一种银杏提取物及其制剂中组分同时测定的方法

摘要

本发明涉及一种银杏提取物及其制剂中组分同时快速测定的方法。本发明包括如下步骤：以50％甲醇/50％水稀释样品；利用RP‑HPLC法进行黄酮和内酯及银杏酸的测定，建立了银杏提取物制剂中17种黄酮、5种内酯和5种银杏酸的HPLC‑MS同时测定方法，测定过程中选择的流动相由乙腈和水组成，色谱柱为Acquity UPLC HSS T3柱，流速0.45mL/min，柱温40℃，进样量5μL，质谱选择离子监测(MRM)模式检测；以17种黄酮、5种内酯和5种银杏酸为标样，建立了HPLC‑MS测定方法的线性方程。该方法具有快速简单、结果准确可靠、稳定性好等特点，适用于银杏提取物及其制剂中黄酮、内酯和银杏酸化合物的同时定性与定量分析。

说明书

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种银杏提取物及其制剂中黄酮和内酯及银杏酸同时快速测定的高效液相色谱-质谱方法。

技术背景

银杏提取物，用于缺血性心脑血管疾病、冠心病、心绞痛、脑栓塞、脑血管痉挛等，其用于临床的药品包括注射剂、片剂、颗粒剂等。其中起作用的成分主要为黄酮和内酯类化合物，银杏酸为其中的有害成分。在其质量控制中主要采用的是液相色谱法，其中黄酮类和银杏酸类采用紫外检测，内酯类化合物由于无紫外吸收，采用蒸发光散射检测器(ELSD)检测。对于黄酮类化合物，由于对照品的缺乏，通常将黄酮苷类物质酸解为黄酮苷元后进行测定。对于有害成分银杏酸，通常以白果新酸为对照品，控制总银杏酸的含量。

目前的检测方法中，将黄酮、内酯及银杏酸分别测定，时间较长，溶剂消耗也较大；采用ELSD检测时灵敏度低、重复性差；由于标准品缺乏，测定的酸解后的三种黄酮苷元(槲皮素、山奈素、异鼠李素)，不能全面代表注射剂的性质，不同注射剂即使黄酮总量相近，但各单峰可能含量差异较大。

本发明采用质谱检测，对黄酮、内酯和银杏酸类化合物均有响应，且采用超高效液相色谱，可以快速实现目标物的同时分析。

发明内容

本发明涉及一种银杏提取物及其制剂中黄酮、内酯和银杏酸同时快速测定的超高效液相色谱-质谱方法。采用高效液相色谱分离，质谱检测器在选择反应监测(MRM)模式下检测，可对银杏提取物及其制剂中的17种黄酮、5种内酯和 5种银杏酸实现同时测定。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

1)制备对照品溶液：分别称取槲皮素-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷、杨梅素-3-O-芸香糖苷、杨梅素-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷、芦丁、山奈酚-3-O-对香豆酰基葡萄糖芸香糖苷、万寿菊素-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-2”-葡萄糖基鼠李糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、丁香黄素-3-O-芸香糖苷、3’,5’-二甲氧基杨梅素-3-O-芸香糖苷、山奈酚-3-O-2” -葡萄糖基鼠李糖苷、槲皮素-3-O-对香豆酰基葡萄糖基鼠李糖苷、山奈酚-3-O- 对香豆酰基葡萄糖基鼠李糖苷、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内酯J、白果内酯、银杏酸17：1、银杏酸17：2、银杏酸15：0、白果酸和白果新酸对照品，分别加稀释溶剂得到27个单标；再分别精密量取各单标，置同一容量瓶中，得到混合对照品溶液。再分别量取各单标，置同一容器中，得到混合对照品溶液，取混合对照品溶液加稀释剂稀释，得到不同浓度的混合对照品溶液；稀释溶剂为水或甲醇水溶液，稀释溶剂中水的体积含量为50-100％。

