基于LCMS高通量分析植物次生代谢产物的方法及应用

摘要

本发明公开了一种基于LCMS高通量分析植物次生代谢产物的方法，采用Scheduled‑MRM模式，实现在45min内一针进样，同时对花色素、苯甲酸及其衍生物、儿茶素及其衍生物、香豆素及其衍生物、二氢查尔酮、黄烷酮、黄酮、黄酮醇、异黄酮、苯丙素类、原花青素、二苯乙烯类、萜类等13大类共计130种植物次生代谢产物进行高通量绝对定量分析。该方法前处理提取效率高，且仪器分析方法线性范围宽，可同时检测分析含量差异较大的高丰度和低丰度次生代谢产物；线性相关性好，相关系数均高于0.995；部分物质定量限低至0.01ng/mL，方法灵敏度高；准确度为80.2％～118.2％，精密度为0.7％～119.9％；并通过Scheduled‑MRM扫描能兼顾高通量及方法灵敏度，可广泛用于不同复杂植物样本中次生代谢产物分析。

说明书

技术领域

本发明属于生物分析领域，涉及一种基于LCMS高通量分析植物次生代谢产物的方法及应用，具体涉及130种植物次生代谢产物的LCMS绝对定量分析方法和应用。

背景技术

植物次生代谢产物(secondary metabolites)是指植物体内一大类并非生长发育所必需的小分子有机化合物，是植物在长期演化过程中形成的天然活性成分。目前常见的次生代谢产物有生物碱、苯丙素类、类黄酮、烯萜类、皂苷类、酚酸类及醌类等物质，它们对植物的生长、繁衍、适应等生理过程都具有重要的作用，对植物自身而言它们具有防御天敌、抗病和抗虫侵複等功能。此外，大量研究表明，植物次生代谢产物具有明显的药用价值，一方面可以根据天然药用物质的结构指导新药研发，另一方面，植物次级代谢提取物可以直接用药，具有抗氧化、抗癌、抗肿瘤等药用功效，也可以作为食品添加剂，是天然的风味物质。因此，植物次生代谢物已经成为当前研究和开发利用的热点。

但是，植物基质十分复杂，其次生代谢产物具有结构多样、数量多，且存在大量异构体、不稳定、含量差异较大等特点，大大增加了它们的分析检测难度，是目前对于植物次生代谢物研究的一大挑战。本发明通过优化前处理方法，极大地提高了不同植物样本中不同类型次生代谢产物的提取率，降低了提取过程中代谢物的不稳定性，并通过优化LCMS分析方法，提高了方法的分离度和灵敏度，使得本方法满足异构体及含量差异较大的代谢产物使用的同时，进行高通量分离分析。

发明内容

本发明通过优化LCMS方法和样本前处理方法，提高检测方法灵敏度和分析通量，对花色素、苯甲酸及其衍生物、儿茶素及其衍生物、香豆素及其衍生物、二氢查尔酮、黄烷酮、黄酮、黄酮醇、异黄酮、苯丙素类、原花青素、二苯乙烯类、萜类等13大类共计130种酚类物质进行高通量绝对定量分析，极大地解决了目前针对植物次级代谢产物含量低、异构体多、基质复杂等分析难题。

本发明提供的基于LCMS高通量分析植物次生代谢产物的方法，所述方法包括以下步骤：

步骤(1)：向冻干后的植物样品中加入水和醇的混合溶液，再加入第一溶剂后研磨、超声提取；

步骤(2)：将步骤(1)提取后的混合液离心取上清，然后向剩余的残渣中加入水和醇的混合溶液，涡旋后超声提取；

步骤(3)：将步骤(2)提取后的混合液离心取上清，将离心的上清液挥干，然后用水和第二溶剂的混合溶液复溶，涡旋后超声提取；

步骤(4)：将步骤(3)提取后的混合液离心，取上清液并配制130种代谢物标准品；

步骤(5)：将步骤(4)获得的130种代谢物标准品工作液分成7管混标，浓度为10-200ng/mL；

步骤(6)：将步骤(5)配制的标准品进行母离子扫描、子离子扫描和MRM扫描，进行特征母子离子对的筛选和优化去簇电压DP、碰撞能CE、离子源参数(CUR、CAD、IS、TEM、GAS1、GAS2)；

