提高光能吸收、传导、转化的效率可以达到提高单产的目标。适宜的冠层结构可以增大光截获效率、提高冠层光合速率，是提高群体产量的关键因素。经过多年努力，国内外研究者已选育出一批高光效大豆品种(系)：如黑农41、黑农51等；高光效菜豆品种(系)：如大白鞭、鑫源六号等中小叶高光效型菜豆品种。

光是叶绿体发育和光合作用的必要因素，但在高光强条件下，光能超过光合系统所能利用的数量，植物光合作用的副产物

因此采用基因的手段影响豆科植物光能利用，进而提高豆科植物产量方面具有重要的理论及实际意义。

发明内容

本发明的目的是提供菜豆FtsH类金属蛋白酶PvFtsH2基因及其编码蛋白和应用。

本发明菜豆金属蛋白酶PvFtsH2基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

本发明菜豆金属蛋白酶PvFtsH2基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明菜豆金属蛋白酶PvFtsH2基因在调控豆科植物光抑制响应过程的应用。

进一步的，所述豆科植物为菜豆。

进一步的，所述PvFtsH2基因在光抑制条件下影响F

本发明的有益效果：

本发明在分子水平上首次成功地克隆出菜豆FtsH类金属蛋白酶PvFtsH2基因。

本发明通过植物生理学和分子生物学方法，证实PvFtsH2基因在光抑制响应过程中发挥作用，该基因的突变导致光抑制条件下F

附图说明

图1为在突变体库中筛选到田间种植幼苗死亡的突变体pvsl1；

图2为基于全基因组重测序设计的用于大龙1号和PI60234品种基因定位的124个分子标记的物理位置；

图3为利用F2代群体将PvSL1位点初定为在2号染色体PvM36至PvM37区段；

图4为PvSL1位点的精细定位于PvM355与PvM357之间53.7kb区段；

图5为利用IGV软件观察候选基因Phvul.002G190900在pvsl1突变体基因组中有1bp缺失；

图6为候选基因Phvul.002G190900的基因结构示意图及突变位点标识；

图7为系统进化树分析Phvul.002G190900基因属于FtsH家族基因；

图8为PvSL1与pvsl1蛋白质结构比较；

图9为PvSL1与pvsl1蛋白质亚细胞定位分析；

图10为在太阳光照射下萌发后6天的WT和pvsl1突变体幼苗；

图11为在太阳光照射下萌发后10天的WT和pvsl1突变体幼苗；

图12为在太阳光照射下萌发后14天的WT和pvsl1突变体幼苗；

图13为在太阳光照射下萌发后6天、10天和14天的WT和pvsl1突变体幼苗单叶叶绿素含量分析；

图14为在25μmol·m

图15为在75μmol·m

图16为在68.7-111.2μmol·m

图17为在25μmol·m

图18为在光抑制条件下pvsl1突变体的F

图19为在光抑制条件下pvsl1突变体叶片中细胞死亡面积；

图20为在25μmol·m

图21为在100μmol·m

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式菜豆金属蛋白酶PvFtsH2基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

具体实施方式二：本实施方式菜豆金属蛋白酶PvFtsH2基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

具体实施方式三：本实施方式菜豆金属蛋白酶PvFtsH2基因在调控豆科植物光抑制响应过程的应用。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三不同的是：所述豆科植物为菜豆。其它与具体实施方式三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式三不同的是：所述PvFtsH2基因在光抑制条件下影响F

下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：菜豆PvSL1位点的定位

一、利用

二、利用菜豆品种PI60234与能分离出pvsl1突变体的正常株杂交，获得10粒杂交粒，杂交粒自交后获得10个不同的F2群体，其中有一个F2群体分离出苗期致死突变株，且表型正常植株与苗期致死突变株的比率为3:1，说明pvsl突变体苗期致死的表型由单一基因隐性控制，如表1所示。

表1 F2代群体表型的分离比

三、利用CTAB方法提取菜豆品种大龙1号和PI60234的基因组，基因组重测序由安诺优达基因科技有限公司在IlluminaHiSeq仪器上进行。获得的Illuminasequencing短序列比对菜豆Phaseolus vulgarisv2.1参考基因组(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)利用NGSQToolkit和SpeedSeq软件获得大龙1号和PI60234基因组差异的插入/缺失序列。在获得的插入/缺失序列中选择209个位点，利用Primer 5设计引物，进行PCR验证。PCR反应条件如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸35S，共35循环，再72℃延伸10min，利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物大小在两个品种中存在差异的共124对引物，即有124个分子标记可以用于基因定位，124个分子标记的具体信息如表2所示。124个分子标记分布于菜豆11条染色体，如图2所示。