采用高效液相色谱-质谱对单标进行测定，以单标定性及优化质谱参数。

采用高效液相色谱-质谱对不同浓度的混合对照品溶液进行测定，以不同浓度的混合对照品溶液做定量曲线。

2)制备待测样品溶液：待测样品为银杏提取物及其制剂中的一种或二种以上，用与上述相同的稀释溶剂稀释定容。

3)制定高效液相色谱条件仪器：超高效液相色谱仪为岛津Nexera X2系统色谱柱：Acquity UPLC HSS T3柱(2.1×100mm)

流动相：A，乙腈和/或甲醇；B，含添加剂的水

梯度：5-15％A经5-30min达35-100％A，并保持3-10min。

流速：0.2-0.6mL/min

柱温：25-45℃

添加剂浓度为0.01-1％(v:v)，添加剂为甲酸、乙酸、甲酸铵、乙酸铵的一种或二种以上。

高效液相色谱方法中流动相为乙腈、甲醇、水中的一种或二种以上。

4)制定质谱(MRM)条件

质谱仪为AB QTRAP 6500，27种化合物的质谱参数优化结果如下表所示：

27个目标化合物的保留时间(RT)、选择反应监测定量离子对(MRM)、去簇电压(DP)和碰撞能(CE)

5)进行常规精密度、重复性、回收率试验，进行27种目标物的含量测定。

所述步骤2)中银杏提取物及其制剂包括总提物、注射剂、片剂、散剂、颗粒剂中的一种或二种以上。

所述步骤3)中高效液相色谱柱为粒径1-5μm。

所述步骤3)中高效液相色谱柱为C18、C8的一种或几种。

所述步骤4)中质谱仪为带选择反应监测功能的三重四极杆质谱仪(QQQ)、 Q-Trap、Q Extractive中的一种。

本发明具有如下优点：

1.简单快速、试剂用量少。本发明设计的超高效液相色谱-质谱检测方法可实现银杏提取物及其制剂中黄酮、内酯和银杏酸类化合物的同时测定，操作简单、省时、成本低廉、节省溶剂。

2.本发明设计的超高效液相色谱-质谱方法定性定量银杏提取物及其制剂中的黄酮、内酯和银杏酸类成分，方法精密度高、灵敏度强、重复性好、回收率高。

附图说明

图1为实施例1-7中厂家A、B、C、D、E、F、G舒血宁注射剂样品中27 种化合物的含量比较图。

具体实施方式

实施例1

(一).样品处理：舒血宁注射剂用50％甲醇/50％水稀释50倍。

(二).超高效液相色谱-质谱方法

1)超高效液相色谱分析方法

超高效液相色谱仪为岛津Nexera X2，包括二元溶剂管理器、自动进样器、柱温箱；17种黄酮、5种内酯和5种银杏酸对照品为实验室自制或购买，并经过结构、纯度确认。甲酸为美国Sigma公司产品；乙腈为色谱纯；水为Millpore 超纯水。

色谱条件：

仪器：超高效液相色谱仪为岛津Nexera X2系统

色谱柱：Acquity UPLC HSS T3柱(2.1×100mm)

流动相：A，乙腈-0.5％甲酸；B，水-0.5％甲酸

梯度：

流速：0.45mL/min；柱温：40℃

2)制定质谱(MRM)条件

质谱仪为AB QTRAP 6500，27种化合物的质谱参数优化结果见表1。

表1 27个目标化合物的保留时间(RT)、选择反应监测定量离子对(MRM)、去簇电压(DP)和碰撞能(CE)

3)标准工作曲线与线性关系

将对照品浓度为2mg/mL的各黄酮和内酯的单标、0.2mg/mL各银杏酸的单标，用50％甲醇/50％水配成40μg/mL的黄酮、内酯和4μg/mL银杏酸的混合对照品溶液，再用50％甲醇/50％水依次稀释成20μg/mL、15μg/mL、10μg/mL、 7.5μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL、 0.01μg/mL、0.005μg/mL的黄酮、内酯和2μg/mL、1.5μg/mL、1μg/mL、0.75 μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL、0.01μg/mL、0.005μg/mL、 0.001μg/mL、0.0005μg/mL的银杏酸绘制标准曲线；绘制标准曲线结果见表2。 27种对照品的线性相关系数均大于0.985，在相关范围内浓度与峰面积呈良好线性关系，表明该方法测定黄酮、内酯和银杏酸成分的准确度高。

