相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年5月25日提交的题为“真核细胞选择性裂解的方法和组合物(METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE SELECTIVE LYSIS OF EUKARYOTIC CELLS)”的美国临时专利申请62/676,771号的优先权，其全部内容通过引用并入本文，还要求于2018年12月6日提交的题为“选择性裂解血细胞和分离微生物细胞的方法和组合物(METHODS ANDCOMPOSITIONS FOR THE SELECTIVE LYSIS OF BLOOD CELLS AND SEPARATION OFMICROBIAL CELLS)”的美国临时专利申请62/776,126号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
背景技术
耐药性病原体的出现是一场全球性的医疗危机，迫使医生使用更有效的抗生素治疗常见的传染病。这在很大程度上是因为识别致病菌的复杂性和所需的时间，迫使医生在知道培养样本中的高阴性率的情况下，仍然凭经验开出处方。最终结果是由于服用广谱和不必要的抗生素带来了副作用风险，耐药菌株的出现显著增加，治疗成本更高，回收周期更长。
在治疗出现脓毒症或感染性休克症状的患者时，通常会开出广谱抗生素。鉴于这些情况的严重性，医生通常会立即开出一种或多种广谱抗生素，并且在药物的全部效果得到评估或微生物学结果出来之前，不太可能改变治疗方案。例如，文件“拯救脓毒症战役指南”(SSCG)推荐了一种治疗方案，在该方案中，静脉注射抗生素(由一种或多种针对可能的细菌/真菌病原体的广谱药物组成)应在发现严重脓毒症和感染性休克后的第一个小时内开始使用[R.P.Dellinger等人，《危重病急救医学》(Crit.Care Med)2008]治疗方案规定，每天都要重新评估抗菌方案，一旦知道病原体，作为良好的做法，就应该使用更合适的窄谱抗菌药。
遗憾的是，目前的临床细菌学方法通常在可能为时已晚而无法影响患者预后时提供病原体鉴定信息。这是由于从标本采集到报告病原体鉴定和药敏试验结果有2-3天的时间滞后。时间滞后的原因包括需要将样本运送至临床化验室，并配备专业临床微生物学家，以及在固体培养基上继代培养样本后，血液培养和随后的菌落形成所需的时间。虽然建议尽快将接种的血液培养瓶运送到临床微生物实验室，最好是在2小时内，但在正常工作时间之后到达临床微生物实验室的样本通常会被保存一夜，直到第二天工作人员到达。血液培养阳性对于细菌通常需要至少8-18小时，对于真菌通常需要1-3天。在获得阳性血培养后，一旦标本在固体琼脂上继代培养，细菌至少需要8-12小时，真菌需要1-4天才能形成菌落。对平板进行检查，并选择合适的菌落进行鉴定和药敏试验。这一过程还需要在报告发布之前进行分析和解释，通常是在第3天，这可能太慢了，以至于不能对抗生素选择和患者结果产生有意义的影响。
虽然临床微生物学实验室工作流程的许多方面已经自动化，但临床细菌学仍然是高度劳动密集型的。目前，许多实验室使用Vitek(BioMérieux)或Phoenix(Becton-Dickenson)仪器自动进行鉴定和药敏试验。然而，这些系统，以及基于质谱学的较新系统，仍然依赖于专家人员从琼脂平板中选择合适的菌落。
正在出现的新技术有助于直接快速识别未经处理的样本中的病原体，例如直接从全血中鉴定病原体。这种快速方法通常采用最初的细胞裂解步骤，包括选择性裂解哺乳动物细胞的试剂，同时试图将对样本中微生物细胞的完整性影响降至最低。
发明内容
提供了用于选择性裂解真核细胞和分离微生物细胞的方法和组合物。样本中的血细胞和/或其它真核细胞可以通过向样本中加入包括皂苷和碱性缓冲液的血液裂解试剂，以及任选的聚茴香脑磺酸钠和非离子表面活性剂来选择性地裂解，从而形成混合物。然后可以例如使用分离方法如离心或过滤分离混合物中的微生物细胞，并任选地在生长培养基中检测或培养。提供了适于在与样本混合时保持微生物细胞完整性的血液裂解试剂组合物。在其中样本是血液样本的示例性实施方案中，可以选择血液裂解试剂组合物以避免或减少在离心或过滤时可见的血液碎片的存在。
因此，在第一方面，提供了一种从样本中分离微生物细胞的方法，该方法包括：
将血液样本与血液裂解试剂混合，血液裂解试剂包括皂苷、聚茴香脑磺酸钠和碱性缓冲液，得到皂苷浓度为0.75-60mg/ml，聚茴香脑磺酸钠浓度为0.35-50mg/ml，pH为7.8-10的混合物；和
从混合物中分离微生物细胞。
在另一方面，提供了一种从样本中分离微生物细胞的方法，该方法包括：
将样本与血液裂解试剂混合，血液裂解试剂包括皂苷和碱性缓冲液，以获得具有7.8至10的pH和适于实现样本内血细胞裂解的皂苷浓度的混合物；和
从混合物中分离微生物细胞。
通过参考以下详细描述和附图，可以实现对本发明的功能和有利方面的进一步理解。
附图说明
现在将参考附图仅作为示例来描述实施方案，其中：
图1A至1M示意性说明了通过离心裂解、分离和浓缩样本中的微生物细胞的示例性方法。
图2示出了用于利用集成流体处理盒(fluidic processing cartridge)执行自动离心和洗涤的示例性系统的示意图。
图3A至图3C示出了集成流体处理盒的实例，该集成流体处理盒构造成用于直接从收集管中提取样本，并随后进行离心和洗涤，以获得浓缩和纯化的微生物细胞悬液。
图4提供了说明用于进行自动离心和洗涤的示例性方法的流程图。
图5A显示了在使用等体积的含有皂苷和聚茴香脑磺酸钠(SPS)的1型血液裂解试剂对不同体积的全血样本进行溶血，然后进行两次离心洗涤之后的离心管的图像。
图5B显示在使用等体积的含有Triton X-100、SPS和碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液的2型血液裂解试剂进行不同体积的全血样本的溶血，随后进行两次离心洗涤之后的离心管的图像。
图6绘制了将全血样本与含有Triton X-100、SPS和碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液的2型血液裂解试剂接触，进行离心分离和浓缩、热裂解和实时逆转录聚合酶链反应(实时RT-PCR)后获得的不同细菌种类的ΔC
图7绘制了在将加标磷酸盐缓冲液样本与含有Triton X-100和SPS的试剂接触，进行离心分离和浓缩、热裂解和实时RT-PCR之后，不同细菌种类的ΔC
图8绘制了在将加标磷酸盐缓冲液样本与含有碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液和SPS的试剂接触，进行离心分离和浓缩、热裂解和实时RT-PCR之后，不同细菌种类的ΔC
图9A绘制了在将加标磷酸盐缓冲液样本与含有碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液、皂苷和SPS的试剂接触，进行离心分离和浓缩、热裂解和实时RT-PCR之后，不同细菌种类的ΔC
图9B绘制了将全血样本与含有皂苷、SPS、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液和Triton X-100的3型血液裂解试剂接触，进行离心分离和浓缩、热裂解和实时RT-PCR后获得的不同细菌种类的ΔC
图9C绘制了将全血样本与含有Triton X-100、SPS和碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液的2型血液裂解试剂接触，进行离心分离和浓缩、热裂解和实时RT-PCR后获得的不同细菌种类的ΔC
图10绘制了在将全血样本与含有不同浓度的皂苷、SPS、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液和Triton X-100的3型血液裂解试剂接触，进行离心分离和浓缩、热裂解和实时RT-PCR后，不同细菌种类的ΔC
图11A绘制了在将全血样本与含有皂苷、SPS、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液和不同浓度的Triton X-100的3型血液裂解试剂接触，进行离心分离和浓缩、热裂解和实时RT-PCR之后，不同细菌种类的ΔC
图11B比较了在将全血样本与含有皂苷、SPS、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液和TritonX-100或Tween-20的3型血液裂解试剂接触，进行离心分离和浓缩、热裂解和实时RT-PCR之后，ΔC
图12A绘制了在将全血样本与含有皂苷、SPS、不同浓度的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液和Triton X-100的3型血液裂解试剂接触，进行离心分离和浓缩、热裂解和实时RT-PCR之后，不同细菌种类的ΔC
图12B绘制了混合后pH对初始缓冲液浓度(混合前的缓冲液浓度)的依赖性。
图13A和13B绘制了在使加标磷酸盐缓冲液样本与具有不同pH值的，含有皂苷、SPS、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液和Triton X-100的3型血液裂解试剂接触，进行离心分离和浓缩、热裂解和实时RT-PCR之后，不同细菌种类和三种不同血液裂解试剂pH值的ΔC
图14A绘制了在将全血样本与具有不同pH值的，含有皂苷、SPS、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液和Triton X-100的3型血液裂解试剂接触，进行离心分离和浓缩、热裂解和实时RT-PCR之后，不同细菌种类和三种不同血液裂解试剂pH值(该pH值是在与血液裂解试剂的其它成分混合之前的初始缓冲液的pH值)的ΔC
图14B绘制了最终混合物(3型血液裂解试剂+全血)的pH作为用于制备3型血液裂解试剂的初始碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(9.5、10和10.5)的pH的函数。
图14C是显示在制备和随后使用3型血液裂解试剂期间测量的pH变化的表。
图14D绘制了在将全血样本与含有皂苷、SPS、不同浓度的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液和Triton X-100的3型血液裂解试剂接触，进行离心分离和浓缩、热裂解和实时RT-PCR之后，不同细菌种类和三种不同血液裂解试剂pH值(该pH值在与全血混合之前测量)的ΔC
图15A绘制了在将全血样本与含有皂苷、SPS、各自不同的缓冲体系和Triton X-100的3型血液裂解试剂接触，进行离心分离和浓缩、热裂解和实时RT-PCR之后，不同细菌种类和三种不同血液裂解试剂(每种使用不同的缓冲体系)的ΔC
图15B是显示在与全血混合之前和之后，测得的含有皂苷、SPS、各自不同的缓冲体系pH 10和Triton X-100的3型血液裂解试剂的pH变化的表。
图16A显示将3ml体积的全血样本与含有皂苷和不同浓度的SPS的试剂接触，然后进行两个离心洗涤步骤后的离心管的图像。
图16B显示在将3ml体积的全血样本与含有皂苷、不同浓度的SPS和Triton X-100的试剂接触，随后进行两个离心洗涤步骤后的离心管的图像。
图16C显示在将3ml体积的全血样本与含有皂苷、不同浓度的SPS和碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液的试剂接触，随后进行两个离心洗涤步骤后的离心管的图像。
图16D显示将3ml体积的全血样本与含有皂苷、不同浓度的SPS、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液和Triton X-100的3型血液裂解试剂接触，然后进行两个离心洗涤步骤后的离心管的图像。
图16E绘制了在将全血样本与含有不同浓度的皂苷、SPS、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液和Triton X-100的3型血液裂解试剂接触，进行离心分离和浓缩、热解和实时RT-PCR之后，不同细菌种类的ΔC
图17A是总结包括各种消泡剂的血液裂解试剂的性能的表。
图17B呈现显示不含(左)和含(右)消泡剂的离心管的涡旋后泡沫高度的图像。
图17C是总结不含(HR3)和含(HR5)消泡剂的管的泡沫高度的时间依赖性的表。
图17D是比较不含(HR3)和含(HR5)消泡剂的血液裂解试剂的稳定性的表。
图18A和18B绘制了在皂苷制备后在室温储存的第0天(图18A)和第23天(图18B)，皂苷的溶血活性对在不同储存缓冲液中皂苷溶液的浓度依赖性。
图18C是表示在皂苷制备后，在室温储存的第0天和第23天，在不同储存缓冲液中使用皂苷溶液的绵羊红细胞溶血的HC50值(μg/mL)的表。
图19A和19B绘制了在使加标磷酸盐缓冲液样本(图19A)或加标全血样本(图19B)与含有皂苷、SPS、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液和Triton X-100的3型血液裂解试剂接触，进行离心分离和浓缩、热裂解和实时RT-PCR之后，不同细菌种类和三种不同储存条件的ΔC
图20A和20B绘制了滴定曲线，其指示所测量的Na
图21A显示通过对流混合使阳性血培养样本与含有皂苷和SPS的1型血液裂解试剂接触，随后进行两个离心洗涤步骤后的离心管的图像。
图21B显示通过对流混合使阳性血培养样本与含有皂苷、SPS和碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液的3型血液裂解试剂接触，随后进行两个离心洗涤步骤后的离心管的图像。
图21C显示了将阳性血培养物样本与含不同组成的皂苷、SPS、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液和Triton X-100的3型血液裂解试剂接触，然后进行两次离心洗涤之后，MALDI(VITEK-MS-ID)用于鉴定细胞悬液中金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌的性能。
图21D显示了在阳性血培养物样本与含有皂苷、SPS和碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液的3型血液裂解试剂接触，然后经过1至4个离心洗涤步骤之后，细胞悬液中肺炎克雷伯菌MALDI(VITEK-MS-ID)鉴定的洗涤循环次数的依赖性。
图22A显示了与2型和3型血液裂解试剂接触，然后离心分离和浓缩之后，从全血样本中回收的金黄色葡萄球菌的琼脂平板接种结果。
图22B显示了与含有皂苷、SPS、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液和Triton X-100的3型血液裂解试剂接触，然后进行离心分离和浓缩之后，从全血样本中回收的奇异变形杆菌的琼脂平板接种结果。
图22C显示了与含有皂苷、SPS、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液和Triton X-100的3型血液裂解试剂接触，然后进行离心分离和浓缩之后，从全血样本中回收的铜绿假单胞菌的琼脂平板接种结果。
图22D显示了与含有皂苷、SPS和碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液的3型血液裂解试剂接触，然后进行离心分离和浓缩之后，从全血样本中回收的铜绿假单胞菌(PA)、奇异变形杆菌(PM)和金黄色葡萄球菌(SA)的琼脂平板接种结果(平板计数)。
图23A显示了通过对流混合与含有皂苷、SPS和不同浓度的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液的3型血液裂解试剂接触，然后进行离心分离和浓缩之后，从全血样本中回收的奇异变形杆菌的琼脂平板接种结果。
图23B显示了从通过对流混合含有皂苷、SPS和不同浓度的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液的3型血液裂解试剂处理的，然后离心分离和浓缩的全血样本中回收的金黄色葡萄球菌的琼脂平板接种结果。
图23C显示了与含有皂苷、SPS、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液和两种不同浓度的TritonX-100的3型血液裂解试剂通过对流混合接触，然后离心分离和浓缩之后，从体积为5mL的全血样本中回收的金黄色葡萄球菌的琼脂平板接种结果。
图23D显示了与含有SPS、皂苷、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液和两种不同浓度的TritonX-100的3型血液裂解试剂通过对流混合接触，然后进行离心分离和浓缩之后，从体积为5mL的全血样本中回收奇异变形杆菌的琼脂平板接种结果。
图23E显示了与含有SPS、皂苷、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液和两种不同浓度的TritonX-100的3型血液裂解试剂通过对流混合接触，然后离心分离和浓缩之后，从体积为5mL的全血样本中回收的铜绿假单胞菌(ATCC-35554)的琼脂平板接种结果。
图23F显示了与含有SPS、皂苷、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液和两种不同浓度的TritonX-100的3型血液裂解试剂通过对流混合接触，然后离心分离和浓缩之后，从体积为5mL的全血样本中回收的铜绿假单胞菌(临床分离株)的琼脂平板接种结果。
图23G显示了与含有SPS、皂苷、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液和Triton X-100的3型血液裂解试剂通过对流混合接触，然后以5、10和15分钟三种不同的离心时间进行离心分离和浓缩之后，从体积为5mL的全血样本中回收的铜绿假单胞菌(临床分离株)的琼脂平板接种结果。
图24A显示了在VITEK-MS-ID(由质谱分析鉴定进行的鉴定)、VITEK2-ID(酶法鉴定)和VITEK2-AST(微量稀释法药敏试验)的背景下，在用含有皂苷、SPS和碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液的3型血液裂解试剂接触1mL阳性血培养物样本，然后在离心分离和浓缩之后，从阳性血培养物样本中回收金黄色葡萄球菌。
图24B显示了在VITEK-MS-ID、VITEK2-ID和VITEK2-AST的背景下，在用含有皂苷、SPS和碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液的3型血液裂解试剂接触1mL阳性血培养物样本，然后在离心分离和浓缩之后，从阳性血培养物样本中回收大肠杆菌。
图24C显示了在VITEK-MS-ID、VITEK2-ID和VITEK2-AST的背景下，在用含有皂苷、SPS和碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液的3型血液裂解试剂接触1mL阳性血培养物样本，然后在离心分离和浓缩之后，从阳性血培养物样本中回收铜绿假单胞菌。
图24D显示了在VITEK-MS-ID、VITEK2-ID和VITEK2-AST的背景下，在用含有皂苷、SPS和碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液的3型血液裂解试剂接触1mL阳性血培养物样本，然后在离心分离和浓缩之后，从阳性血培养物样本中回收肺炎克雷伯菌。
图25是总结在VITEK-MS-ID、VITEK2-ID和VITEK2-AST的背景下，将4mL全血样本与含有皂苷、SPS和碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液的3型血液裂解试剂接触，然后离心分离和浓缩，进行琼脂平板接种用于菌落生长之后，全血样本中的24株革兰氏阳性菌(8种各3株)、24株(8种各3株)革兰氏阳性菌和12株(4种各3株)真菌的活细胞回收率的表。
图26A和26B示意性说明进行对流混合的方法。
具体实施方式
将参考以下论述的细节来描述本发明的各种实施例和方面。以下描述和附图是对本发明的说明，并且不应被解释为限制本发明。描述了许多具体细节以提供对本发明的各种实施例的透彻理解。然而，在某些情况下，为了提供对本发明的实施例的简要讨论，没有描述公知的或传统的细节。
如本文所用，术语“包括(comprise)”和“包括(comprising)”被解释为是包容性的和开放式的，而不是排他的。具体地，当在说明书和权利要求书中使用时，术语“包括(comprise)”和“包括(comprising)”及其变化形式意指包含指定的特征、步骤或成分。这些术语不应被解释为排除其他特征、步骤或成分的存在。
如本文所用，术语“示例性”意指“用作实例、例子或说明”且不应解释为比本文中所公开的其它配置优选或有利。
如本文所用，术语“约”和“大约”旨在涵盖可能存在于值范围的上限和下限中的变化，如性质、参数和尺寸的变化。除非另外指明，否则术语“约”和“大约”意指加或减25％或更少。
应当理解，除非另外指明，否则任何指定的范围或组是单独地提及范围或组的每一个成员，以及其中涵盖的每一个可能的子范围或子组的简写方式，并且关于其中的任何子范围或子组是类似的。除非另外指明，否则本发明涉及并明确并入子范围或子组的每一个特定成员和组合。
如本文所用，当与数量或参数结合使用时，术语“近似”是指跨越数量或参数的约十分之一至十倍的范围。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语旨在具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。除非另外指明，如通过上下文，如本文所用，以下术语旨在具有以下含义：
如本文所用，短语“完整细胞”是指含有核酸的微生物细胞，其中微生物细胞可通过分离方法分离，例如但不限于离心分离、过滤、微流体分离或免疫磁性分离。
如本文所用，短语“样本”是指含有、可能含有或怀疑含有一种或多种微生物细胞的液体或悬液。样本的非限制性实例包括体液，例如淋巴液、脑脊液、血液(例如全血、血液培养和血浆)、尿液、痰液和唾液。样本的其它实例包括均质化组织悬液，包括但不限于粪便、肌肉组织、脑组织和肝脏组织的均质化悬液。样本可以是经处理的或未经处理的，并且可以任选地包括一种或多种试剂或生长培养基。在血培养样本(含有生长培养基和全血的样本)的情况下，血培养样本可以是通过检测模式(例如，通过自动血液培养系统)被认为微生物细胞存在呈阳性的血培养样本，基于通过一个或多个培养模式进行的测量怀疑微生物细胞存在的中间培养血培养样本，或者没有初始检测结果的中间培养血培养样本。
如本文所用，短语“血细胞”是指存在于血液中的哺乳动物细胞，包括但不限于红细胞(blood cell/erythrocyte)、白细胞(white blood cells/leukocyte)和血小板(platelets/thrombocyte)。