表2 124个分子标记的具体信息

四、利用CTAB方法提取F2群体中每个个体的基因组，利用124个分子标记对F2群体进行基因分型。PCR反应条件如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸35S，共35循环，再72℃延伸10min，利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物大小通过。基因分型的结果通过QTL IciMapping_4.0软件分析，结果显示候选基因定位于PvM36与PvM37基因区段上，如图3所示。

五、在PvM36与PvM37之间设计3个用于精细定位的分子标记，如表3所示。在200个F2:3代个体中，我们获得4个可用于基因精细定位的个体，进一步将PvSL1定位于PvM355与PvM357之间53.7kb的区段，如图4所示，该区段中包含5个基因：Phvul.002G190500、Phvul.002G190600、Phvul.002G190700、Phvul.002G190800、Phvul.002G190900和Phvul.002G191000。

表3用于精细定位的三个引物

六、利用IGV软件筛查上述5个基因，发现只有Phvul.002G190900的基因序列在大龙1号和pvsl1突变体中存在差异，如图5所示；在pvsl1突变体中Phvul.002G190900基因的第二个外显子中缺失1bp，如图6所示，说明Phvul.002G190900是PvSL1位点的最优候选基因。

七、在phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov)利用Phvul.002G190900蛋白序列比对拟南芥蛋白质组，发现与其相似性最高的是拟南芥FtsH2和FtsH8蛋白，如图7所示。进一步对Phvul.002G190900氨基酸序列与FtsH2和FtsH8氨基酸序列的相似性进行比较，发现Phvul.002G190900氨基酸序列与FtsH2氨基酸序列相似性最高，如表4所示，故将Phvul.002G190900基因命名为PvFtsH2基因。

表4 PvFtsH2氨基酸序列与FtsH2和FtsH8氨基酸序列相似性分析

实施例2：PvFtsH2和pvftsh2基因的克隆

一、以大龙1号及其突变体pvsl1突变体为材料，用购买自康维世纪公司的OminiPlant RNA试剂盒(CW25985)的操作手册提取叶片总RNA。

二、取1μg总RNA用于cDNA的合成，cDNA的合成操作按照购买自全式金公司的TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Sythesis SuperMix试剂盒(AT311-03)的使用手册进行，获得cDNA；

三、以获得的cDNA为模板通过正向引物F1与反向引物R1扩增PvFtsH2基因，通过正向引物F1与反向引物R2扩增pvftsh2基因，PCR反应条件如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸35S，共38循环，再72℃延伸10min，将PCR产物在ABI3130测序仪(ABI公司)上进行测序。测序结果表明菜豆PvFtsH2基因由2088个碱基组成，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO：1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO：2所示。pvsl1突变体中pvftsh2基因由1338个碱基组成，其核苷酸序列如序列表中的SEQ IDNO：3所示，其编码蛋白的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO：4所示。

正向引物F1：5'-ATGGCAGCATCATCTGCATG-3'

反向引物R1：5'-AACAGTGGCTGGTACTGGAG-3'

反向引物R2：5'-GGAGATTTGCAAGATCAG-3'

四、菜豆PvFtsH2蛋白由696个氨基酸组成，其氨基酸序列如序列表中的SEQ IDNO：2所示。pvsl1突变体中pvftsh2蛋白由461个氨基酸组成，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO：4所示。与PvFtsH2蛋白质序列相比pvftsh2蛋白序列缺少了C端235个氨基氨酸，这235个氨基氨酸包括了金属蛋白酶结构域，如图8所示，故影响了蛋白质功能。图8中的结构域由左起分别是：FtsH蛋白质跨膜结构域、ATP酶结构域和金属蛋白酶结构域。PvFtsH2突变并不影响pvftsh2蛋白的FtsH蛋白质跨膜结构域，故与pvftsh2蛋白PvFtsH2蛋白的亚细胞定位均位于叶绿体中，如图9所示。

