基于链置换等温扩增技术及反向荧光增强技术检测miRNA的方法及检测试纸

摘要

本发明属于miRNA检测领域，尤其是涉及一种基于链置换等温扩增技术及反向荧光增强技术检测miRNA的方法及检测试纸，包括下述步骤：(1)均一粒径胶体金的制备：(2)高荧光猝灭性能AuNP@hDNA‑BHQ2探针的制备；(3)Klenow聚合酶实现链置换等温扩增；(4)核酸试纸条的组装和检测：实现样品中miRNA的高效特异性检测，通过SH‑hDNA‑BHQ2的核苷酸序列和不同的引物设计协同作用，可以从待测样品中高特异性的检测出目标miRNA，实现高特异性检测。

说明书

技术领域

本发明属于miRNA检测领域，尤其是涉及一种基于链置换等温扩增技术及反向荧光增强技术检测miRNA的方法及检测试纸。

背景技术

包括帕金森病(PD)和阿尔兹海默症(AD)在内的神经退行性疾病对全球2-3％的老年人群产生了重大影响。运动障碍帕金森病评分表(MSD-UPDRS)等评估量表是临床常用的神经退行性疾病诊断方法，量表法主要通过医生基于症状组合的识别进行主观诊断评估，临床上尚缺乏客观的生化分析方法对神经性退行性疾病进行体外检测。近来一些研究表明，miRNA-5010和miRNA-331在神经退行性疾病尤其是帕金森病人的全血样本中显著上调，因此，准确定量miRNA-5010和miRNA-331对帕金森病的早期筛查与诊断具有重要意义。传统的基于miRNA的检测如基因测序、荧光定量PCR等，但是这些检测方式毫无例外都需要大型的仪器配合，不仅费时、费力，而且只适合医院等一些检测机构，无法造福于每个家庭以实现便携、惠民大众化。因此miRNA-5010和miRNA-331的早期简便检测已经成为现今的研究热点。

胶体金核酸试纸条是一种对复杂样品中目标物质进行检测的固相免疫分析方法，其主要原理如下：利用胶体金标记一种短的DNA序列，与目标物质核酸反应形成复合物，由于毛细管作用在固相层析膜上涌动，被检测线上的DNA序列捕获，形成肉眼可见的T线。一定条件下，T线信号强弱与目标核酸浓度正相关，将胶体金免疫层析检测试纸条联合胶体金读取仪的方法，根据反射光度法原理，可以快速、准确、简单的对相关物质进行定量或者半定量检测，胶体金核酸试纸条已成为一种核酸即时检验(Point-of-caretesting,POCT)方法。

近年来，研究者将核酸检测的关注点集中在POCT技术的开发应用上，从而实现核酸标志物的现场检测。反向荧光增强试纸条(rLFTS)基于金纳米粒子(AuNP)可以肉眼定性和定量荧光猝灭信号，与传统荧光增强试纸条(LFTS)相比具有更低的检测限(LOD)，AuNP检测探针的荧光淬灭是rLFTS灵敏度提高的主要因素。黑洞淬灭剂(BHQ)是一类高效荧光淬灭剂，因此，制备BHQ2标记的AuNP将有助于增强探针的荧光猝灭特性，从而提高rLFTS的灵敏度。

链置换等温扩增技术是一种基于酶促反应的核酸体外等温扩增技术，该技术通过内切酶对目标DNA的未修饰链进行切口，然后通过聚合酶在DNA切口的3’端延伸并置换下游DNA链的反应，将置换的DNA链充当反义反应的模板，目标DNA获得指数扩增，有助于miRNA的灵敏检测。其中，“入侵堆叠引物”链置换等温扩增反应(ISAR)显示了miRNA灵敏检测的独特优势，实现连续堆叠杂交和置换反应，显著提高等温扩增效率。

发明内容

本发明提出了一种基于链置换等温扩增技术及反向荧光增强技术检测miRNA的方法及检测试纸，具体技术方案如下；

一种基于链置换等温扩增技术及反向荧光增强技术检测miRNA的方法,包括下述步骤：

(1)均一粒径胶体金的制备：使用水热法制备均一粒径的胶体金纳米粒子；

(2)高荧光猝灭性能AuNP@hDNA-BHQ2探针的制备：通过金巯键反应将SH-DNA-BHQ2与AuNP反应，制得到的两种AuNP@hDNA1-BHQ2探针；AuNP@hDNA1-BHQ2探针以及AuNP@hDNA2-BHQ2探针,其中AuNP@hDNA1-BHQ2与miRNA-5010互补杂交配对,AuNP@hDNA2-BHQ2与miRNA-331互补杂交配对；

