一种胡蜂毒液指纹图谱的建立方法、胡蜂毒液指纹图谱及其应用

摘要

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种胡蜂毒液指纹图谱的建立方法、胡蜂毒液指纹图谱及其应用。本发明提供的方法包括以下步骤：以胡蜂毒液的水溶液为供试品溶液，以五羟色胺的水溶液为对照品溶液，将所述对照品溶液和供试品溶液分别进行高效液相色谱分析，以对照品溶液的色谱峰为基准，得到胡蜂毒液指纹图谱。本发明提供的方法操作简便，重复性较好、精密度较高，所得胡蜂毒液指纹图谱分离效果好，灵敏度高，能简便的应用于胡蜂毒液的质量控制，为其质量控制提供保障，为今后的相关新药研制及开发提供前期基础。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种胡蜂毒液指纹图谱的建立方法、胡蜂毒液指纹图谱及其应用。

背景技术

近几十年间，胡蜂毒液引起人们越来越多的关注，研究表明，胡蜂毒液中的活性物质主要有大分子蛋白质(如各种酶类、过敏原等)、生物活性胺(包括组胺、5-羟色 胺等)以及小肽分子(包括肥大细胞脱粒肽、趋化肽等)。目前，对于胡蜂毒液的研 究主要集中在蜂毒肽的化学成分及药理作用等方面，研究人员已从多种胡蜂的毒液中 纯化并鉴定得到这些小肽分子，且有研究报道显示蜂毒肽具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎、 抗菌和抗辐射等多种药理学作用。现代药理学和临床研究表明，蜂毒还具有许多生物 功能，如镇痛作用、抗凝血作用、抗血栓形成活性等。

胡蜂毒液价格较高，化学成分复杂，且产地、来源、采收时节等因素对胡蜂毒液 的化学成分和疗效具有相当大的影响。因此，亟需开发胡蜂毒液质量控制方法，以保 证系统、全面地反映胡蜂毒液质量，保证其临床应用的有效性与可控性，与其它混伪 产品进行区分，减少不必要的损失。

发明内容

本发明的目的在于提供一种胡蜂毒液指纹图谱的建立方法、胡蜂毒液指纹图谱及其应用，本发明提供的方法操作简便，准确可靠，能够全面、准确地评价胡蜂毒液的 质量。

本发明提供了一种胡蜂毒液指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：

以胡蜂毒液的水溶液为供试品溶液，以五羟色胺的水溶液为对照品溶液，将所述对照品溶液和供试品溶液分别进行高效液相色谱分析，以对照品溶液的色谱峰为基准， 得到胡蜂毒液指纹图谱；

所述高效液相色谱的色谱条件为：

流动相：流动相包括流动相A和流动相B，其中，流动相A为三氟乙酸的乙腈溶 液，所述流动相A中三氟乙酸的体积百分含量为0.05～0.2％；流动相B为三氟乙酸的 水溶液，所述流动相B中三氟乙酸的体积百分含量为0.05～0.2％；

梯度洗脱程序：0～40min，流动相A由5～6％增加至77～78％；40～58min，流动相A由77～78％增加至95％。

优选地，所述胡蜂毒液包括大胡蜂毒液、凹纹胡蜂毒液、黄腰胡蜂毒液或基胡蜂毒液。

优选地，进行所述高效液相色谱分析时采用DAD检测器，检测波长为215nm；

色谱柱为ZORBAX 300SB-C18色谱柱，规格为：长为250mm，内径为4.6mm， 填料粒径为5μm；柱温为20～35℃；

流动相的流速为0.8～1.2mL/min。

优选地，所述胡蜂毒液为大胡蜂毒液时，所述高效液相色谱的色谱条件为：

流动相：流动相A中三氟乙酸的体积百分含量为0.1％，流动相B中三氟乙酸的体积百分含量为0.1％；

梯度洗脱程序：0～40min，流动相A由5％增加至77％；40～58min，流动相A由 77％增加至95％；

柱温为25℃，流动相的流速为1mL/min；

所得胡蜂毒液指纹图谱为大胡蜂毒液指纹图谱，含有12个共有指纹峰，参照峰为五羟色胺色谱峰，12个共有指纹峰的相对保留时间分别为：1号峰0.481±0.005，2号 峰0.509±0.004，3号峰0.638±0.005，4号峰0.790±0.004，5号峰1.000±0.000，6 号峰1.791±0.010，7号峰2.594±0.016，8号峰3.824±0.029，9号峰3.976±0.029， 10号峰4.224±0.029，11号峰4.295±0.026，12号峰4.610±0.031。

