冬凌草茎水提物粉末,其制备,抗肿瘤作用及应用

摘要

本发明公开了冬凌草茎水提物粉末,其制备方法以及在治疗肿瘤中的应用。通过本发明所述的方法制备得到的冬凌草茎水提物粉末含17种奎尼酸类化合物和11种槲皮素类化合物。实验证明,本发明的冬凌草茎水提物粉末具有优秀的抗肿瘤作用。因而提出本发明为肿瘤治疗提供了有效的技术手段。

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备冬凌草茎水提物粉末的方法,涉及由该方法制备的冬凌草茎水提物粉末在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明属于生物医药领域。

背景技术

恶性肿瘤严重威胁人类的健康。根据WHO公布的预测数据,2020年全世界癌症发病率将增加50％,全球每年新增癌症患者人数将达到1500万人。虽然临床已经有足够数量的抗肿瘤药物可供选择,但是因为毒副作用而不尽人意。在抗癌药物的研究中,寻找天然抗肿瘤药物非常吸引研究兴趣。全球应用的175种抗癌药物中,有57％直接或间接来源于天然产物。可是它们仍然存在严重的毒副作用。寻找活性明确,毒副作用低的天然抗肿瘤药物尤其吸引研究兴趣。

冬凌草是唇形科香茶菜属植物碎米桠Rabdosia rubescens(Hemsl.)Hara的全草。冬凌草为多年生草本植物,广泛分布于我国黄河长江流域,主产于河南济源太行山和王屋山地区。因具有清热解毒,清咽利喉和消肿止痛功能,民间一直将冬凌草全草煮水饮用。在过去的30多年里,冬凌草的化学成分及药理作用研究主要集中在叶和茎的脂溶性部分,代表性成分为冬凌草甲素和冬凌草乙素。迄今没有任何与冬凌草茎的水提物的化学成分及治疗作用相关的研究见诸文献。与叶相比,冬凌草全草中茎占的比例高。有效地应用冬凌草茎有重要意义。

发明人长期从事冬凌草茎水提物粉末的化学成分及治疗作用研究。发明人对冬凌草茎水提物粉末的化学组分进行质谱分析,发现了28种未见报道的组分,主要包括桂皮酰奎尼酸和多取代槲皮素。虽然报道过冬凌草茎水提物粉末单一组分的生物活性,但是全组分联合的生物活性并不知情。通过反复研究发明人发现,这28种组分可治肿瘤。与冬凌草的已知发明相比,本发明的冬凌草茎水提物粉末可治疗肿瘤的发明达到了一个全新高度。根据这些认识,发明人提出了本发明。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种制备冬凌草茎水提物粉末的方法,以及由该方法制得的冬凌草茎水提物粉末。实验证明,由本发明制备的冬凌草茎水提物粉末有抗肿瘤作用。为了达到所述目的,本发明采用了以下五个技术手段。