如本文所用，短语“血液样本”是指包括一种或多种血细胞的任何样本。血液样本的非限制性实例包括全血样本、血培养样本、血沉棕黄层样本和血小板样本。
如本文所用，短语“全血”或“全血样本”是指包括血浆和血细胞的哺乳动物血液。“全血”或“全血样本”可包括一种或多种试剂，如抗凝血剂。例如，可以将全血收集在可以包括一种或多种试剂的样本瓶中，试剂例如但不限于包括SPS(聚茴香脑磺酸钠)、EDTA(乙二胺四乙酸)、柠檬酸钠和肝素的抗凝血剂。
如本文所用，短语“选择性裂解”是指血液裂解试剂或裂解过程，其中裂解后保持完整的微生物细胞的比例超过裂解后保持完整的真核细胞的比例，其中真核细胞与从其采集样本的对象相关。
如本文所用，短语“微生物细胞”和“微生物”包括细菌(例如革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，以及细菌孢子)和单细胞真菌(例如酵母和霉菌)。
如本文所用，短语“真核细胞”是指来源于不包括真菌的真核生物的细胞，如动物，特别是含有血液的动物，包括无脊椎动物如甲壳类动物和脊椎动物。如本文所用，“脊椎动物”包括冷血动物(鱼类、爬行动物、两栖动物)和温血动物(鸟类和哺乳动物)。
如本文所用，术语“有效缓冲液浓度”是指，当涉及通过将一体积的样本与一体积的血液裂解试剂混合而形成的混合物时，其中血液裂解试剂的体积包括缓冲体系，血液裂解试剂的缓冲液浓度与血液裂解试剂体积除以血液裂解试剂体积与样本体积之和所形成的比率的乘积。有效缓冲液浓度表示最终混合物中血液裂解试剂对缓冲体系的贡献(即，应用于血液裂解试剂的缓冲液浓度的稀释因子)，并且由于样本中存在的缓冲成分，其可以不同于最终混合物中的实际缓冲液浓度。
如本文所用，短语“分离过程”是指适于分离和任选地浓缩微生物细胞的过程。分离过程的非限制性实例包括离心、过滤、免疫磁性分离和微流体分离。
通常，怀疑含有微生物细胞的全血样本首先在生长培养基存在下培养以获得高浓度的细胞，然后在琼脂平板上传代培养以支持单个菌落的生长。然后将来自菌落的微生物细胞用于随后的测定。遗憾的是，这种基于生长的方法需要数小时或数天的时间延迟以实现足够的微生物生长来支持随后的测定。
最近，已经努力在不存在血液培养的情况下直接从全血中检测微生物细胞，而不需要生长步骤。从全血样本中直接鉴定微生物细胞通常需要在进行后续鉴定测定之前分离微生物细胞并浓缩。例如，在标题为“微生物样本的预处理方法(Method for Pretreatmentof Microbial Samples)”的美国专利9,707,555号和标题为“用于提取微生物细胞的装置和方法(Apparatus and Method for the Extraction of Microbial Cells)”的国际专利公开PCT/CA 2013/000992号中公开了适于直接从全血中鉴定微生物细胞的用于微生物细胞分离和浓缩的改进方法，这两篇文献通过引用整体并入本文。
根据国际专利公开PCT/CA 2013/000992号公开的方法，基于血液的样本，例如全血或培养的血液，与血液裂解试剂(BLR)组合并进行离心。该血液裂解试剂裂解并且消化血细胞，使得残留的血液碎片在离心过程中不显著沉降，同时留下完整的并且适合于离心分离的微生物细胞。图1A-1M示出了根据国际专利公开PCT/CA 2013/000992号的教导的一个实施方案的预处理装置和方法的示例性实现方式，其中采用了缓冲液体，并且这些教导简要概括如下。
参见图1A，根据国际专利公开PCT/CA 2013/000992号的教导，提供了预处理容器20，其含有一定体积的血液裂解试剂22和一定体积的缓冲液体21。预处理容器20是适于离心的容器，例如微量离心管。缓冲液体21是高密度且与水不混溶的液体，其用于形成在离心期间微生物沉降到其上的液体表面32。如图1A所示，缓冲液体21的密度使得其在重力的影响下沉降在预处理容器20的底部。应当理解，如本文所用关于缓冲液体21使用的术语“高密度”是指这样的密度，其足够高以使得目标微生物细胞在主要离心力的作用下基本上不会穿透缓冲液体。因此，缓冲液体21的密度被选择为大于微生物细胞和其它液体两者的密度。该缓冲液体在其他液体中也是不可混溶的，这些其他液体包括但不限于全血、与全血混合的血液培养基、血液裂解试剂22以及洗涤液(如下)，使得其在整个预处理过程中保持不同的液相。
图1B示出了将一定体积的血液样本26添加到预处理容器20中，其中血液裂解试剂22与血液样本26的混合形成混合物30(在图1C中示出)。在将样本提供给预处理容器20(例如，通过可刺穿的橡胶塞25)之后，可以搅动预处理容器以产生样本与血液裂解试剂22的进一步混合(如图1C所示)。在形成混合物30并搅拌预处理容器20之后，将预处理容器20离心，如图1D所示。预处理容器20以合适的速率离心合适的时间以使混合物30中的微生物细胞流出悬液并在缓冲液体21和上清液33之间的界面32处收集，如图1D所示。如国际专利公开PCT/CA2013/000992号教导的，分子量为约300-850的氟化烃适合作为缓冲液体。实例为FC-40、FC-43、FC-70和FC-77，并且缓冲液体体积应足够大以提供足够大的沉降表面，使得所有目标沉淀物收集在其表面上。
在离心之后，预处理容器20可以重新定向在适合于随后的抽吸和分配操作的位置，例如图1E中所示的竖直定向，使得缓冲液体21移动到预处理容器20的底部并且由于重力而保持在那里。防止细胞的重悬使得能够除去大部分上清液，如图1F中所示，使得仅小体积的残留上清液留下含有保留的微生物细胞。
如图1G-1K所示，然后可以任选地进行一个或多个洗涤循环以纯化上清液并降低预处理样本中存在的血细胞碎片和血液裂解试剂的浓度。参照图1G，可以将一定体积的洗涤液35加入到样本预处理容器20中。在添加洗涤液35之后，混合溶液以重悬已在离心期间沉淀或吸附到容器壁上的碎片。这可以通过如图1H所示的涡旋来实现。然后将预处理容器20离心并再定向，并以类似于图1D-1F的方式除去相当一部分上清液，如图1I-1K所示。
在进行(任选的)洗涤循环后，可以搅拌预处理容器20，如图1L所示，使得保留的微生物细胞重悬在残留上清液37中。例如，如上所述，预处理容器20可以低速涡旋大约5至20秒。在搅拌之后，使缓冲液体21沉降在预处理容器20的底部，如图1M所示，使得预处理容器20包括缓冲液体21上方保留的微生物细胞的残留悬液。然后可以除去该残留的悬液以获得提取的样本，称为预处理的样本38。
基于国际专利申请PCT/CA2013/000992号的方法，用于执行微生物细胞分离和浓缩的示例性自动化系统在国际专利申请PCT/CA2015/050449号中被教导，其标题为“用于执行自动离心分离的设备、系统和方法(Apparatus,System and Method for PerformingAutomated Centrifugal Separation)”，其全部内容通过引用并入本文。图2提供了用于执行自动离心分离(和/或洗涤)的示例性集成系统100的图示。示例系统100包括离心机110，离心机110接收用于离心分离的一个或多个集成流体处理盒120。离心机110包括一个或多个接收器112，其连接到机动化转子114上并且配置成用于接纳集成流体处理盒120。盒容器112可以是例如实验室离心机中常见的固定角度类型或摆动桶类型(例如，每个接收器112可以枢转地连接到机动化转子114)。
盒接口组件(单元)130配置成当机动化转子114静止时与集成流体处理盒120可移除地接合(或对接)，用于控制集成流体处理盒120内的流体流动。盒接口组件130与集成射流盒的接口可例如经由盒接口组件与集成射流盒120之间的直接接口发生，或者例如经由离心机110上(例如机动化转子114或盒接收器112上)的接口(例如致动接口)发生。离心机110和盒接口组件130经由控制和处理单元140来控制。
根据国际专利申请PCT/CA2015/050449号的教导，参考图3A中的示例性示意图，绘制了示例性集成流体处理盒500，其并入了适于从全血中自动分离和洗涤微生物细胞以获得浓缩悬液的元件。示例性集成流体处理盒包括样本转移接收器501、大流体离心室502、稀释剂室504和上清液室506。稀释剂室504预填充有洗涤缓冲液流体505，经由配备有截流阀512的导管510流体连接到大流体离心室502，含通向大气515的通风口，并且以其它方式关闭。上清液室506经由配备有截流阀513的导管511与大流体离心室502流体连接，并且含通向大气516的通风口，否则上清液室506关闭。大流体离心室502具有圆锥形或圆形底部形状和平滑内表面，其最小化在离心期间微生物细胞的吸附或捕集，并且除了通向相应导管的开口522、523、524、525、526之外被封闭。在本示例性实施方案中，大流体离心室用于处理含有血液的样本(例如全血、血培养样本或其它含有血液的样本)，并且含有血液裂解试剂503和缓冲流体529以帮助微生物细胞回收并使可能损害目标核酸的完整性和回收的细胞的压实损伤降至最低。
样本转移接收器配备有安装在接收器底部的针507。针连接至配备有断流阀509的流体路径508，该断流阀509通向大流体离心室502。具有可刺穿盖521(例如，
国际专利申请PCT/CA2015/050449教导的示例性集成流体处理盒500是一种封闭的盒(除了下面描述的通风口之外)，该盒在插入样本之后执行分离和洗涤盒的室和管道内的浓缩悬液所需的所有功能，将所有试剂和溶液储存在盒上的室中，并且将包括废料上清液在内的所有过量液体保留在盒上的室中。这些通风口和端口中的一个或多个可以由透气膜保护，该透气膜具有足够小的孔径以防止微生物病原体进入该装置的目标范围内。根据本示例性实施方案，所有多余的和废弃的液体被储存在盒上并且不暴露给使用者。因此，封闭的盒提供了一种装置，该装置保护使用者不与样本直接接触，并且对于该装置，样本在分离和洗涤过程中不易受外部因素的污染。
如国际专利申请PCT/CA2015/050449号教导的，参考图3A所示的示例性集成流体处理盒500，在图4中大致描述了自动分离和洗涤过程。在国际专利申请PCT/CA2015/050449号中详细描述的盒接口组件，配备有执行必要动作所需的所有部件，包括致动盒阀509、512、513和517以及空气置换装置，该空气置换装置能够通过盒端口518向盒离心室施加正负压力。
将含样本的样本管520插入盒500的样本转移接收器501中，从而刺穿管帽521以执行样本转移到如图4的300所示的大流体离心室。盒接口组件经由盒接收器与盒接合，如下文详细描述的，并且被致动，使得阀509打开并且阀512、513和517关闭，从而密封除了来自样本管的路径508之外的从大流体离心室发出的所有流体路径。
空气置换装置通过连接器与端口518接合，该连接器提供与端口的密封连接。任选地，刚性或柔性管将空气置换装置连接到连接器。通过操作空气置换装置从大流体离心室抽取空气以使样本经由流体路径508从样本管520流入大流体离心室502来执行样本转移到大流体离心室502。端口518的入口523必须定位在流体水平面上方并且在流体水平面与入口523之间具有足够的气隙，使得没有流体流入入口523到达端口518。空气置换激活的流动是以受控的方式进行的，使得预定体积的样本被转移到大流体离心室中。
根据国际专利申请PCT/CA2015/050449号的教导的一个实施方案，流动路径508的入口522也在流体水平上方的气隙中，使得在转移所需体积的样本之后，经由端口518的空气置换可反向以提供进入大流体离心室的少量空气置换，以清除样本流体的流动路径508并将此残留样本移回到样本管520中。然后，阀509关闭，并且任选地将样本管520从接收器501移除。
在样本转移过程之前，血液裂解试剂503可以存在于离心室502中，或者可以以与样本类似的方式从血液裂解试剂管中转移。可替代地，可以在盒上提供血液裂解试剂存储室，并且可以提供具有阀和通风口的流体路径，以允许血液裂解试剂503以类似于如下的洗涤缓冲液到大流体离心室的移动的方式移动到大流体离心室。
如国际专利申请PCT/CA2015/050449号，在将样本加入到大流体离心室502中之后，可以如图4中的305所示任选地混合样本和血液裂解试剂503。可以提供混合机构，由此仪器执行盒的涡旋、摇动或循环倒置。该操作在从大流体离心室502发出的所有流体路径上的阀关闭的情况下执行。可在通向端口518的流体路径上提供阀以防止流体在混合期间进入空气路径。另外，或可选地，防止流体通过的透气膜可以放置在大流体离心室和端口518之间的空气路径中，以防止流体到达端口518。该膜还可以构造成用作空气过滤器以防止微生物从环境或从空气置换装置进入。可替代地，端口518和进入开口523之间的通向大流体离心室的路径可设计成具有高流体阻力，使得在主要条件下将防止流体进入开口523或将防止流体一直行进到端口518。同样地，分别在稀释剂室505和上清液室506中的通风口515和516可以配备有透气膜和/或具有高流体阻力的路径以用于类似目的。
在混合步骤305之后，执行离心沉降步骤310，由此使盒接口组件与机动化转子114脱开，并且使盒120离心，使得大流体离心室中的微生物细胞沉降在缓冲液体上，例如，根据PCT专利申请PCT/CA2013/000992号的方法，如上所述。离心机可以是例如角式离心机或吊桶式离心机，并且离心参数可以例如根据PCT专利申请PCT/CA2013/000992号提供的条件进行选择。
施加到大流体离心容器内的流体的相对离心力可例如在1000-15,000g的范围内，或例如2,000-12,000g，或例如3000-10,000g，或例如3000-7,000g，或例如5000-10,000g，或者，例如，4000-8,000g。在涉及从生物样本分离细菌和真菌细胞的应用中，已经发现合适的相对离心力(RCF)在1000g-15000g的范围内，并且更具体地，在3000g-7000g的范围内。
在图4的离心沉降步骤310之后，离心转子停止，盒接口组件与机动化转子重新接合，如315所示，从大流体离心室502到上清液腔506的上清液527的提取如320所示进行，由此残留物528(含微生物细胞)保留在大流体离心室502的底部。通过打开阀513，同时阀509、512和517保持关闭并使空气置换装置连接器与端口518接合并且可控地将空气置换到大流体离心室中来执行该动作。因此，引起上清液流动的空气置换通过流体路径511发生，流体路径511的入口524位于上清液的最低范围的下方。任选地，将入口524放置在将从大流体离心室排出的上清液的最低范围处，从而防止来自大流体离心室提取残留物528。
在上清液提取步骤320之后，执行洗涤缓冲液分配步骤325和330，由此将洗涤缓冲液分配到大流体离心室502中。该动作通过打开阀512，同时保持阀509、513和517关闭并使空气置换装置连接器与端口518接合，并可控制地从微流体离心室502排空空气来执行。因此通过流体路径510发生由空气置换引起的洗涤缓冲液的流动。洗涤缓冲液路径510的入口525优选位于大流体离心室中的液面的最高范围之上。
在洗涤缓冲液分配步骤544之后，执行混合步骤332以充分混合大流体离心室中的洗涤缓冲液和残留流体。这可以通过如前所述的盒的涡旋、摇动或循环倒置来执行。在混合步骤332之后，进行离心沉降步骤310以重新沉降收集的微生物细胞，并如步骤320中那样从离心室中除去上清液。步骤325-335和步骤310-320的顺序共同形成洗涤循环，由此将细胞悬液在洗涤缓冲液中稀释，将微生物细胞再沉淀，并提取上清液。可将洗涤循环重复多次以根据需要进行多次额外的洗涤循环，以获得充分稀释污染物和干扰物的最终微生物细胞悬液。
如国际专利申请PCT/CA2015/050449号，所需的稀释度取决于样本组成和下游检测程序。在一个实施方案中，预期用于涉及从生物样本中分离细菌和真菌细胞，微生物细胞的电裂解和通过核糖体RNA的逆转录实时聚合酶链反应(逆转录RT-PCR)扩增进行检测的应用，稀释因子在100-100000的范围内选择，其中更优选的在1000-50000范围内。在涉及从血液样本分离细菌和真菌细胞、裂解微生物细胞和通过PCR扩增DNA检测的另一个实施方案中，稀释因子可以小至1，条件是使用抑制剂抗性聚合酶以及合适的扩增子检测方案。现有技术中报道了全血中DNA扩增和检测方法的示例性实现方式(例如，L.A.Neely等人，《科学转化医学》(Science translational medicine)5.182(2013)：182ra54-182ra54)。
在最后的上清液提取步骤320之后，执行混合步骤342以将沉淀的微生物细胞重悬在最后的残留流体528中以产生最后的悬液。在重悬步骤342之后，通过流体路径510的空气置换提取最终悬液。最终悬液的体积取决于应用的性质。例如，当预期的应用是检测全血中或培养的血中的微生物细胞时，最终细胞悬液的体积可以选择在10μL-500μL范围内，而更优选的范围是20μL-120μL，或50μL-100μL。在提取最终细胞悬液的过程中，打开阀门517并且关闭阀门509、512和513，并且将空气通过端口518转移到大流体离心室中以将流体经由流体路径516转移到开口526之外。开口526定位在缓冲流体529的顶表面处，使得最终悬液整体或基本上全部悬液从大流体离心室排出，而不挤出任何缓冲流体529，如图3A所示。可替代地，开口526定位成使得最终悬液和缓冲流体的一部分或全部可通过流体路径516从大流体离心室挤出。该流体路径516通向下一个下游盒元件，在一些实施方案中，该盒元件可以是室或被配置成允许从该盒中收回最终悬液以在该盒外部进行进一步处理的室，并且在其他实施方案中，该流体路径可以是通向悬液收集室或例如如下所述的电裂解室的流体路径。
图3B和3C示出了用于在封闭系统中执行自动样本制备和任选地执行一个或多个另外的后续处理步骤(例如测定)的示例性集成盒，如国际专利申请PCT/CA2015/050449号所公开的。所示的示例性集成盒700具有三个部件，第一部件698包括样本转移接收器501、大流体离心室502、稀释剂室504和上清液室506。第一部件698可以是由与该装置的形式和功能相容的材料制成的单一塑料模制部件。可替代地，第一部件698可以是子部件的组件，这些子部件是由与该装置的材料、形式和功能一致的工具模制或形成的塑料部件。在这方面，材料应被选择为具有足够高的强度以承受盒将经受的高离心力，并且材料应与所使用的流体相容，并且在分子应用的情况下，不应将干扰下游过程的污染物引入预处理的细胞悬液中。可以制造第一部件698的材料的非限制性实例是聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、PET、聚苯乙烯、环烯烃共聚物或这些材料的一些变体。
第二部件699是安装在部件698的侧面上的微流体装置，其包括连接部件698中的室的流体路径和阀，并且可选地包括用于另外的流体处理的部件，例如但不限于电裂解、逆转录和PCR(RT-PCR)。第二部件699是由在其中形成孔、通道和室的多个层构成的层压件。
这些层可以被机加工、冲压、压纹或模制以形成必要的特征。基于通过粘合剂粘合、热粘合、超声波粘合或本领域技术人员已知的其他方法层压的亚层的功能，每个层可以由单一亚层或多个亚层组成，每个亚层是不同材料或先前列出的相同材料。呈现的层和子层仅为了便于理解所讨论的实施方案的目的而分组。在涉及分子加工的本示例性实现方式中，材料应当与流体相容，并且在其中进行分子扩增的情况下，材料不应当引入抑制此类扩增(例如RT-PCR)或干扰目标微生物检测的物质，并且不应被非目标分析物(例如非目标微生物细胞)或核酸污染。材料还应在不会吸附目标分子、反应物和试剂成分至干扰过程的程度。示例性塑料材料和塑料膜材料包括但不限于聚碳酸酯、聚丙烯、PET和环烯烃。
在将洗涤缓冲液和预处理流体分别分配到稀释剂室和大流体离心室中之后，室开口710(图3B中所示)可以用膜密封，箔密封或帽697(图3C中所示)密封。这些密封件或帽可以使用与热密封、粘合剂粘合、超声波粘合相容的方法和材料来粘合。可替代地，这些腔室可以在分配这些液体之前被密封，并且可以提供替代端口以用于分配这些液体的目的，并且这些端口可以在分配操作之后被密封。帽697可以是模制的、压纹的、机加工的或快速制作原型的，并且可以由聚碳酸酯，聚苯乙烯、PET、聚酯或适于其形式和功能的其他材料构造。
国际专利申请PCT/CA2013/000992号公开了许多不同的血液裂解试剂组合物，其可用于在离心之前消化血液成分。如上，血液裂解试剂的存在引起血细胞的选择性裂解。在国际专利申请PCT/CA2013/000992教导的一个示例性实现方式中，血液裂解试剂可以是包含皂苷和聚茴香脑磺酸钠(聚茴香脑磺酸的钠盐，称为SPS)的水性液体，并且具有这种组合物的血液裂解试剂在下文中称为1型血液裂解试剂。该血液裂解试剂还可以包括一种防沫剂，例如聚(丙二醇)(PPG，例如具有大约2000的分子量。国际专利申请PCT/CA2013/000992号教导了在混合全血和血液裂解试剂后，1型血液裂解试剂的皂苷和SPS的实例浓度范围分别为约1.5至80mg/mL和0.5至20mg/mL。
如国际专利申请PCT/CA2013/000992教导的，SPS是抗凝血剂和抗吞噬作用剂并且已知其抑制抗微生物剂(Sullivan，N.M.，Sutter，V.L，和Finegold，S.M.(1975).实用的好氧膜过滤血培养技术：程序的发展(Practical aerobic membrane filtration bloodculture technique:development of procedure).《临床微生物学杂志》(Journal ofclinical microbiology)，1(1)，30-36)。SPS有助于血细胞裂解的机制尚不清楚。不希望受理论限制，据信SPS可在血细胞裂解期间对微生物提供一定水平的保护，降低细胞碎片中细菌截留的发生率，和/或降低可另外存在于沉淀物中的凝结成分的量。
在由国际专利申请PCT/CA2013/000992号教导的血液裂解组合物的另一个示例性实现方式中，血液裂解试剂可以是在pH范围为9至11的缓冲液中包含Triton X-100和SPS的水性液体，并且具有这种组合物的血液裂解试剂此后称为2型血液裂解试剂。该血液裂解试剂还可以包括一种防沫剂，例如聚(丙二醇)(PPG，例如具有大约2000的分子量。国际专利申请PCT/CA2013/000992号教导了在混合全血和血液裂解试剂后，2型血液裂解试剂的TritonX-100和SPS的示例性浓度范围分别为约0.5至1.5％w/v和5至10mg/mL。
如上所述，根据国际专利申请PCT/CA2013/000992号的教导，发现上述的1型血液裂解试剂组合物适合于从全血中手动和半自动地分离和浓缩微生物细胞。但是，当根据国际专利申请PCT/CA2015/050449号的自动化方法，使国际专利申请PCT/CA2013/000992号中公开的试剂配方适应于从全血中自动分离和浓缩微生物细胞，并随后从全血中鉴定微生物细胞时，本发明人发现1型血液裂解试剂组合物最适合全血量小于约1ml的情况。