(3)Klenow聚合酶实现链置换等温扩增：miRNA-5010和miRNA-331分别通过核酸杂交打开对应的hDNA的配对茎序列；生物素标记引物Biotin-Primer和地高辛标记引物Digoxin-Primer与相应被打开的hDNA的茎序列杂交，引物在Klenow聚合酶的帮助下进行延伸，逐渐取代目标miRNA，并与打开的hDNA完全杂交形成dsDNA双链序列，在AuNP的表面分别形成了dsDNA1-BHQ2-Biotin或dsDNA2-BHQ2-Digoxin，被取代的miRNA-5010或miRNA-331释放出来，循环参与扩增反应得到大量的AuNP@dsDNA1-BHQ2-biotin或AuNP@dsDNA2-BHQ2-digoxin反应液，实现信号放大。

(4)核酸试纸条的组装和检测：将所需的SA-Cy5、Digo-Ab-Cy3和羊抗鼠二抗通过划线仪分别划线到硝化纤维素膜上，并将试纸条卡壳和样本垫、胶金垫、检测垫、吸收垫组装起来，形成核酸试纸条；将上述反应步骤(3)产生的反应液加入到组装好的核酸试纸条上，反应一段时间后得到相应结果。

其中，hDNA1-BHQ2为5’-AACACATCGTCCCTGGGGAATGGGAGACACAAAAGGACGATGTG-BHQ2-3’；hDNA2-BHQ2为5’-AATGTGCTACGGGGATCCCTGGGACCATACCTAGCCGTAGCACA-BHQ2-3’。

步骤(1)的具体步骤为：将50-100mL的2-5mM柠檬酸钠水溶液添加到三颈烧瓶中并加热至沸腾；同时在不断搅拌下将1-5mL的10-30mM HAuCl4·4H2O添加到沸水中。加热10min后，溶液的颜色逐渐变为酒红色，使溶液缓慢冷却至室温；将上述反应制备的金种子加热到90℃后，分多次加入将5-10mL的10-30mM HAuCl4·4H2O添加到溶液中，最终制备得到的胶体金纳米粒子溶液粒径为13-40nm。

步骤(2)的具体步骤为：取10-50μL的浓度为10-50μM的SH-hDNA-BHQ2探针，加入10-50μL的浓度1-10mM的三(2-羧乙基)膦TCEP溶液，活化1-3h后，加入1-5mL的步骤(1)中制备的均一粒径纳米粒子，旋转培养反应6-24小时；之后加入10-100μL的8μg/μL的HCG鼠源单克隆抗体MIgG，反应1-5h；再加入0.1-0.5mL的浓度为3M的氯化钠溶液，置于4℃反应过夜后，在8000-15000转速条件下离心15-30min，除去上清，用0.1-0.5mL的0.01M磷酸缓冲溶液PBS重悬沉淀，得到的则为AuNP@hDNA-BHQ2探针。

所述步骤(3)的具体步骤在30-100μL溶液中进行，该溶液由10-20μL的待测目标样品、0.5-2μL Klenow聚合酶、10-20μL Biotin/Digoxin-Primer、AuNP@hDNA-BHQ2、10-20μL0.5mM dNTPs、10-20μL 2％DMSO和10-20μL 0.01M PBS的反应缓冲液组成；混合溶液在37℃中孵育20-40min后实现等温扩增。

步骤(4)中，SA-Cy5、Digo-Ab-Cy3的制备方法为：将SA和NHS-Cy5按照摩尔质量比1:1-5混合，用100-1000μL的硼酸BS缓冲溶液混匀，室温反应1-5h后，在4℃转速为5000-15000g高速离心30min去除上清后溶解沉淀，利用10kd的millipore超滤管离心处理，最终制备得到SA-Cy5；将抗地高辛抗体DigoxinAb和NHS-Cy3同法处理，最终制备Digo-Ab-Cy3。