第一个技术手段是提出了本发明的一种冬凌草茎水提物粉末,所述冬凌草茎水提物粉末含17种奎尼酸类化合物及11种槲皮素类化合物,所述17种奎尼酸类化合物为3-O-[E-2,4,6-三(3-羧基-2-丙烯酰氧)-5-(3-羟基-2-丙烯酰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-O-[E-2-(6-羟基-1,3,5-己三烯羰氧)-4-(4-羧基-1,3-丁二烯羰氧)-5-甲氧-6-(3-羟基-1-丙烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-O-[E-2,4-二(4-羧基-1-丁烯羰氧)-3-羟基-5-甲氧-6-(6-羧基-1,3-己二烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-O-[E-2-(4-羟基-1,3-丁二烯羰氧)-4-(3-羟基丙烯酰氧)-5-羟基-6-(3-羟基-1-丙烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-O-[E-2-(5-羟基-1-戊烯羰氧)-3-甲氧-4-(3-羧基-1-丙烯羰氧)-5-(3-羟基丙酰氧)-6-(5-羧基-1-戊烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-O-[E-2,5-二甲氧-3-羟基-4-(4-羧基丁羰氧)-6-(5-羧基戊羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-O-[E-2-(4-羧基丁羰氧)-3-羟基-4-(3-羧基丙羰氧)-5-甲酰氧-6-(4-羧基-1-丁烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-O-[E-2-甲酰氧-3,4-二(5-羧基-1-戊烯羰氧)-5-(8-羧基-1-辛烯羰氧)-6-(7-羧基-1-庚烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-O-[E-2-羧基乙酰氧-3,6-二(5-羧基-1-戊烯羰氧)-4-(4-羧基-1-丁烯羰氧)-5-(8-羧基-1-庚烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-O-[E-2,4-二(4-羧基-1-丁烯羰氧)-3-羟基-5-(5-羟基戊羰氧)-6-(5-羟基-1,3-戊二烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-O-[E-2-(4-羧基丁羰氧)-3-羟基-4-(4-羧基-1-丁烯羰氧)-5,6-二(5-羟基-1-戊烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-O-[E-2,4-二(4-羧基丁羰氧)-3-羟基-5-(3-羟基丙酰氧)-6-羧基乙酰氧桂皮酰]奎尼酸,3-O-[E-2-甲酰氧-3-(5-羧基-1-戊烯羰氧)-4-(4-羧基-1-丁烯羰氧)-5-(8-羧基-1-辛烯羰氧)-6-(5-羟基戊羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-O-[E-2,5-二羟甲氧-4-(3-羧基丙酰氧)-6-(5-羧基戊羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-O-[E-2-(5-羟基戊羰氧)-3-羟基-4-(4-羧基丁羰氧)-5,6-二羧基乙酰氧桂皮酰]奎尼酸,3-O-[E-2-(4-羧基丁羰氧)-4,6-二(4-羧基-1-丁烯羰氧)-5-(3-羧基丙羰氧)桂皮酰]奎尼酸和3-O-[E-2-(3-羧基丙酰氧)-3-(5-羧基-1-戊烯羰氧)-4,6-二(4-羧基-1-丁烯羰氧)-5-(8-羧基-1-辛烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸；所述的11种槲皮素类化合物为3-O-葡萄糖苷-3’-(6-羟基己羰氧)-4’-甲氧-5’-(5-羟基戊羰氧)槲皮素，3-O-葡萄糖苷-2’-羟基-3’-羟甲氧-4’-羟基乙酰氧-5’,6’-二羧基乙酰氧槲皮素,3-O-葡萄糖苷-2’,6’-二羟甲氧基-3’-(3-羟基丙羰氧)-4’-羟基-5’-(3-羧基丙酰氧)槲皮素,3-O-葡萄糖苷-2’,6’-二甲氧-3’-(5-羟基-1,3-戊二烯羰氧)-4’-(3-羟基-1-丙烯羰氧)槲皮素,3-O-葡萄糖苷-3’-(4-羧基-1-丁烯羰氧)-4’-(4-羧基丁羰氧)槲皮素,3-O-葡萄糖苷-2’-羟基-4’-(3-羧基丙烯酰氧)-5’-(3-羧基丙羰氧)槲皮素,3-O-葡萄糖苷-2’-甲氧-4’-(3-羧基-1-丙烯羰氧)-5’-(5-羟基-1-戊烯羰氧)-6’-(7-羟基-1,3-庚二烯羰氧)槲皮素,3-O-葡萄糖苷-2’-甲氧-4’,5’-二羟甲氧-6’-(7-羟基庚羰氧)槲皮素,3-O-葡萄糖苷-2’,3’-二甲酰氧-4’-(4-羧基-1-丁烯羰氧)-5’-(3-羧基丙羰氧)-6’-(4-羟基-1-丁烯羰氧)槲皮素,3-O-葡萄糖苷-2’-羟基-3’,5’-二羟甲氧-4’-羧基乙酰氧-6’-(3-羧基丙酰氧)槲皮素和3-O-葡萄糖苷-2’,3’,4’-三甲酰氧-5’-(4-羟基-1,3-丁二烯羰氧)-6’-羧基乙酰氧槲皮素。