这在图5A中示出，其示出了在使用1型血液裂解试剂进行不同体积的全血样本的溶血之后的离心管的离心后图像。将全血样本收集在具有SPS抗凝血剂的真空容器中，并将1ml至5ml等分试样的全血分配在各自的15mL离心管中。将全血样本与不同体积的1型血液裂解试剂混合，使得在混合时，皂苷和SPS的浓度分别为37.5mg/mL和7.5mg/mL，与血容量无关。将所得混合物进行2个洗涤循环。尽管观察到1ml全血的溶血充分，但是在较高样本体积的情况下观察到溶血不充分。例如，在3ml全血的溶血期间，血液碎片沉降和洗涤循环不能增加样本纯度。如图5A中所示，在离心超过体积1ml的全血后，存在显著的残留血液碎片。通过在离心管的下部区域中可见的深色残留物，血液碎片的消化不足是明显的，随着全血容量的增加，残留物也会增加。这样的残留物可能使样本制备步骤的自动化复杂化，因为血液碎片在离心或过滤时形成块状物。
本发明人发现，为了便于自动处理更大体积的全血而不产生显著的碎片，可以使用具有2型血液裂解试剂组合物的血液裂解试剂。这在图5B中示出，其示出了在使用2型血液裂解试剂进行不同血液体积的全血样本的溶血之后的离心管的离心后图像。将1ml至5ml的全血样本与不同体积的含有Triton X-100、SPS和碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液的2型血液裂解试剂混合。将以缓冲液浓度为200mM、pH为10制备的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲溶液10ml与SPS浓度为30mg/ml和Triton X-100为3％w/v的溶液10ml组合，得到体积为20ml、SPS浓度为15mg/ml、Triton X-100浓度为1.5％w/v、缓冲浓度为100mM、pH为9.9的试剂溶液来制备试剂溶液。将全血样本与等体积的试剂溶液混合后，SPS的浓度为7.5mg/ml，Triton X-100的浓度为0.75％w/v，pH为9.1，与血液体积无关，且有效缓冲液浓度为50mM，与血液体积无关。将所得混合物进行2个洗涤循环。如图5B所示，全血体积中的任何一个都看不到残留的血液碎片。由2型血液裂解试剂提供的显著改善的消化被认为是由于高pH环境所致。
尽管2型血液裂解试剂成功地进行了血液成分的消化，同时避免了大量的离心后碎片，但是本发明人发现，虽然2型血液裂解试剂适合于分离和浓缩许多类型的微生物细胞，但是在对某些微生物细胞种类进行离心处理后进行实时逆转录聚合酶链式反应(实时RT-PCR)时，发现使用2型血液裂解试剂会导致信号丢失。例如，本发明人发现当2型血液裂解试剂用于处理含有铜绿假单胞菌和奇异变形杆菌的全血样本时，血液裂解试剂似乎影响微生物细胞的完整性，导致在离心处理期间rRNA的损失，并且导致在实时RT-PCR检测期间所需循环数增加。
本发明人如下实验性研究了2型血液裂解试剂对细胞完整性的影响。通过将含有铜绿假单胞菌(PA)、奇异变形杆菌(PM)和金黄色葡萄球菌(SA)的3ml体积的，根据以下实施例2制备的加标全血样本与2型血液裂解试剂接触来进行实验。将以缓冲液浓度为200mM、pH为10制备的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲溶液10ml与SPS浓度为40mg/ml和Triton X-100为3％w/v的溶液10ml组合，得到体积为20ml、SPS浓度为20mg/ml、Triton X-100浓度为1.5％w/v、缓冲浓度为100mM、pH为9.9的试剂溶液来制备试剂溶液。将5mL试剂与3mL全血液样本品混合后，SPS的浓度为12.5mg/ml，Triton X-100的浓度为0.94％w/v，pH值为9.1，有效缓冲液浓度为62.5mM。根据实施例3的方法制备加标磷酸盐缓冲液样本。根据以下实施例6和7中提供的方法，分别对加标对照的加标磷酸盐缓冲液样本和加标全血样本进行样本预处理和实时RT-PCR。测定阈值周期值(CT值；即，信号增加超过噪声阈值之后的PCR循环数)，并且基于加标全血CT值和加标对照CT值之间的差异确定CT值的差异ΔCT。
如图6所示，铜绿假单胞菌(PA)和奇异变形杆菌(PM)的ΔCT值显著高于金黄色葡萄球菌(SA)的ΔCT值，表明这些微生物细胞种类似乎受到与2型血液裂解试剂接触的负面影响。不受理论的限制，认为全血样本暴露于2型血液裂解试剂和离心处理后观察到的RT-PCR测定的性能退化可能是以下原因中的一种或多种的结果：(i)由血液裂解试剂引起的微生物细胞损伤，在使用基于离心的细胞分离的情况下，其可以引起目标细胞内容物的损失或降低沉降系数，(ii)在离心过程中(例如初始离心分离和可选的额外离心细胞洗涤周期)去除微生物细胞以及血液碎片，和/或(iii)通过将高水平的血液碎片转移至最终细胞悬液来抑制逆转录(RT)和/或聚合酶链反应(PCR)反应。其中，在初始样本中微生物细胞的数量稀少的情况下，预期前两个原因更严重，例如微生物细胞的数量通常小于10CFU/mL的血流感染的情况，因为前两个原因与分析物的损失有关。相反，由于测定抑制剂(上面列出的第三个原因)引起的性能退化(ΔCT)通常可以通过进行额外的扩增循环来补偿，代价是目标定量的准确性。
鉴于图6中所示的结果，本发明人确定，当在自动化系统中处理高体积(＞1ml)的全血时，将需要新型试剂制剂来实现血液成分的合适消化，同时保持以每ml单一CFU水平的灵敏度对广泛范围的微生物细胞种类进行后续(下游)分子扩增的能力。因此，本发明人寻求开发一种新的裂解试剂制剂，其能够在自动系统中处理高体积(＞1ml)的全血，同时保持宽范围的微生物细胞类型(例如种类)的完整性以促进随后的分子扩增。
作为寻找改进的血液裂解试剂的初始步骤，本发明人通过实验研究了1型和2型血液裂解试剂组合物的不同成分对细胞完整性的影响。
Triton X-100对微生物细胞完整性影响的实验研究
在不存在高pH环境(例如不存在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液)的情况下，对2型血液裂解试剂的成分之一Triton X-100对微生物细胞完整性的影响进行了实验研究。通过使含有铜绿假单胞菌(PA)、奇异变形杆菌(PM)和金黄色葡萄球菌(SA)根据以下实施例3制备)的加标磷酸盐缓冲液样本与含有Triton X-100和SPS的溶液接触来进行实验，使得各样本中Triton X-100的终浓度为0，0.188，0.375，0.55和0.75％w/v，以及SPS浓度为15mg/mL。根据以下实施例5中提供的方法进行样本制备和实时RT-PCR。还制备根据以下实施例3的方法制备的加标磷酸盐缓冲液样本用于加标对照，并根据以下实施例4的方法进行实时RT-PCR。根据加标磷酸盐缓冲液样本CT值和加标对照CT值之间的差值确定的ΔCT值被用作暴露于Triton X-100后微生物细胞完整性的替代指标。
得到的ΔC
高pH环境对微生物细胞完整性影响的实验研究
实验研究了2型血液裂解试剂的特性之一--高pH环境对微生物细胞完整性的影响，其中高pH是由于2型血液裂解试剂的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液成分所致。通过使含有铜绿假单胞菌(PA)，奇异变形杆菌(PM)和金黄色葡萄球菌(SA)的加标磷酸盐缓冲液样本(根据以下实施例3制备)与含有碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液和SPS的试剂溶液接触来进行实验。通过将1ml的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液与1ml具有30mg/ml的SPS浓度的溶液组合来制备试剂溶液，碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液各自分别以18、56、90、100和220mM的缓冲液浓度制备，并且各自分别具有10.4、10.4、10.3、10.3和10.2的pH以获得具有2ml的体积和15mg/ml的SPS浓度，分别为10.3、10.3、10.3、10.3和10.2的pH值，以及分别为9、28、45、50和110mM的缓冲液浓度的试剂溶液。将1ml试剂溶液与1ml加标磷酸盐缓冲液样本混合后，SPS浓度为7.5mg/mL，pH值范围为9.5-10，缓冲液浓度分别为4.5、14、22.5、25和55mM。根据以下实施例5中提供的方法进行样本制备和实时RT-PCR。还制备根据以下实施例3的方法制备的加标磷酸盐缓冲液样本用于加标对照，并根据以下实施例4的方法进行实时RT-PCR。根据加标磷酸盐缓冲液样本CT值和加标对照CT值之间的差值确定的ΔCT值被用作微生物细胞完整性的替代指标。
图8中所示的所得ΔC
有皂苷-碱性pH的3型血液裂解试剂
前述实施例说明在图6中观察到的对于2型血液裂解试剂的情况的信号损失似乎是由于与该试剂类型相关的高pH环境的存在。为了试图克服2型血液裂解试剂的这种限制，并且为了克服上述1型血液裂解试剂的限制，本发明人考虑了1型和2型血液裂解试剂的成分的机制。
理解皂苷的溶血活性是由于与存在于真核细胞膜上但不存在于原核(微生物)细胞膜上的胆固醇的相互作用，本发明人假设皂苷作为表面活性剂可以在微生物细胞上形成层，而不会对微生物细胞造成损伤。不受理论的限制，本发明人进一步假设如果试剂既具有皂苷又具有高pH，由皂苷产生的表面活性剂层可以ΔCT作为保护层，屏蔽微生物细胞免受高pH环境的其它有害作用。换句话说，本发明人推测当与具有皂苷和高pH的试剂接触时，微生物细胞可以被皂苷包被，并有效地防止试剂中碱性缓冲液的产物的攻击。
为检验这一假说，试验研究了皂苷与高pH环境的组合对加标磷酸盐缓冲液样本中微生物细胞完整性的影响。通过使含有铜绿假单胞菌(PA)，奇异变形杆菌(PM)和金黄色葡萄球菌(SA)的加标磷酸盐缓冲液样本(根据以下实施例3制备)与含有皂苷、SPS和碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液的试剂溶液接触来进行实验。将碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液1ml，碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液各自分别以18、56、90、100和220mM的缓冲液浓度制备，并且各自分别具有10.4、10.3、10.3、10.3和10.2的pH，与SPS浓度为30mg/ml和皂苷浓度为60mg/ml的1ml溶液组合来制备试剂溶液，以获得各自具有2ml的体积和15mg/ml的SPS浓度，30mg/ml的皂苷浓度，分别为7.2、9.2、9.7、9.9和10的pH值，以及分别为9、28、45、50和110mM的缓冲液浓度的试剂溶液。将1ml试剂溶液与1ml加标磷酸盐缓冲液样本混合后，SPS浓度为7.5mg/mL，皂苷浓度为15mg/ml，pH值为7-10，缓冲液浓度分别为4.5、14、22.5、25和55mM。随后根据以下实施例5中提供的方法进行离心分离和实时RT-PCR。还制备根据以下实施例3的方法制备的加标磷酸盐缓冲液样本用于加标对照，并根据以下实施例4的方法进行实时RT-PCR。根据加标磷酸盐缓冲液样本CT值和加标对照CT值之间的差值确定的ΔCT值被用作微生物细胞完整性的替代指标。
所得到的ΔC
然后本发明人通过实验研究了3型血液裂解试剂对全血样本的细胞完整性的影响。通过将含有铜绿假单胞菌(PA)、奇异变形杆菌(PM)和金黄色葡萄球菌(SA)的3ml体积的，根据以下实施例2制备的加标全血样本与3型血液裂解试剂接触来进行实验。将以缓冲浓度为200mM、pH为10.1制备的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲溶液10ml与SPS浓度为30mg/ml，皂苷为60mg/mL和Triton X-100为3％w/v的溶液10ml组合，得到体积为20ml、SPS浓度为15mg/ml、皂苷浓度为30mg/ml和Triton X-100浓度为1.5％w/v、缓冲浓度为100mM、pH为10.0的试剂溶液来制备3型血液裂解试剂溶液。将5ml的3型血液裂解试剂与3ml全血样本混合后，SPS浓度为9.375mg/mL，皂苷浓度为18.75mg/mL，Triton X-100浓度为0.94％w/v，pH值为9.2，有效缓冲液浓度为62.5mM。根据实施例3的方法制备加标磷酸盐缓冲液样本。根据以下实施例6和7中提供的方法，分别对用作加标对照的加标磷酸盐缓冲液样本和加标全血样本进行离心分离和实时RT-PCR。测定阈值周期值(CT值；即，信号增加超过噪声阈值之后的PCR循环数)，并且基于加标全血CT值和加标对照CT值之间的差异确定CT值的差异ΔCT。
如图9B所示，铜绿假单胞菌(PA)、奇异变形杆菌(PM)和金黄色葡萄球菌(SA))的ΔCT值都显著低于使用2型血液裂解试剂获得的值(图9C再次示出了通过用2型血液裂解试剂处理全血样本获得的结果，如最初在图6中所示)，证明了用于处理全血样本的3型血液裂解试剂的成功。此外，3型血液裂解试剂成功地在宽范围浓度的全血中进行无可见残留物(即，无可见血液碎片)的溶血，从而实现(i)用核酸回收完整的微生物细胞和(ii)甚至在离心之后消化无可见血液碎片的残留血液成分。
本发明人进行了一系列实验以研究当处理加标微生物细胞的全血样本时，新型3型血液裂解试剂的各种成分的不同浓度对试剂性能的影响，如下。
全血样本处理中3型血液裂解试剂性能对皂苷浓度依赖性的实验研究
进行实验以研究当用于处理加标了微生物细胞的全血液样本品时，3型血液裂解试剂的性能对皂苷浓度的依赖性。将3ml体积的含铜绿假单胞菌(PA)、奇异变形杆菌(PM)和金黄色葡萄球菌(SA)的，根据以下实施例2制备的加标全血样本与各种3型血液裂解试剂接触来进行实验。将以缓冲液浓度为200mM和pH为10.1制备的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液10ml与SPS浓度为30mg/ml，皂苷浓度范围为0-80mg/ml和Triton X-100为3％w/v的溶液10ml组合来制备各种3型血液裂解试剂溶液,以获得体积为20ml，SPS浓度为15mg/ml，皂苷浓度为0-40mg/ml，Triton X-100浓度为1.5％w/v，缓冲液浓度为100mM和pH值范围为9.5-10的试剂溶液。将5ml的3型血液裂解试剂与3ml全血样本混合后，SPS浓度为9.375mg/mL，皂苷浓度范围为6.25-25mg/mL，Triton X-100浓度为0.94％w/v，pH值约为9.2，有效缓冲液浓度为62.5mM。根据实施例3的方法制备加标磷酸盐缓冲液样本。根据以下实施例6和7中提供的方法，分别对加标对照的加标磷酸盐缓冲液样本和加标全血样本进行离心分离和实时RT-PCR。测定阈值周期值(CT值；即，信号增加超过噪声阈值之后的PCR循环数)，并且基于加标全血CT值和加标对照CT值之间的差异确定CT值的差异ΔCT。
如图10所示，对于12.5mg/ml和更高的皂苷浓度，所有三种微生物种类的ΔCT值小于5。在皂苷浓度为18.75mg/ml和更高时，皂苷对所有微生物种类的保护作用似乎已完全实现。
全血样本处理中3型血液裂解试剂性能对Triton X-100浓度依赖性的实验研究
进行实验以研究当用于处理加标了微生物细胞的全血液样本品时，3型血液裂解试剂的性能对Triton X-100浓度的依赖性。将3ml体积的含铜绿假单胞菌(PA)、奇异变形杆菌(PM)和金黄色葡萄球菌(SA)的，根据以下实施例2制备的加标全血样本与各种3型血液裂解试剂接触来进行实验。将以缓冲液浓度为200mM和pH为10.1制备的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液10ml与SPS浓度为30mg/ml，皂苷浓度为60mg/mL和Triton X-100浓度范围为0-2.25％w/v的溶液10ml组合来制备各种3型血液裂解试剂溶液，以获得体积为20ml，SPS浓度为15mg/ml，皂苷浓度为30mg/ml，Triton X-100浓度范围为0-1.12％，缓冲液浓度为100mM和pH值范围为9.5-10的试剂溶液。将5ml的3型血液裂解试剂与3ml全血样本混合后，SPS浓度为9.375mg/mL，皂苷浓度为18.75mg/mL，Triton X-100浓度范围为0-0.7％w/v，pH值为9.2，有效缓冲液浓度为62.5mM。根据实施例3的方法制备加标磷酸盐缓冲液样本。根据以下实施例6和7中提供的方法，分别对用作加标对照的加标磷酸盐缓冲液样本和加标全血样本进行离心分离和实时RT-PCR。测定阈值周期值(CT值；即，信号增加超过噪声阈值之后的PCR循环数)，并且基于加标全血CT值和加标对照CT值之间的差异确定CT值的差异ΔCT。
如图11A中所示，对于0.23％w/v和更大的Triton X-100浓度，所有三种微生物种类的ΔCT值小于5，并且基本上与Triton X-100浓度无关。
3型血液裂解试剂对不同非离子型全血标本处理洗涤剂依赖性的实验研究
进行实验以证明吐温20(Tween 20)作为非离子洗涤剂的适用性。将3ml体积的含铜绿假单胞菌(PA)、奇异变形杆菌(PM)和金黄色葡萄球菌(SA)的，根据以下实施例2制备的加标全血样本与3型血液裂解试剂接触来进行实验。制备两种不同的3型血液裂解试剂溶液。通过将10ml的用200mM的缓冲液浓度和10.1的pH制备的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液与10ml的SPS浓度为30mg/ml，皂苷浓度为60mg/mL和Triton X-100浓度为3％的溶液组合来制备一种血液裂解试剂。通过将10ml的用200mM的缓冲液浓度和10.1的pH制备的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液与10ml的SPS浓度为30mg/ml，皂苷浓度为60mg/mL和Tween-20浓度为3％的溶液组合来制备另一种血液裂解试剂。所得血液裂解试剂溶液的体积为20ml，SPS浓度为15mg/ml，皂苷浓度为30mg/ml，Triton X-100或Tween-20浓度为1.5％，缓冲液浓度为100mM，pH值接近10。将5ml的3型血液裂解试剂与3ml全血样本混合后，SPS浓度为9.375mg/mL，皂苷浓度为18.75mg/mL，Triton X-100或Tween-20浓度为0.94％w/v，pH值为9.2，有效缓冲液浓度为62.5mM。根据实施例3的方法制备加标磷酸盐缓冲液样本。根据以下实施例6和7中提供的方法，分别对用作加标对照的加标磷酸盐缓冲液样本和加标全血样本进行离心分离和实时RT-PCR。测定阈值周期值(CT值；即，信号增加超过噪声阈值之后的PCR循环数)，并且基于加标全血CT值和加标对照CT值之间的差异确定CT值的差异ΔCT。图11B中呈现的ΔCT值说明所有三种微生物种类的ΔCT值在吐温20(Tween 20)和Triton X-100的情况下非常相似。
全血样本处理中3型血液裂解试剂对碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液初始浓度依赖性的实验研究
进行试验以研究用于处理加标微生物细胞的全血样本时，3型血液裂解试剂的性能对碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液初始浓度的依赖性。将3ml体积的含铜绿假单胞菌(PA)、奇异变形杆菌(PM)和金黄色葡萄球菌(SA)的，根据以下实施例2制备的加标全血样本与各种3型血液裂解试剂接触来进行实验。将以缓冲液浓度为0、20、100、200和400mM且pH值在9.5-10范围内制备的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液10ml与SPS浓度为30mg/ml，皂苷浓度为60mg/ml和Triton X-100浓度为3％w/v的溶液10ml组合来制备各种3型血液裂解试剂溶液，以获得体积为20ml，SPS浓度为15mg/ml，皂苷浓度为30mg/ml，Triton X-100浓度为1.5％w/v，pH值为4.7、7.0、9.8、9.9和10.0以及缓冲液浓度分别为0、10、50、100、200mM的试剂溶液。将5ml的3型血液裂解试剂与3ml全血样本混合后，SPS浓度为9.375mg/mL，皂苷浓度为18.75mg/mL，Triton X-100浓度为0.94％w/v，pH值为7.2、9.2、9.7、9.9和10.0，有效缓冲液浓度为0、6.25、31.25、62.5和125mM。根据实施例3的方法制备加标磷酸盐缓冲液样本。根据以下实施例6和7中提供的方法，分别对用作加标对照的加标磷酸盐缓冲液样本和加标全血样本进行离心分离和实时RT-PCR。测定阈值周期值(CT值；即，信号增加超过噪声阈值之后的PCR循环数)，并且基于加标全血CT值和加标对照CT值之间的差异确定CT值的差异ΔCT。
如图12A所示，对于50mM至200mM的初始碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液浓度，所有三种微生物种类的ΔCT值小于5。对于10mM及以下的初始碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液浓度，发现ΔCT值超过10。不受理论的限制，据信这种作用是由于血液裂解试剂的缓冲能力不足，使得在将试剂与血液混合后，混合物的pH向约为7.4的血液的pH值下降。因此，培养基的碱性不足以能够充分消化血细胞碎片。对于200mM的初始碳酸盐-碳酸氢盐浓度，还发现ΔCT值升高，这可能是由于试剂的缓冲能力增加使得混合物pH保持接近于血液裂解试剂的初始pH值。这种pH可能通过升高的渗透压损坏一些细菌细胞，特别是革兰氏阴性菌。此外，较高的碳酸盐浓度增加了血液裂解试剂的密度并因此增加了裂解血液的密度。这导致更长的沉降时间和在第一洗涤循环之前更长的暴露于试剂的有害作用。例如，具有100、250和500mM的初始碳酸盐-碳酸氢盐浓度的血液裂解试剂的密度分别为1.01、1.025和1.05g/mL。将这些试剂以5:3的比率添加到全血，具有1.06g/mL的平均密度，将产生具有1.029、1.038和1.054g/mL的相应密度的最终混合物。因此，密度为1.10的细菌细胞需要长大约50％的时间来沉淀。
如图12B所示，当混合前(即与全血样本和其它3型血液裂解试剂成分混合前)的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液的初始pH接近10时，3型血液裂解试剂与全血混合后获得的混合物的pH由于试剂有限的缓冲能力而降至10以下，最终pH值取决于初始碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液浓度(即取决于缓冲能力)。测得与0mM和200mM的初始碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液浓度对应的最终混合后pH值分别为7.4和9.6。在下面描述的一系列另外的实验中进一步研究了这一方面。
全血和缓冲液样本处理中3型血液裂解试剂性能对pH依赖性的实验研究
