一种基于响应面法优化的青阳参苷元超声提取方法

摘要

本发明属于医药技术领域，公开了一种基于响应面法优化的青阳参苷元超声提取方法。提取工艺包括以下步骤：一、粉碎青阳参根茎，过筛；二、称取青阳参粉末，加入乙醇和盐酸水溶液，放至超声清洗仪中提取；三、提取液用碱调节PH至7～8；四、将提取液抽滤，滤液以甲醇定容，采用HPLC法测定青阳参苷元的含量，计算提取率。优化方法则是通过超声辅助提取方法结合响应面分析、Design Expert 11软件，优化出青阳参苷元的最佳提取条件，提高提取率，工艺稳定可靠，可操作性强。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种基于响应面法优化的青阳参苷元超声提取方法。

背景技术

青阳参为萝藦科鹅绒藤属植物，多年生草质缠绕藤本，分布于云南、贵州、湖南等地，青阳参药材为植物青阳参的干燥根，用于治疗癫痫、抑郁、肝脏纤维化等症。现代药学表明，青阳参药材主要有效成分是C21甾体类皂苷，包括青阳参苷元(Qingyangshengenin)、告达亭(Candatin)、罗素他命(Rostratamin)、青阳参皂苷A、青阳参皂苷B等。其中，青阳参苷元更是多种皂苷的基本苷元结构，研究其高效提取方法尤为重要。

传统的天然产物有效成分提取方法有很多种，包括浸渍法、加热回流法、超临界萃取法、超声提取法等。其中，超声提取法是利用超声波的强振动、强空化作用及次级效应缩短天然产物有效成分的溶出时间，工艺简单，成本低廉，提取效率高。青阳参苷元的提取率受到诸多因素影响，如酸解糖基的盐酸浓度、溶剂的乙醇含量、超声功率、超声温度、超声时间、料液比、粒径大小等。

传统的天然产物提取方法的优化多基于实际实验，极大地耗费人力、物力。响应面法的原理是利用合理的实验设计，采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，通过分析寻求最佳提取条件，解决多变量优化问题。响应面法可以减少实验次数，得到的优化数据更有效接近真实水平，已广泛应用于生物、化学等领域。目前，利用响应面法优化青阳参苷元的超声提取方法尚未见报道。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种基于响应面法优化的青阳参苷元超声提取方法，填补现有技术的空缺。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

1、首先使用单因素实验确定提取液的盐酸浓度、乙醇含量、超声功率、超声温度和超声时间对青阳参苷元提取率的影响，包括以下步骤：

(1)将青阳参根茎粉碎，过筛；

(2)称取青阳参粉末，加入乙醇和盐酸水溶液，使提取溶液的盐酸浓度0.2～0.4mol/L，乙醇含量10～90％，料液比1:10g/mL，放至超声清洗仪中，以超声功率240～600W，超声温度30～70℃，超声时间10～50min进行提取。