实施例3：在自然光下培养pvsl1突变体幼苗死亡

一、挑选饱满的WT和pvsl1突变体种子于萌发器中，25℃萌发5天，将萌发后的种子移栽至盆钵中，盆钵置于自然日照条件下培养(室外晚间温度大于15℃)。分别在萌发后6天、10天和14天观察表型，发现萌发后6天WT和pvsl1突变体叶片几乎无差异，如图10所示；萌发后10天，pvsl1突变体叶有失绿表型，如图11所示；萌发后14天，pvsl1突变体幼苗萎蔫死亡，如图12所示。

二、分别测量WT和pvsl1突变体萌发后6天、10天和14天叶绿素含量。挑选饱满的WT和pvsl1突变体种子与萌发器中，25℃萌发5天，将萌发后的种子移栽至盆钵中，盆钵置于自然日照条件下培养(室外晚间温度大于15℃)。分别在萌发后6天、10天和14天取材测量叶绿素含量，方法如下：取0.2mg单叶材料，要求该0.2mg材料包含5个单株叶片，液氮冷冻磨碎后，放入20ml 80％丙酮溶液中，-20℃黑暗放置24小时，其中摇晃数次。取上清液，于分光光度计上测量663和445的吸光度，根据公式(20.2×A

实施例4：不同光强条件下培养WT和pvsl1突变体叶绿素含量比较

一、每种材料挑选饱满的种子于萌发器中，25℃萌发5天，将萌发后的种子移栽至盆钵中，人工气候培养箱(light：16h，dark：8h)25℃进行培养。培养箱的光照强度分别为25μmol·m

二、在三种不同强下培养20天后，观察WT和pvsl1突变体单叶，发现在25μmol·m

三、在三种不同强下培养10天后，测量WT和pvsl1突变体单叶的叶绿素含量，方法如下：取0.2mg单叶材料，要求该0.2mg材料包含5个单株叶片，液氮冷冻磨碎后，放入20ml80％丙酮溶液中，-20℃黑暗放置24小时，其中摇晃数次。取上清液，于分光光度计上测量663和445的吸光度，根据公式(20.2×A

实施例5：WT和pvsl1突变体对光抑制的响应

一、每种材料挑选饱满的种子于萌发器中，25℃萌发5天，将萌发后的种子移栽至盆钵中，人工气候培养箱(light：16h，dark：8h)，25μmol·m

二、培养10天后，将幼苗转移至光抑制条件：人工气候培养箱(连续光照)，100μmol·m

三、在光抑制条件下培养72小时后，用台盼蓝染色液对WT和pvsl1突变体叶片进行染色，结果显示在pvsl1突变体叶片中，有更多的细胞死亡，如图19所示。在光抑制条件下pvsl1突变体叶片中细胞死亡数目增多。

实施例6：D1蛋白稳定性分析

检测在高光强和低光强培养条件下，WT和pvsl1突变体中D1蛋白质含量。每种材料挑选饱满的种子于萌发器中，25℃萌发5天，将萌发后的种子移栽至盆钵中，人工气候培养箱(light：16h，dark：8h)，光强分别为25μmol·m