在加标磷酸盐缓冲液和加标全血样本的基础上，进行实验以研究pH对3型血液裂解试剂中微生物细胞完整性的影响。通过使含有铜绿假单胞菌(PA)、奇异变形杆菌(PM)和金黄色葡萄球菌(SA)的加标磷酸盐缓冲液样本(根据以下实施例3制备)与各种3型血液裂解试剂接触来进行第一组实验。将以缓冲液浓度为200mM且pH值分别为9.5、10和10.5范围内制备的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液10ml与SPS浓度为30mg/ml，皂苷浓度为60mg/mL的皂苷和Triton X-100浓度为3％w/v的溶液10ml组合来制备各种3型血液裂解试剂溶液，以获得体积为20ml，SPS浓度为15mg/ml，皂苷浓度为30mg/ml，Triton X-100浓度为1.5％w/v，pH值为9.6、10.0和10.3以及缓冲液浓度为100mM的试剂溶液。将1ml的3型血液裂解试剂与1ml的加标磷酸盐缓冲液样本混合后，SPS浓度为7.5mg/mL，皂苷浓度为15mg/mL，Triton X-100浓度为0.75％w/v，pH值为9.5-10，有效缓冲液浓度为50mM。在类似条件下进行额外实验，但混合后Triton X-100浓度为0.375％w/v。随后根据以下实施例5中提供的方法进行离心分离和实时RT-PCR。还制备根据以下实施例3的方法制备的加标磷酸盐缓冲液样本用于加标对照，并根据以下实施例4的方法进行实时RT-PCR。根据加标磷酸盐缓冲液样本CT值和加标对照CT值之间的差值确定的ΔCT值被用作微生物细胞完整性的替代指标。
涉及加标磷酸盐缓冲液样本的实验的所得ΔC
通过使含有铜绿假单胞菌(PA)、奇异变形杆菌(PM)和金黄色葡萄球菌(SA)的加标全血样本(与图13A和13B中加标磷酸盐缓冲液样本形成对比)(根据以下实施例2制备)与各种3型血液裂解试剂接触来进行第二组实验。将以缓冲液浓度为200mM且pH值在9.5、10和10.5范围内制备的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液10ml与SPS浓度为30mg/ml，皂苷浓度为60mg/mL和Triton X-100浓度为3％w/v的溶液10ml组合来制备各种3型血液裂解试剂溶液，以获得体积为20ml，SPS浓度为15mg/ml，皂苷浓度为30mg/ml，Triton X-100浓度为1.5％w/v，pH值为9.6、10.0和10.3以及缓冲液浓度为100mM的试剂溶液。将1ml的3型血液裂解试剂与1ml全血样本混合后，SPS浓度为7.5mg/mL，皂苷浓度为15mg/mL，Triton X-100浓度为0.75％w/v，pH值为9.0、9.2和9.7，有效缓冲液浓度为50mM。根据实施例3的方法制备加标磷酸盐缓冲液样本。根据以下实施例5和8中提供的方法，分别对用作加标对照的加标磷酸盐缓冲液样本和加标全血样本进行离心分离和实时RT-PCR。根据加标磷酸盐缓冲液样本CT值和加标对照CT值之间的差值确定的ΔCT值被用作微生物细胞完整性的替代指标。
涉及全血样本的实验的所得ΔC
注意，由于血液的缓冲能力，3型血液裂解试剂的最终pH值和初始缓冲液浓度不是独立的参数。实际上，在将3型血液裂解试剂与全血混合后，观察到混合物的pH值从用于制备血液裂解试剂的pH值的初始水平降低，如图12B所示。
观察到从碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液的初始pH到全血混合物的最终pH的降低量取决于用于制备血液裂解试剂的初始缓冲液浓度。为了进一步研究这一点，制备具有不同初始pH和缓冲液浓度值的各种3型血液裂解试剂并与全血混合，并且在将血液裂解试剂与全血混合之前和之后进行pH测量。将以pH值分别为9.5、10和10.5，每个用100、150和200mM三种浓度的缓冲液制备的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液10ml与SPS浓度为30mg/ml，皂苷浓度为60mg/mL和Triton X-100浓度为3％w/v的溶液10ml组合来制备各种3型血液裂解试剂溶液，以获得体积为20ml，SPS浓度为15mg/ml，皂苷浓度为30mg/ml，Triton X-100浓度为1.5％w/v，pH值接近9.6、10和10.3以及缓冲液浓度为50、75和100mM的试剂溶液。将1ml血液裂解试剂与1ml全血样本混合后，SPS浓度为7.5mg/mL，皂苷浓度为15mg/mL，Triton X-100浓度为0.75％w/v，pH值在9.0-9.2、9.2-9.5和9.7-9.9之间，有效缓冲液浓度分别为25、37.5和50mM。
图14B绘制了对于初始碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液的不同pH值(9.5、10和10.5)，根据用于制备3型血液裂解试剂的初始碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液浓度的最终混合物(3型血液裂解试剂+全血)的pH。如图所示，血液中的HCO
以上实验说明了在血液裂解试剂/全血混合物中的最终pH对微生物细胞回收的影响。该最终pH取决于血液裂解试剂中的碳酸盐缓冲能力和缓冲液在加入血液裂解试剂之前的初始pH。前述实施例表明，通过在低起始pH下使用高浓度的碳酸盐缓冲液，或通过在高起始pH下使用低浓度的缓冲液，可以实现9-9.5的目标pH范围。在该实施例中，调节血液裂解试剂中的缓冲能力和初始pH以实现全血中相同的pH值。然后在细胞回收实验中测试这些混合物以确定碳酸盐缓冲液浓度的影响。
在另一个实验中，制备具有不同pH值和缓冲液浓度的一组血液裂解试剂，使得在与全血混合时，将实现约9.5的最终pH值。图14C是说明使用碳酸盐-碳酸氢盐缓冲体系制备合适的血液裂解试剂的表。该表记录缓冲液先与试剂成分混合形成3型血液裂解试剂，再与全血混合时的pH值和原始缓冲液浓度的稀释。通过混合特定比例的碳酸钠和碳酸氢钠来制备pH值为9.5和10.5的1M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液的原液。进行缓冲液的稀释，使得混合形成3型血液裂解试剂，然后与全血混合后的最终pH相似(约9.5)。将以pH值分别为9.66、10.19和10.78，每个分别用400、200和120mM三种浓度的缓冲液制备的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液10ml与SPS浓度为30mg/ml，皂苷浓度为60mg/mL和Triton X-100浓度为3％w/v的溶液10ml组合来制备各种3型血液裂解试剂溶液，以获得体积为20ml，SPS浓度为15mg/ml，皂苷浓度为30mg/ml，Triton X-100浓度为1.5％w/v，pH值为9.65、9.97和10.23以及缓冲液浓度为200、100和60mM的试剂溶液。将5ml的3型血液裂解试剂与3ml全血样本混合后，SPS浓度为9.375mg/mL，皂苷浓度为18.75mg/mL，Triton X-100浓度为0.94％w/v，有效缓冲液浓度分别为125、62.5和37.5mM，pH值近乎相似为9.45、9.52、9.56。
例如，在最低pH开始的缓冲液以最高浓度制备，而最低浓度的缓冲液以最高pH开始。缓冲液在稀释时，与血液裂解试剂中的酸性皂苷及血液中的HCO
通过将根据以下实施例2制备的含有铜绿假单胞菌(PA)、奇异变形杆菌(PM)和金黄色葡萄球菌(SA)的加标全血样本与图14C所示的表中的3型血液裂解试剂(即血液裂解试剂的pH值和碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液的浓度分别为9.65、9.97、10.23和200mM、100mM和60mM)接触来进行另一组实验。根据实施例3的方法制备加标磷酸盐缓冲液样本。根据以下实施例5和8中提供的方法，分别对用作加标对照的加标磷酸盐缓冲液样本和加标全血样本进行离心分离和实时RT-PCR。根据加标全血样本CT值和加标对照CT值之间的差值确定的ΔCT值被用作微生物细胞完整性的替代指标。
涉及全血样本的实验的所得ΔC
应当理解，在本文提供的许多示例性实施方案中使用的示例性碳酸盐缓冲体系仅用作说明性实例，并且在替代方案中可以使用其他缓冲体系。其它合适的碱性缓冲液的非限制性实例包括硼酸盐、碳酸盐、CAPS(N-环己基-3-氨基丙磺酸)、CAPSO(3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸)、CHES(2-(N-环己基氨基)乙烷磺酸)、焦磷酸盐、AMP(2-氨基-2-甲基-1-丙醇)和乙醇胺。
为了证明示例性替代缓冲体系的可操作性，通过使根据以下实施例2制备的含有铜绿假单胞菌(PA)、奇异变形杆菌(PM)和金黄色葡萄球菌(SA)的加标全血样本与含有Triton X-100、皂苷、SPS和三种不同缓冲体系的各种3型血液裂解试剂接触来进行实验。将10ml的缓冲液浓度为200mM且每个pH值在10的碳酸盐-碳酸氢盐、CAPS和CHES缓冲液与10ml的SPS浓度为30mg/ml，皂苷浓度为60mg/mL和Triton X-100浓度为3％w/v的溶液组合来制备各种3型血液裂解试剂溶液，以获得体积为20ml，SPS浓度为15mg/ml，皂苷浓度为30mg/ml，Triton X-100浓度为1.5％w/v，pH值分别为9.43、9.47和9.55以及每个缓冲液浓度为100mM的试剂溶液。将5ml的3型血液裂解试剂与3ml全血样本混合后，3种不同示例性缓冲体系的SPS浓度为9.375mg/mL，皂苷浓度为18.75mg/mL，Triton X-100浓度为0.94％w/v，有效缓冲液浓度为62.5mM，pH值近乎相似分别为9.29、9.10、9.06。根据实施例3的方法制备加标磷酸盐缓冲液样本。根据以下实施例6和7中提供的方法，分别对用作加标对照的加标磷酸盐缓冲液样本和加标全血样本进行离心分离和实时RT-PCR。根据加标全血样本CT值和加标对照CT值之间的差值确定的ΔCT值被用作微生物细胞完整性的替代指标。
图15A绘制了使用不同缓冲液的不同3型血液裂解试剂制剂的观察到的ΔCT值。结果表明，在实时RT-PCR测定的情况下，三种缓冲体系在回收率方面没有显著性差异。
图15B是表示在将3型血液裂解试剂与全血混合之前和之后的pH的表。这些pH值几乎相似，表明具有相似pH值和离子强度的不同缓冲体系可用于具有相似溶血性能和微生物细胞完整性的3型血液裂解试剂。
全血样本处理中3型血液裂解试剂对SPS依赖性的实验研究
本发明人还通过实验研究了SPS在清除血液碎片中的作用。如以上所解释的，此类碎片的存在可以导致微生物细胞的截留和损失并且还可以阻止自动离心和/或过滤，这是由于与块状物的存在相关联的问题(结块问题)。此外，碎片可能在离心洗涤过程中沉淀并转移到最终细胞悬液中。这可以抑制对微生物细胞或其裂解物的下游测定。进行了一系列的4个实验以研究具有混合后不同浓度的SPS的3型血液裂解试剂的不同成分在清除血液碎片中的作用。如下文将解释的，发现SPS的存在似乎在血液裂解和离心后减少或消除血液碎片中起重要作用。使用未加标微生物细胞的全血样本进行四个实验，因为这些实验的目的是观察和研究血液裂解后血液碎片的形成。
根据实施例9中描述的方法，在不存在Triton X-100和碳酸盐缓冲液的情况下，通过将3ml未加标全血样本与5ml各种含有皂苷和SPS的血液裂解试剂成分混合来进行第一个实验，使得混合后，皂苷终浓度为18.75mg/ml，SPS浓度范围为0-20mg/ml。图16A显示了四个样本的离心管的照片。很明显，在没有由碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液促进的高pH环境的情况下，皂苷和SPS不能实现血液成分的充分消化，并且观察到显著的血液碎片。
根据实施例9中描述的方法，在不存在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液的情况下，通过将3ml未加标全血样本与5ml含有皂苷、SPS和Triton X-100的各种裂解试剂成分混合来进行第二个实验，使得混合后，最终皂苷浓度为18.75mg/ml，最终Triton X-100浓度为0.75％w/v，SPS浓度范围为0-20mg/ml。图16B显示了四个样本的离心管的照片。照片显示对于10mg/ml的SPS浓度仅存在非常少量的血液碎片，并且对于20mg/ml的SPS浓度血液碎片似乎被完全消除。
根据实施例9中描述的方法，在不存在Triton X-100的情况下，通过将3mL未加标全血样本与5mL各种含有皂苷、SPS和碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液的裂解试剂成分混合来进行第三个实验。将pH值范围为9.5-10、缓冲液浓度为200mM的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲溶液10ml与SPS浓度为0-40mg/ml、皂苷60mg/mL的溶液10ml组合，得到体积为20ml、皂苷浓度为30mg/ml、SPS浓度为0-20mg/ml以及缓冲液浓度为100mM的试剂溶液来制备裂解试剂溶液。将5ml血液裂解试剂与3ml全血样本混合后，SPS浓度范围为0-12.5mg/mL，皂苷浓度为18.75mg/mL，有效缓冲液浓度为62.5mM。图16C显示了四个样本的离心管的照片。照片显示，对于0-10mg/ml范围内的SPS浓度，存在中等量的血液碎片，并且对于20mg/ml的SPS浓度，血碎片似乎被完全消除。
第四个实验通过将3mL未加标全血样本与5ml根据实施例9中描述的方法制备含有皂苷、SPS、Triton X-100和碳酸盐缓冲液的3型血液裂解试剂混合来进行。将以pH值在9.5-10的范围，缓冲液浓度为200mM制备的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液10ml与SPS浓度范围为0-40mg/mL，皂苷浓度为60mg/mL，Triton X-100浓度为3％w/v的溶液10ml组合来制备3型血液裂解试剂溶液，以获得其体积为20ml，SPS浓度范围为0-20mg/ml，皂苷浓度为30mg/ml，Triton X-100浓度为1.5％w/v，缓冲液浓度为100mM的试剂溶液。将5ml血液裂解试剂与3ml全血样本混合后，SPS浓度范围为0-12.5mg/mL，皂苷浓度为18.75mg/mL，Triton X-100浓度为0.94％w/v，有效缓冲液浓度为62.5mM。图16D显示了四个样本的离心管的照片。照片显示在没有SPS存在下存在少量血液碎片，并且对于5-20mg/ml的SPS浓度，血液碎片似乎被完全消除。然而，注意到即使在图16D中对于超过5mg/ml的SPS浓度没有观察到血液碎片(结块)的存在，但是对于5mg/ml的样本，仍然存在少量的血液碎片，其可能足以影响下游分子测定的性能。因此，如下，10mg/mL至30mg/ml的SPS浓度可优选用于涉及后续分子测定的实施方案。然而，当减少结块时，高于50mg/ml的浓度在一些应用中可能太高，因为SPS是一些PCR酶的抑制剂。
前述四个实验在视觉上证明SPS似乎在血液成分的消化和血液碎片的减少和/或消除中起重要作用，这对于涉及离心、过滤或其它方法如免疫磁性和基于微流体的分离的自动样本制备方法可能是重要的。实际上，观察到SPS的存在与(i)3型血液裂解试剂和(ii)含3型血液裂解试剂的成分的子集的其他血液裂解试剂的残留血液碎片的减少相关。
进行进一步的实验以研究当用于处理加标了微生物细胞的全血液样本品时，3型血液裂解试剂的性能对SPS浓度的依赖性。将3ml体积的含铜绿假单胞菌(PA)、奇异变形杆菌(PM)和金黄色葡萄球菌(SA)的，根据以下实施例2制备的加标全血样与含皂苷、碳酸盐缓冲液、Triton X-100和SPS的各种3型血液裂解试剂接触本来进行实验。将以缓冲液浓度为200mM和pH值范围为9.5-10制备的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液10ml与SPS浓度范围为0-80mg/ml，皂苷浓度为60mg/ml，Triton X-100浓度为3％w/v的溶液10ml组合来制备3型血液裂解试剂溶液，以获得体积为20ml，SPS浓度范围为0-40mg/ml，皂苷浓度为30mg/ml，Triton X-100浓度为1.5％w/v和缓冲液浓度为100mM的3型血液裂解试剂溶液。将每种血液裂解试剂5ml与3ml全血混合后，SPS浓度范围为0-25mg/mL，皂苷浓度为18.75mg/mL，Triton X-100浓度为0.94％w/v，有效缓冲液浓度为62.5mM。根据实施例3的方法制备加标磷酸盐缓冲液样本。根据以下实施例6和7中提供的方法，分别对用作加标对照的加标磷酸盐缓冲液样本和加标全血样本进行离心分离和实时RT-PCR。测定阈值周期值(CT值；即，信号增加超过噪声阈值之后的PCR循环数)，并且基于加标全血CT值和加标对照CT值之间的差异确定CT值的差异ΔCT。
如图16E所示，对于3.125mg/ml和更高的最终(后混合)SPS浓度，所有三种微生物种类的ΔCT值小于5。对于与不存在SPS的血液裂解试剂接触的样本，未获得可检测信号。因此，这些结果表明在没有SPS的情况下，通过实时RT-PCR检测rRNA受损，可能是由于上述结块现象造成的。
虽然本文描述的许多示例性实施方案使用Triton X-100(例如已知为聚乙二醇对(1,1,3,3-四甲基丁基对)-苯基醚)、辛基酚乙氧基化物、聚氧乙烯辛基苯基醚、聚乙氧基化4-辛基苯酚以及叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)作为非离子表面活性剂，应理解，适于裂解血液成分和保存完整微生物细胞的3型血液裂解试剂可包括宽范围的非离子表面活性剂。合适的非离子表面活性剂的非限制性实例包括但不限于烷基糖苷、Brij 35(C12E23聚氧乙烯醇十二烷基醚)(15、7)、Brij 58(CI 6E20聚氧乙烯醇十二烷基醚)(16)、Genapol(13-19)、烷基N-甲基葡糖酰胺如MEGA-8,-9,-10、辛基葡糖苷(12、6)、Pluronic F127、Triton X-100(C14H22O(C2H4O))(13、4)、Triton X-114(C24H4206)(12、4)、吐温20(Tween 20，聚山梨酯20)(16、7)和吐温80(Tween 80，聚山梨酯80)(15)Nonidet P40脱氧胆酸钠、还原的TritonX-100和/或Igepal CA 630。
本发明人已观察到，在不存在消泡剂的情况下，3型血液裂解试剂制剂在各种混合和储存条件下可易于起泡。因此，在一些示例性实施方案中，3型血液裂解试剂可以进一步包括消泡剂。消泡剂优选不溶于发泡培养基，具有低表面张力以使其铺展在表面上，并且能够渗透泡沫气-液界面以使其不稳定并使其坍塌。此外，在涉及盒内流体输送的自动应用中，消泡剂应完全消除或显著减少泡沫形成。另外，在血液裂解过程中，理想的消泡剂将对微生物细胞具有最小的亲和力或没有亲和力，并且作为乳液保持悬浮在液体中。在分离(例如离心或过滤)期间，由于消泡剂收集和截留微生物细胞的风险，在消泡剂和血液裂解试剂的剩余部分之间不应形成相分离。
本发明人通过实验研究了来自西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)的两种可商购的消泡制剂：有机消泡剂204(产品编号A8311)和硅酮消泡剂SE-15(产品编号A8582)。消泡剂204(“AF204”)含有100％的由基于非硅酮聚丙烯的聚醚分散体的混合物组成的活性成分。研究了AF204本身以及与平均分子量为4000Da的聚丙二醇(“PPG4000”)的组合。消泡剂SE-15为活性硅酮聚合物和非离子乳化剂的10％w/v乳液。
在以下实例中，根据三个标准评估具有添加的消泡剂的各种3型血液裂解试剂：1)剧烈摇晃后的泡沫高度，2)对微生物细胞回收的影响(根据rRNA检测和扩增循环)，以及3)中期稳定性。将以缓冲浓度为200mM、pH为9.5-10的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液10ml与SPS浓度为30mg/ml、皂苷浓度为60mg/ml、Triton X-100浓度为3％w/v，以及AF204、SE-15、PPG4000或其混合物的溶液10ml，其各自浓度为0.1-0.4％(v/w)组合来制备3型血液裂解试剂溶液，以获得体积为20ml，SPS浓度为15mg/ml，皂苷浓度为30mg/ml，Triton X-100浓度为1.5％w/v，缓冲液浓度为100mM，以及AF204、SE-15、PPG4000或其混合物，每个浓度为0.05-0.2％w/v的3型血液裂解试剂溶液。
将1mL的血液裂解试剂分配在15ml锥形管中并在90°弧中剧烈振荡10秒，然后放置在管架中，其中可以观察并测量来自液体表面的泡沫高度(图17A)。在没有任何消泡剂的情况下，观察到当以上述方式振荡时裂解试剂产生高度为约25mm的泡沫。
当使用非硅酮基消泡剂时，当AF204与PPG4000(理想地以10:1的比率)组合时，泡沫高度更有效地降低。然而，在继续振荡后，消泡混合物的作用减弱，将泡沫高度从第一次振荡后的3.5mm增加至随后的振荡后的10mm。硅酮基乳液SE-15单独以0.05-0.2％(v/w)的浓度在1mL上述3型血液裂解试剂中使用。泡沫高度从未处理样本中的25mm下降到具有0.05％(v/w)SE-15的2.5mm，并且下降到具有0.2％(v/w)SE-15的几乎没有泡沫。
观察到消泡剂SE-15的作用在随后的血液裂解试剂的搅拌下是持久的。为了进一步说明SE-15的消泡性能，将5mL上述3型血液裂解试剂与0.05％(v/w)SE-15(图17B，右)和不存在消泡试剂的3型血液裂解试剂(图17B，左)在各自的15mL离心管中以最大速度在标准台式实验室涡旋器上涡旋1分钟。这些实验的结果总结在图17B和17C中。涡旋后立即，与未处理的血液裂解试剂相比，具有SE-15的血液裂解试剂(图17B，右和图17C中的HR5)具有接近五分之一的泡沫高度。在20秒内，泡沫几乎完全塌缩，而未处理的血液裂解试剂中的泡沫(图17B，左和图17C中的HR3)保持不变。
为了评价消泡剂对细胞回收的影响，将根据以下实施例3制备的含有铜绿假单胞菌(PA)，奇异变形杆菌(PM)和金黄色葡萄球菌(SA)的加标磷酸盐缓冲液样本(除了微生物细胞以200CFU/ml的浓度而不是100CFU/ml加标)与含有消泡剂的各种3型血液裂解试剂混合(图17A)。将1ml血液裂解试剂与1ml加标磷酸盐缓冲液样本混合后，SPS浓度为7.5mg/mL，皂苷浓度为15mg/mL，Triton X-100浓度为0.75％w/v，缓冲液浓度为50mM，消泡剂(AF204、SE-15、PPG4000或其混合物)浓度范围为0.0025-0.1％(w/v)。随后根据实施例5中提供的方法进行离心分离和实时RT-PCR。ΔCT值是通过从使用具有消泡剂的3型血液裂解试剂的实验的测量CT值中减去在使用不具有消泡剂的3型血液裂解试剂的实验中获得的CT值来确定的。
图17A所示的细胞完整性实验的结果证明，对于硅酮和非硅酮基消泡剂，当与不存在消泡剂的3型试剂相比时，没有观察到CT值的显著增加。实际上，对于两种消泡剂，由消泡剂在血液裂解试剂中产生的乳液在整个血液裂解过程中保持均质化的，没有观察到相分离。此外，在SE-15的情况下，显微评估未观察到在示例性离心过程的最后洗涤中残留的任何乳液颗粒，表明试剂被有效地除去并因此不能干扰下游测定。