“优化去簇电压DP、碰撞能CE、离子源参数(CUR、CAD、IS、TEM、GAS1、GAS2)”具体指：通过对比不同化合物在不同DP(20-200eV)、CE(10-80eV)、离子源参数气帘气CUR(30-50psi)、碰撞气CAD(Low、medium、High)、喷雾电压IS(正离子模式：4000-5500V；负离子模式：-3000～-4500V)、离子源温度TEM(350-700℃)、辅助气GAS1(30-60psi)、辅助气GAS2(30-60psi)，确定每个化合物最佳灵敏度下的质谱条件。

步骤(7)：将步骤(6)优化后的离子对及质谱参数编辑好后，优化色谱方法，包括色谱柱及流动相优化；

“色谱柱及流动相优化”具体指：色谱柱分别选择了Waters BEH C18(100*2.1mm,1.7μm)；Waters HSS T3(100*2.1mm,1.8μm)；Phenomenex Kinetex Polar C18(100*2.1mm,2.7μm)三种不同型号的色谱柱进行了优化，通过比较相同梯度下不同异构体的分离度情况最终选择了Waters HSS T3(100*2.1mm,1.8μm)，并延长了色谱分离时间，且当pH值调整为3.1，即0.1％甲酸时，能实现最佳的分离度。

步骤(8)：将步骤(7)优化后的液质方法编辑好后，进行130种代谢物混合标准品检测，确定每个化合物的色谱保留时间，形成分段Scheduled-MRM扫描(分段MRM扫描)。