a.将研砵、200ml玻璃烧杯、5ml枪头、纱布、提取缓冲液(50mM HEPES-KOH，pH7.6；0.33M sorbitol；2mM Na

b.取5g新鲜叶片，剪成1～3mm的小块，放入已预冷的烧杯中，于4℃冰箱预冷15min；

c.向预冷的研砵中加入少许已预冷的提取缓冲液，将已预冷的叶片放入研砵中，将叶片碾碎为小片(不要用力过猛，不用研磨过细)；

d.将剩余的提取缓冲液全部倒入研砵中，轻轻混匀，冰上静置10min，期间混匀几次；

e.用新的四层纱布将提取混合液过滤至预冷的50ml离心管中，为防止在转移过程中液体外溢，使用5ml移液器转移；

f.500g，4℃离心1min，离心机升降速调节为2；

g.用5ml移液器将上清转移至新的离心管中；

h.1800g，4℃离心1min，升降速调节为2；

i.弃上清，用提取缓冲液洗沉淀2次，镜检提取的叶绿体是否完整，结果如图所示；

j.用10ml PBS渗透溶解内囊体膜，4℃，用Rotational Mixer WH-986缓慢旋转2小时；

k.5000g，4℃离心5min，离心机升降速调节为9；

l.弃上清，用100μl 3×蛋白质上样缓冲液悬浮沉淀；

m.煮沸5min，用SDS-PAGE分离，分别用D1和D2蛋白特异性抗体做WESTERN杂交。其中D2蛋白是内参。

结果显示在25μmol·m

序 列 表

<110> 中国科学院东北地理与农业生态研究所

<120>菜豆金属蛋白酶PvFtsH2基因及其编码蛋白和应用

<160> 7

<210> 1

<211> 2088

<212> DNA

<213> 菜豆属（Phaseolus vulgaris Linn. cv. Dalong1）

<220>

<223>菜豆金属蛋白酶PvFtsH2基因

<400> 1

atggcagcat catctgcatg ccttgttggg aatggtttat ctacacgggg taatagagtg 60

gctcttaaga aggacttcaa tggaagatat ctctactcat cttggagact ttcgtcattg 120

aataataaca aggcgtcaaa agcattttcc ataagggcat ccttggagga aaggcaacaa 180

gaagggagaa gggggtttct gaaattattg cttggaaatg ctggagttgg tgtgcctgca 240

ttgttgggaa gtggcaaagc ttatgctgat gaacaagggg cttcctcctc cagaatgtct 300

tactccaggt ttctagagta tttggacaag gacagagtaa aaaaagtgga tctttatgaa 360

aacggaacca ttgctgttgt tgaggctgtt tctcctgaat tggggaatag ggtgcagcgt 420

gttaaagttca actccctgga cttaatcagg agctccttc agaaattcag ggaaaagaat 480

attgactttg cagctcatag tgcccaagaa gagtcaggtt ctcttttagc taatctgatt 540

gggaatctgg ccttcccttt gctcttgatt ggaggtttgt tccttctctc gagacgatca 600

ggagggatgg gaggtcctgg tgggcctgga tttcctcttg cttttggtca atctaaagcc 660

aagtttcaaa tggaaccaaa cactggagtg acatttgatg atgttgctgg ggtggatgaa 720

gccaagcagg actttatgga ggtggtggag tttctaaaga agcctgagag gttcactgct 780

gttggggctc gcatacctaa aggagttctt cttgttggtc ctccaggaac tggaaagacc 840

ctgttagcca aggctattgc tggtgaagct ggtgttccct ttttttcaat atctggttct 900

gagtttgttg agatgtttgt tggtgttggt gcttctcgag ttcgtgattt gttcaagaag 960

gccaaagaga atgccccttg cattgtcttt gttgatgaaa ttgatgctgt tggaagacaa 1020

agaggaactg gaattggtgg agggaatgat gaaagagagc agaccctgaa ccaacttttg 1080

acagaaatgg atggttttga gggtaatact ggtatcattg tcattgcagc aactaacagg 1140

gcagatattc ttgactctgc cttattgaga ccaggacgat ttgatagaca ggtaacagtt 1200