第二个技术手段是提出了制备所述冬凌草茎水提物粉末方法。取冬凌草茎用自来水洗净,切碎,在蒸馏水中于50℃-100℃加热0.5-4小时并于200-400rpm搅拌冷却至室温,过滤,滤饼用蒸馏水洗3次,合并的滤液减压浓缩,得到的粉末即为冬凌草茎水提物粉末。

第三个技术手段是提供冬凌草茎水提物粉末的质谱总离子流图谱。

第四个技术手段是提供与冬凌草茎水提物粉末的质谱总离子流谱中的峰对应的28种组分的化学结构。

第五个技术手段是评价冬凌草茎水提物粉末的抗肿瘤活性。

附图说明

图1冬凌草茎水提物粉末的UPLC-质谱总离子流图谱。

图2冬凌草茎水提物粉末中的3-O-[E-2,4,6-三(3-羧基-2-丙烯酰氧)-5-(3-羟基-2-丙烯酰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。

图3冬凌草茎水提物粉末中的3-O-[E-2-(6-羟基-1,3,5-己三烯羰氧)-4-(4-羧基-1,3-丁二烯羰氧)-5-甲氧-6-(3-羟基-1-丙烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。

图4冬凌草茎水提物粉末中的3-O-[E-2,4-二(4-羧基-1-丁烯羰氧)-3-羟基-5-甲氧-6-(6-羧基-1,3-己二烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。

图5冬凌草茎水提物粉末中的3-O-[E-2-(4-羟基-1,3-丁二烯羰氧)-4-(3-羟基丙烯酰氧)-5-羟基-6-(3-羟基-1-丙烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。

图6冬凌草茎水提物粉末中的3-O-[E-2-(5-羟基-1-戊烯羰氧)-3-甲氧-4-(3-羧基-1-丙烯羰氧)-5-(3-羟基丙酰氧)-6-(5-羧基-1-戊烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。

图7冬凌草茎水提物粉末中的3-O-[E-2,5-二甲氧-3-羟基-4-(4-羧基丁羰氧)-6-(5-羧基戊羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。

图8冬凌草茎水提物粉末中的3-O-[E-2-(4-羧基丁羰氧)-3-羟基-4-(3-羧基丙羰氧)-5-甲酰氧-6-(4-羧基-1-丁烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。

图9冬凌草茎水提物粉末中的3-O-[E-2-甲酰氧-3,4-二(5-羧基-1-戊烯羰氧)-5-(8-羧基-1-辛烯羰氧)-6-(7-羧基-1-庚烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。

图10冬凌草茎水提物粉末中的3-O-[E-2-羧基乙酰氧-3,6-二(5-羧基-1-戊烯羰氧)-4-(4-羧基-1-丁烯羰氧)-5-(8-羧基-1-庚烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。

图11冬凌草茎水提物粉末中的3-O-[E-2,4-二(4-羧基-1-丁烯羰氧)-3-羟基-5-(5-羟基戊羰氧)-6-(5-羟基-1,3-戊二烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。

图12冬凌草茎水提物粉末中的3-O-[E-2-(4-羧基丁羰氧)-3-羟基-4-(4-羧基-1-丁烯羰氧)-5,6-二(5-羟基-1-戊烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。

图13冬凌草茎水提物粉末中的3-O-[E-2,4-二(4-羧基丁羰氧)-3-羟基-5-(3-羟基丙酰氧)-6-羧基乙酰氧桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。

图14冬凌草茎水提物粉末中的3-O-[E-2-甲酰氧-3-(5-羧基-1-戊烯羰氧)-4-(4-羧基-1-丁烯羰氧)-5-(8-羧基-1-辛烯羰氧)-6-(5-羟基戊羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。

图15冬凌草茎水提物粉末中的3-O-[E-2,5-二羟甲氧-4-(3-羧基丙酰氧)-6-(5-羧基戊羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。