优选地，所述胡蜂毒液为凹纹胡蜂毒液时，所述高效液相色谱的色谱条件为：

流动相：流动相A中三氟乙酸的体积百分含量为0.1％，流动相B中三氟乙酸的体积百分含量为0.1％；

梯度洗脱程序：0～40min，流动相A由6％增加至78％；40～58min，流动相A由 78％增加至95％；

柱温为27℃，流动相的流速为1mL/min；

所得胡蜂毒液指纹图谱为凹纹胡蜂毒液指纹图谱，含有13个共有指纹峰，参照峰为五羟色胺色谱峰，13个共有指纹峰的相对保留时间分别为：1号峰0.476±0.012，2 号峰0.643±0.005，3号峰0.788±0.009，4号峰1.000±0.000，5号峰2.370±0.064，6 号峰2.653±0.034，7号峰3.105±0.073，8号峰3.178±0.075，9号峰3.357±0.038， 10号峰3.703±0.055，11号峰3.757±0.063，12号峰4.106±0.058，13号峰4.349±0.06。

优选地，所述胡蜂毒液为黄腰胡蜂毒液时，所述高效液相色谱的色谱条件为：

流动相：流动相A中三氟乙酸的体积百分含量为0.1％，流动相B中三氟乙酸的体积百分含量为0.1％；

梯度洗脱程序：0～40min，流动相A由5％增加至77％；40～58min，流动相A由 77％增加至95％；

柱温为25℃，流动相的流速为1mL/min；

所得胡蜂毒液指纹图谱为黄腰胡蜂毒液指纹图谱，含有10个共有指纹峰，参照峰为五羟色胺色谱峰，10个共有指纹峰的相对保留时间分别为：1号峰0.493±0.008，2 号峰0.642±0.007，3号峰1.000±0.000，4号峰1.723±0.025，5号峰2.523±0.058，6 号峰2.925±0.084，7号峰3.927±0.147，8号峰4.124±0.094，9号峰4.458±0.104， 10号峰4.753±0.104。

优选地，所述胡蜂毒液为基胡蜂毒液时，所述高效液相色谱的色谱条件为：

流动相：流动相A中三氟乙酸的体积百分含量为0.1％，流动相B中三氟乙酸的体积百分含量为0.1％；

梯度洗脱程序：0～40min，流动相A由5％增加至77％；40～58min，流动相A由 77％增加至95％；

柱温为25℃，流动相的流速为1mL/min；

所得胡蜂毒液指纹图谱为基胡蜂毒液指纹图谱，含有12个共有指纹峰，参照峰为五羟色胺色谱峰，12个共有指纹峰的相对保留时间分别为：1号峰0.449±0.001，2号 峰0.810±0.026，3号峰1.000±0.000，4号峰3.111±0.021，5号峰3.478±0.011，6 号峰3.756±0.012，7号峰3.934±0.012，8号峰4.188±0.012，9号峰4.576±0.014， 10号峰4.715±0.014，11号峰4.800±0.014，12号峰5.938±0.017。

优选地，所述供试品溶液的制备方法，包括以下步骤：

将胡蜂毒液与水混合后进行超声处理，将所得超声物料经离心处理，所得上清液作为供试品溶液；所述胡蜂毒液与水的用量比为(1～15)mg：(2～80)mL。

本发明提供了上述技术方案所述胡蜂毒液指纹图谱的建立方法得到的胡蜂毒液指 纹图谱。

本发明提供了上述技术方案所述胡蜂毒液指纹图谱在胡蜂毒液质量控制中的应用。

本发明提供了一种胡蜂毒液指纹图谱的建立方法。本发明提供的方法操作简便，重复性较好、精密度较高，所得胡蜂毒液指纹图谱分离效果好，灵敏度高，能简便的 应用于胡蜂毒液的质量控制，为其质量控制提供保障，为今后的相关新药研制及开发 提供前期基础。