为了评价3型血液裂解试剂对细胞回收的短期稳定性，将根据以下实施例3制备的含有铜绿假单胞菌(PA)，奇异变形杆菌(PM)和金黄色葡萄球菌(SA)的加标磷酸盐缓冲液样本(除了微生物细胞以200CFU/ml的浓度而不是100CFU/ml加标)与用(HR5)或不用(HR3)SE-15制备的各种3型血裂解试剂混合，示于图17D。制备3型血液裂解试剂溶液，其体积为20ml，SPS浓度为15mg/ml，皂苷浓度为30mg/ml，Triton X-100浓度为1.5％w/v，缓冲液浓度为100mM，含有或不含0.05％SE-15(w/v)。将1ml血液裂解试剂与1ml加标磷酸盐缓冲液样本混合后，SPS浓度为7.5mg/mL，皂苷浓度为15mg/mL，Triton X-100浓度为0.75％w/v，缓冲液浓度为50mM，SE-15浓度为0.0025％(w/v)。根据以下实施例5中提供的方法进行样本制备和实时RT-PCR。还制备根据以下实施例3的方法制备的加标磷酸盐缓冲液样本用于加标对照，并根据以下实施例4的方法进行实时RT-PCR。根据加标磷酸盐缓冲液样本CT值和加标对照CT值之间的差值确定的ΔCT值被用作微生物细胞完整性的替代指标。在消泡剂存在下制备的3型血液裂解试剂的短期稳定性没有显示出细胞回收和消泡性质有任何变差。
如上，消泡剂SE-15(Antifoam SE-15)是由10％硅聚合物和至多5％的非离子乳化剂组成的市售乳液。硅聚合物为聚二甲基硅氧烷(化学通式：(H3C)3[Si(CH3)
上述实验研究证明，通过将全血样本与3型血液裂解试剂(用于选择性裂解血液和/或其它真核细胞)混合可以实现全血样本的有效分离、纯化和浓缩，3型血液裂解试剂包括但不限于皂苷、SPS、非离子表面活性剂、碱性缓冲液和任选的消泡剂。如上所述，本发明人假设皂苷作为表面活性剂可以在微生物细胞上形成层而不会对微生物细胞造成损害，并且由皂苷产生的表面活性剂层可以ΔCT作为碱性环境中的保护层，屏蔽微生物细胞免受高pH环境的其它有害作用。尽管如此，发明人最初还是遇到了阻力，他们对这种试剂组合的成功预期很低，因为预期皂苷与高pH环境不相容。具体地，本发明人怀疑皂苷的溶血作用和上述皂苷的潜在保护作用可能受到由碱性环境引起的皂苷降解的有害影响。
皂苷通常作为来自南美皂皮树(Quillaja saponaria Molina tree)的提取物获得，并且由超过30种结构上不同的糖苷的复杂混合物组成，糖苷的不同在于附着于共同三萜系化合物骨架的多糖的性质。主要皂苷类、QS-7、QS-17、QS-18和QS-21占总皂苷含量的至多90wt％，并且在其化学结构\毒性和溶血活性方面表征最充分。当分离时，QS-17、QS-18和QS-21都以大约相同的剂量(7-25μg/mL)引起溶血。
当以20wt％的浓度溶于水时，皂苷是弱酸性的，并且根据其纯度将显示4-5的pH。在大于8的pH值下，主要皂苷化合物QS-7、QS-17、QS-18和QS-21将发生碱水解，生成“脱乙酰化皂苷”DS-1和DS-2。这些脱乙酰化皂苷显示出比它们的亲代皂苷低大约10倍的溶血活性(D.J.Pillion，J.A.Amsden，C.R.Kensil，J.Recchia“Quillaja皂苷作为胰岛素经鼻和眼部给药的赋形剂之间的结构-功能关系(Structure—function relationship amongQuillaja saponins serving as excipients for nasal and ocular delivery ofinsulin)”，《药学科学杂志》(J of Pharmaceutical Sciences)，第85卷第5期，1996，518-524页)。在这样的升高的pH水平下，皂苷混合物的临界胶束浓度也将增长10倍，从在pH 6.5下的200mg/L增加至在pH 10下的2000mg/L(W-J Chen，L-C Hsiao，K K-Y Chen“使用植物衍生的皂苷生物表面活性剂从铜(II)/镍(II)加标高岭土中将金属解吸为土壤成分(Metaldesorption fromcopper(II)/nickel(II)-spiked kaolin as a soil component usingplant-derived saponin biosurfactant)”，《加工生物化学》(Process Biochemistry)，第43卷，第5期，2008，488-498页。考虑到皂苷在碱性环境中的这种已知降解，以及相关的溶血活性降低，发明人对3型血液裂解试剂的成功感到惊讶，因为3型血液裂解试剂的有效性不会立即下降。
本发明人进行了一组稳定性实验以进一步研究皂苷在3型试剂的碱性环境存在下的降解。如下，这些实验从通过rRNA扩增确定的(i)溶血能力和(ii)微生物细胞完整性的双重角度研究了3型血液裂解试剂的稳定性。
在首次从溶血能力的角度考察皂苷在碱性环境中的稳定性的实验中，通过切向流过滤进一步提纯了来自Desert King International的皂苷(Saponin-Ultra)，得到的溶液中总皂苷为197mg/mL，按(HPLC)皂苷含量计算>80％，多酚<1.5％(w/w)杂志和多糖<5％(w/w)杂质含量低。将该溶液在三种不同缓冲液之一中稀释至30mg/ml的浓度：(1)未缓冲(溶于水，最终pH～4.3)；(2)60mM乙酸钠缓冲液(最终pH～4.9)；(3)100mM碳酸钠缓冲液(最终终pH～9.8)。将皂苷样本储存在室温下的密封小瓶中，然后使用以下程序测试溶血活性。将皂苷溶液在含0.9％w/v的NaCl的1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)(PBS)中稀释至4mg/mL的浓度。在单独的2mL聚丙烯管中，为每种皂苷溶液制备200μL的连续稀释液，在PBS中从1280μg/mL到5μg/mL。阳性对照是200μL的1％w/v的Triton X-100的PBS溶液，而阴性对照是200μL的单独PBS。向每个样本和对照中加入200μL在PBS中的4％v/v绵羊红细胞(Innovative ResearchIC100-0210)。将聚丙烯管加盖，然后在室温下在旋转摇床上孵育2小时。将试管在3000RPM下离心5分钟，然后从每个上清液取50μL，在96孔测定板用150μL的PBS稀释。
通过在UV/可见光酶标仪中测量每个样本在540nm下的吸光度来研究溶血。根据不同稀释度的吸光度值绘制出剂量-反应曲线，由此计算出每个皂苷样本的HC50值(达到50％完全溶血的皂苷浓度)。将皂苷在不同缓冲液中稀释后立即进行一次溶血测试，并在室温下储存23天后再次进行溶血试验，以研究皂苷的短期稳定性。
图18A和18B分别显示了在第0天和第23天获取的每种皂苷溶液的剂量反应曲线，图18C显示了从该曲线得出的计算的HC50值。第一天后，每种皂苷在低和高pH值下的溶血活性几乎相同(HC50值为约36μg/mL)。23天后，贮存在酸性缓冲液(pH<5)中的皂苷在它们的剂量反应和HC50值(在39和38μg/mL之间)上没有显示出显著变化，而贮存在碱性缓冲液(pH～10)中的皂苷在相同的时间上显示出2倍的溶血活性损失(89μg/mL)。
该溶血活性的损失是由于高活性皂苷QS-7、QS-17、QS-18和QS-21缓慢碱水解成较少活性的“脱乙酰化皂苷”DS-1和DS-2。然而，在较高的pH下，至少在用血液裂解试剂进行裂解的典型时间段内(例如，大约5分钟)，皂苷似乎大部分是完整的，如在第0天的溶血活性所指示的。
以上讨论说明了皂苷在高pH培养基中的溶血效率方面的不稳定性。进行第二组实验以研究碱性pH和非离子表面活性剂对皂苷保持微生物细胞完整性的能力的影响。如在一些前述实施例实验中，使用rRNA扩增作为血液裂解和微生物细胞分离后细胞完整性的代表，通过ΔCT定量完整性。当碳酸盐缓冲液单独保存或与血液裂解试剂的其余成分一起保存时，通过随时间监测ΔCT值来进行实验。使用两种3型血液裂解试剂进行实验。
将以缓冲液浓度为200mM和pH值为10制备的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液20ml与SPS浓度范围为30mg/ml，皂苷浓度为60mg/ml，Triton X-100浓度为3％w/v以及SE-15的浓度为0.1％w/v的试剂溶液10ml组合来制备第一3型血液裂解试剂溶液，以获得体积为20ml，SPS浓度范围为15mg/ml，皂苷浓度为30mg/ml，Triton X-100浓度为1.5％w/v，SE-15浓度为0.05％w/v和缓冲液浓度为100mM的3型血液裂解试剂溶液。基于3型血液裂解试剂制备第二试剂，但不加入缓冲液，使得可以通过在使用前将该试剂与碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液组合来获得3型血液裂解试剂，从而避免储存期间皂苷的降解。该第二试剂具有30mg/ml的SPS浓度，60mg/ml的皂苷浓度，3％w/v的Triton X-100浓度和0.1％w/v的SE-15浓度。
在室温下储存第一试剂(在储存之前将所有试剂成分预混合)和第二试剂(在没有碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液的情况下储存)一周后，将第二试剂与等体积的200mM混合碳酸盐缓冲液(pH 10)，由此提供SPS浓度为15mg/ml，皂苷浓度为30mg/ml，Triton X-100浓度为1.5％w/v，SE-15浓度为0.05％w/v的后混合3型血液裂解试剂。然后将预混合和后混合3型血液裂解试剂与(i)根据以下实施例2制备的加标体积为3ml的含有铜绿假单胞菌(PA)、奇异变形杆菌(PM)、和金黄色葡萄球菌(SA)的全血样本接触，和(ii)与根据以下实施例3制备的含有铜绿假单胞菌(PA)、奇异变形杆菌(PM)和金黄色葡萄球菌(SA)的加标磷酸盐缓冲液样本接触。将5ml的每种血液裂解试剂分别与3ml的加标磷酸盐缓冲液或加标全血混合后，皂苷浓度为18.75mg/mL，SPS浓度为9.375mg/mL，Triton X-100浓度为0.94％w/v，SE-15的浓度为0.03％w/v，有效缓冲液浓度为62.5mM。随后根据以下实施例7中提供的方法对加标磷酸盐缓冲液样本和加标全血样本进行离心分离和实时RT-PCR。还制备根据以下实施例3的方法制备的加标磷酸盐缓冲液样本用于加标对照，并根据以下实施例6的方法进行实时RT-PCR。
测定阈值周期值(CT值；即，信号增加超过噪声阈值之后的PCR循环数)，并且基于加标磷酸缓冲液CT值(图19A)或加标全血CT值(图19B)和加标对照CT值之间的差异确定CT值的差异ΔCT。使用第一试剂的新制备版本进行单独的一组实验以提供稳定性的参考。
加标磷酸盐缓冲液样本和加标全血样本的结果分别示于图19A和19B中。如观察到的，在一周内，3型血液裂解试剂的性能退化，使得ΔCT值增加3-8个循环，3型血液裂解试剂具有与缓冲体系预混合的皂苷，从而在高pH下储存。这些实验结果表明，当皂苷储存在高pH环境中时，在使用加标弱磷酸盐缓冲液的情况下，在大约一周的时间尺度上，在选择性裂解过程中，皂苷的保护作用似乎显著降低，但当血液裂解试剂与血液混合时，这种降解似乎没有那么显著的影响(即，观察到较少的ΔCT增加)。
上述实验结果表明，虽然皂苷的保护效果在与全血样本混合后不会立即或很快受到影响(例如，混合后最多一天)，但通过将皂苷成分与碱性缓冲液的基本成分分开进行长期储存(例如，储存几天、几周或几个月)，可以改善试剂的性能。例如，可以将3型血液裂解试剂的一种成分配制成在中性或酸性环境中含有皂苷，中性或酸性环境在混合一种或多种另外的试剂成分时转化成碱性pH。这些试剂成分可以液体形式、干燥形式或液体和干燥形式的组合储存(一种或多种试剂成分以液体形式储存，一种或多种其它试剂成分以干燥形式储存)。这些试剂成分可以在进行血液样本的血液裂解之前混合。例如，试剂成分可以在接触血液样本之前立即混合以形成3型血液裂解试剂(例如，在接触血液样本的几秒钟或几分钟内)，或者可替换地，试剂成分可以在接触血液样本之前以适当的延迟(例如，数小时)混合以形成3型血液裂解试剂，其中延迟被确定(例如，通过评估微生物细胞完整性对延迟的依赖性的一系列实验)，以在血液裂解过程期间保持微生物细胞的充分完整性。
在涉及试剂成分分离的一个示例性实现方式中，包括碱性盐(例如碳酸钠或碳酸钾)的第一试剂可以与含皂苷且在pH 3.5至5.5之间缓冲(例如用乙酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐、苯甲酸盐或苹果酸盐缓冲液缓冲)的第二试剂分开储存。第一试剂可以干燥形式储存，使得其在与第二试剂混合时溶解。在第一试剂被第二试剂充分溶解后(例如通过混合)，所得到的血液裂解试剂可以与血液样本接触。
可以实现根据前述实例的3型血液裂解试剂的碱性成分的分离，条件是第一试剂的成分，特别是皂苷，在室温下在适当的酸性pH缓冲液的存在下在温和酸性条件下长期稳定。此外，第一试剂和第二试剂应当被配置成使得固体碱相对于酸性缓冲液的适当比例可以被溶解，使得可以实现混合的3型血液裂解试剂的最终碱性pH水平以及所期望的有效缓冲液浓度。还有益的是，选择碱性盐以使得其可以在足够快的时间标度上溶解，不阻碍流体流动(例如，当在自动化过程中使用时，其中通道或阀可以另外被阻塞)，也不保持作为可能损害完整微生物细胞的回收的未溶解颗粒存在。
在所选择的非限制性示例实现方式中，可以用于形成合适的第一试剂的示例碱性盐包括碳酸钠和碳酸钾，这是因为它们在水中具有相对高的溶解度(在25℃下分别为31g/100mL和111g/100mL，这允许它们在第二试剂的存在下容易地溶解。这样的盐可以被制备为高度浓缩的水溶液，该高度浓缩的水溶液能够使碱性试剂作为液体分配，该碱性试剂然后可以被干燥以留下固体试剂(本示例性实现方式中的第一试剂)。在另一个示例性实现方式中，第一试剂可以形成(例如压制)成小的固体粒料(例如直径为2-4mm)，当与第二(液相)试剂组合时，小的固体粒料可以快速破碎并溶解。第一试剂和第二试剂可以各自的组合物形成，使得当混合时，能获得3型血液裂解试剂的目标pH和/或不超过最大pH(和/或缓冲液浓度)。
以下实例提供了用于产生两种试剂的示例性方法，这两种试剂可以分开储存并且随后混合以获得3型血液裂解试剂，以便在储存过程中维持皂苷活性。第一试剂配置成用于提供一种碱性溶液，如碳酸钠，并且在溶血之前与第二试剂保持分开，并且可以作为一种液体提供，或作为一种固体提供，该固体在与第二试剂混合时可以随后溶解。在本非限制性示例实现方式中，第一试剂包括碳酸钠或碳酸钾并且以固相储存。第二(液相)试剂包含皂苷且用中性或酸性pH缓冲，例如3.5至6.5、3.5至8、或4至5范围内的pH。
为了确定第一试剂和第二试剂的合适的相对量，以便在混合两种试剂之后获得期望的pH，在弱酸性缓冲液中制备第二试剂，然后用作为碳酸钠溶液的第一试剂滴定。在加入酸性缓冲液和碳酸钠滴定剂之前，第二试剂(4.5mL)包含浓度为1.67体积％的Triton X-100，浓度为22.2mg/mL的SPS，浓度为33.3mg/mL的皂苷，浓度为0.056％(v/w)的消泡剂SE-15。然后用不同量的乙酸钠(pH 5)或柠檬酸钠(pH 4.5和pH 5)缓冲第二试剂。
图20A和20B绘制了当分别用作为碳酸钠溶液(1摩尔)提供的第一试剂滴定含不同量的柠檬酸钠和乙酸钠的第二试剂时测量的pH变化。在每种情况下，目标pH为9.5-10.0，使得乙酸盐/柠檬酸盐与碳酸钠的总浓度为80至100mM。如图中所示，在最初少量添加碳酸钠溶液时，试剂混合物在较低的pH水平下保持弱缓冲，但是在pH 7和9之间，pH快速升高，因为碳酸盐支配新的缓冲体系。
在柠檬酸盐缓冲液(示于图20A中)的情况下，达到pH 9所需的碳酸钠的量取决于第二试剂的初始pH和柠檬酸盐的浓度。例如，对于pH 4.5的40mM的柠檬酸盐，需要至少27mg的碳酸钠(相当于几乎50mM的缓冲液浓度)来将pH增加至9以上，而对于30mM的柠檬酸盐，21mg的碳酸钠(或大约40mM的缓冲液浓度)足以达到相同的pH水平。然而，40mM柠檬酸钠(pH4.5)和27mg碳酸钠的组合提供了更高的缓冲浓度，其预期更能抵抗由暴露于血液引起的pH变化。
在乙酸盐缓冲液的情况下(在图20B中示出)，与柠檬酸盐缓冲液相比，对初始乙酸盐浓度的依赖性较不明显，这允许更容易地以期望的缓冲能力为目标而不影响pH。
图20A和20B中所示的示例性滴定曲线可以用于确定第一试剂中为了达到期望的pH水平所需要的固体碳酸钠的量。例如，如果使用40mM的pH 4.5的柠檬酸盐缓冲液，则为了在约pH 9.6至9.7下获得100mM的总缓冲液浓度，在第一试剂中将需要32mg的碳酸钠粉末。
本发明人已经发现，3型血液裂解试剂在实现选择性血细胞裂解同时保持微生物细胞的完整性和避免产生残留血液碎片方面的有效性可以取决于血液裂解试剂与样本混合的充分程度。有效混合方法的非限制性实例包括但不限于涡旋、搅拌、基于磁珠的混合和互连室之间的输送。合适的混合程度和混合过程中的合适时间可以通过改变混合参数和持续时间，进行研究微生物细胞完整性(例如通过替代测定如rRNA扩增)和/或研究残留血液碎片的实验，选择实现足够细胞完整性和/或减少或消除残留血液碎片的混合参数来实验性确定。本发明人已经发现，在血细胞裂解的示例性情况下，在进行充分混合的混合操作期间发生裂解。例如，当通过涡旋或在流体室之间输送进行混合时，合适的混合时间在30秒至2分钟的范围内。
虽然本文的许多示例性实施方案采用离心来实现微生物细胞分离，但是应当理解，本发明的血液裂解试剂组合物和相关方法可以与其它微生物细胞分离方法(例如但不限于过滤、免疫磁分离和其它分离技术例如基于微流体的分离)组合用于进行血液成分和/或其它真核细胞的选择性裂解。
此外，尽管本文的血液裂解试剂显示出对于选择性裂解血液样本中的血细胞是有效的，但是应当理解，本文所述的血液裂解试剂及其变体可以应用于多种样本类型，并且可以对于选择性裂解除血细胞之外的其它类型的真核细胞是有效的。例如，本文公开的细胞裂解试剂(在一些示例性实施方案中，其可被称为“真核细胞裂解试剂”)可用于裂解样本中的真核细胞(血细胞或其它真核细胞)，样本例如但不限于淋巴液、脑脊液、痰液、唾液和均质化的组织悬液(例如用于裂解存在于体液或从真核生物获得的其它样本中的非微生物内源性细胞)。
如上，根据“血液样本”的定义内的血培养样本的内含物，在一些示例性实施方案中，3型血液裂解试剂可用于从血培养样本(例如阳性血培养样本或中间培养血培养样本)提取完整的微生物细胞。可以怀疑1型血液裂解试剂将是用于提取完整微生物细胞的最适当的血液裂解试剂选择。例如，1型血液裂解试剂可能似乎是优选的，因为皂苷和SPS的组合通常不会损害细菌细胞。此外，血液培养瓶中的血液含量通常已经被稀释了至少四倍，并且作为这种稀释的结果，预期暴露于1型血液裂解试剂后阳性血培养样本中血细胞碎片的相对量为暴露于1型血液裂解试剂后具有相似体积的全血样本中存在的血细胞碎片的约四分之一。因此可能的原因是，考虑到血细胞碎片的这种减少，1型试剂可能适合于处理血培养样本。
然而，如下所示，本发明人进行的实验观察表明，血培养样本的较高稀释度不一定转化为更容易去除血细胞碎片，并且3型血液裂解试剂优选用于处理血培养样本。
血液裂解试剂类型对阳性血培养样本离心后残留物影响的实验研究
进行本实验研究以研究不同类型的血液裂解试剂组合物对暴露于阳性血培养样本后存在的残留碎片的影响。使用实施例10的方法制备接种有大肠杆菌的阳性血培养样本。根据实施例11的方法，使用1型或3型血液裂解试剂处理体积为1ml至5mL的样本。在1型血液裂解试剂的情况下，在将1型血液裂解试剂与阳性血培养样本混合时，无论样本体积如何，皂苷和SPS的浓度分别为37.5mg/mL和7.5mg/mL。在3型血液裂解试剂的情况下，在将3型血液裂解试剂与阳性血培养样本混合时，无论样本体积如何，皂苷、SPS、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH 10)的浓度分别为17.5mg/mL、7.5mg/mL、25mM(有效缓冲液浓度)。
图21A和21B显示了对于1型和3型试剂分别进行阳性血培养样本的溶血后的离心管的图像，阳性血培养样本的体积从1ml到5ml不等。
如图21A所示，在将阳性血培养样本与1型血液裂解试剂接触后，未被1型血液裂解试剂完全消化的血液碎片在离心过程中与微生物细胞一起沉降，形成在复杂网络中包含微生物细胞和血细胞碎片的粘性块状物。该细胞碎片块在自动离心洗涤循环期间不容易破裂，并且当洗涤的微生物细胞被重悬时，大量血细胞碎片保留，这可能影响下游过程(例如测定)的性能。
与此形成鲜明对比的是，如图21B所示，在将阳性血培养样本与3型血液裂解试剂接触后，在升高的pH下消化血液碎片，并且在离心后获得的所得沉淀物几乎完全由微生物细胞组成。在图21B中可以容易地看出清洁的微生物细胞沉淀物，其显示出与使用1型血液裂解试剂形成的粘性和深色块状物显著不同的白色沉淀物。同样显而易见的是，在3型血液裂解试剂的情况下，由于不存在血细胞碎片，沉淀物的量显著减少。通过3型血液裂解试剂处理获得的高纯度微生物细胞沉淀物可以很容易地再悬浮，由于不存在由残留血细胞碎片引起的干扰影响，因此有望促进性能改进的下游测定。
注意，虽然前述实施例证明了用于离心处理血培养样本以获得基本上不含血细胞碎片的微生物细胞沉淀物的3型血液裂解试剂的益处，但是预期用于处理血培养样本的3型血液裂解试剂的使用也将有益于其他分离形式，例如过滤。此外，预计通过3型血液裂解试剂处理的样本的消化和粘度的改善将促进在流体盒中基于自动运输的混合，其中，通过将液体从一个流体通道或流体室流动到另一个流体通道或流体室来实现混合，反之亦然，任选地重复该过程一次或多次。
实验研究证明使用3型血液裂解试剂能对阳性血液培养进行直接MALDI
如上，在用3型血液裂解试剂处理阳性血培养样本后获得的清洁的微生物细胞沉淀物可以在不存在或减少另外的样本制备步骤的情况下促进进行随后的测定步骤，例如鉴定测定。本发明人进行以下实验以证明直接对微生物细胞进行MALDI的能力，微生物细胞通过在初始血细胞裂解步骤之后使用3型血液裂解试剂进行阳性血培养样本的分离和纯化而获得，而不需要传代培养步骤。制备三种示例性3型试剂，每种具有不同的示例性组成，使得在将1mL阳性血培养样本与等体积的3型血液裂解试剂混合后，各成分的浓度如下：
示例性3型血液裂解试剂1：将血液裂解试剂与阳性血培养样本混合后，皂苷、SPS、Triton X-100的浓度和碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH 10)的有效浓度分别为17.5mg/mL，10mg/mL，0.75％和50mM。
示例性3型血液裂解试剂2：将血液裂解试剂与阳性血培养样本混合后，皂苷、SPS、Triton X-100的浓度和碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH 10)的有效浓度分别为17.5mg/mL，10mg/mL，0％和50mM。
示例性3型血液裂解试剂3：将血液裂解试剂与阳性血培养样本混合后，皂苷、SPS、Triton X-100的浓度和碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH 10)的有效浓度分别为17.5mg/mL，10mg/mL，0％和25mM。