步骤(1)中，所述植物样本是指拟南芥叶片、烟草叶片等。

步骤(1)中，所述醇为甲醇、乙醇等；优选地，为甲醇。

步骤(1)中，所述第一溶剂为氯仿、二氯甲烷、MTBE等；优选地，为氯仿。

步骤(1)中，所述水、醇、第一溶剂的体积比为(1-3)：(1-2)：(1-2)；优选地，为1：2：2。

其中，所述水和醇的混合液中还包括0.2％的BHT。

步骤(1)中，所述研磨的时间为1-5min；优选地，为1-3min；进一步优选地，为2min。

步骤(1)中，所述研磨的频率为40-90Hz；优选地，为60Hz。

步骤(1)中，所述超声提取的时间为10-30min；优选地，为20min。

步骤(1)中，所述超声提取的温度为4-15℃；优选地，为4℃。

步骤(2)中，所述离心的温度为4-15℃；优选地，为4-10℃；进一步优选地，为4℃。

步骤(2)中，所述离心的转速为11000-15000rpm；优选地，为11000-14000rpm；进一步优选地，为13000rpm。

步骤(2)中，所述离心的时间为5-20min；优选地，为5-15min；进一步优选地，为10min。

步骤(2)中，所述醇为甲醇、乙醇等；优选地，为甲醇。

步骤(2)中，所述水、醇的体积比为1：2。

步骤(2)中，所述涡旋的时间为0.5-3min；优选地，为1-3min；进一步优选地，为1min。

步骤(2)中，所述超声提取的时间为10-30min；优选地，为20min。

步骤(2)中，所述超声提取的温度为4-15℃；优选地，为4℃。

步骤(3)中，所述离心的温度为4-15℃；优选地，为4-10℃；进一步优选地，为4℃。

步骤(3)中，所述离心的转速为11000-15000rpm；优选地，为11000-14000rpm；进一步优选地，为13000rpm。

步骤(3)中，所述离心的时间为5-20min；优选地，为5-15min；进一步优选地，为10min。

步骤(3)中，所述“挥干”是指通过真空冷冻浓缩机对样本进行溶剂挥发；其目的为对样本进行浓缩。

步骤(3)中，所述“复溶”是指向样本中加入一定量的溶剂；其目的为对样本进行定容。

步骤(3)中，所述第二溶剂为甲醇、乙腈等；优选地，为甲醇。

步骤(3)中，所述水、第二溶剂的体积比为(1-2)：(1-2)；优选地，为1:2。

其中，所述水和甲醇的混合液中含有内标L-2-氯苯丙氨酸；浓度为5-20ng/mL；优选地，为12ng/mL。

步骤(3)中，所述涡旋的时间为1-3min；优选地，为2min。

步骤(3)中，所述超声提取的时间为10-30min；优选地，为20min。

步骤(3)中，所述超声提取的温度为4-15℃；优选地，为4℃。

步骤(4)中，所述离心的温度为4-15℃；优选地，为4-10℃；进一步优选地，为4℃。

步骤(4)中，所述离心的转速为11000-14000rpm；优选地，为11000-13000rpm；进一步优选地，为13000rpm。

步骤(4)中，所述离心的时间为5-15min；优选地，为5-10min；进一步优选地，为5min。

本发明步骤(2)-(4)离心后的上清液合后并优选转移到棕色LC进样瓶中，-80℃下保存。

步骤(5)中混标中应避免异构体的存在，即异构体需分配在不同的混标中。

步骤(5)中，将步骤(4)获得的130种代谢物标准品工作液分成7管混标，浓度优选为100ng/mL。

步骤(6)中，将步骤(5)配制的标准品优选通过液相自动进样器进样方式进行母离子扫描、子离子扫描和MRM扫描。

步骤(7)中，所述色谱柱为色谱柱Waters BEH C18(100*2.1mm,1.7μm)；WatersHSS T3(100*2.1mm,1.8μm)；Phenomenex Kinetex Polar C18(100*2.1mm,2.7μm)中的一种或多种；优选地，为Waters HSS T3(100*2.1mm,1.8μm)。

步骤(7)中，所述色谱分离的时间为45min。

步骤(7)中，所述色谱分离的pH值为2.5-4；优选地，为3.1，即0.1％甲酸时，能实现最佳的分离度。

在一具体实施方式中，所述方法包括以下步骤：

(a)样本处理

取冻干后植物样品约50mg，加入600μL水：甲醇(V:V＝1:2，含0.2％BHT)，再加入400μL氯仿和2颗钢珠，研磨机研磨(60Hz，2min)，然后4℃超声提取20min；离心10min(4℃，13000rpm)，取上清500μL装入EP管中；向残渣中继续加入400μL水：甲醇(V:V＝1:2)，涡旋1min，超声提取20min；离心10min(4℃，13000rpm)，取300μL上清，跟上一批500μL上清合并，共计800μL；取100μL上清挥干，然后用100μL水：甲醇(V:V＝1：2)复溶，含12ng/mL内标(L-2-氯苯丙氨酸)，涡旋2min，超声20min；离心5min(4℃，13000rpm)，取80μL上清液，转移到棕色LC进样瓶中，-80℃下保存，直到上机分析。

由于植物基质复杂，且次生代谢产物具有极性小，一些脂质类物质容易对其检测造成干扰；次生代谢产物含量少，且一些黄酮类物质容易氧化降解等特点。本发明通过优化，在提取过程中加入了抗氧化剂BHT，极大地降低了次生代谢产物在提取过程中的降解。同时，在提取过程中加入了氯仿，清除了一些植物色素及磷脂类的物质对次生代谢物检测过程中的基质干扰。

(b)LCMS分析

(b-1)质谱方法优化

由于本发明中涉及的代谢物较多，且存在不少异构体，为了提高质谱方法优化效率，将130种代谢物标准品工作液分成7管混标，混标中应避免异构体的存在，即异构体需分配在不同的混标中，通过液相自动进样器进样方式进行母离子扫描、子离子扫描和MRM扫描进行特征母子离子对的筛选和优化去簇电压DP、碰撞能CE、离子源参数(CUR、CAD、IS、TEM、GAS1、GAS2)等质谱参数，实现目标化合物离子对的快速筛选和确定，最优条件如下：正离子模式：CUR：35psi；IS：5500V；TEM：600℃；Gas1：60psi；Gas2：50psi；负离子模式：CUR：35psi；IS：-4500V；TEM：600℃；Gas1：60psi；Gas2：50psi。

自动进样器进样法是直接根据化合物分子量信息，将所有物质的母离子在一定的质量窗口中进行预设，这样可以直接同时筛选并优化多个离子通道。传统最常用的质谱方法优化的方式是采用蠕动泵注射方式，这种过程需要人工一步一步优化，当物质较多时，工作量很大。因此，与蠕动泵注射方式相比，这种方式自动化程度高，通量大，大大节省了时间和人力成本。