步骤(4)的具体方法为：将样本垫切割为1.1-2cm之间；与样本垫一端抵靠接触的为胶金垫、将胶金垫切割为0.3-0.8cm；与胶金垫另一端抵靠接触的为检测垫、检测垫包含有检测线和质控线；将制得的SA-Cy5和Digo-Ab-Cy3用PBS定量溶解为1-5mg/mL；同时配制1-5mg/mL的羊抗鼠二抗；将所需的SA-Cy5、Digo-Ab-Cy3和羊抗鼠二抗通过划线仪分别划线到硝化纤维素膜上，形成检测miRNA-5010的T1线、检测miRNA-331的T2线、和检测AuNP@Abs的C线；试纸条包含样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸，在37℃干燥1h后，将各部份组装在背卡上，通过切条机将背卡切成2-5mm的单条；将步骤(3)中的反应试剂加入到试纸条,试纸条信号收集时间为5-15min，通过相应时间内的生检测线上胶体金信号的累积与相应miRNA浓度的关系，得到相应结果。

本发明还包括一种核酸试纸条技术，采用所述的方法制备得到。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

miRNA-5010和miRNA-331的含量与帕金森病(PD)和阿尔兹海默症(AD)在内的神经退行性疾病密切相关，但由于其低浓度，小尺寸和高同源性等特征，实现其快速，简单超灵敏的检测仍是一项巨大的挑战。我们将链置换等温扩增技术与反向荧光增强试纸条技术进行结合，实现对miRNA-5010和miRNA-331快速、灵敏同时检测，无需专业人员操作，成本较低，便于推广使用。

本申请能够显著提高miRNA的检测灵敏度。主要通过放大检测信号，增强探针的荧光猝灭特性两方面的有机结合，即以基于链置换等温扩增策略实现连续堆叠杂交和置换反应，提供更多待检测的d-DNA，用于核酸试纸条的检测；通过金巯键反应构建AuNP@hDNA-BHQ2探针，该探针同时包含AuNP及BHQ2，可进一步猝灭更多荧光信号，显著增强探针的荧光猝灭特性；从而显著提高了检测的灵敏度。

实现样品中miRNA-5010和miRNA-331的同时检测。通过在不同的测试线(T线)上分别标记Cy5和Cy3荧光分子，可在同一rLFTS实现miRNA-5010和miRNA-331的共同检测，有助于帕金森病的精准诊断。

实现样品中miRNA的高效特异性检测，通过SH-hDNA-BHQ2的核苷酸序列和不同的引物设计协同作用，可以从待测样品中高特异性的检测出目标miRNA，实现高特异性检测。

实现样品中miRNA的快速、灵敏直接检测，针对样品，由于链置换反应的高效性以及核酸试纸条的快速性，显著提高了样本中miRNA的检测时间，将miRNA检测时间缩短到35分钟左右。

附图说明：

图1为基于链置换等温扩增技术及反向荧光增强试纸条技术同检miRNA-5010和miRNA-331的方法原理示意图；

图2为链置换等温扩增反应琼脂糖凝胶电泳表征结果图；

图3为检测miRNA-5010和miRNA-331特异性的研究结果图；

图4为基于链置换等温扩增技术及反向荧光增强试纸条技术同检miRNA-5010和miRNA-331的灵敏度实验图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合附图和实施方式对本发明作进一步的详细说明；

本发明同时检测miRNA-5010和miRNA-331原理如图1所示，首先，使用水热法制备均一粒径的胶体金纳米粒子，接着将胶体金纳米粒子与巯基化的h-DNA分子茎环探针反应，制备高特异性的胶体金核酸探针。通过Au-S键的反应将SH-DNA-BHQ2与AuNP反应，形成具有高荧光猝灭性能的AuNP@hDNA-BHQ2探针。制得到的两种AuNP@hDNA1-BHQ2和AuNP@hDNA2-BHQ2探针分别与miRNA-5010和miRNA-331互补杂交配对，按照1:1混合后作为检测探针备用。最后，通过Biotin与SA，Digoxin和anti-Digoxin抗体之间的结合反应，AuNP@dsDNA1-BHQ2-biotin和AuNP@dsDNA2-BHQ2-digoxin两种复合物分别聚集在T1线(SA-Cy5)和T2线(Digo-Ab-Cy3)上，从而产生快速可视化颜色信号和明显的反向荧光增强信号(Cy5和Cy3染料的淬灭)。因此，基于链置换等温扩增构建的快速便携式金纳米反向荧光增强试纸条，可以实现miRNA-5010和miRNA-331的快速，便携和同步检测。