根据实施例10的方法制备含有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌或铜绿假单胞菌的阳性血培养样本。随后根据实施例12中提供的方法进行离心分离，使用4个洗涤循环。随后通过MALDI(
图21C说明通过MALDI(VITEK-MS-ID)鉴定的阳性培养血液样本中金黄色葡萄球菌、大肠杆菌或铜绿假单胞菌对3型血液裂解试剂组合物的依赖性。对于所有示例性3型血液裂解试剂组合物的情况，正确鉴定了所有三种细菌种类。结果表明，3型血液裂解试剂成分的广泛组成可用于通过MALDI从血培养样本中准确和直接鉴定。
在本实验证明中，在细胞分离期间采用4个洗涤循环。应当理解，通常不需要使用4个洗涤循环，并且可以使用更多或更少数量的洗涤循环。例如，进行另一个实验以说明较少次数的洗涤循环提供足够的样本纯度用于通过MALDI进行高性能鉴定。将以缓冲液浓度为100mM的和pH为10制备的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液10ml与SPS浓度为30mg/ml，皂苷浓度为60mg/ml的溶液10ml组合来制备3型血液裂解试剂溶液，以获得体积为20ml，SPS浓度为15mg/ml，皂苷浓度为30mg/ml，缓冲液浓度为50mM和pH值范围为9.5-10的试剂溶液。将1ml血液裂解试剂与1ml阳性血培养样本混合后，SPS浓度为7.5mg/mL，皂苷浓度为15mg/mL，pH值范围为9.2-9.6，有效缓冲液浓度为25mM。根据实施例10的方法制备含有肺炎克雷伯菌的阳性血培养样本。随后根据以下实施例12中提供的方法使用不同次数的洗涤循环对阳性血培养样本进行离心分离。通过MALDI(
正如观察到的那样，使用细胞悬液的结果在使用至少2次洗涤周期时提供了高置信度的鉴定。这些结果证明，对于给定的一组处理条件(例如，每次洗涤的特定示例性稀释系数、3型血液裂解试剂的特定示例性成分、特定示例性血培养瓶配方、特定示例性体积的阳性血培养样本、通过3型血液裂解试剂对阳性血培养样本的特定示例性稀释、以及用于基于质谱分析数据进行鉴定的特定示例性分析方法)，为了通过MALDI进行鉴定，至少需要两个洗涤步骤。然而，应当理解，在其它情况下，洗涤步骤的所需数目可以不同，并且可以大于或小于两个。此外，如上，本示例性方法不旨在限于基于离心的分离和其它分离方式，例如过滤、免疫磁性分离和基于微流体的分离可用于替代方案中。
如上所述，3型血液裂解试剂已被证明能充分消化血细胞，并防止形成粘性网络，否则在使用1型溶血剂时会得到粘性网络。因此，根据本发明的几个示例性实施方案，3型血液裂解试剂可以用于处理血培养样本，例如阳性血培养样本，以便提取完整的微生物细胞用于后续处理。
考虑到本文提供的实例，本文公开了血液裂解试剂的多种示例性组合物，以及进行血细胞和/或其它真核细胞的选择性裂解的方法。在一个示例性实施方案中，进行样本中血细胞和/或其它真核细胞的选择性裂解，同时保持样本中一种或多种微生物细胞的完整性的方法可以通过使样本与含有皂苷、SPS、碱性缓冲液和非离子表面活性剂的血液裂解试剂接触来进行，将样本与血液裂解试剂混合，将混合物孵育足够的时间以实现样本内血液和/或真核细胞的裂解，和分离微生物细胞。
在一个示例性实施方案中，血液裂解试剂可以具有这样的组成，使得在血液裂解试剂与样本混合后，皂苷的浓度为3-60mg/ml。在其它示例性实施方案中，最终混合物中皂苷的浓度可以为10-30mg/ml。应理解，皂苷的合适浓度可根据一种或多种因素而变化，因素例如但不限于在分离期间需要保存完整性的微生物细胞的类型，最终混合物中的pH和/或有效缓冲液浓度，以及样本的类型和样本的量。应当理解，对于给定的一组条件，通过遵循本文的实验方法可以确定合适的皂苷浓度范围，以便研究皂苷浓度对一种或多种性能度量的影响，性能度量例如但不限于血液裂解效率、残留血细胞碎片的量和微生物细胞完整性。
在一个示例性实施方案中，血液裂解试剂可以具有这样的组成，使得在血液裂解试剂与样本混合后，SPS的浓度为1.5-50mg/ml。在其它示例性实施方案中，最终混合物中SPS的浓度可以为5-20mg/ml。应理解，SPS的合适浓度可根据一种或多种因素而变化，因素例如但不限于在分离期间需要保存完整性的微生物细胞的类型，最终混合物中的pH和/或有效缓冲液浓度，以及样本的类型和样本的量。应当理解，对于给定的一组条件，通过遵循本文的实验方法可以确定合适的SPS浓度范围，以便研究SPS浓度对一种或多种性能度量的影响，性能度量例如但不限于血液裂解效率、残留血细胞碎片的量和微生物细胞完整性。
在一个示例性实施方案中，血液裂解试剂可以具有这样的组成，使得在血液裂解试剂与样本混合后，非离子表面活性剂的浓度为0-3％w/v。在其它示例性实施方案中，最终混合物中非离子表面活性剂的浓度范围可以为0.5-2％。应理解，非离子表面活性剂的合适浓度可根据一种或多种因素而变化，因素例如但不限于在分离期间需要保存完整性的微生物细胞的类型，最终混合物中的pH和/或有效缓冲液浓度，样本的类型和样本的量。应当理解，对于给定的一组条件，通过遵循本文的实验方法可以确定合适的非离子表面活性剂浓度范围，以便研究非离子表面活性剂浓度对一种或多种性能度量的影响，性能度量例如但不限于血液裂解效率、残留血细胞碎片的量和微生物细胞完整性。
在一个示例性实施方案中，血液裂解试剂可以具有这样的组成，使得在血液裂解试剂与样本混合后，pH的范围为7.8-10。在其它示例性实施方案中，最终混合物的pH的范围可以为8.2-9.5。在其他示例性实施方案中，最终混合物的pH可以由上限pH值10、9.9、9.8、9.7、9.6或9.5界定，并且由下限pH值8.0、8.2、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9和9.0界定的范围内。在一些示例性实施方案中，可以选择缓冲液浓度使得有效缓冲液浓度在10-300mM的范围内。在其他示例性实施方案中，可以选择缓冲液浓度使得有效缓冲液浓度在30-100mM的范围内。
应当理解，合适的pH可以根据一个或多个因素而变化，例如但不限于，在分离期间需要保存完整性的微生物细胞的类型，最终混合物中的有效缓冲液浓度，与样本混合之前的血液裂解试剂的初始pH，样本的类型和样本的量。
在一些示例性实施方案中，血液裂解试剂可以具有9-11(或，例如，9.5-10.5)的pH，并且可以选择缓冲液浓度(或缓冲液容量)，使得在将血液裂解试剂与样本混合之后，pH降低至最终pH即小于10、小于9.9、小于9.8、小于9.7、小于9.6、或小于9.5、和大于8.2、大于8.4、大于8.5、大于8.6、大于8.7、大于8.8、大于8.9、或大于9.0。不受理论的限制，本发明人怀疑在9-11范围内的初始pH对于进行血细胞的有效消化是有益的，然而如果在血细胞裂解后维持这样的高pH，则所得到的高pH会不利地影响一些微生物细胞(例如铜绿假单胞菌和奇异变形杆菌)的完整性。
应当理解，对于给定的一组条件，通过遵循本文的实验方法可以确定合适的最终pH和/或有效缓冲液浓度范围，以便研究pH和/或缓冲液浓度范围对一种或多种性能度量的影响，性能度量例如但不限于血液裂解效率、残留血细胞碎片的量和微生物细胞完整性。
在一个示例性实施方案中，血液裂解试剂还可包括消泡剂，消泡剂包括聚二甲基硅氧烷乳液，聚二甲基硅氧烷乳液含有合适的非离子表面活性剂作为水包油乳化剂，并且可具有使得在血液裂解试剂与样本混合之后，消泡剂乳液的浓度在0.005至1％(v/w)之内的组成。在其它示例性实施方案中，最终混合物中消泡剂乳液的浓度范围可以为0.01至0.05％。应当理解，消泡剂的合适浓度可以根据一个或多个因素而变化，例如但不限于，血液裂解试剂的其它成分的浓度、样本的类型和样本的量。应理解，对于给定的一组条件，可通过遵循本文的实验方法确定合适的消泡剂组合物和浓度，以便研究消泡剂浓度和组合物对一种或多种性能度量的影响，性能度量例如但不限于在涉及混合和/或分离过程的自动化操作期间产生的泡沫的量，以及输送流体所需的压力。
在一个示例性实施方案中，进行样本中血细胞和/或其它真核细胞的选择性裂解，同时保持样本中一种或多种微生物细胞的完整性的方法可以通过将样本与含有皂苷、SPS以及碱性缓冲液(例如具有根据前述实例范围的示例性浓度和pH)的血液裂解试剂接触来进行，将样本与血液裂解试剂混合，并分离微生物细胞。虽然包含非离子表面活性剂在许多应用中是有益的，但在一些应用中，例如对残留碎片的存在较不敏感的应用和/或不涉及下游分子扩增的应用中，不必实现选择性裂解。
在一个示例性实施方案中，进行样本中血细胞和/或其它真核细胞的选择性裂解，同时保持样本中一种或多种微生物细胞的完整性的方法可以通过将样本与含有皂苷以及碱性缓冲液(例如具有根据前述实例范围的示例性浓度和pH)的血液裂解试剂接触来进行，将样本与血液裂解试剂混合，并分离微生物细胞。虽然包含非离子表面活性剂和SPS在许多应用中是有益的，但在一些应用中，例如对残留碎片的存在较不敏感的应用和/或不涉及下游分子扩增的应用中，这些成分可以不必实现选择性裂解。
虽然以上公开的许多示例性方法涉及在形成血液裂解试剂和样本的混合物之后分离微生物细胞，但是应当理解，在其他示例性实施方案中，可以使用混合物进行核酸提取而不从混合物中分离微生物细胞。例如，可以使混合物与适合于提取的固相接触，例如用二氧化硅或阴离子交换树脂包被的磁珠，以便从混合物中除去哺乳动物核酸，然后可以使所得混合物经历裂解步骤(例如化学的、机械的、电的或超声的)，使得微生物细胞裂解。然后可将所得裂解液与合适的固相接触以提取由微生物细胞释放的核酸。
如上所述，血液裂解试剂可作为两种或更多种试剂提供，两种或更多种试剂可单独储存并在使用前混合，使得血液裂解试剂的皂苷成分储存在与血液裂解试剂的碱性成分分离的酸性环境中。在一个示例性实现方式中，被混合以形成最终血液裂解试剂的一种或多种试剂可以储存在固相中。
尽管前述实施例已经公开了本发明的3型血液裂解试剂用于进行血细胞和/或其它真核细胞的裂解，然后分离微生物细胞和随后通过逆转录rRNA扩增检测和/或鉴定微生物细胞的用途，但是应当理解，这仅仅是本文考虑的试剂组合物和方法的一个示例性应用。在涉及微生物细胞的后续(下游)检测的应用中，应理解核酸例如但不限于DNA、rRNA、mRNA和tmRNA的检测可经由扩增(例如但不限于PCR、逆转录PCR和等温扩增方法)或经由非扩增方法(例如杂交测定和测序)或其组合进行。在其他示例性方法中，可以通过与微生物细胞表面的亲和反应、质谱法、红外光谱法、显微术、流式细胞术和/或通过检测与微生物细胞相关的挥发性有机物来进行检测，仅列举了几种可替代的检测方式。
上述许多示例性实施方案涉及全血样本的处理。例如，如上所述，可以选择血液裂解试剂的组成，使得可以处理超过1ml，或甚至超过5ml的全血体积，同时保持微生物细胞的完整性，并且避免在离心或过滤全血样本和血液裂解试剂的混合物之后进行后续洗涤步骤时可见的血液碎片形成。然而，应理解，本文的方法可适用于多种样本类型，包括但不限于淋巴液、脑脊液、尿液、痰液、唾液和均质化的悬液如粪便和均质化的组织样本。
下面提供了用于处理血培养样本例如阳性血培养样本和中间培养物样本的示例性和非限制性组成范围。虽然以下示例性浓度范围已基于其促进MALDI的后续性能的适用性而确定，但应理解，以下提供的浓度范围及其变化形式可用于在进行其它下游测定或下游过程时进行血细胞裂解。
在一个示例性实施方案中，血液裂解试剂可以具有这样的组成，使得在血液裂解试剂与血培养样本混合后，皂苷的浓度为0.75-60mg/ml。在其它示例性实施方案中，最终混合物中皂苷的浓度可以为2.5-30mg/ml。应理解，皂苷的合适浓度可根据一种或多种因素而变化，因素例如但不限于在分离期间需要保存完整性的微生物细胞的类型，最终混合物中的pH和/或有效缓冲液浓度，以及血培养样本中微生物细胞的浓度。应当理解，对于给定的一组条件，通过遵循本文的实验方法可以确定合适的皂苷浓度范围，以便研究皂苷浓度对一种或多种性能度量的影响，性能度量例如但不限于血液裂解效率、残留血细胞碎片的量和微生物细胞完整性。
在一个示例性实施方案中，血液裂解试剂可以具有这样的组成，使得在血液裂解试剂与血培养样本混合后，SPS的浓度为0.35-50mg/ml。在其它示例性实施方案中，最终混合物中SPS的浓度可以为1.25-20mg/ml。应理解，SPS的合适浓度可根据一种或多种因素而变化，因素例如但不限于在分离期间需要保存完整性的微生物细胞的类型，最终混合物中的pH和/或有效缓冲液浓度，以及血培养样本中微生物细胞的浓度。应当理解，对于给定的一组条件，通过遵循本文的实验方法可以确定合适的SPS浓度范围，以便研究SPS浓度对一种或多种性能度量的影响，性能度量例如但不限于血液裂解效率、残留血细胞碎片的量和微生物细胞完整性。
在一个示例性实施方案中，血液裂解试剂可以具有这样的组成，使得在血液裂解试剂与血培养样本混合后，非离子表面活性剂的浓度为0-3％w/v。在其它示例性实施方案中，最终混合物中非离子表面活性剂的浓度范围可以为0.16-2％。应理解，非离子表面活性剂的合适浓度可根据一种或多种因素而变化，因素例如但不限于在分离期间需要保存完整性的微生物细胞的类型，最终混合物中的pH和/或有效缓冲液浓度，以及血培养样本中微生物细胞的浓度。应当理解，对于给定的一组条件，通过遵循本文的实验方法可以确定合适的非离子表面活性剂浓度范围，以便研究非离子表面活性剂浓度对一种或多种性能度量的影响，性能度量例如但不限于血液裂解效率、残留血细胞碎片的量和微生物细胞完整性。
在一个示例性实施方案中，血液裂解试剂可以具有这样的组成，使得在血液裂解试剂与血培养样本混合后，pH的范围为7.8-10。在其它示例性实施方案中，最终混合物的pH的范围可以为8.2-9.5。在其他示例性实施方案中，最终混合物的pH可以由上限pH值10、9.9、9.8、9.7、9.6或9.5界定，并且由下限pH值8.0、8.2、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9和9.0界定的范围内。在一些示例性实施方案中，可以选择缓冲液浓度使得有效缓冲液浓度在2.5-500mM的范围内。在其他示例性实施方案中，可以选择缓冲液浓度使得有效缓冲液浓度在5-250mM的范围内。
应当理解，合适的pH可以根据一个或多个因素而变化，例如但不限于，在分离期间需要保存完整性的微生物细胞的类型，最终混合物中的有效缓冲液浓度，与血培养样本混合之前的血液裂解试剂的初始pH，以及血培养样本中微生物细胞的浓度。
在一些示例性实施方案中，血液裂解试剂可以具有9-11(或，例如，9.5-10.5)的pH，并且可以选择缓冲液浓度(或缓冲液容量)，使得在将血液裂解试剂与血培养样本混合之后，pH降低至最终pH即小于10、小于9.9、小于9.8、小于9.7、小于9.6、或小于9.5、和大于8.2、大于8.4、大于8.5、大于8.6、大于8.7、大于8.8、大于8.9、或大于9.0。不受理论的限制，本发明人怀疑在9-11范围内的初始pH对于进行血细胞的有效消化是有益的，然而如果在血细胞裂解后维持这样的高pH，则所得到的高pH会不利地影响一些微生物细胞(例如铜绿假单胞菌和奇异变形杆菌)的完整性。
应当理解，对于给定的一组条件，通过遵循本文的实验方法可以确定合适的最终pH和/或有效缓冲液浓度范围，以便研究pH和/或缓冲液浓度范围对一种或多种性能度量的影响，性能度量例如但不限于血液裂解效率、残留血细胞碎片的量和微生物细胞完整性。
在一个示例性实施方案中，血液裂解试剂还可包括消泡剂，消泡剂包括聚二甲基硅氧烷乳液，聚二甲基硅氧烷乳液含有合适的非离子表面活性剂作为水包油乳化剂，并且可具有使得在血液裂解试剂与血培养样本混合之后，消泡剂乳液的浓度在0.005至1％(v/w)之内，或者例如，在0.05％至0.2％(v/w)之间的组成。在其它示例性实施方案中，最终混合物中消泡剂乳液的浓度范围可以为0.01至0.05％。应当理解，消泡剂的合适浓度可以根据一个或多个因素而变化，例如但不限于，血液裂解试剂的其它成分的浓度和血培养样本中微生物细胞的浓度。应理解，对于给定的一组条件，可通过遵循本文的实验方法确定合适的消泡剂组合物和浓度，以便研究消泡剂浓度和组合物对一种或多种性能度量的影响，性能度量例如但不限于在涉及混合和/或分离过程的自动化操作期间产生的泡沫的量，以及输送流体所需的压力。
用3型血液裂解试剂回收活微生物细胞
鉴于前述3型血液裂解试剂在促进样本中血细胞的有效裂解和支持完整微生物细胞的自动分离方面的成功，本发明人研究了与3型血液裂解试剂接触后分离的微生物细胞的活力。尽管那些涉及核酸检测或MALDI用于微生物细胞鉴定的应用可能只需要用完整的核酸或蛋白来分离已分离的微生物细胞，但其他应用，例如涉及分离的微生物细胞的后续生长的应用(例如，药敏试验或传统的基于生长的鉴定方法)要求分离的微生物细胞是活的(即能够进行细胞分裂)。
本发明人首先考虑了使用1型血液裂解试剂从含有血细胞的样本中分离活微生物细胞的可行性。1型血液裂解试剂采用皂苷及SPS。尽管已知皂苷可保存微生物细胞活力，但图5A显示，包括皂苷和SPS但不包括非离子表面活性剂或碱性pH缓冲液的1型血液裂解试剂组合物不能充分消化体积超过约1mL的全血样本中的裂解血细胞，导致血细胞碎片的存在，这在自动分离(例如，离心和过滤)过程中可能是有问题的。因此，认为1型血液裂解试剂对于涉及自动血细胞裂解和活微生物细胞的自动分离的应用是无效的。
然后本发明人考虑了2型血液裂解试剂用于涉及自动化血细胞裂解和活微生物细胞的自动化分离的应用的可行性。虽然2型血液裂解试剂已被证明能够消化大范围全血容量的血液残留物(例如，见图5B)，但在缺乏皂苷的保护作用的情况下，这类试剂会导致大范围微生物细胞种类的活力丧失。
因此，本发明人得出的结论是，3型血液裂解试剂将最适合于血细胞的自动裂解和随后的活微生物细胞的自动分离。进行一系列实验以研究3型血液裂解试剂的各种成分在处理全血样本时对革兰氏阳性和革兰氏阴性种类的活力的影响，并且进行另外的实验以证明使用3型血液裂解试剂从血培养样本中提取活微生物细胞。下面详细描述这些实验，并证明3型血液裂解试剂适用于活微生物细胞的自动分离。
2型和3型血液裂解试剂暴露对全血中金黄色葡萄球菌活力影响的实验研究
在第一个实验中，在将细胞暴露于2型和3型血液裂解试剂后评估金黄色葡萄球菌细胞的回收。这种革兰氏阳性细菌预计能在Triton X-100和碱性pH带来的更恶劣的条件下存活下来。因此，在本实验中评估2型和3型试剂。
将以缓冲液浓度为200mM和pH为10制备的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液10ml与SPS浓度为40mg/ml，皂苷浓度为60mg/ml和Triton X-100为3％w/v的溶液10ml组合来制备示例性3型血液裂解试剂溶液，以获得体积为20ml，SPS浓度为20mg/ml，皂苷浓度为30mg/ml，TritonX-100浓度为1.5％w/v，缓冲液浓度为100mM和pH值范围为9.5-10的试剂溶液。将5ml的血液裂解试剂与3ml全血样本混合后，SPS浓度为12.5g/mL，皂苷浓度为18.75mg/mL，Triton X-100浓度为0.94％w/v，pH值为约9.5，有效缓冲液浓度为62.5mM。
将以缓冲液浓度为200mM和pH为10制备的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液10ml与SPS浓度为40mg/ml，Triton X-100浓度为3％w/v的溶液10ml组合来制备2型血液裂解试剂溶液，以获得体积为20ml，SPS浓度为20mg/ml，Triton X-100浓度为1.5％w/v，缓冲液浓度为100mM和pH值范围为9.5-10的试剂溶液。将5ml血液裂解试剂与3ml全血样本混合后，SPS浓度为12.5mg/mL，Triton X-100浓度为0.94％w/v，pH值为9.2-9.5，有效缓冲液浓度为62.5mM。
分别根据实施例2和3的方法制备含有金黄色葡萄球菌的加标全血样本或加标磷酸盐缓冲液样本。随后根据以下实施例13和14中提供的方法对作为加标对照的加标磷酸盐缓冲液样本和加标全血样本进行离心分离(分别使用3型和2型血液裂解试剂)。将细胞悬液平板接种在含有5％羊血的胰蛋白酶大豆琼脂上并在37℃孵育过夜。
图22A中呈现的结果清楚地证明金黄色葡萄球菌细胞的活力被2型血液裂解试剂损害。另一方面，皂苷类在3型血液裂解试剂中的存在保持了回收的金黄色葡萄球菌细胞的活力。
3型血液裂解试剂暴露对全血中选择的革兰氏阴性菌细胞活力影响的实验研究
与前述实例的革兰氏阳性金黄色葡萄球菌细菌细胞相比，预期革兰氏阴性细菌细胞对3型血液裂解试剂中存在的Triton X-100和碱性pH的耐受性较低。因此，仅使用3型血液裂解试剂进行实验。研究了针对3型血液裂解试剂，不同浓度的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液和Triton X-100对革兰氏阴性菌细胞活力的影响。
将以缓冲液浓度为100mM或200mM和pH为10制备的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液10ml与SPS浓度为40mg/ml，皂苷浓度为60mg/ml和Triton X-100为0％或1.5％w/v的溶液10ml组合来制备示例性3型血液裂解试剂溶液，以获得体积为20ml，SPS浓度为20mg/ml，皂苷浓度为30mg/ml，Triton X-100浓度为0或0.75％w/v，缓冲液浓度为50mM或100mM和pH值范围为9.5-10的试剂溶液。将5ml血液裂解试剂与3ml全血样本混合后，SPS浓度为12.5mg/mL，皂苷浓度为18.75mg/mL，Triton X-100浓度为0％或0.47％w/v，pH范围为9.2-9.5，有效缓冲液浓度为31.25或62.5mM。
分别根据实施例2和3的方法制备含有奇异变形杆菌的加标全血样本或加标磷酸盐缓冲液样本。根据以下实施例13和14中提供的方法，分别对用作加标对照的加标磷酸盐缓冲液样本和加标全血样本进行离心分离。将细胞悬液平板接种在含有5％羊血的胰蛋白酶大豆琼脂上并在37℃孵育过夜。
图22B中显示的结果表明奇异变形杆菌细胞的活力依赖于Triton X-100和/或碱性缓冲液的浓度。实际上，如图中所示，在最低有效缓冲液浓度(50mM)和最低Triton X-100浓度(0％)的情况下观察到最高平板计数(且因此活力最高)。
进行另一个实验以研究不同浓度的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液和Triton X-100对铜绿假单胞菌细胞活力的影响。将以缓冲液浓度为100mM、150mM或200mM和pH为10制备的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液10ml与SPS浓度为40mg/ml，皂苷浓度为60mg/ml和Triton X-100为0％或0.75％w/v的溶液10ml组合来制备3型血液裂解试剂溶液，以获得体积为20ml，SPS浓度为20mg/ml，皂苷浓度为30mg/ml，Triton X-100浓度为0或0.375％w/v，缓冲液浓度为50mM、75mM或100mM和pH值范围为9.5-10的试剂溶液。将5ml血液裂解试剂与3ml全血样本混合后，SPS浓度为12.5mg/mL，皂苷浓度为18.75mg/mL，Triton X-100浓度为0％或0.23％w/v，pH范围为9.2-9.5，有效缓冲液浓度为31.25mM、47mM或62.5mM。