图16冬凌草茎水提物粉末中的3-O-[E-2-(5-羟基戊羰氧)-3-羟基-4-(4-羧基丁羰氧)-5,6-二羧基乙酰氧桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。

图17冬凌草茎水提物粉末中的3-O-[E-2-(4-羧基丁羰氧)-4,6-二(4-羧基-1-丁烯羰氧)-5-(3-羧基丙羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。

图18冬凌草茎水提物粉末中的3-O-[E-2-(3-羧基丙酰氧)-3-(5-羧基-1-戊烯羰氧)-4,6-二(4-羧基-1-丁烯羰氧)-5-(8-羧基-1-辛烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。

图19冬凌草茎水提物粉末中的3-O-葡萄糖苷-3’-(6-羟基己羰氧)-4’-甲氧-5’-(5-羟基戊羰氧)槲皮素及裂解产物。

图20冬凌草茎水提物粉末中的3-O-葡萄糖苷-2’-羟基-3’-羟甲氧-4’-羟基乙酰氧-5’,6’-二羧基乙酰氧槲皮素及裂解产物。

图21冬凌草茎水提物粉末中的3-O-葡萄糖苷-2’,6’-二羟甲氧基-3’-(3-羟基丙羰氧)-4’-羟基-5’-(3-羧基丙酰氧)槲皮素及裂解产物。

图22冬凌草茎水提物粉末中的3-O-葡萄糖苷-2’,6’-二甲氧-3’-(5-羟基-1,3-戊二烯羰氧)-4’-(3-羟基-1-丙烯羰氧)槲皮素及裂解产物。

图23冬凌草茎水提物粉末中的3-O-葡萄糖苷-3’-(4-羧基-1-丁烯羰氧)-4’-(4-羧基丁羰氧)槲皮素及裂解产物。

图24冬凌草茎水提物粉末中的3-O-葡萄糖苷-2’-羟基-4’-(3-羧基丙烯酰氧)-5’-(3-羧基丙羰氧)槲皮素及裂解产物。

图25冬凌草茎水提物粉末中的3-O-葡萄糖苷-2’-甲氧-4’-(3-羧基-1-丙烯羰氧)-5’-(5-羟基-1-戊烯羰氧)-6’-(7-羟基-1,3-庚二烯羰氧)槲皮素及裂解产物。

图26冬凌草茎水提物粉末中的3-O-葡萄糖苷-2’-甲氧-4’,5’-二羟甲氧-6’-(7-羟基庚羰氧)槲皮素及裂解产物。

图27冬凌草茎水提物粉末中的3-O-葡萄糖苷-2’,3’-二甲酰氧-4’-(4-羧基-1-丁烯羰氧)-5’-(3-羧基丙羰氧)-6’-(4-羟基-1-丁烯羰氧)槲皮素及裂解产物。

图28冬凌草茎水提物粉末中的3-O-葡萄糖苷-2’-羟基-3’,5’-二羟甲氧-4’-羧基乙酰氧-6’-(3-羧基丙酰氧)槲皮素及裂解产物。

图29冬凌草茎水提物粉末中的3-O-葡萄糖苷-2’,3’,4’-三甲酰氧-5’-(4-羟基-1,3-丁二烯羰氧)-6’-羧基乙酰氧槲皮素及裂解产物。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明,下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的,它们仅用来对本发明进行具体描述,不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备冬凌草茎水提物粉末

取300g干冬凌草茎用自来水洗洗净,切碎。切碎的茎在700-1200mL蒸馏水中于50℃-100℃加热.0.5-4小时,同时搅拌200-400rpm)。冷却至室温,过滤,滤液减压浓缩得到72g冬凌草茎水提物粉末。

实施例2测定冬凌草茎水提物粉末的色谱和质谱离子流谱

2-1.样品溶液的制备(10mg/mL)