gatgttccag atataagggg aaggactgaa atcctaaagg ttcatggtag caataaaaag 1260

tttgatggtg atgtttctct tgatgtgatt gccatgagaa cgcctggttt tagtggagct 1320

gatcttgcaa atctcctgaa tgaggctgcc atattagccg gtcgacgtgg aaagacagca 1380

atttcctcta aagagattga tgattctatt gataggattg ttgctggaat ggagggaaca 1440

gtgatgacag atgggaagag caaaagttta gtagcatatc atgaagttgg tcatgcaatt 1500

tgtggaactt tgactcctgg tcatgatgct gtgcaaaagg taacactagt tcctcgtggt 1560

caagctcggg gtcttacatg gttcattcct tccgacgatc caactctgat ctccagacaa 1620

caactcttcg caagaattgt tggtggactt ggtggtaggg ctgcagaaga aattattttt 1680

ggtgagcctg aggtcacaac tggagctgct ggtgatttgc agcaaatcac cggtttggca 1740

aaacagatgg taactacatt tggaatgtct gatattggtc cttggtcact gatggaacca 1800

tcagcacaaa gtggggatat tatcatgagg atgatggcaa ggaactcaat gtcagagagg 1860

cttgcagaag acatcgatgc tgccatcaag aggatctcag atgaagcata tgaaattgcc 1920

ttagaacata taaggaacaa ccgtgaggcc attgacaaga ttgtggaagt ccttctggag 1980

aaggagacat tgagtggaga tgaattccgt gctatactgt ctgaatttgc tgaaattcca 2040

gctgaaaacc gggtccctcc ttcaactcca gtaccagcca ctgtttaa 2088

<210> 2

<211> 696

<212> PRT

<213>菜豆属（Phaseolus vulgaris Linn. cv. Dalong1）

<220>

<223>菜豆金属蛋白酶PvFtsH2基因编码蛋白

<400> 2

Met Ala Ala Ser Ser Ala Cys Leu Val Gly Asn Gly Leu Ser Thr

5 10 15

Arg Gly Asn Arg Val Ala Leu Lys Lys Asp Phe Asn Gly Arg Tyr

20 25 30

Leu Tyr Ser Ser Trp Arg Leu Ser Ser Leu Asn Asn Asn Lys Ala

35 40 45

Ser Lys Ala Phe Ser Ile Arg Ala Ser Leu Glu Glu Arg Gln Gln

50 55 60

Glu Gly Arg Arg Gly Phe Leu Lys Leu Leu Leu Gly Asn Ala Gly

65 70 75

Val Gly Val Pro Ala Leu Leu Gly Ser Gly Lys Ala Tyr Ala Asp

80 85 90

Glu Gln Gly Ala Ser Ser Ser Arg Met Ser Tyr Ser Arg Phe Leu

95 100 105

Glu Tyr Leu Asp Lys Asp Arg Val Lys Lys Val Asp Leu Tyr Glu

110 115 120

Asn Gly Thr Ile Ala Val Val Glu Ala Val Ser Pro Glu Leu Gly

125 130 135

Asn Arg Val Gln Arg Val Lys Val Gln Leu Pro Gly Leu Asn Gln

140 145 150

Glu Leu Leu Gln Lys Phe Arg Glu Lys Asn Ile Asp Phe Ala Ala

155 160 165

His Ser Ala Gln Glu Glu Ser Gly Ser Leu Leu Ala Asn Leu Ile

170 175 180

Gly Asn Leu Ala Phe Pro Leu Leu Leu Ile Gly Gly Leu Phe Leu

185 190 195

Leu Ser Arg Arg Ser Gly Gly Met Gly Gly Pro Gly Gly Pro Gly

200 205 210