附图说明

图1为大胡蜂毒液与五羟色胺的HPLC对比图；

图2为大胡蜂毒液HPLC图中S峰与五羟色胺的紫外吸收曲线图；

图3为20个批次的大胡蜂毒液的HPLC指纹图谱；

图4为大胡蜂毒液指纹图谱相似度评价的共有模式对照图谱R；

图5为凹纹胡蜂毒液与五羟色胺的HPLC对比图；

图6为凹纹胡蜂毒液HPLC图中S峰与五羟色胺的紫外吸收曲线图；

图7为20个批次的凹纹胡蜂毒液的HPLC指纹图谱；

图8为凹纹胡蜂毒液指纹图谱相似度评价的共有模式对照图谱R；

图9为黄腰胡蜂毒液与五羟色胺的HPLC对比图；

图10为黄腰胡蜂毒液HPLC图中S峰与五羟色胺的紫外吸收曲线图；

图11为20个批次的黄腰胡蜂毒液的HPLC指纹图谱；

图12为黄腰胡蜂毒液指纹图谱相似度评价的共有模式对照图谱R；

图13为基胡蜂毒液与五羟色胺的HPLC对比图；

图14为基胡蜂毒液HPLC图中S峰与五羟色胺的紫外吸收曲线图；

图15为20个批次的基胡蜂毒液的HPLC指纹图谱；

图16为基胡蜂毒液指纹图谱相似度评价的共有模式对照图谱R。

具体实施方式

本发明提供了一种胡蜂毒液指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：

以胡蜂毒液的水溶液为供试品溶液，以五羟色胺的水溶液为对照品溶液，将所述对照品溶液和供试品溶液分别进行高效液相色谱分析，以对照品溶液的色谱峰为基准， 得到胡蜂毒液指纹图谱；

所述高效液相色谱的色谱条件为：

流动相：流动相包括流动相A和流动相B，其中，流动相A为三氟乙酸的乙腈溶 液，所述流动相A中三氟乙酸的体积百分含量为0.05～0.2％；流动相B为三氟乙酸的 水溶液，所述流动相B中三氟乙酸的体积百分含量为0.05～0.2％；

梯度洗脱程序：0～40min，流动相A由5～6％增加至77～78％；40～58min，流动相A由77～78％增加至95％。

在本发明中，所述胡蜂毒液优选包括大胡蜂毒液、凹纹胡蜂毒液、黄腰胡蜂毒液或基胡蜂毒液，具体是胡蜂科胡蜂属大胡蜂、凹纹胡蜂、黄腰胡蜂或基胡蜂产生的毒 液。本发明所述胡蜂毒液具体是指胡蜂粗毒原料。在本发明中，所述供试品溶液的制 备方法，优选包括以下步骤：将胡蜂毒液与水混合后进行超声处理，将所得超声物料 经离心处理，所得上清液作为供试品溶液；所述胡蜂毒液与水的用量比优选为(1～15) mg：(2～80)mL，更优选为15mg：2mL；所述水优选为超纯水。在本发明的实施例 中，具体是精密称定大胡蜂毒液置具塞锥形瓶中，加入超纯水，涡旋0.5min，混匀后 再超声处理10min，放置室温后以10000rpm转速离心10min；取上清液经0.45μm微 孔滤膜过滤，取续滤液，摇匀，作为供试品溶液备用。

在本发明中，所述对照品溶液的浓度优选为1mg/mL；在本发明的实施例中，具 体是精密称取五羟色胺，加超纯水，制成浓度为1mg/mL的对照品溶液，备用。

得到照品溶液和供试品溶液后，本发明将所述对照品溶液和供试品溶液分别进行高效液相色谱分析，以对照品溶液的色谱峰为基准，得到胡蜂毒液指纹图谱。下面针 对每种胡蜂毒液采用的高效液相色谱条件以及所得胡蜂毒液指纹图谱进行说明：

(1)所述胡蜂毒液为大胡蜂毒液时，所述高效液相色谱的色谱条件为：

流动相：流动相包括流动相A和流动相B，其中，流动相A为三氟乙酸的乙腈溶 液，所述流动相A中三氟乙酸的体积百分含量为0.1％；流动相B为三氟乙酸的水溶液， 所述流动相B中三氟乙酸的体积百分含量为0.1％；

