抗氧化生物测定法在丹参多组分缓释制剂体外释药评价中的应用研究

摘要

随着治疗模式和疾病谱的改变，以及单一药物毒副作用的不断涌现，复方药物以其独有的优势已成为新药研发的热点，在此基础上，加之缓控释技术的不断成熟以及在患者顺应性和安全性方面的独特优势，开发复方药物缓控释制剂的研究已成为药剂学发展的重要方向。一方面借助复方药物间增效减毒的治疗优势，另一方面，缓控释技术的引入所带来的便利也更易于被广大患者，尤其是需长期服药的慢性病患者所接受。伴随着该类制剂的需求不断增多，随之而来的多组分缓控释制剂体外释药评价方法的缺乏成为困扰药学工作者的难题和该类制剂发展的瓶颈。　　现行的评价方法多沿用原单一成分缓释制剂的评价方法，仅对多组分中的某一成分或对各成分分别绘制释药曲线，难以全面表征多组分制剂释药过程中的总体行为，无法细微刻画多组分制剂的体内外释放行为特征，难以体现多组分制剂的作用特点和组分间的配比特征，因此亟待建立预测能力强、可靠性高、与体内过程相关性强，具有快速、便捷特征的评价方法，以推动该类制剂的发展。　　本文以构建适宜于多组分的缓释制剂体外释药评价方法为目的，选择临床疗效确切、药理作用明确的丹参为模式药物，以其主要有效组分及其配比为切入点，建立基于ABTS、FRAP抗氧化生物测定技术和方法作为链接多成分间量效关系的桥梁，开展基于多组分药物的总抗氧化活性为指标的评价方法。对所建立的方法进行系统的方法学考察，保证所建立方法的可靠性及耐受性，从而构建适宜于多组分缓释制剂体外释药评价的抗氧化生物测定方法，并找到抗氧化生物测定方法与体外累积释药评价方法的相关性。　　本实验通过对ABTS法影响因素的综合考察，确定反应条件为：1体积的样品溶液与20倍体积的210 mmol·L-1 ABTS+溶液反应16 h后，于415 nm下测定吸光度值，从而计算样品清除ABTS+的能力。　　本实验还通过对FRAP法影响因素的综合考察，确定了反应条件为：1体积的样品溶液与20体积的FRAP工作液（0.3 mmol·L-1醋酸盐缓冲溶液：10 mmol·L-1 TPTZ：20 mmol·L-1三氯化铁溶液=10:1:1）反应100 min后，于593 nm下测定吸光度值，从而评价样品的抗氧化能力。　　为进一步验证方法的普适性，我们考察了两种方法在释放度测定中的主要影响因素，并对所建立的方法进行了系统的方法学考察，以保证所建立方法的耐用性和可靠性。　　为阐明方法的科学性，探索成分间是否存在可能的相互作用，应用两种方法分别测定了丹参主成分（丹酚酸B、迷迭香酸、原儿茶醛）及其不同比例配比以及丹参总酚酸提取物的抗氧化活性。结果表明各组分均在一定范围内呈良好的线性关系，且能辩识其可能的相互作用，证明该方法应用于表征多组分制剂释药过程中制剂的总体行为具有优势。　　为了探讨两种方法的普适性，采用UPLC法测定不同释药速率的丹参骨架片中各单成分（丹酚酸B、原儿茶醛、迷迭香酸）的体外释放度；采用酶标仪测定所得样品的吸光度值表示其抗氧化活性，对骨架片中各成分的累计释放度经时曲线与总体抗氧化活性经时曲线进行相关性分析。发现不同释药速率的丹参骨架片中各成分的累积释放度曲线与抗氧化活性经时曲线的相关系数R2均大于临界0.898值。表明3个成分的体外累计释放曲线与总抗氧化活性经时曲线有良好的相关性，采用该方法代替成分体外溶出评价，用于制剂处方设计具有可行性。　　为解释丹参骨架片体内的释放行为，利用大鼠肠外翻模型探讨丹参总酚酸提取物的肠吸收特征，选择丹参总酚酸提取物中三种主要成分为考察对象，以UPLC测定成分累积吸收数据，结果表明迷迭香酸、丹酚酸B在回肠内为被动吸收，符合一级速度过程；迷迭香酸、丹酚酸B在空肠内低、中剂量时为零级速度过程，高剂量时为一级速度过程，是一种主、被动同时存在的吸收方式；原儿茶醛在空肠、回肠内均为被动吸收。小肠不同部位的吸收实验表明，空肠可能为迷迭香酸、丹酚酸B的主要吸收部位，回肠可能为原儿茶醛的主要吸收部位。丹参水提物中原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B三成分在小肠均有吸收，但各成分的吸收速率及其机制不尽相同，提示小肠对丹参水提物的成分具有选择性吸收，并不是简单地半透膜吸收过程，为进一步揭示体内外释药行为奠定基础。

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综述:常用体外抗氧化检测方法的评价分析

前言

第一章体外抗氧化活性方法的建立

第 一 节 ABTS法测定丹参总酚酸抗氧化活性的方法学研究

1 仪器与试药

2 方法与结果

3 小结

第 二 节 FRAP法测定丹参总酚酸抗氧化活性的方法学研究

1 仪器与试药

2 方法与结果

3 小结

第三节丹参总酚酸提取物中各主要成分相互作用研究

1 仪器与试药

2 方法与结果

3 小结

第二章外翻肠囊法研究丹参总酚酸在大鼠肠内的吸收

1 材料

2 方法与结果

3 小结

第三章生物测定法在丹参骨架片体外释放中的应用研究

第一节丹参骨架片的制备及表征

1 仪器试药

2 方法与结果

第二节生物测定法在丹参骨架片体外释放评价中的应用

1 仪器试药

2 方法与结果

3 小结

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参考文献

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