Phe Pro Leu Ala Phe Gly Gln Ser Lys Ala Lys Phe Gln Met Glu

215 220 225

Pro Asn Thr Gly Val Thr Phe Asp Asp Val Ala Gly Val Asp Glu

230 235 240

Ala Lys Gln Asp Phe Met Glu Val Val Glu Phe Leu Lys Lys Pro

245 250 255

Glu Arg Phe Thr Ala Val Gly Ala Arg Ile Pro Lys Gly Val Leu

260 265 270

Leu Val Gly Pro Pro Gly Thr Gly Lys Thr Leu Leu Ala Lys Ala

275 280 285

Ile Ala Gly Glu Ala Gly Val Pro Phe Phe Ser Ile Ser Gly Ser

290 295 300

Glu Phe Val Glu Met Phe Val Gly Val Gly Ala Ser Arg Val Arg

305 310 315

Asp Leu Phe Lys Lys Ala Lys Glu Asn Ala Pro Cys Ile Val Phe

320 325 330

Val Asp Glu Ile Asp Ala Val Gly Arg Gln Arg Gly Thr Gly Ile

335 340 345

Gly Gly Gly Asn Asp Glu Arg Glu Gln Thr Leu Asn Gln Leu Leu

350 355 360

Thr Glu Met Asp Gly Phe Glu Gly Asn Thr Gly Ile Ile Val Ile

365 370 375

Ala Ala Thr Asn Arg Ala Asp Ile Leu Asp Ser Ala Leu Leu Arg

380 385 390

Pro Gly Arg Phe Asp Arg Gln Val Thr Val Asp Val Pro Asp Ile

395 400 405

Arg Gly Arg Thr Glu Ile Leu Lys Val His Gly Ser Asn Lys Lys

410 415 420

Phe Asp Gly Asp Val Ser Leu Asp Val Ile Ala Met Arg Thr Pro

425 430 435

Gly Phe Ser Gly Ala Asp Leu Ala Asn Leu Leu Asn Glu Ala Ala

440 445 450

Ile Leu Ala Gly Arg Arg Gly Lys Thr Ala Ile Ser Ser Lys Glu

455 460 465

Ile Asp Asp Ser Ile Asp Arg Ile Val Ala Gly Met Glu Gly Thr

470 475 480

Val Met Thr Asp Gly Lys Ser Lys Ser Leu Val Ala Tyr His Glu

485 490 495

Val Gly His Ala Ile Cys Gly Thr Leu Thr Pro Gly His Asp Ala

500 505 510

Val Gln Lys Val Thr Leu Val Pro Arg Gly Gln Ala Arg Gly Leu

515 520 525

Thr Trp Phe Ile Pro Ser Asp Asp Pro Thr Leu Ile Ser Arg Gln

530 535 540

Gln Leu Phe Ala Arg Ile Val Gly Gly Leu Gly Gly Arg Ala Ala

545 550 555

Glu Glu Ile Ile Phe Gly Glu Pro Glu Val Thr Thr Gly Ala Ala

560 565 570

Gly Asp Leu Gln Gln Ile Thr Gly Leu Ala Lys Gln Met Val Thr

575 580 585

Thr Phe Gly Met Ser Asp Ile Gly Pro Trp Ser Leu Met Glu Pro

590 595 600

Ser Ala Gln Ser Gly Asp Ile Ile Met Arg Met Met Ala Arg Asn

605 610 615

Ser Met Ser Glu Arg Leu Ala Glu Asp Ile Asp Ala Ala Ile Lys

620 625 630

Arg Ile Ser Asp Glu Ala Tyr Glu Ile Ala Leu Glu His Ile Arg

635 640 645

Asn Asn Arg Glu Ala Ile Asp Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Glu