梯度洗脱程序：0～40min，流动相A由5％增加至77％；40～58min，流动相A由 77％增加至95％；流动相的流速为1mL/min；

采用DAD检测器，检测波长为215nm；进样量为5μL；色谱柱：ZORBAX 300SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)，柱温为25℃；

所得胡蜂毒液指纹图谱为大胡蜂毒液指纹图谱，含有12个共有指纹峰，参照峰为五羟色胺色谱峰，12个共有指纹峰的相对保留时间分别为：1号峰0.481±0.005，2号 峰0.509±0.004，3号峰0.638±0.005，4号峰0.790±0.004，5号峰1.000±0.000，6 号峰1.791±0.010，7号峰2.594±0.016，8号峰3.824±0.029，9号峰3.976±0.029， 10号峰4.224±0.029，11号峰4.295±0.026，12号峰4.610±0.031。

(2)所述胡蜂毒液为凹纹胡蜂毒液时，所述高效液相色谱的色谱条件为：

流动相：流动相包括流动相A和流动相B，其中，流动相A为三氟乙酸的乙腈溶 液，所述流动相A中三氟乙酸的体积百分含量为0.1％；流动相B为三氟乙酸的水溶液， 所述流动相B中三氟乙酸的体积百分含量为0.1％；

梯度洗脱程序：0～40min，流动相A由6％增加至78％；40～58min，流动相A由 78％增加至95％；流动相的流速为1mL/min；

采用DAD检测器，检测波长为215nm；进样量为5μL；色谱柱：ZORBAX 300SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)，柱温为27℃；

所得胡蜂毒液指纹图谱为凹纹胡蜂毒液指纹图谱，含有13个共有指纹峰，参照峰为五羟色胺色谱峰，13个共有指纹峰的相对保留时间分别为：1号峰0.476±0.012，2 号峰0.643±0.005，3号峰0.788±0.009，4号峰1.000±0.000，5号峰2.370±0.064，6 号峰2.653±0.034，7号峰3.105±0.073，8号峰3.178±0.075，9号峰3.357±0.038， 10号峰3.703±0.055，11号峰3.757±0.063，12号峰4.106±0.058，13号峰4.349±0.06。

(3)所述胡蜂毒液为黄腰胡蜂毒液时，所述高效液相色谱的色谱条件为：

流动相：流动相包括流动相A和流动相B，其中，流动相A为三氟乙酸的乙腈溶 液，所述流动相A中三氟乙酸的体积百分含量为0.1％；流动相B为三氟乙酸的水溶液， 所述流动相B中三氟乙酸的体积百分含量为0.1％；

梯度洗脱程序：0～40min，流动相A由5％增加至77％；40～58min，流动相A由 77％增加至95％；流动相的流速为1mL/min；

采用DAD检测器，检测波长为215nm；进样量为5μL；色谱柱：ZORBAX 300SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)，柱温为25℃；

所得胡蜂毒液指纹图谱为黄腰胡蜂毒液指纹图谱，含有10个共有指纹峰，参照峰为五羟色胺色谱峰，10个共有指纹峰的相对保留时间分别为：1号峰0.493±0.008，2 号峰0.642±0.007，3号峰1.000±0.000，4号峰1.723±0.025，5号峰2.523±0.058，6 号峰2.925±0.084，7号峰3.927±0.147，8号峰4.124±0.094，9号峰4.458±0.104， 10号峰4.753±0.104。

(4)所述胡蜂毒液为基胡蜂毒液时，所述高效液相色谱的色谱条件为：

流动相：流动相包括流动相A和流动相B，其中，流动相A为三氟乙酸的乙腈溶 液，所述流动相A中三氟乙酸的体积百分含量为0.1％；流动相B为三氟乙酸的水溶液， 所述流动相B中三氟乙酸的体积百分含量为0.1％；

梯度洗脱程序：0～40min，流动相A由5％增加至77％；40～58min，流动相A由 77％增加至95％；流动相的流速为1mL/min；

采用DAD检测器，检测波长为215nm；进样量为5μL；色谱柱：ZORBAX 300SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)，柱温为25℃；