(b-2)色谱方法优化

由于本发明中涉及的代谢物较多，且存着不少的异构体。为了实现代谢物的分离，分别进行了色谱柱、流动相pH值和洗脱梯度等方面的优化。

色谱柱分别选择了Waters BEH C18(100*2.1mm,1.7μm)；Waters HSS T3(100*2.1mm,1.8μm)；Phenomenex Kinetex Polar C18(100*2.1mm,2.7μm)三种不同型号的色谱柱进行了优化，最终选择了Waters HSS T3(100*2.1mm,1.8μm)，并延长了色谱分离时间，且当pH值调整为3.1，即0.1％甲酸时，能实现最佳的分离度，如图1A和图1B为最终混标分别在正离子和负离子模式下的提取离子流图。

最后，由于代谢物较多，为了保证所有化合物具有足够的扫描点数采用，通过Scheduled-MRM模式，该模式可以大大提高灵敏度及离子对通量，从而保证峰形和灵敏度。因而，本发明方法实现了一针进样即可在45分钟内对植物样本中13类共计130种次生代谢产物进行绝对定性定量分析。

本发明还提供了上述方法在定性/定量/绝对定量分析植物次生代谢产物中的应用。

本发明所述的植物次生代谢产物指花色素、苯甲酸及其衍生物、儿茶素及其衍生物、香豆素及其衍生物、二氢查尔酮、黄烷酮、黄酮、黄酮醇、异黄酮、苯丙素类、原花青素、二苯乙烯类、萜类等13大类共计130种植物次生代谢产物。

本发明的有益效果在于，本发明基于Sciex Qtrap 6500+液质联用平台，采用Scheduled-MRM模式，实现在45min内一针进样，同时对花色素、苯甲酸及其衍生物、儿茶素及其衍生物、香豆素及其衍生物、二氢查尔酮、黄烷酮、黄酮、黄酮醇、异黄酮、苯丙素类、原花青素、二苯乙烯类、萜类等13大类共计130种植物次生代谢产物进行高通量绝对定量分析。该方法前处理提取效率高，且仪器分析方法线性范围宽，宽至2-4个数量级，可同时检测分析含量差异较大的高丰度和低丰度次生代谢产物；线性相关性好，线性相关系数均高于0.995；部分物质定量限低至0.01ng/mL，方法灵敏度高；方法准确度为80.2％～118.2％，精密度为0.7％～119.9％；并通过Scheduled-MRM扫描能在兼顾高通量及方法灵敏度，可广泛用于不同复杂植物样本中次生代谢产物分析。

附图说明

图1为最终混标分别在正离子和负离子模式下的提取离子流图。其中，图1A为标准品正离子模式提取离子流图；图1B为标准品负离子模式提取离子流图。备注：图中横坐标表示：保留时间，min；纵坐标表示：响应强度，cps。

图2为进行130种次生代谢产物LC-MS/MS分析，部分样本检测的提取离子流图。其中，图2A为芍药根总离子流图；图2B为拟南芥叶片总离子流图；图2C为烟草叶片总离子流图；图2D为D中药总离子流图。备注：图中横坐标表示：保留时间，min；纵坐标表示：响应强度，cps。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例一

1、材料与方法

1.1试剂与材料

130种植物次生代谢物标准品(纯度≥98％)，具体信息见表1，均购自上海源叶生物。色谱级试剂甲醇、乙腈、氯仿、水均购自Sigma-Aldrich。

实验所用中药复方粉末、茶叶叶片、烟草叶片、水稻叶片、三七叶片、拟南芥叶片等11种不同植物样本取材自上海中医药大学、上海市农科院等单位。

表1代谢物信息表

1.2标准品制备

用分析天平精密称取适量的标准品，用甲醇溶解，得到标准储备液，储备液浓度均为1mg/mL，梯度稀释储备液，浓度分别为5000ng/mL(工作液1)，100ng/mL(工作液2)，其中工作液1用于配制混合标准溶液；工作液2用于质谱条件的优化。

1.3LC-MS/MS分析方法

本实施例采用UPLC-ESI-MS/MS分析方法，对目标代谢物进行定性定量检测，具体分析条件和分析方法如下：

质谱系统采用的是美国AB Sciex公司的Qtrap6500+质谱检测系统，配有电喷雾(ESI)离子源和Analyst 1.7工作站。优化的质谱分析条件如下：气帘气：30psi；离子喷雾电压：-4500/5500V；源温度：550℃；雾化气：35psi；辅助加热气：45psi，每个代谢物离子对信息如下表2所示：