650 655 660

Lys Glu Thr Leu Ser Gly Asp Glu Phe Arg Ala Ile Leu Ser Glu

665 670 675

Phe Ala Glu Ile Pro Ala Glu Asn Arg Val Pro Pro Ser Thr Pro

680 685 690

Val Pro Ala Thr Val Gln

695 696

<210> 3

<211> 1338

<212> DNA

<213> 菜豆属（Phaseolus vulgaris Linn. cv. Dalong1）

<220>

<223>菜豆pvsl1突变体中pvftsh2基因

<400> 3

atggcagcat catctgcatg ccttgttggg aatggtttat ctacacgggg taatagagtg 60

gctcttaaga aggacttcaa tggaagatat ctctactcat cttggagact ttcgtcattg 120

aataataaca aggcgtcaaa agcattttcc ataagggcat ccttggagga aaggcaacaa 180

gaagggagaa gggggtttct gaaattattg cttggaaatg ctggagttgg tgtgcctgca 240

ttgttgggaa gtggcaaagc ttatgctgat gaacaagggg cttcctcctc cagaatgtct 300

tactccaggt ttctagagta tttggacaag gacagagtaa aaaaagtgga tctttatgaa 360

aacggaacca ttgctgttgt tgaggctgtt tctcctgaat tggggaatag ggtgcagcgt 420

gttaaagttca actccctgga cttaatcagg agctccttc agaaattcag ggaaaagaat 480

attgactttg cagctcatag tgcccaagaa gagtcaggtt ctcttttagc taatctgatt 540

gggaatctgg ccttcccttt gctcttgatt ggaggtttgt tccttctctc gagacgatca 600

ggagggatgg gaggtcctgg tgggcctgga tttcctcttg cttttggtca atctaaagcc 660

aagtttcaaa tggaaccaaa cactggagtg acatttgatg atgttgctgg ggtggatgaa 720

gccaagcagg actttatgga ggtggtggag tttctaaaga agcctgagag gttcactgct 780

gttggggctc gcatacctaa aggagttctt cttgttggtc ctccaggaac tggaaagacc 840

ctgttagcca aggctattgc tggtgaagct ggtgttccct ttttttcaat atctggttct 900

gagtttgttg agatgtttgt tggtgttggt gcttctcgag ttcgtgattt gttcaagaag 960

gccaaagaga atgccccttg cattgtcttt gttgatgaaa ttgatgctgt tggaagacaa 1020

agaggaactg gaattggtgg agggaatgat gaaagagagc agaccctgaa ccaacttttg 1080

acagaaatgg atggttttga gggtaatact ggtatcattg tcattgcagc aactaacagg 1140

gcagatattc ttgactctgc cttattgaga ccaggacgat ttgatagaca ggtaacagtt 1200

gatgttccag atataagggg aaggactgaa atcctaaagg ttcatggtag caataaaaag 1260

tttgatggtg atgtttctct tgatgtgatt gccatgagac gcctggtttt agtggagctg 1320

atcttgcaaa tctcctga 1338

<210> 4

<211> 445

<212> PRT

<213>菜豆属（Phaseolus vulgaris Linn. cv. Dalong1）

<220>

<223>菜豆pvsl1突变体中pvftsh2基因编码蛋白

<400> 4

Met Ala Ala Ser Ser Ala Cys Leu Val Gly Asn Gly Leu Ser Thr

5 10 15

Arg Gly Asn Arg Val Ala Leu Lys Lys Asp Phe Asn Gly Arg Tyr

20 25 30

Leu Tyr Ser Ser Trp Arg Leu Ser Ser Leu Asn Asn Asn Lys Ala

35 40 45

Ser Lys Ala Phe Ser Ile Arg Ala Ser Leu Glu Glu Arg Gln Gln

50 55 60

Glu Gly Arg Arg Gly Phe Leu Lys Leu Leu Leu Gly Asn Ala Gly

65 70 75

Val Gly Val Pro Ala Leu Leu Gly Ser Gly Lys Ala Tyr Ala Asp

80 85 90

Glu Gln Gly Ala Ser Ser Ser Arg Met Ser Tyr Ser Arg Phe Leu

95 100 105

Glu Tyr Leu Asp Lys Asp Arg Val Lys Lys Val Asp Leu Tyr Glu

110 115 120

Asn Gly Thr Ile Ala Val Val Glu Ala Val Ser Pro Glu Leu Gly

125 130 135

Asn Arg Val Gln Arg Val Lys Val Gln Leu Pro Gly Leu Asn Gln

140 145 150

Glu Leu Leu Gln Lys Phe Arg Glu Lys Asn Ile Asp Phe Ala Ala

155 160 165

His Ser Ala Gln Glu Glu Ser Gly Ser Leu Leu Ala Asn Leu Ile

170 175 180

Gly Asn Leu Ala Phe Pro Leu Leu Leu Ile Gly Gly Leu Phe Leu

185 190 195

Leu Ser Arg Arg Ser Gly Gly Met Gly Gly Pro Gly Gly Pro Gly

200 205 210

Phe Pro Leu Ala Phe Gly Gln Ser Lys Ala Lys Phe Gln Met Glu

215 220 225

Pro Asn Thr Gly Val Thr Phe Asp Asp Val Ala Gly Val Asp Glu

230 235 240

Ala Lys Gln Asp Phe Met Glu Val Val Glu Phe Leu Lys Lys Pro

245 250 255

Glu Arg Phe Thr Ala Val Gly Ala Arg Ile Pro Lys Gly Val Leu

260 265 270

Leu Val Gly Pro Pro Gly Thr Gly Lys Thr Leu Leu Ala Lys Ala

275 280 285

Ile Ala Gly Glu Ala Gly Val Pro Phe Phe Ser Ile Ser Gly Ser

290 295 300

Glu Phe Val Glu Met Phe Val Gly Val Gly Ala Ser Arg Val Arg

305 310 315

Asp Leu Phe Lys Lys Ala Lys Glu Asn Ala Pro Cys Ile Val Phe

320 325 330

Val Asp Glu Ile Asp Ala Val Gly Arg Gln Arg Gly Thr Gly Ile

335 340 345

Gly Gly Gly Asn Asp Glu Arg Glu Gln Thr Leu Asn Gln Leu Leu

350 355 360

Thr Glu Met Asp Gly Phe Glu Gly Asn Thr Gly Ile Ile Val Ile

365 370 375

Ala Ala Thr Asn Arg Ala Asp Ile Leu Asp Ser Ala Leu Leu Arg

380 385 390

Pro Gly Arg Phe Asp Arg Gln Val Thr Val Asp Val Pro Asp Ile

395 400 405

Arg Gly Arg Thr Glu Ile Leu Lys Val His Gly Ser Asn Lys Lys

410 415 420

Phe Asp Gly Asp Val Ser Leu Asp Val Ile Ala Met Arg Arg Leu

425 430 435

Val Leu Val Glu Leu Ile Leu Gln Ile Ser

440 445

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物F1

<400> 5

atggcagcatcatctgcatg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R1

<400> 6

aacagtggctggtactggag 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R2

<400> 7

ggagatttgcaagatcag 18