所得胡蜂毒液指纹图谱为基胡蜂毒液指纹图谱，含有12个共有指纹峰，参照峰为五羟色胺色谱峰，12个共有指纹峰的相对保留时间分别为：1号峰0.449±0.001，2号 峰0.810±0.026，3(S)号峰1.000±0.000，4号峰3.111±0.021，5号峰3.478±0.011， 6号峰3.756±0.012，7号峰3.934±0.012，8号峰4.188±0.012，9号峰4.576±0.014， 10号峰4.715±0.014，11号峰4.800±0.014，12号峰5.938±0.017。

本发明提供了采用上述技术方案所述胡蜂毒液指纹图谱的建立方法得到的胡蜂毒 液指纹图谱。

本发明提供了上述技术方案所述胡蜂毒液指纹图谱在胡蜂毒液质量控制中的应用。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发 明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1、大胡蜂毒液指纹图谱的方法建立

(1)仪器及试剂

高效液相色谱仪：美国Agilent1260液相色谱仪系统，配备在线脱气机、四元梯度泵、DAD检测器、自动进样器、柱温箱；色谱柱：ZORBAX 300SB-C18(4.6mm×250 mm，5μm)；

五羟色胺(标准品)，三氟乙酸(色谱纯)，乙腈(色谱纯)，自制超纯水。

(2)高效液相色谱的色谱条件

流动相：流动相包括流动相A和流动相B，其中，流动相A为三氟乙酸的乙腈溶 液，所述流动相A中三氟乙酸的体积百分含量为0.1％；流动相B为三氟乙酸的水溶液， 所述流动相B中三氟乙酸的体积百分含量为0.1％；

梯度洗脱程序：0～40min，流动相A由5％增加至77％；40～58min，流动相A由 77％增加至95％；流动相的流速为1mL/min；

进样量为5μL，柱温为25℃，检测波长为215nm；理论板数按五羟色胺计算不低 于2000。

(3)供试品溶液的制备

精密称定大胡蜂毒液15mg，置具塞锥形瓶中，加入超纯水2mL，涡旋0.5min， 混匀后再超声处理10min，放置室温后以10000rpm转速离心10min；取上清液经0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，摇匀备用。

(4)对照品溶液的制备

精密称取五羟色胺，加超纯水，制成浓度为1mg/mL的对照品溶液，备用。

(5)参照物的确定

通过对比供试品溶液与对照品溶液的HPLC色谱图，可知供试品溶液中的S峰与 五羟色胺保留时间相同(如图1所示)；利用DAD检测器对其图谱分别进行扫描，结 果显示，供试品溶液中S峰与五羟色胺的紫外吸收图谱相同，进一步确定供试品溶液 的HPLC图谱中的S峰为五羟色胺(如图2所示)。由于供试品溶液中的五羟色胺峰 面积较大，出峰位置合理，且保留时间的重现性良好，故选择五羟色胺作为大胡蜂毒 液的参照峰(S)。

2、方法学考察

(1)精密度试验

取大胡蜂毒液依照“1、大胡蜂毒液指纹图谱的方法建立”中方法制备供试品溶液并进行高效液相色谱分析，连续进样6次(S1、S2、S3、S4、S5、S6)，以五羟色胺 峰(峰S)为参照峰，分别对共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积进行考察，结果 见表1和表2。由表1和表2可知，各共有指纹峰的相对保留时间的RSD均<1.0％，相 对峰面积的RSD均<13％，表明仪器精密度良好。

表1精密度试验相对保留时间(n＝6)

表2精密度试验相对保留峰面积(n＝6)

(2)重复性试验

取大胡蜂毒液6份，分别依照“1、大胡蜂毒液指纹图谱的方法建立”中方法制备 供试品溶液并进行高效液相色谱分析(R1、R2、R3、R4、R5、R6)，以五羟色胺峰 (峰S)为参照峰，分别对共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积进行考察，结果见 表3和表4。由表3和表4可知，各共有指纹峰的相对保留时间的RSD均<2.00％，相 对峰面积的RSD均<17.00％，说明本发明方法重复性好。

表3重复性试验相对保留时间(n＝6)

表4重复性试验相对峰面积(n＝6)