称取26.7mg冬凌草茎水提物粉末,用2.67mL超纯水中将粉末溶解。得到的溶液经超声震荡1分钟,之后再于13000rpm离心10分钟。取上清液,过0.22μm滤膜,置于样品瓶中供色谱和质谱测定用。

2-2色谱条件

色谱柱:Waters,Acquity

表1流动相梯度表

2-3.测定色谱图

按照上面的色谱测定条件测定并记录冬凌草茎水提物粉末的UPLC色谱图(见说明书附图1)。

2-4.测定离子流谱和质谱的条件

电喷雾离子化模式为正(PI)及负(NI)模式。离子模式参数:毛细管电压为1000V,去溶剂气流速为800L/h,温度450℃,源温度为120℃,锥孔气流速为50L/h,喷雾气压为6bar,碎裂电压为20-45V,取样锥电压为6V,采集模式为MSE continuum分辨率模式,带电粒子的质量数与电荷数之比(m/z)数据采集范围为100-1500,低能量通道Trap碎裂电压为6V,高能量通道Trap碎裂电压选择梯度电压为20-60V,选取LE(亮氨酸脑啡肽)为质量锁采集m/z,范围为100-1500。

2-5.记录离子流谱和质谱

按照上面的条件测定并记录冬凌草茎水提物粉末的离子流谱(见说明书附图1)。

实施例3指定冬凌草茎水提物粉末中28种组分的结构

将实施例2的UPLC色谱与质谱联接,测定冬凌草茎水提物粉末的UPLC-质谱。质谱条件是电喷雾离子化的正离子和负离子两种模式。离子模式参数:毛细管电压为1000V,去溶剂气流速为800L/h,温度450℃,源温度为120℃,锥孔气流速为50L/h,喷雾气压为6bar,碎裂电压为20-45V,取样锥电压为6V,采集模式为MSE continuum分辨率模式,带电粒子的质量数与电荷数之比(m/z)数据采集范围为100-1500,低能量通道Trap碎裂电压为6V,高能量通道Trap碎裂电压选择梯度电压为20-60V,选取LE(亮氨酸脑啡肽)为质量锁采集m/z,范围为100-1500。在30分钟内分出28个独立峰。根据质谱裂解规律,这些峰(按照总离子流图谱从左到右的峰顺序)的结构指定见表2。

表2测得的总离子流图谱中峰对应组分保留时间,负离子质量数,结构及名称

实施例4评价冬凌草茎水提物粉末的抗肿瘤作用

ICR雄性小鼠,体重20±2g,从由北京维通利华实验动物技术有限公司购买。实验分为生理盐水(空白对照)组,阿霉素(阳性对照)组和冬凌草茎水提物粉末组。每组12只小鼠。小鼠腋皮下接种S180腹水瘤。无菌条件下抽取生长旺盛的S180腹水瘤瘤液,用生理盐水稀释成为1:2的液体之后充分混合。制得的肿瘤细胞悬液用新鲜配制的0.2％台盼蓝染色,混匀后按白细胞计数方法计数,染蓝色者为死细胞,不染色者为活细胞。按公式计算细胞浓度和细胞存活率。即细胞浓度＝4大方格内活细胞数/4×10

小鼠接种S180瘤细胞悬液之后,生理盐水组的小鼠每天按照0.2mL/只小鼠口服生理盐水,连续口服7天；阿霉素组的小鼠每天按照2μmol/kg腹腔注射阿霉素,连续注射7天；冬凌草茎水提物粉末组的小鼠每天按照35mg/kg口服；冬凌草茎水提物粉末,连续口服7天。第8天称小鼠体重,乙醚麻醉之后脱颈椎处死。用镊子固定小鼠右腋肿瘤生长部位,剪开皮肤,暴露肿瘤,钝性剥离,称重。用瘤重表示冬凌草茎水提物粉末的抗肿瘤活性。结果见表3。结果表明在35mg/kg/天口服剂量下冬凌草茎水提物粉末有明确的抗肿瘤作用。

表3冬凌草茎水提物粉末的抗肿瘤活性

a)与生理盐水比p<0.05；n＝12。