表2 130种次级代谢物离子对及参数

色谱系统采用的是岛津公司超高效液相色谱仪，配Waters ACQUITY UPLC HSS T3(100*2.1mm,1.8μm)液相色谱柱，柱温为40℃，进样量为5μL。流动相A(0.1％甲酸-水)，流动相B(乙腈)，采用梯度洗脱，方法如下表所示：0minA/B(95:5，V/V)，3minA/B(95:5，V/V)，36minA/B(45:55，V/V)，39minA/B(0:100，V/V)，42minA/B(0:100，V/V)，42.1minA/B(95:5，V/V)，45minA/B(95:5，V/V)。

1.4样本制备

取冻干后植物样品约50mg，加入600μL水：甲醇(V:V＝1:2，含0.2％BHT)，再加入400μL氯仿和2颗钢珠，研磨机研磨(60Hz，2min)，然后4℃超声提取20min；离心10min(4℃，13000rpm)，取上清500μL装入EP管中；向残渣中继续加入400μL水：甲醇(V:V＝1:2)，涡旋1min，超声提取20min；离心10min(4℃，13000rpm)，取300μL上清，跟上一批500μL上清合并，共计800μL；取100μL上清挥干，然后用100μL水：甲醇(V:V＝1：2)复溶，含12ng/mL内标(L-2-氯苯丙氨酸)，涡旋2min，超声20min；离心5min(4℃，13000rpm)，取80μL上清液，转移到棕色LC进样瓶中，-80℃下保存，直到上机分析。

1.5数据分析

利用SCIEX OS-MQ软件(美国Sciex公司)中采用优化后的参数对各MRMtransition进行自动识别和积分，并辅助人工检查。

2结果与讨论

2.1质谱方法优化

由于本发明中涉及的代谢物较多，且存在不少异构体，为了提高质谱方法优化效率，将130种代谢物标准品工作液分成7管混标，混标中应避免异构体的存在，即异构体需分配在不同的混标中，通过液相自动进样器进样方式进行母离子扫描、子离子扫描和MRM扫描进行特征母子离子对的筛选和优化去簇电压DP、碰撞能CE、离子源参数(CUR、CAD、IS、TEM、GAS1、GAS2)等质谱参数，实现目标化合物离子对的快速筛选和确定，最优条件如下：正离子模式：CUR：35psi；IS：5500；TEM：600℃；Gas1：60psi；Gas2：50psi；负离子模式：CUR：35psi；IS：-4500V；TEM：600℃；Gas1：60psi；Gas2：50psi。

自动进样器进样法是直接根据化合物分子量信息，将所有物质的母离子在一定的质量窗口中进行预设，这样可以直接同时筛选并优化多个离子通道。传统最常用的质谱方法优化的方式是采用蠕动泵注射方式，这种过程需要人工一步一步优化，当物质较多时，工作量很大。因此，与蠕动泵注射方式相比，这种方式自动化程度高，通量大，大大节省了时间和人力成本。

2.2色谱方法优化

由于本发明中涉及的代谢物较多，且存着不少的异构体。为了实现代谢物的分离，分别进行了色谱柱、流动相pH值和洗脱梯度等方面的优化。

色谱柱分别选择了Waters BEH C18(100*2.1mm,1.7μm)；Waters HSS T3(100*2.1mm,1.8μm)；Phenomenex Kinetex Polar C18(100*2.1mm,2.7μm)三种不同型号的色谱柱进行了优化，最终选择了Waters HSS T3(100*2.1mm,1.8μm)，并延长了色谱分离时间，且当pH值调整为3.1，即0.1％甲酸时，能实现最佳的分离度，如图1A和图1B为最终混标分别在正离子和负离子模式下的提取离子流图。

最后，由于代谢物较多，为了保证所有化合物具有足够的扫描点数采用，通过Scheduled-MRM模式，该模式可以大大提高灵敏度及离子对通量，从而保证峰形和灵敏度，且方便后续增加更多的化合物。因而，本发明方法实现了一针进样即可在45分钟内对植物样本中13类共计130种次生代谢物进行绝对定性定量分析。