(3)稳定性试验

随机取“精密度试验”中的供试品溶液1份，分别于0、2、4、10、12、16h依照“1、 大胡蜂毒液指纹图谱的方法建立”中方法进行高效液相色谱分析，以五羟色胺峰(峰S) 为参照峰，分别对共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积进行考察，结果见表5和 表6。由表5和表6可知，各共有指纹峰的相对保留时间的RSD均<1.00％，相对峰面 积的RSD均<27.00％，表明供试品溶液在16h内基本稳定。

表5稳定性试验相对保留时间(n＝6)

表6稳定性试验相对峰面积(n＝6)

3、20批大胡蜂毒液指纹图谱的建立及数据分析

取分布于云南省、广西省、贵州省等7个不同产地、不同年份的20批大胡蜂毒液(S1～S20)，依照“1、大胡蜂毒液指纹图谱的方法建立”中方法制备供试品溶液并进 行高效液相色谱分析，得20批样品的高效液相色谱图。

采用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012.130723版)软件导入20批大胡蜂毒液的高效液相色谱图数据，将5号峰(五羟色胺)作为参 照峰，确定了12个共有峰。样品色谱峰经多点校正，以中位数法生成对照指纹图谱， 时间窗宽度为0.5，参数设定后进行色谱峰自动匹配，建立对照指纹图谱，其中，20批 大胡蜂毒液的指纹图谱见图3，指纹图谱共有模式对照图谱见图4。

对各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积进行计算，结果见表7和表8。由表7可知，各共有指纹峰相对保留时间的RSD均＜1.00％，说明本发明所建立的大胡蜂毒 液指纹图谱的12个共有指纹峰非常吻合，在不同产地、不同时间采收的大胡蜂毒液的 指纹图谱特征峰高度一致；由表8可知，各共有指纹相对峰面积的RSD均较大，说明 不同产地的大胡蜂毒液各成分含量有差异。

表7 20批大胡蜂毒液样品相对保留时间(n＝20)

表8 20批大胡蜂毒液样品相对峰面积(n＝20)

4、20批大胡蜂毒液指纹图谱相似性评价

取分布于云南省、广西省、贵州省等7个不同产地、不同年份的20批大胡蜂毒液(S1～S20)，依照“1、大胡蜂毒液指纹图谱的方法建立”中方法制备供试品溶液并进 行高效液相色谱分析，得20批样品的高效液相色谱图；采用中国药典委员会推荐的计 算机辅助相似度评价软件(中南大学中药现代化研究中心编制)计算，相似度见表9。 由表9可知，20批大胡蜂毒液样品与对照图谱相似度在0.986～0.999之间，均大于0.950， 表明药材质量相对稳定。

表9 20批大胡蜂毒液样品指纹图谱相似度评价结果

实施例2

1、凹纹胡蜂毒液指纹图谱的方法建立

(1)仪器及试剂：同实施例1。

(2)高效液相色谱的色谱条件：梯度洗脱：0～40min，6％A～78％A；40～58min，78％A～95％A；柱温27℃；其余条件同实施例1。

(3)供试品溶液的制备：精密称定凹纹胡蜂毒液15mg，按照实施例1的方法制 备供试品溶液。

(4)对照品溶液的制备：按照实施例1的方法制备对照品溶液。

(5)参照物的确定

通过对比供试品溶液与对照品溶液的HPLC色谱图，可知供试品溶液中的S峰与 五羟色胺保留时间相同(如图5所示)；利用DAD检测器对其图谱分别进行扫描，结 果显示，供试品溶液中S峰与五羟色胺的紫外吸收图谱相同，进一步确定供试品溶液 的HPLC图谱中的S峰为五羟色胺(如图6所示)。由于供试品溶液中的五羟色胺峰 面积较大，出峰位置合理，且保留时间的重现性良好，故选择五羟色胺作为凹纹胡蜂 毒液的参照峰(S)。

2、方法学考察

(1)精密度试验

取凹纹胡蜂毒液依照“1、凹纹胡蜂毒液指纹图谱的方法建立”中方法制备供试品溶液并进行高效液相色谱分析，连续进样6次(S1、S2、S3、S4、S5、S6)，以五羟 色胺峰(峰S)为参照峰，分别对共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积进行考察， 结果见表10和表11。由表10和表11可知，各共有指纹峰的相对保留时间的RSD均 <1.0％，相对峰面积的RSD均<5％，表明仪器精密度良好。

表10精密度试验相对保留时间(n＝6)

表11精密度试验相对保留峰面积(n＝6)