分别根据实施例2和3的方法制备含有铜绿假单胞菌的加标全血样本或加标磷酸盐缓冲液样本。根据以下实施例13和14中提供的方法，分别对用作加标对照的加标磷酸盐缓冲液样本和加标全血样本进行离心分离。将细胞悬液平板接种在含有5％羊血的胰蛋白酶大豆琼脂上并在37℃孵育过夜。
图22C中呈现的结果表明铜绿假单胞菌细胞的活力也取决于Triton X-100的浓度，并且似乎也取决于碱性缓冲液的浓度。前述实验表明，对于选择的革兰氏阴性微生物细胞，微生物细胞的分离后的活力似乎与非离子表面活性剂的浓度和3型裂解试剂的缓冲液浓度成反比。实际上，结果表明，当有效碱浓度和非离子表面活性剂浓度足够低时，可以获得改善的分离后活力。设计以下实验以进一步研究3型裂解试剂组合物对降低浓度的碱性缓冲液和/或非离子表面活性剂的分离后微生物细胞活力的影响。
不存在非离子表面活性剂的3型血液裂解试剂对活微生物细胞回收影响的实验研究
进行实验以研究在3型裂解试剂中不存在非离子表面活性剂对回收的用于以3ml的体积处理全血样本的微生物细胞的活力的影响。将以缓冲液浓度为100mM或50mM和pH为10制备的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液10ml与SPS浓度为40mg/ml，皂苷浓度为60mg/ml的溶液10ml组合来制备3型血液裂解试剂溶液，以获得体积为20ml，SPS浓度为20mg/ml，皂苷浓度为30mg/ml,缓冲液浓度为50mM或25mM和pH值范围为9.5-10的试剂溶液。将5ml血液裂解试剂与3ml全血样本混合后，SPS浓度为12.5mg/mL，皂苷浓度为18.75mg/mL，pH值范围为9.2-9.5，有效缓冲液浓度为31.25mM或15.6mM。分别根据实施例2和3的方法制备含有铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌和金黄色葡萄球菌细胞的加标全血样本和加标磷酸盐缓冲液样本。根据实施例13和14中提供的方法，分别对用作加标对照的加标磷酸盐缓冲液样本和加标全血样本进行离心分离。将细胞悬液平板接种在含有5％羊血的胰蛋白酶大豆琼脂上并在37℃孵育过夜。
图22D中呈现的结果显示，对于不存在非离子表面活性剂的裂解试剂，当混合后有效缓冲液浓度分别为25mM和50mM时，对于所有微生物细胞种类，微生物细胞的活回收率高于80％和高于60％。因此，该实验研究证实了图22B和22C所示的结果，表明当使用3型裂解试剂用于裂解具有中等(例如3ml)体积的全血样本的血液成分时用于提取活微生物细胞，通过在不存在(或存在低浓度)非离子表面活性剂的情况下制备裂解缓冲液，可以获得合适的活细胞回收值，对于革兰氏阳性和革兰氏阴性种类，对于较低的有效缓冲液浓度，回收增加。
3型血液裂解试剂中低缓冲液浓度对活革兰氏阴性菌细胞回收影响的实验研究
前一研究证明，当裂解试剂的有效缓冲液浓度降低时，活微生物细胞的回收通常增加。本发明人已经观察到，随着有效缓冲液浓度的降低，样本-试剂混合物的粘度增加。本研究旨在研究较低(＜50mM)有效缓冲液浓度对活细菌细胞回收的影响。
将以缓冲液浓度为100mM、50mM或20mM的和pH为10制备的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液10mL与SPS浓度为40mg/ml，皂苷浓度为60mg/ml的溶液10ml组合来制备3型血液裂解试剂溶液，以获得体积为20ml，SPS浓度为20mg/ml，皂苷浓度为30mg/ml，缓冲液浓度为50mM、25mM或10mM和pH值范围为9.5-10的试剂溶液。将5ml血液裂解试剂与3ml全血样本混合后，SPS浓度为12.5mg/mL，皂苷浓度为18.75mg/mL，pH值范围为9.2-9.5，有效缓冲液浓度为31.25mM、或15.6mM、或6.25mM。分别根据实施例2和3的方法制备含有奇异变形杆菌细胞和加标对照的全血样本。根据实施例13中提供的方法，对用作加标对照的加标磷酸盐缓冲液样本进行离心分离。将血液裂解试剂和加标全血样本通过对流混合进行混合，随后根据以下实施例15中提供的方法进行离心分离。将细胞悬液平板接种在含有5％羊血的胰蛋白酶大豆琼脂上并在37℃孵育过夜。
图23A中显示的结果表明，对于低至6.25mM的有效碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液浓度，奇异变形杆菌细胞已经被很好地回收。
为了说明这种低效碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液浓度仍然适合回收金黄色葡萄球菌细胞，用金黄色葡萄球菌细胞重复上述实验，有效缓冲液浓度分别为6.25mM、15.5mM和31.25mM。结果示于图23B中。如观察到的，当有效缓冲液浓度降低时，金黄色葡萄球菌细胞的回收有轻微下降。在不受理论限制的情况下，由较低的有效缓冲液浓度引起的血液-试剂混合物的粘度增加可能会由于沉降率的降低而削弱微生物细胞的离心分离的有效性。因此，即使微生物细胞的活力不会受到有效缓冲液浓度降低的影响，在离心过程中较低的沉降速率可能导致活微生物细胞回收减少，因为一些活微生物细胞保留在上清液中并且在洗涤操作期间被无意地去除。
高全血量(＞3ml)对3型血液裂解试剂活微生物细胞回收影响的实验研究
进行本实验以研究较大(例如＞3ml；5ml)暴露于3型裂解试剂后回收微生物细胞时的全血体积。假定在大体积样本的情况下经常遇到的溶血血液的较高粘度可能对实现高回收率的能力有影响。将以缓冲液浓度为100mM和pH为10制备的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液10mL与SPS浓度为40mg/ml，皂苷浓度为70mg/ml和Triton X-100为0.3％或0％w/v的溶液10ml组合来制备3型血液裂解试剂溶液，以获得体积为20ml，SPS浓度为20mg/ml，皂苷浓度为35mg/ml，Triton X-100浓度为0.15％或0％w/v，缓冲液浓度为50mM和pH值范围为9.5-10的试剂溶液。将5ml血液裂解试剂与5ml全血样本混合后，SPS浓度为10mg/mL，皂苷浓度为17.5mg/mL，Triton浓度为0.075％或0％w/v，pH值为9.2-9.5，有效缓冲液浓度为25mM。
分别根据实施例2和3的方法制备含有奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌细胞的加标全血样本和加标磷酸盐缓冲液样本和加标对照。根据实施例13中提供的方法，对用作加标对照的加标磷酸盐缓冲液样本进行离心分离，所不同的是使用5mL体积的样本并除去9.9mL的上清液。将血液裂解试剂和加标全血样本通过对流混合进行混合，随后根据以下实施例15中提供的方法进行离心分离，所不同的是使用5mL体积的样本。将细胞悬液平板接种在含有5％羊血的胰蛋白酶大豆琼脂上并在37℃孵育过夜。金黄色葡萄球菌、奇异变形杆菌和铜绿假单胞菌的结果分别示于图23C、23D和23E中。
图23C和23D证明，对于处理含有金黄色葡萄球菌和奇异变形杆菌的5ml全血样本的情况，对于测试的0-0.15％w/v的低浓度范围，活微生物细胞的分离后回收似乎不显著依赖于Triton X-100的浓度。
然而，如在图23E中观察到的，铜绿假单胞菌细胞的回收率对于0％的Triton X-100的情况是低的。通过用从临床分离物获得的铜绿假单胞菌细胞的不同菌株重复实验验证了该观察结果。结果如图23F所示，与图23E一样，表明少量Triton X-100的存在提高了活细胞的回收。不受理论的限制，认为这种低回收率是由本发明大的(5mL)全血样本大小的溶血血液的观察到的高粘度引起的。特别地，相信当不存在Triton X-100时，微生物细胞的活力不通过与裂解试剂接触而显著受损，所得到的血液-试剂混合物的高粘度阻止铜绿假单胞菌细胞的有效离心分离，铜绿假单胞菌细胞似乎比在本实验中研究的其他细菌种类对无效离心分离更敏感。尽管如此，图23E中所示的结果证明，甚至低浓度(0.15％w/v)的TritonX-100(即，足以避免图22C中观察到的回收损失的浓度)的添加足以显著降低粘度并且能够实现铜绿假单胞菌的高活细胞回收。
在涉及高体积全血的另一个实例中，研究了离心时间对铜绿假单胞菌细胞回收的影响。使用实施例15的方法对流混合5mL体积的3型血液裂解试剂和5mL全血样本。所得混合物具有17.5mg/mL的皂苷浓度，10mg/mL的SPS浓度，0.075％的Triton X-100浓度，9.2-9.5范围内的pH值和25mM的有效缓冲液浓度(在最终混合物中)。在沉降的第一步骤期间，使用5、10和15分钟的三个不同离心时间。然而，在随后的洗涤操作期间的离心时间保持在2分钟。还根据实施例3的方法制备含有铜绿假单胞菌细胞的加标磷酸盐缓冲液样本。根据实施例13中提供的方法，对用作加标对照的加标磷酸盐缓冲液样本进行离心分离，所不同的是使用5mL体积的样本并除去9.9mL的上清液。将回收的悬液平板接种后的琼脂平板的照片呈现在图23G中。三次离心的回收率分别为39％、83％和88％。这些结果支持这样的假设，即在图23E(和图23F)中看到的活力的表观降低可以主要由离心分离时由于粘度增加导致的回收损失引起，这又导致沉降速率降低。根据图23G所示的结果，在全血样本与3型血液裂解缓冲液接触之后，通过增加离心分离时间(和/或离心力，例如通过增加旋转速率和/或径向分离)可以增加活铜绿假单胞菌细胞的回收。
鉴于上述结果，在涉及暴露于3型裂解试剂之后的活微生物细胞的自动分离的一些应用中，特别是在处理具有约5ml或更大体积的全血的情况下，可以选择3型裂解试剂组合物，其在微生物细胞活力(暴露于3型血液裂解试剂之后)、对残留碎片的充分消化和粘度之间取得平衡，以便促进多种微生物种类的活微生物细胞的自动分离。
注意，分离的微生物细胞随后生长形成的菌落可用于下游诊断测试。例如，按照实施例16中描述的方法，通过基质辅助激光解吸/电离(MALDI)测试图23C、23D和23E中显示的菌落。所有3个种类细菌细胞经MALDI鉴定，置信水平为99.9％。
虽然前述结果已经证明从全血样本中成功提取活微生物细胞，但是应当理解，本文描述的涉及3型血液裂解试剂的示例性方法和组合物可以扩展至多种样本类型。例如，3型血液裂解试剂可用于从血培养样本(例如阳性血培养样本)提取活微生物细胞。因此，可以使用3型血液裂解试剂以方便直接从血培养样本进行表型药敏试验，而不需要传代培养。
3型血液裂解试剂处理阳性血培养样本以提取活微生物细胞及进行微生物鉴定和药敏试验的实验证明
通过处理阳性血培养样本获得的细胞悬液可以进行下游(后续)测试，例如适于测定微生物细胞的特性和抗微生物敏感性中的一者或两者的测试。为了说明对从血培养样本中分离的活微生物细胞进行后续测试(测定)的非限制性实例，通过与3型血液裂解试剂接触来处理阳性血培养样本并且随后进行离心分离，通过
将以缓冲液浓度为200mM和pH为10制备的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液10ml与SPS浓度为30mg/ml，皂苷浓度为75mg/ml的溶液10ml组合来制备3型血液裂解试剂溶液，以获得体积为20ml，SPS浓度为15mg/ml，皂苷浓度为37.5mg/ml，缓冲液浓度为100mM和pH值范围为9.5-10的试剂溶液。将1ml血液裂解试剂与1ml阳性血培养样本混合后，SPS浓度为7.5mg/mL，皂苷浓度为18.75mg/mL，pH值范围为9.2-9.5，有效缓冲液浓度为50mM。
根据实施例10的方法制备加入金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌的阳性血培养样本。随后根据以下实施例12中提供的方法对阳性血培养样本进行离心分离。按照实施例16中描述的方法通过MALDI(VITEK-MS-ID)测试悬液中的微生物细胞用于微生物细胞鉴定，按照实施例17中描述的方法进行基于代谢的鉴定(VITEK2-ID)和基于肉汤微量稀释的抗生素敏感性测试(VITEK2-AST)。在每种情况下，还通过实施例16和17使用如实施例12从阳性血液培养直接平板接种获得的菌落生长来测试参考阳性对照。
结果呈现在图24A至24D中，并且证明基于离心分离的微生物细胞的直接处理获得的结果与使用阳性对照菌落获得的结果之间有非常高的一致性。所有4种微生物细胞种类的MALDI鉴定结果一致，均有100％正确ID，超过99.4％鉴定置信度。类似地，所有4种微生物细胞的VITEK2系统的代谢鉴定结果非常一致，均有100％正确ID，超过95％鉴定概率。使用VITEK2系统的AST结果——基于没有继代培养的阳性血培养的直接AST——也证明与使用阳性对照菌落获得的结果非常一致，所有四种微生物细胞种类至少有94％的S/l/R分类一致性。因此，这些结果表明，从阳性血培养中进行ID和AST的直接方法和传统的菌落培养方法在临床上具有很强的等效性。
用3型血液裂解试剂处理全血样本用于活微生物细胞回收和随后的微生物鉴定和药敏试验的实验证明
从全血中回收的活细胞然后在固相生长培养基上形成菌落可以进行下游(后续)测试，例如适合于确定微生物细胞的特性和抗微生物敏感性中的一者或两者的测试。为了说明对从全血样本回收的活微生物细胞进行后续测试(测定)的非限制性实例，针对多种细菌和真菌种类制备低浓度加标全血样本，对于以下各项中的每一个具有三种菌株(2种ATCC菌株和1种临床分离物)：(i)8种革兰氏阳性菌，(ii)8种革兰氏阴性菌和(iii)4种真菌。将加标全血样本与3型血液裂解试剂混合，并进行离心分离以回收悬液中的活细胞。将回收的细胞悬液接种在固相生长培养基上并孵育以形成菌落生长。通过
将以缓冲液浓度为100mM和pH为10制备的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液10ml与SPS浓度为30mg/ml，皂苷浓度为150mg/ml的溶液10ml组合来制备3型血液裂解试剂溶液，以获得体积为20ml，SPS浓度为15mg/ml，皂苷浓度为75mg/ml，缓冲液浓度为50mM和pH值范围为9.5-10的试剂溶液。将4ml血液裂解试剂与4ml全血样本混合后，SPS浓度为7.5mg/mL，皂苷浓度为37.5mg/mL，pH值范围为9.2-95，有效缓冲液浓度为25mM。
根据以下实施例2制备含有相应微生物细胞菌株的体积为4ml的加标全血样本，标示浓度为10CFU/mL。随后根据实施例14中提供的方法进行离心分离，所不同的是使用4mL体积的加标全血样本和血液裂解试剂。将细胞悬液平板接种在含有5％绵羊血的胰蛋白酶大豆琼脂上，并如实施例14中对各种类孵育。作为加标对照，将用于加标全血样本的细胞的相同浓度和体积等分试样直接接种在含有5％绵羊血的胰蛋白酶大豆琼脂上并如实施例14中孵育。在可见菌落形成后，计数菌落的数目并通过比较加标全血回收与加标对照的菌落计数来计算活细胞回收的百分比。按照实施例16中描述的方法通过MALDI(VITEK-MS-ID)测试从加标全血样本获得的菌落用于微生物细胞鉴定，并且按照实施例17中描述的方法进行基于代谢的鉴定(VITEK2-ID)和基于肉汤微量稀释的抗生素敏感性测试(VITEK2-AST)。在每种情况下，参考阳性对照也通过实施例16和17使用从各自加标对照获得的菌落生长进行测试。
图25中总结了24株革兰氏阳性菌、24株革兰氏阴性菌和12株真菌的活细胞回收以及ID和AST测定的结果。回收结果证明，在所有病原体类型中，对于低(＜10CFU/ml)接种，平均活病原体回收非常高(>90％)。MALDI鉴定测定在所有病原体类型中实现了100％正确鉴定。VITEK2鉴定(代谢)测定法也实现了所有病原体类型的100％正确鉴定。AST测定在所有病原体类型中实现>97％S/I/R分类一致性。这些结果证明了3型血液裂解试剂用于以低(临床相关)滴度从全血中有效回收活微生物细胞的可行性，以及3型血液裂解试剂用于基于从血液培养中分离的活微生物细胞进行鉴定和抗微生物易感性测定的适用性。
考虑到上面提供的实施例，下面公开了在分离后保持微生物细胞的活力的血液裂解试剂的多种示例性组合物，以及进行血细胞和/或其它真核细胞的选择性裂解和活微生物细胞的提取的方法。在一个示例性实施方案中，进行样本中(例如全血样本)血细胞和/或其它真核细胞的选择性裂解，同时保持样本中一种或多种微生物细胞的活力的方法可以通过使样本与含有皂苷、SPS、碱性缓冲液和非离子表面活性剂的血液裂解试剂接触来进行，将样本与血液裂解试剂混合，将混合物孵育足够的时间以实现样本内血液和/或真核细胞的裂解，和分离活微生物细胞。
当可以容忍诸如但不限于铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌和鲍曼不动杆菌等一些革兰氏阴性细菌种类的损伤导致的回收损失时，血液裂解试剂可以具有这样的组合物，即当血液裂解试剂与样本混合后，皂苷的浓度可以达到100mg/ml，SPS的浓度可以达到50mg/ml，非离子表面活性剂的浓度可以达到3％w/v，有效缓冲液浓度可达300mM，最终混合物的pH值可达10.5。然而，革兰氏阴性菌细胞可能对更高浓度的非离子表面活性剂，更高的缓冲液浓度和最终混合物的pH敏感。在一些实现方式中，将这些量保持在上限以下可能是有益的，约束是混合物的粘度和血细胞碎片的残留物不会太高而不利地影响沉降过程或阻止中间流体在流体盒的流体通道中的流动。
在一个示例性实施方案中，血液裂解试剂可以具有这样的组成，使得在血液裂解试剂与样本混合后，皂苷的浓度为3-60mg/ml。在其它示例性实施方案中，最终混合物中皂苷的浓度可以为10-30mg/ml。应理解，皂苷的合适浓度可根据一种或多种因素而变化，因素例如但不限于在分离期间需要保存活力的微生物细胞的类型，最终混合物中的pH和/或有效缓冲液浓度，以及样本的类型和样本的量。应当理解，对于给定的一组条件，通过遵循本文的实验方法可以确定合适的皂苷浓度范围，以便研究皂苷浓度对一种或多种性能度量的影响，性能度量例如但不限于血液裂解效率、残留血细胞碎片的量和微生物细胞活力。
在一个示例性实施方案中，血液裂解试剂可以具有这样的组成，使得在血液裂解试剂与样本混合后，SPS的浓度为1.5-50mg/ml。在其它示例性实施方案中，最终混合物中SPS的浓度可以为5-20mg/ml。应理解，SPS的合适浓度可根据一种或多种因素而变化，因素例如但不限于在分离期间需要保存活力的微生物细胞的类型，最终混合物中的pH和/或有效缓冲液浓度，以及样本的类型和样本的量。应当理解，对于给定的一组条件，通过遵循本文的实验方法可以确定合适的SPS浓度范围，以便研究SPS浓度对一种或多种性能度量的影响，性能度量例如但不限于血液裂解效率、残留血细胞碎片的量和微生物细胞活力。
在一个示例性实施方案中，血液裂解试剂可以具有这样的组成，使得在血液裂解试剂与样本混合后，非离子表面活性剂的浓度为0-3％w/v。在其它示例性实施方案中，最终混合物中非离子表面活性剂的浓度范围可以为0.5-2％。应理解，非离子表面活性剂的合适浓度可根据一种或多种因素而变化，因素例如但不限于在分离期间需要保存活力的微生物细胞的类型，最终混合物中的pH和/或有效缓冲液浓度，样本的类型和样本的量。应当理解，对于给定的一组条件，通过遵循本文的实验方法可以确定合适的非离子表面活性剂浓度范围，以便研究非离子表面活性剂浓度对一种或多种性能度量的影响，性能度量例如但不限于血液裂解效率、残留血细胞碎片的量和微生物细胞活力。
在一个示例性实施方案中，血液裂解试剂可以具有这样的组成，使得在血液裂解试剂与样本混合后，pH的范围为7.8-10。在其它示例性实施方案中，最终混合物的pH的范围可以为8.2-9.5。在其他示例性实施方案中，最终混合物的pH可以由上限pH值10、9.9、9.8、9.7、9.6或9.5界定，并且由下限pH值8.0、8.2、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9和9.0界定的范围内。在一些示例性实施方案中，可以选择缓冲液浓度使得有效缓冲液浓度在10-300mM的范围内。在其他示例性实施方案中，可以选择缓冲液浓度使得有效缓冲液浓度在30-100mM的范围内。
应当理解，合适的pH可以根据一个或多个因素而变化，例如但不限于，在分离期间需要保存活力的微生物细胞的类型，最终混合物中的有效缓冲液浓度，与样本混合之前的血液裂解试剂的初始pH，样本的类型和样本的量。
在一些示例性实施方案中，血液裂解试剂可以具有9-11(或，例如，9.5-10.5)的pH，并且可以选择缓冲液浓度(或缓冲液容量)，使得在将血液裂解试剂与样本混合之后，pH降低至最终pH即小于10、小于9.9、小于9.8、小于9.7、小于9.6、或小于9.5、和大于8.2、大于8.4、大于8.5、大于8.6、大于8.7、大于8.8、大于8.9、或大于9.0。不受理论的限制，本发明人怀疑在9-11范围内的初始pH对于进行血细胞的有效消化是有益的，然而如果在血细胞裂解后维持这样的高pH，则所得到的高pH会不利地影响一些微生物细胞(例如铜绿假单胞菌和奇异变形杆菌)的活力。
应当理解，对于给定的一组条件，通过遵循本文的实验方法可以确定合适的最终pH和/或有效缓冲液浓度范围，以便研究pH和/或缓冲液浓度范围对一种或多种性能度量的影响，性能度量例如但不限于血液裂解效率、残留血细胞碎片的量和微生物细胞活力。
在一个示例性实施方案中，血液裂解试剂还可包括消泡剂，消泡剂包括聚二甲基硅氧烷乳液，聚二甲基硅氧烷乳液含有合适的非离子表面活性剂作为水包油乳化剂，并且可具有使得在血液裂解试剂与样本混合之后，消泡剂乳液的浓度在0.005至0.5％(v/w)之内的组成。在其它示例性实施方案中，最终混合物中消泡剂乳液的浓度范围可以为0.01至0.05％。应当理解，消泡剂的合适浓度可以根据一个或多个因素而变化，例如但不限于，血液裂解试剂的其它成分的浓度、样本的类型和样本的量。应理解，对于给定的一组条件，可通过遵循本文的实验方法确定合适的消泡剂组合物和浓度，以便研究消泡剂浓度和组合物对一种或多种性能度量的影响，性能度量例如但不限于在涉及混合和/或分离过程的自动化操作期间产生的泡沫的量，以及输送流体所需的压力。
在一个示例性实施方案中，进行样本中血细胞和/或其它真核细胞的选择性裂解，同时保持样本中一种或多种微生物细胞的活力的方法可以通过将样本与含有皂苷、SPS以及碱性缓冲液(例如具有根据前述实例范围的示例性浓度和pH)的血液裂解试剂接触来进行，将样本与血液裂解试剂混合，并分离微生物细胞。虽然包含非离子表面活性剂在许多应用中是有益的，但在一些应用中，例如对残留碎片的存在较不敏感的应用和/或不涉及下游分子扩增的应用中，不必实现选择性裂解。
在一个示例性实施方案中，进行样本中血细胞和/或其它真核细胞的选择性裂解，同时保持样本中一种或多种微生物细胞的活力的方法可以通过将样本与含有皂苷以及碱性缓冲液(例如具有根据前述实例范围的示例性浓度和pH)的血液裂解试剂接触来进行，将样本与血液裂解试剂混合，并分离微生物细胞。虽然包含非离子表面活性剂和SPS在许多应用中是有益的，但在一些应用中，例如对残留碎片的存在较不敏感的应用和/或不涉及下游分子扩增的应用中，这些成分可以不必实现选择性裂解。
下面提供了用于处理血培养样本例如阳性血培养样本和中间培养物样本的示例性和非限制性组成范围用于提取活的微生物细胞。虽然基于它们在固相生长培养基上促进菌落生长的适合性，基于肉汤微量稀释的药敏试验确定了以下示例性浓度范围，但应当理解，当进行使用活微生物细胞的其它过程时，以下提供的浓度范围及其变化形式可用于进行血细胞裂解。