2.3样本制备

由于植物基质的复杂，且次生代谢产物具有极性小，一些脂质类物质容易对其检测造成干扰；含量少；且一些黄酮类物质容易氧化降解等特点。本发明提取方法在Vrhovsek等人的方法上进行优化，在提取过程中加入了抗氧化剂BHT，极大地降低了次生代谢产物在提取过程中的降解。同时，在提取过程中加入了氯仿，清除了一些植物色素及磷脂类的物质对次生代谢物检测过程中的基质干扰。

2.4方法学考察

为了保障本发明方法的准确性与可靠性，本发明从方法的灵敏度、线性范围及精密度等方面进行了方法学考察来保障方法的适用性、稳定性及可靠性。

2.4.1线性范围及灵敏度

本发明采用外标法定量，对母液进行梯度稀释，S1～S12分别为：0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、5、10、25、50、100、200ng/mL，一般取5-7个有效的数据点，保证标准曲线每个点的实际值与其理论值之间偏差不超过20％。以不同浓度梯度标准品浓度(ng/mL)为横坐标，质谱峰的峰面积(PeakArea)为纵坐标，采用最小二乘法进行线性拟合绘制不同代谢物的标准曲线，不同代谢物的线性范围见表3，130种次生代谢物的线性相关系数(R

混合标准品进行梯度稀释，考察本发明方法的灵敏度，最低定量限(LLOQ)定义为信噪比(S/N≥10)的浓度，所有130种次生代谢物的LLOQ见表3，所有代谢物的最低定量限都为ng/mL级别，(2S)-Liquiritigenin等26种代谢物的LLOQ低至0.01ng/mL，说明本发明方法灵敏度高，满足次生代谢物等痕量物质的检测需求。

表3 130种次生代谢物最低定量限(LLOQ)、线性范围、回归方程及相关系数

2.4.2准确度及精密度

根据中国药典2015版四部《通则9012生物样品定量分析方法验证指导原则》及每个化合物的最低定量限及线性范围低、中、高三个浓度，每个浓度连续测5个重复，通过实测值与理论值的比值计算准确度，通过计算峰面积的RSD值考察方法的日内精密度，连续测三天考察日间精密度，考察结果见表4，根据结果显示：130种代谢物的准确度为80.2％～118.2％，精密度为0.7％～119.9％，表明本发明所述方法稳定可靠，可满足定性定量检测要求。

表4方法准确度及精密度(n＝5)

2.5方法应用

收集中药复方粉末、茶叶叶片、烟草叶片、水稻叶片、三七叶片、拟南芥叶片等11种不同植物样本，每种3个重复，进行130种次生代谢产物LC-MS/MS分析，部分样本检测的提取离子流图如图2A～2D所示，所有样本代谢物检出的数量如表5所示。

表5不同植物样本中130种植物次生代谢产物的检出情况(n＝3)

*ng/mL该单位为0.001～0.01、0.01～0.1、0～10、10～100、>100等不同浓度区间的单位。

通过对不同样本中次级代谢产物的检测浓度分析可知，本发明所述方法线性范围宽，能满足不同类型的复杂植物样本定量分析要求，中药、烟草叶片中次生代谢产物等活性物质多于拟南芥、水稻等。

3结论

本发明通过优化LCMS方法实现了在45min内一针进样，同时对花色素、苯甲酸及其衍生物、儿茶素及其衍生物、香豆素及其衍生物、二氢查尔酮、黄烷酮、黄酮、黄酮醇、异黄酮、苯丙素类、原花青素、二苯乙烯类、萜类等13大类共计130种植物次生代谢产物进行高通量绝对定量分析。本发明前处理提取效率高，且仪器分析方法线性范围宽，宽至2-4个数量级，可同时检测分析含量差异较大的高丰度和低丰度次生代谢产物；线性相关性好，线性相关系数均高于0.995；部分物质定量限低至0.01ng/mL，方法灵敏度高；方法准确度为80.2％～118.2％，精密度为0.7％～119.9％，并通过Scheduled-MRM扫描能在兼顾高通量及方法灵敏度；方法稳定可靠，能满足不同类型的植物样本检测要求。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。