(3)超声后的提取液用碱调节PH至7～8；

(4)将提取液抽滤，滤液以甲醇定容，然后采用HPLC法测定青阳参苷元的含量，计算提取率。

优选地，步骤(1)中，所用青阳参根茎粉碎后过100目筛。

优选地，步骤(2)中，所用提取溶液的盐酸浓度为0.36mol/L。

优选地，步骤(2)中，所用提取溶液的乙醇含量为50％。

优选地，步骤(2)中，所用超声功率为600W。

优选地，步骤(2)中，所用超声温度为60℃。

优选地，步骤(2)中，所用超声时间为30min。

优选地，步骤(3)中，所用碱为饱和NaHCO

优选地，步骤(4)中，所用HPLC法条件为乙腈-水作流动相，检测波长259nm。

2、采用响应面法优化青阳参苷元超声提取方法，包括以下步骤：

(1)将青阳参根茎粉碎，过100目筛；

(2)称取青阳参粉末，加入乙醇和盐酸水溶液，使提取溶液的盐酸浓度0.36mol/L，料液比1:10g/mL，放至超声清洗仪中以超声功率600W提取；

(3)超声后的提取液用饱和NaHCO

(4)将提取液抽滤，滤液以甲醇定容，然后采用HPLC法以乙腈-水作流动相，在259nm波长下测定青阳参苷元的含量，计算提取率；

(5)通过响应面法建立青阳参苷元提取率与乙醇含量、超声温度、超声时间三个因素之间的二次多项式方程模型；

(6)根据二次多项式方程模型，采用统计软件对实验参数进行分析，得到青阳参苷元的最佳提取条件。

进一步的，所述步骤(2)中乙醇含量30～70％，超声温度50～70℃，超声时间20～40min。

进一步的，所述步骤(5)中建立的二次多项式方程模型为：Y＝0.2643+0.0166A+0.0077B+0.0157C+0.0031AB+0.0210AC-0.0110BC-0.0313A

进一步的，所述步骤(6)中采用的统计软件为Design Exper 11。

进一步的，所述步骤(6)中得到的青阳参苷元最佳超声提取条件为：青阳参根茎粉碎过100目筛，提取溶液的盐酸浓度0.36mol/L，乙醇含量58％，料液比1:10g/mL，超声功率600W，超声温度63℃，超声时间33min。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明提供了一种基于响应面法优化的青阳参苷元超声提取方法，以青阳参根茎为原料，首先使用单因素实验选择最佳的提取溶液盐酸浓度、乙醇含量、超声功率、超声温度和超声时间，并以弱碱NaHCO

本发明获得的优选提取方法缩短了提取时间，提高了青阳参苷元的得率，降低了能耗，对环境友好，是一种高效、经济、绿色的提取方法。

附图说明

图1是乙醇含量A对青阳参苷元提取率的影响；

图2是超声温度B对青阳参苷元提取率的影响；

图3是超声时间C对青阳参苷元提取率的影响；

图4是乙醇含量A与超声温度B对青阳参苷元提取率交互作用的响应面图及等高线图；

图5是乙醇含量A与超声时间C对青阳参苷元提取率交互作用的响应面图及等高线图；

图6是超声温度B与超声时间C对青阳参苷元提取率交互作用的响应面图及等高线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明技术方案做进一步详细描述：

如图1-6所示

实施例一种基于响应面法优化的青阳参苷元超声提取方法

材料与试剂

昆明本地药材市场购买青阳参根茎。青阳参苷元对照品购自上海同田生物技术股份有限公司。

甲醇、乙醇、盐酸、NaHCO

仪器与设备

一、青阳参苷元的提取步骤

1、将青阳参根茎粉碎，过100目筛；

2、称取青阳参粉末，加入乙醇和盐酸水溶液，放至超声清洗仪中提取；

3、超声后的提取液用饱和NaHCO

4、将提取液抽滤，滤液以甲醇定容，得到青阳参苷元提取液。

二、青阳参苷元的测定

1、青阳参苷元标准曲线的绘制

精确称取10mg青阳参苷元标准品，用甲醇配制成1mg/mL的母液；将母液稀释成不同浓度，以浓度C(mg/mL)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，得线性回归方程：Y＝17174520C-68757，R

2、制备好的青阳参苷元提取液用滤膜过滤后，利用HPLC法以乙腈-水作流动相，在259nm波长下检测青阳参苷元的吸收峰面积，最后按外标法计算提取液中青阳参苷元的含量以及提取率。

三、单因素实验方法及结果

1、单因素实验方法

选取提取溶液的盐酸浓度、乙醇含量、超声功率、超声温度和超声时间进行单因素实验，得到各因素与青阳参苷元提取率的关系。

2、单因素实验结果

(1)提取溶液的盐酸浓度对提取率的影响

在料液比1:10g/mL、乙醇含量50％、超声功率420W、超声温度50℃、超声时间30min的条件下，考察提取溶液的盐酸浓度在0.20、0.24、0.28、0.32、0.36、0.40mol/L范围内对青阳参苷元提取率的影响，结果表明提取溶液的盐酸浓度为0.36mol/L所得提取率最高。