(2)重复性试验

取凹纹胡蜂毒液6份，分别依照“1、凹纹胡蜂毒液指纹图谱的方法建立”中方法制备供试品溶液并进行高效液相色谱分析(R1、R2、R3、R4、R5、R6)，以五羟色胺 峰(峰S)为参照峰，分别对共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积进行考察，结果 见表12和表13。由表12和表13可知，各共有指纹峰的相对保留时间的RSD均<1.00％， 相对峰面积的RSD均<5.00％，说明本发明方法重复性好。

表12重复性试验相对保留时间(n＝6)

表13重复性试验相对峰面积(n＝6)

(3)稳定性试验

随机取“精密度试验”中的供试品溶液1份，分别于0、2、4、6、8、12h依照“1、 凹纹胡蜂毒液指纹图谱的方法建立”中方法进行高效液相色谱分析，以五羟色胺峰(峰 S)为参照峰，分别对共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积进行考察，结果见表14 和表15。由表14和表15可知，各共有指纹峰的相对保留时间的RSD均<2.00％，相对 峰面积的RSD均<5.00％，表明供试品溶液在12h内基本稳定。

表14稳定性试验相对保留时间(n＝6)

表15稳定性试验相对峰面积(n＝6)

3、20批凹纹胡蜂毒液指纹图谱的建立及数据分析

取分布于云南省、广西省、贵州省等7个不同产地、不同年份的20批凹纹胡蜂毒 液(S1～S20)，依照“1、凹纹胡蜂毒液指纹图谱的方法建立”中方法制备供试品溶液 并进行高效液相色谱分析，得20批样品的高效液相色谱图。

采用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012.130723版)软件导入20批凹纹胡蜂毒液的高效液相色谱图数据，将4号峰(五羟色胺)作为 参照峰，确定了13个共有峰。样品色谱峰经多点校正，以中位数法生成对照指纹图谱， 时间窗宽度为0.5，参数设定后进行色谱峰自动匹配，建立对照指纹图谱，其中，20批 凹纹胡蜂毒液的指纹图谱见图7，指纹图谱共有模式对照图谱见图8。

对各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积进行计算，结果见表16和表17。由表16可知，各共有指纹峰相对保留时间的RSD均＜3.00％，说明本发明所建立的凹纹 胡蜂毒液指纹图谱的13个共有指纹峰非常吻合，在不同产地、不同时间采收的凹纹胡 蜂毒液的指纹图谱特征峰高度一致；由表17可知，各共有指纹相对峰面积的RSD均 较大，说明不同产地的凹纹胡蜂毒液各成分含量有差异。

表16 20批凹纹胡蜂毒液样品相对保留时间(n＝20)

表17 20批凹纹胡蜂毒液样品相对峰面积(n＝20)

4、20批凹纹胡蜂毒液指纹图谱相似性评价

取分布于云南省、广西省、贵州省等7个不同产地、不同年份的20批凹纹胡蜂毒 液(S1～S20)，依照“1、凹纹胡蜂毒液指纹图谱的方法建立”中方法制备供试品溶液 并进行高效液相色谱分析，得20批样品的高效液相色谱图；采用中国药典委员会推荐 的计算机辅助相似度评价软件(中南大学中药现代化研究中心编制)计算，相似度见 表18。由表18可知，20批凹纹胡蜂毒液样品与对照图谱相似度在0.957～1.000之间， 均大于0.950，表明药材质量相对稳定。

表18 20批样品指纹图谱相似度评价结果

实施例3

1、黄腰胡蜂毒液指纹图谱的方法建立

(1)仪器及试剂：同实施例1。

(2)高效液相色谱的色谱条件：同实施例1。

(3)供试品溶液的制备：精密称定黄腰胡蜂毒液15mg，按照实施例1的方法制 备供试品溶液。

(4)对照品溶液的制备：按照实施例1的方法制备对照品溶液。

(5)参照物的确定

通过对比供试品溶液与对照品溶液的HPLC色谱图，可知供试品溶液中的S峰与 五羟色胺保留时间相同(如图9所示)；利用DAD检测器对其图谱分别进行扫描，结 果显示，供试品溶液中S峰与五羟色胺的紫外吸收图谱相同，进一步确定供试品溶液 的HPLC图谱中的S峰为五羟色胺(如图10所示)。由于供试品溶液中的五羟色胺峰 面积较大，出峰位置合理，且保留时间的重现性良好，故选择五羟色胺作为黄腰胡蜂 毒液的参照峰(S)。