本方法的可行性验证如图2所示，如图2所示的琼脂糖凝胶(3％)电泳结果可清楚的观察到条带1中hDNA1-BHQ2的核酸序列，当hDNA1-BHQ2与miRNA-5010靶标之间进行互补碱基配对反应时，可以在稍高的凝胶电泳带位置(条带2)观察到hDNA1/miRNA-5010双链复合物。对在条带3和条带4进行分析表征，结果表明在没有miRNA-5010存在的情况下，条带3中仅观察到了hDNA1的条带，而在存在miRNA-5010的情况下，在较高位置出现了明亮的dsDNA1-BHQ2-biot in信号(条带4)，该3％琼脂糖凝胶电泳实验的证明，链置换等温扩增当且仅当存在目标miRNA的情况下才能发生相应。

实施例1:miRNA-5010和miRNA-331检测特异性的研究：

将75mL的2.2mM柠檬酸钠水溶液添加到三颈烧瓶中并加热至沸腾；同时在不断搅拌下将0.5mL的24mM HAuCl4·4H2O添加到沸水中。加热10min后，溶液的颜色逐渐变为酒红色，使溶液缓慢冷却至室温；将上述反应制备的金种子加热到90℃后，分多次加入将8mL的24mM HAuCl4·4H2O添加到溶液中，最终制备得到的胶体金纳米粒子溶液粒径为30nm。取20μL的浓度为20μM的SH-hDNA-BHQ2探针，加入20μL的浓度5mM的三(2-羧乙基)膦TCEP溶液，活化1小时后，加入3mL的步骤(1)中制备的均一粒径纳米粒子，旋转培养反应12小时；之后加入100μL的8μg/μL的HCG鼠源单克隆抗体MIgG，反应4小时；再加入0.5mL的浓度为3M的氯化钠溶液，置于4℃反应过夜后，在4℃转速为7093g下离心30min，除去上清，用0.1mL的0.01M磷酸缓冲溶液PBS重悬沉淀，得到的则为AuNP@hDNA-BHQ2探针。

将SA和NHS-Cy5按照摩尔质量比1:4混合，用500μL的硼酸BS缓冲溶液混匀，室温反应4h后，在4℃转速为11093g高速离心30min去除上清后溶解沉淀，利用10kd的millipore超滤管离心处理，最终制备得到SA-Cy5；将抗地高辛抗体DigoxinAb和NHS-Cy3同法处理，最终制备Digo-Ab-Cy3。将样本垫切割为1.2cm之间；与样本垫一端抵靠接触的为胶金垫、将胶金垫切割为0.5cm；与胶金垫另一端抵靠接触的为检测垫、检测垫包含有检测线和质控线；将制得的SA-Cy5和Digo-Ab-Cy3用PBS定量溶解为1.5mg/mL；同时配制2.5mg/mL的羊抗鼠二抗；将所需的SA-Cy5、Digo-Ab-Cy3和羊抗鼠二抗通过划线仪分别划线到硝化纤维素膜上，形成检测miRNA-5010的T1线、检测miRNA-331的T2线、和检测AuNP@Abs的C线；试纸条包含样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸，在37℃干燥1h后，将各部份组装在背卡上，通过切条机将背卡切成3mm的试纸条；

将15μL miRNA-5010(1×10

图像检测结果如图3所示：阴性对照NC组用于rLFTS检测时，只有质控C线有可视化红色信号，而T1和T2线均不出现可视化信号；当miRNA-5010(1×10

实施例2:miRNA-5010和miRNA-331共存时同步检测的研究：ISAR-rLFTS的选择性对于准确检测两种miRNA尤为重要，因此我们研究了不同浓度的miRNA-5010或miRNA-331的miRNA-331标准溶液混合对应的另一种miRNA后对检测结果的影响，其他反应如实施例1，阳性实验组为加入1×10

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为发明的保护范围。