(2)乙醇含量对提取率的影响

在提取溶液的盐酸浓度0.36mol/L、料液比1:10g/mL、超声功率420W、超声温度50℃、超声时间30min的条件下，考察乙醇含量在10、30、50、70、90％范围内对青阳参苷元提取率的影响，结果表明乙醇含量为50％所得提取率最高，见图1。

(3)超声功率对提取率的影响

在提取溶液的盐酸浓度0.36mol/L、料液比1:10g/mL、乙醇含量50％、超声温度50℃、超声时间30min的条件下，考察超声功率在240、330、420、510、600W范围内对青阳参苷元提取率的影响，结果表明超声功率为600W所得提取率最高。

(4)超声温度对提取率的影响

在提取溶液的盐酸浓度0.36mol/L、料液比1:10g/mL、乙醇含量50％、超声功率600W、超声时间30min的条件下，考察超声温度在30、40、50、60、70℃范围内对青阳参苷元提取率的影响，结果表明超声温度为60℃所得提取率最高，见图2。

(5)超声时间对提取率的影响

在提取溶液的盐酸浓度0.36mol/L、料液比1:10g/mL、乙醇含量50％、超声功率600W、超声温度60℃的条件下，考察超声时间在10、20、30、40、50min范围内对青阳参苷元提取率的影响，结果表明超声时间为30min所得提取率最高，见图3。

四、响应面法优化提取条件

1、响应面实验设计

在单因素实验的基础上，根据Box-Benhnken中心组合设计原理，以乙醇含量、超声温度、超声时间为自变量，青阳参苷元提取率为响应值，设计了三因素三水平响应面分析实验。每个实验点进行三份平行实验。具体实施方法见表1和表2。

表1响应面实验因素及水平

表2 Box-Benhnken实验设计方案及青阳参苷元提取率

2、回归模型建立及方差分析

采用Design Expert 11软件对实验数据进行分析，回归拟合后获得青阳参苷元提取率与乙醇含量、超声温度、超声时间之间的二次多项式方程模型：Y＝0.2643+0.0166A+0.0077B+0.0157C+0.0031AB+0.0210AC-0.0110BC-0.0313A

P值反映模型或因素对响应值影响的显著程度，P值越小表示越显著；失拟项用以评估模型的可靠性，当失拟项的P值不显著时，表示模型模拟情况良好，可用于后续分析。从表3的回归模型方差分析及显著性检验结果看出：回归模型的P<0.01，说明该模型差异极显著，具有统计学意义；A、B、C、AC、BC、A

表3回归模型方差分析

注：P>0.05表示差异不显著；*P<0.05表示差异显著；**P<0.01表示差异极显著。

3、响应面图形分析

响应面图反映各因素对响应值的影响，曲面变化弧度越大，表示因素对响应值影响越大。等高线图则反映因素之间的交互作用，等高线呈椭圆形表示因素之间交互作用显著。将各因素两两进行拟合，得出响应面图及等高线图图4、图5、图6。由响应面图可知，影响青阳参苷元提取率的显著因素为乙醇含量与超声时间，超声温度最小。从等高线图看出，乙醇含量与超声时间之间交互作用相对更显著。响应面图及等高线图与回归模型方差分析结果是一致的。

4、最佳提取条件验证

根据Design Expert 11分析优化，得到青阳参苷元的最佳超声提取条件为：乙醇含量58％，超声温度63℃，超声时间33min，青阳参苷元提取率预测为0.2710％。验证实验：青阳参根茎粉碎过100目筛，提取溶液的盐酸浓度0.36mol/L，乙醇含量58％，料液比1:10g/mL，超声功率600W，超声温度63℃，超声时间33min，三次平行实验，测得青阳参苷元提取率平均值为0.2745％，结果与模型预测值相近，说明该模型优化的最佳超声提取条件具有可靠性。

本发明提供了一种基于响应面法优化的青阳参苷元超声提取方法，以青阳参根茎为原料，首先使用单因素实验选择最佳提取溶液的盐酸浓度、乙醇含量、超声功率、超声温度和超声时间，并以弱碱NaHCO

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。