表2 27种对照品的标准曲线、线性范围、检出限及定量限

4)重复性、精密度试验

采用稀释50倍的舒血宁注射剂样品，在超高效液相色谱-质谱仪中分别重复进样5次，分别计算27个化合物峰面积的相对标准偏差，精密度结果见表3， RSD均小于8％，说明仪器性能良好，重现性高。取5份舒血宁注射剂样品分别稀释50倍后测定，重复性结果见表3，RSD均小于8％。(该样品中不含白果内酯及5种银杏酸)

表3样品中27个化合物的精密度和重复性

“-”表示样品中不存在

5)回收率实验

平行处理6份舒血宁注射剂，稀释前分别加入约样品中含量100％的各标样，然后稀释50倍后测定，结果见表4。可以看出，27种化合物的回收率均在95-107％之间，RSD小于9.1％，结果可靠且符合分析要求。

表4 27个化合物的加标回收率结果(n＝6)

(三)实际舒血宁注射剂样品含量测定

按上述超高效液相色谱-质谱方法分析厂家A的舒血宁注射剂样品，27种化合物的测定结果见表5。

表5不同舒血宁注射剂产品中27种化合物的定量结果

实施例2

将实施例1中第(三)节的样品改为B样品，其他与实施例1相同。

(三)实际舒血宁注射剂样品含量测定

按上述超高效液相色谱-质谱方法分析厂家B的舒血宁注射剂样品，27种化合物的测定结果见表5。

实施例3

将实施例1中第(三)节的样品改为C样品，其他与实施例1相同。

(三)实际舒血宁注射剂样品含量测定

按上述超高效液相色谱-质谱方法分析厂家C的舒血宁注射剂样品，27种化合物的测定结果见表5。

实施例4

将实施例1中第(三)节的样品改为D样品，其他与实施例1相同。

(三)实际舒血宁注射剂样品含量测定

按上述超高效液相色谱-质谱方法分析厂家D的舒血宁注射剂样品，27种化合物的测定结果见表5。

实施例5

将实施例1中第(三)节的样品改为E样品，其他与实施例1相同。

(三)实际舒血宁注射剂样品含量测定

按上述超高效液相色谱-质谱方法分析厂家E的舒血宁注射剂样品，27种化合物的测定结果见表5。

实施例6

将实施例1中第(三)节的样品改为F样品，其他与实施例1相同。

(三)实际舒血宁注射剂样品含量测定

按上述超高效液相色谱-质谱方法分析厂家F的舒血宁注射剂样品，27种化合物的测定结果见表5。

实施例7

将实施例1中第(三)节的样品改为G样品，其他与实施例1相同。

(三)实际舒血宁注射剂样品含量测定

按上述超高效液相色谱-质谱方法分析厂家G的舒血宁注射剂样品，27种化合物的测定结果见表5。

A、B、C、D、E、F、G样品中27种化合物的含量比较见图1。

在中国药典2015版中，对银杏提取物中的黄酮类采用紫外检测，且由于对照品的缺乏，通常将黄酮苷类物质酸解为黄酮苷元后进行总黄酮醇苷的测定。对于内酯类化合物，由于其无紫外吸收，采用蒸发光散射检测器(ELSD)检测。目前的检测方法中，黄酮和萜类内酯分别测定，时间较长，溶剂消耗也较大；采用ELSD 检测时灵敏度低、重复性差；由于标准品缺乏，测定的酸解后的三种黄酮苷元总量(槲皮素、山奈素、异鼠李素)，不能全面代表注射剂的性质，不同注射剂即使黄酮总量相近，但各单个黄酮苷可能含量差异较大。本发明共同时测定了银杏制剂中27种化合物的含量，还包括限量检出的5银杏酸化合物，对银杏制剂的全面质量控制具有重要的意义。