在一个示例性实施方案中，血液裂解试剂可以具有这样的组成，使得在血液裂解试剂与血培养样本混合后，皂苷的浓度为0.75-60mg/ml。在其它示例性实施方案中，最终混合物中皂苷的浓度可以为2.5-30mg/ml。应理解，皂苷的合适浓度可根据一种或多种因素而变化，因素例如但不限于在分离期间需要保存完整性的微生物细胞的类型，最终混合物中的pH和/或有效缓冲液浓度，以及血培养样本中微生物细胞的浓度。应当理解，对于给定的一组条件，通过遵循本文的实验方法可以确定合适的皂苷浓度范围，以便研究皂苷浓度对一种或多种性能度量的影响，性能度量例如但不限于血液裂解效率、残留血细胞碎片的量和微生物细胞完整性。
在一个示例性实施方案中，血液裂解试剂可以具有这样的组成，使得在血液裂解试剂与血培养样本混合后，SPS的浓度为0.35-50mg/ml。在其它示例性实施方案中，最终混合物中SPS的浓度可以为1.25-20mg/ml。应理解，SPS的合适浓度可根据一种或多种因素而变化，因素例如但不限于在分离期间需要保存完整性的微生物细胞的类型，最终混合物中的pH和/或有效缓冲液浓度，以及血培养样本中微生物细胞的浓度。应当理解，对于给定的一组条件，通过遵循本文的实验方法可以确定合适的SPS浓度范围，以便研究SPS浓度对一种或多种性能度量的影响，性能度量例如但不限于血液裂解效率、残留血细胞碎片的量和微生物细胞完整性。
在一个示例性实施方案中，血液裂解试剂可以具有这样的组成，使得在血液裂解试剂与血培养样本混合后，非离子表面活性剂的浓度为0-3％w/v。在其它示例性实施方案中，最终混合物中非离子表面活性剂的浓度范围可以为0-2％。应理解，非离子表面活性剂的合适浓度可根据一种或多种因素而变化，因素例如但不限于在分离期间需要保存完整性的微生物细胞的类型，最终混合物中的pH和/或有效缓冲液浓度，以及血培养样本中微生物细胞的浓度。应当理解，对于给定的一组条件，通过遵循本文的实验方法可以确定合适的非离子表面活性剂浓度范围，以便研究非离子表面活性剂浓度对一种或多种性能度量的影响，性能度量例如但不限于血液裂解效率、残留血细胞碎片的量和微生物细胞完整性。
在一个示例性实施方案中，血液裂解试剂可以具有这样的组成，使得在血液裂解试剂与血培养样本混合后，pH的范围为7.8-10。在其它示例性实施方案中，最终混合物的pH的范围可以为8.2-9.5。在其他示例性实施方案中，最终混合物的pH可以由上限pH值10、9.9、9.8、9.7、9.6或9.5界定，并且由下限pH值8.0、8.2、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9和9.0界定的范围内。在一些示例性实施方案中，可以选择缓冲液浓度使得有效缓冲液浓度在2.5-300mM的范围内。在其他示例性实施方案中，可以选择缓冲液浓度使得有效缓冲液浓度在5-100mM的范围内。
应当理解，合适的pH可以根据一个或多个因素而变化，例如但不限于，在分离期间需要保存完整性的微生物细胞的类型，最终混合物中的有效缓冲液浓度，与血培养样本混合之前的血液裂解试剂的初始pH，以及血培养样本中微生物细胞的浓度。
在一些示例性实施方案中，血液裂解试剂可以具有9-11(或，例如，9.5-10.5)的pH，并且可以选择缓冲液浓度(或缓冲液容量)，使得在将血液裂解试剂与血培养样本混合之后，pH降低至最终pH即小于10、小于9.9、小于9.8、小于9.7、小于9.6、或小于9.5、和大于8.2、大于8.4、大于8.5、大于8.6、大于8.7、大于8.8、大于8.9、或大于9.0。不受理论的限制，本发明人怀疑在9-11范围内的初始pH对于进行血细胞的有效消化是有益的，然而如果在血细胞裂解后维持这样的高pH，则所得到的高pH会不利地影响一些微生物细胞(例如铜绿假单胞菌和奇异变形杆菌)的完整性。
应当理解，对于给定的一组条件，通过遵循本文的实验方法可以确定合适的最终pH和/或有效缓冲液浓度范围，以便研究pH和/或缓冲液浓度范围对一种或多种性能度量的影响，性能度量例如但不限于血液裂解效率、残留血细胞碎片的量和微生物细胞完整性。
在一个示例性实施方案中，血液裂解试剂还可包括消泡剂，消泡剂包括聚二甲基硅氧烷乳液，聚二甲基硅氧烷乳液含有合适的非离子表面活性剂作为水包油乳化剂，并且可具有使得在血液裂解试剂与血培养样本混合之后，消泡剂乳液的浓度在0.005至0.5％(v/w)之内的组成。在其它示例性实施方案中，最终混合物中消泡剂乳液的浓度范围可以为0.01至0.05％。应当理解，消泡剂的合适浓度可以根据一个或多个因素而变化，例如但不限于，血液裂解试剂的其它成分的浓度和血培养样本中微生物细胞的浓度。应理解，对于给定的一组条件，可通过遵循本文的实验方法确定合适的消泡剂组合物和浓度，以便研究消泡剂浓度和组合物对一种或多种性能度量的影响，性能度量例如但不限于在涉及混合和/或分离过程的自动化操作期间产生的泡沫的量，以及输送流体所需的压力。
涉及分离活的和/或完整的微生物细胞的3型裂解试剂的示例性应用
前述示例性实施方案说明了在通过将样本(例如血液样本，例如全血样本或血培养样本)与3型血液裂解试剂接触以选择性地裂解血细胞并随后使用分离方法(例如但不限于离心、过滤、免疫磁分离和微流控分离)来获得活的和/或完整的微生物细胞的悬液之后使用3型裂解试剂的几个示例性应用。上述用于分离的微生物细胞的后续处理的示例性应用包括分子扩增测定(在进行微生物细胞的裂解之后)、对活的分离细胞进行代谢鉴定测定、对分离的活的和/或完整的微生物细胞进行的MALDI测定、以及对活的分离细胞进行表型、基于生长的药敏试验测定。应当理解，提供这些示例性应用以说明可能应用的子集，可能应用涉及在用3型血液裂解试剂裂解血细胞后处理分离的微生物细胞，3型血液裂解试剂包括碱溶液中的皂苷和SPS。
应当理解，本文描述的示例性应用可以根据手动方法、半自动方法或全自动方法来执行。下面提供用于各种应用的半自动和自动系统、装置和方法的具体实例。
在一些示例性实施方案中，可以使用一个集成盒来在一个完全自动化且封闭的环境中执行微生物细胞分离和随后的处理。例如，如图3A-3C所示，或其变型，集成盒可用于样本的全自动处理，包括使样本与3型血液裂解试剂接触，分离微生物细胞以获得纯化的细胞悬液，以及进行随后的样本制备和测定步骤(例如电裂解和逆转录PCR)。
在另一个示例性实现方式中，可以使用例如图3A-3C所示的盒(或其变体)的盒来执行从样本中自动分离和浓缩微生物细胞，产生纯化的微生物细胞悬液，该纯化的微生物细胞悬液是可获得的并且适合于在外部转移分离的微生物细胞之后的后续测定，例如但不限于分子鉴定测定，MALDI鉴定测定，和基于生长的测定，例如表型药敏试验。
例如，参见图3A-3C，可以将密封端口结合到微流体装置699中，该微流体装置699与位于微流体装置699中的提取室流体连通。提取室可以通过通道516和阀519与离心室501流体连通。在打开阀519之后，可以将分离的细胞悬液转移到提取室，在提取室中，可以在破坏密封之后将其手动或自动地取出(例如通过移液器或注射器)。在另一个示例性实现方式中，可在离心室502上方形成可移除的帽，允许自动或手动移除微生物细胞悬液用于后续处理。应当理解，尽管图3A-3C中所示的示例性集成盒采用自动离心来执行分离，但是这种集成盒可以被修改为包括替代的分离方式，例如但不限于过滤，免疫磁分离和基于微流体的分离。
在一些示例性实施方案中，在已经获得了相对于该初始样本已经纯化的微生物细胞悬液之后，可以将所得到的微生物细胞悬液与生长培养基(例如在固相或液相中)接触以便培养这些分离的微生物细胞。这种方法可以有益于降低可能存在于初始样本中的抗生素的浓度，使得分离的微生物细胞可以随后在抗生素浓度显著降低(例如，降低超过10、10
在一个示例性实现方式中，在已经获得分离的活微生物细胞之后，可以使分离的活微生物细胞与固相生长培养基接触(例如分散在固相生长培养基上或固相生长培养基上)并在适于促进微生物细胞生长的环境中孵育。固相生长培养基的非限制性实例包括常规琼脂、明胶、瓜尔胶、黄原胶。在一些示例性实现方式中，该固相生长培养基可以根据微生物细胞的类型是生色的。在一些实施方案中，可将生色或荧光底物加入琼脂培养基中，用于通过对菌落进行特异性或非特异性染色来鉴定微生物，如例如欧洲专利申请EP1088896A2号所述。
应当理解，涉及从分离的微生物细胞直接形成菌落的本示例性实施方案可以以手工方法、半自动方法或全自动方法进行。例如，在一些示例性实现方式中，微生物细胞可以在自动化集成盒(例如图3A-3C所示的盒或其变体)内分离，并且随后手动或自动转移以接触固相生长介质。在替代的示例性实现方式中，该过程可以在封闭的集成盒内完全自动化，这在将分离的微生物细胞转移到固相生长培养基中时可以有利于避免引入污染物。
提供以下实施例以使本领域技术人员能够理解和实践本发明的实施方案。它们不应被认为是对本发明范围的限制，而仅仅是其示例性和代表性的。
实施例
实施例1：微生物细胞培养准备
如下制备除金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌之外的革兰氏阳性菌细胞培养物：
1.将30μL的相应的细菌种类和菌株甘油储备液接种于3mL的胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)中并且在37℃下在150rpm下振荡孵育过夜。
2.将TSB中10倍稀释的培养物在37℃孵育1小时(粪肠球菌、屎肠球菌和无乳链球菌)或2小时(表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌和化脓性链球菌)。
如下制备除铜绿假单胞菌细胞培养物之外的革兰氏阴性菌：
1.将30μL的相应的细菌种类和菌株甘油储备液接种于3mL的TSB中并且在37℃下在150rpm下振荡孵育过夜。
2.将在TSB中10倍稀释的培养物在37℃孵育1小时(鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌复合菌(Enterobacter cloacae complex)、产气肠杆菌、大肠杆菌、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌和奇异变形杆菌)或2小时(粘质沙雷氏菌)。
金黄色葡萄球菌细胞培养物制备如下：
将30μL的相应菌株甘油储备液接种于3mL的TSB中，并在37℃在150rpm振荡下孵育3小时。
肺炎链球菌细胞培养物制备如下：
将30μL的相应的种类和菌株甘油储备液接种于3mL的TSB中并且在37℃下在产生CO
铜绿假单胞菌：
1.将6μL铜绿假单胞菌菌株甘油储备液在具有5％绵羊血平板的胰酶大豆琼脂(TSA)上划线并且在37℃下孵育过夜(P1)。
2.将菌落在琼脂平板上再传代培养一次(P2)。
3.将来自平板的一个菌落接种在3ml的TSB中，并在37℃在150rpm振荡下孵育3小时。
真菌细胞培养物制备如下：
1.将30μL的相应的真菌种类和菌株甘油储备液接种于3mL的TSB中并且在30℃下在150rpm下振荡孵育过夜。
2.TSB中10倍稀释的培养物在30℃孵育2小时(白色念珠菌、光滑念珠菌(Candidaglabrata)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)和热带念珠菌(Candidatropicalis))。
基于OD测量，在TSB中以10
实施例2：加标全血样本的制备
从健康个体抽取5-8mL体积的血液样本到BD
实施例3：加标磷酸盐缓冲液样本的制备
将具有约10
实施例4：在不存在用于实时RT-PCR测定加标对照的血液裂解试剂的情况下1mL加标磷酸盐缓冲液样本的样本制备
用于实时RT-PCR加标对照的样本制备如下进行：
1.在15ml离心管中，将1ml加标磷酸盐缓冲液与1ml的PB混合。
2.将离心管涡旋1分钟。
3.将离心管以4000rpm离心3分钟。
4.除去1.9ml的上清液。
5.进行4个洗涤循环，其中在每个洗涤循环期间，加入0.9ml的PB(洗涤缓冲液)并通过温和涡旋将溶液混合10秒，在4000rpm下离心3分钟，取出0.9ml的上清液并弃去，使得保留100μl残留液体。
6.将得到的细胞悬液在95℃下加热裂解10分钟。
7.通过混合1μl热裂解液，3μl实时RT-PCR主混合物和1μl目标特异性引物组来制备RT-PCR反应，并在Illumina实时Eco系统热循环仪(Illumina Real-Time Eco systemthermal cycler)上进行实时RT-PCR检测测定。
实施例5：与用于实时RT-PCR测定的血液裂解试剂成分接触的1mL加标磷酸盐缓冲液样本的样本制备
如下对加标磷酸盐缓冲液样本进行样本制备：
1.在15ml离心管中，将1ml加标磷酸盐缓冲液与1ml血液裂解试剂(或血液裂解试剂成分的子集)混合。
2.将离心管涡旋1分钟。
3.将离心管以4000rpm离心3分钟。
4.除去1.9ml的上清液。
5.进行4个洗涤循环，其中在每个洗涤循环期间，加入0.9ml的洗涤缓冲液并通过温和涡旋将溶液混合10秒，在4000rpm下离心3分钟，取出0.9ml的上清液并弃去，使得保留100μl残留液体。
6.将得到的细胞悬液在95℃下加热裂解10分钟。
7.通过混合1μl热裂解液，3μl实时RT-PCR主混合物和1μl目标特异性引物组来制备RT-PCR反应，并在Illumina实时Eco系统热循环仪(Illumina Real-Time Eco systemthermal cycler)上进行实时RT-PCR检测测定。
实施例6：在不存在用于实时RT-PCR测定加标对照的血液裂解试剂的情况下3mL加标磷酸盐缓冲液样本的样本制备
用于实时RT-PCR加标对照的样本制备如下进行：
1.在15ml离心管中，将3ml加标磷酸盐缓冲液与5ml的PB混合。
2.将离心管在涡旋器的最大速度下涡旋混合1分钟。
3.将离心管以4000rpm离心8分钟。
4.除去7.9ml的上清液。
5.进行4个洗涤循环，其中在每个洗涤循环期间，加入0.9ml的洗涤缓冲液并通过温和涡旋将溶液混合，在4000rpm下离心3分钟，取出0.9ml的上清液并弃去，使得保留100μl残留液体。
6.将得到的细胞悬液在95℃下加热裂解10分钟。
7.通过混合1μl热裂解液，3μl实时RT-PCR主混合物和1μl目标特异性引物组来制备RT-PCR反应，并在Illumina实时Eco系统热循环仪(Illumina Real-Time Eco systemthermal cycler)上进行实时RT-PCR检测测定。
实施例7：用于实时RT-PCR测定的3mL加标全血样本的样本制备
如下对加标全血样本进行样本制备：
1.在15mL离心管中，将5ml血液裂解试剂加入到3ml样本中。
2.将离心管在涡旋器的最大速度下涡旋混合1分钟。
3.将离心管以4000rpm离心8分钟。
4.除去7.9ml的上清液。
5.进行4个洗涤循环，其中在每个洗涤循环期间，加入0.9ml的洗涤缓冲液并通过温和涡旋将溶液混合，在4000rpm下离心3分钟，取出0.9ml的上清液并弃去，使得保留100μl残留液体。
6.将得到的细胞悬液在95℃下加热裂解10分钟。
7.通过混合1μl热裂解液，3μl实时RT-PCR主混合物和1μl目标特异性引物组来制备RT-PCR反应，并在Illumina实时Eco系统热循环仪(Illumina Real-Time Eco systemthermal cycler)上进行实时RT-PCR检测测定。
实施例8：用于实时RT-PCR测定的1mL加标全血样本的样本制备
如下对加标全血样本进行样本制备：
1.在15mL离心管中，将1ml血液裂解试剂加入到1ml样本中。
2.将离心管在涡旋器的最大速度下涡旋混合1分钟。
3.将离心管以4000rpm离心3分钟。
4.除去1.9ml的上清液。
5.进行4个洗涤循环，其中在每个洗涤循环期间，加入0.9ml的洗涤缓冲液并通过温和涡旋将溶液混合，在4000rpm下离心3分钟，取出0.9ml的上清液并弃去，使得保留100μl残留液体。
6.将得到的细胞悬液在95℃下加热裂解10分钟。
7.通过混合1μl热裂解液，3μl实时RT-PCR主混合物和1μl目标特异性引物组来制备RT-PCR反应，并在Illumina实时Eco系统热循环仪(Illumina Real-Time Eco systemthermal cycler)上进行实时RT-PCR检测测定。
实施例9：用于血液碎片形成的实验研究的3mL全血样本的样本制备
如下进行未加标全血样本的样本制备：
1.在15mL离心管中，将5ml血液裂解试剂加入到3ml样本中。
2.将离心管在涡旋器的最大速度下涡旋混合1分钟。
3.将混合物以4000rpm离心7分钟；
4.除去上清液，在管底部留下100μL残留物,
5.进行两个洗涤循环，其中在每个洗涤循环期间，加入0.9ml洗涤缓冲液，以4000rpm离心3分钟，并且在第一洗涤循环期间，取出0.9ml的上清液并弃去,
6.拍摄所得管的照片以研究血液碎片的存在。
实施例10：制备阳性血培养样本
如下制备阳性血培养样本：
1.将细菌以5-10CFU/ml的标示浓度加标10mL全血样本中。
2.向FA Plus需氧血液培养瓶接种10mL加标全血并在37℃下℃孵育直至培养物变为阳性。
实施例11：通过将样本与血液裂解试剂对流混合来处理阳性血培养样本
用于处理阳性血液培养的对流混合器示于图26A和26B中。其包括两个直径为15.9mm的10mL注射器(S1和S2)，并且通过ID＝0.91mm且长度为10cm的管T连接。样本制备如下进行：
1.将1mL血液抽取到一个注射器中(S1)，如图26A所示；
2.将1mL血液裂解试剂抽入另一注射器(S2)，如图26A所示；
3.以90mL/min的流速从S2抽取1mL的血液裂解试剂至S1，如图26B所示；
4.将2mL血液+血液裂解试剂混合物抽入S2；(未示出)
5.将混合物抽回S1；(未示出)
6.重复步骤4和5，5次。
7.将溶血液样本转移至15mL离心管中。
8.将混合物以4000rpm离心3分钟。
9.除去上清液，在管底部留下100μL残留液体。
10.进行两个洗涤循环，其中在每个洗涤循环期间，加入0.9ml洗涤缓冲液，以4000rpm离心3分钟，并且在第一洗涤循环期间，取出0.9ml的上清液并弃去。
11.拍摄所得管的照片以研究血液碎片的存在。
实施例12：细胞阳性血培养样本处理用于悬液回收
阳性血培养样本的样本制备如下：
1.在15mL离心管中，将体积为1mL的阳性血培养样本与1mL血液裂解试剂混合。
2.将离心管在涡旋器的最大速度下涡旋混合1分钟。
3.将混合物以4000rpm离心3分钟。
4.除去1.9mL上清液，在管底部留下100μL残留液体。
5.进行4个洗涤循环，其中在每个洗涤循环期间，加入0.9ml的洗涤缓冲液并通过温和涡旋将溶液混合，在4000rpm下离心3分钟，取出0.9ml的上清液并弃去，使得保留100μl残留液体。
6.在洗涤循环结束时，除去0.9的上清液，将100μL的残留液体重新悬浮并作为回收的细胞悬液。
7.作为阳性对照参考，将阳性血液培养接种在具有5％绵羊血平板的胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)上并在37℃孵育18-24小时。
实施例13：在不存在用于活细胞琼脂平板接种加标对照的血液裂解试剂的情况下，3mL加标磷酸盐缓冲液样本的样本制备
如下为活细胞琼脂平板接种加标对照进行样本制备：
1.在15ml离心管中，将3ml加标磷酸盐缓冲液与5ml的PB混合。
2.将离心管在涡旋器的最大速度下涡旋混合1分钟。
3.将离心管以4000rpm离心8分钟。
4.除去7.9ml的上清液。
5.将得到的细胞悬液接种在琼脂平板上，并在37℃孵育18-24小时用于细菌菌落生长，或在30℃孵育24-72小时用于真菌菌落生长。将链球菌种的琼脂平板在37℃在CO
实施例14：通过涡旋混合3mL加标全血样本制备样本用于活细胞回收琼脂平板接种试验
如下进行通过涡旋混合的样本制备以从加标全血样本中回收活微生物细胞：
1.在15-mL离心管中，将5ml血液裂解试剂加入到3ml样本中。
2.将离心管在涡旋器的最大速度下涡旋混合1分钟。
3.将离心管以4000rpm离心8分钟。
4.除去7.9ml的上清液。
5.进行4个洗涤循环，其中在每个洗涤循环期间，加入0.9ml的洗涤缓冲液并通过温和涡旋将溶液混合，在4000rpm下离心3分钟，取出0.9ml的上清液并弃去，使得保留100μl残留液体。
6.将得到的细胞悬液接种在琼脂平板上，并在37℃孵育18-24小时用于细菌菌落生长，或在30℃孵育24-72小时用于真菌菌落生长。将链球菌种的琼脂平板在37℃在CO
实施例15：使用对流混合对3mL加标全血样本进行处理以回收活细胞
用于样本制备全血的对流混合器呈现在图26A和26B中。其包括两个直径为15.9mm的10mL注射器，并且通过ID＝0.91mm且长度为10cm的管连接。样本制备如下进行：
1.将3mL血液抽取到一个注射器中(S1)
2.将5mL血液裂解试剂抽入另一注射器(S2)
3.以90mL/min的流速从S2抽取5mL的血液裂解试剂至S1
4.将8mL血液+血液裂解试剂混合物抽入S2
5.将混合物抽回至S1
6.重复步骤4和5，5次
7.将混合室的内容物排空至15mL的离心管8中。以4000RPM离心10分钟
9.去除上清液，在管底部留下100μL
10.加入900μL洗涤缓冲液并通过涡旋混合
11.以4000RPM离心2分钟
12.重复步骤9-11，3次
13.去除上清液，在管底部留下100μL
14.将得到的细胞悬液平板接种于琼脂平板上并在37℃孵育以进行菌落生长。
实施例16：通过
对于VITEK-MS-ID，从实施例12中的阳性血液培养制备回收的细胞悬液和参考对照菌落以及从实施例14中的全血中回收的活细胞菌落如下：
1.将1μL的细菌细胞悬液点样在VITEK MS-DS目标载玻片的一个样本区域上，然后加入1μL的VITEK MS-CHCA(α-氰基-4-羟基-肉桂酸)并使其干燥。
2.使用无菌1μL接种环将细菌菌落样本施加到VITEK MS-DS目标载玻片的一个样本区域上，随后添加1μL的VITEK MS-CHCA并使其干燥。
3.使用无菌1μL接种环将真菌菌落样本施加到VITEK MS-DS目标载玻片的一个样本区域上，随后向样本上添加1μL的VITEK-MS-FA(甲酸)并风干。在干燥的样本上加入1μL的VITEK MS-CHCA并使其干燥。
4.加标微生物的种类通过bioMérieux的
实施例17：
对于
1.在提供的试管中，将回收的细菌细胞悬液加入3.0mL的0.45％无菌生理盐水中，用DensiChek Plus浊度计制备
2.将细菌菌落样本如上所述接种到0.45％无菌盐水中，制备0.5-0.63麦氏浊度单位的细胞悬液。
3.将真菌菌落样本如上所述接种到0.45％无菌盐水中，制备1.8-2麦氏浊度单位的细胞悬液。
4.使用bioMérieux
已经通过举例示出了上述具体实施例，并且应当理解，这些实施例可以容许各种修改和替代形式。还应当理解，权利要求不旨在限于所公开的具体形式，而是覆盖落入本发明的精神和范围内的所有修改、等同物和替代方案。
机译： 用于选择性裂解血细胞的方法和组合物和微生物细胞分离
机译： 用于选择性裂解血细胞的方法和组合物和微生物细胞分离
机译： 选择性裂解血细胞的方法和组合物和微生物细胞分离