2、方法学考察

(1)精密度试验

取黄腰胡蜂毒液依照“1、黄腰胡蜂毒液指纹图谱的方法建立”中方法制备供试品溶液并进行高效液相色谱分析，连续进样6次(S1、S2、S3、S4、S5、S6)，以五羟 色胺峰(峰S)为参照峰，分别对共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积进行考察， 结果见表19和表20。由表19和表20可知，各共有指纹峰的相对保留时间的RSD均 <3.0％，相对峰面积的RSD均<5％，表明仪器精密度良好。

表19精密度试验相对保留时间(n＝6)

表20精密度试验相对保留峰面积(n＝6)

(2)重复性试验

取黄腰胡蜂毒液6份，分别依照“1、黄腰胡蜂毒液指纹图谱的方法建立”中方法制备供试品溶液并进行高效液相色谱分析(R1、R2、R3、R4、R5、R6)，以五羟色胺 峰(峰S)为参照峰，分别对共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积进行考察，结果 见表21和表22。由表21和表22可知，各共有指纹峰的相对保留时间的RSD均<5.00％， 虽然相对峰面积的RSD差异较大，但相对保留时间的重复性好，说明本发明方法重复 性在可接受范围内。

表21重复性试验相对保留时间(n＝6)

表22重复性试验相对峰面积(n＝6)

(3)稳定性试验

随机取“精密度试验”中的供试品溶液1份，分别于0、2、4、6、8、12h依照“1、 黄腰胡蜂毒液指纹图谱的方法建立”中方法进行高效液相色谱分析，以五羟色胺峰(峰 S)为参照峰，分别对共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积进行考察，结果见表23 和表24。由表23和表24可知，各共有指纹峰的相对保留时间的RSD均<3.00％，相对 峰面积的RSD均<6.00％，表明供试品溶液在12h内基本稳定。

表23稳定性试验相对保留时间(n＝6)

表24稳定性试验相对峰面积(n＝6)

3、20批黄腰纹胡蜂毒液指纹图谱的建立及数据分析

取分布于云南省、广西省、贵州省等7个不同产地、不同年份的20批黄腰胡蜂毒 液(S1～S20)，依照“1、黄腰胡蜂毒液指纹图谱的方法建立”中方法制备供试品溶液 并进行高效液相色谱分析，得20批样品的高效液相色谱图。

采用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012.130723版)软件导入20批黄腰胡蜂毒液的高效液相色谱图数据，将3号峰(五羟色胺)作为 参照峰，确定了10个共有峰。样品色谱峰经多点校正，以中位数法生成对照指纹图谱， 时间窗宽度为0.5，参数设定后进行色谱峰自动匹配，建立对照指纹图谱，其中，20批 黄腰胡蜂毒液的指纹图谱见图11，指纹图谱共有模式对照图谱见图12。

对各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积进行计算，结果见表25和表26。由表25可知，各共有指纹峰相对保留时间的RSD均<3.00％，说明本发明所建立的黄腰 胡蜂毒液指纹图谱的10个共有指纹峰非常吻合，在不同产地、不同时间采收的黄腰胡 蜂毒液的指纹图谱特征峰高度一致；由表26可知，各共有指纹相对峰面积的RSD均 较大，说明不同产地的黄腰胡蜂毒液各成分含量有差异。

表25 20批黄腰胡蜂毒液样品相对保留时间(n＝20)

表26 20批黄腰胡蜂毒液样品相对峰面积(n＝20)

4、20批黄腰胡蜂毒液指纹图谱相似性评价

取分布于云南省、广西省、贵州省等7个不同产地、不同年份的20批黄腰胡蜂毒 液(S1～S20)，依照“1、黄腰胡蜂毒液指纹图谱的方法建立”中方法制备供试品溶液 并进行高效液相色谱分析，得20批样品的高效液相色谱图；采用中国药典委员会推荐 的计算机辅助相似度评价软件(中南大学中药现代化研究中心编制)计算，相似度见 表27。由表27可知，20批黄腰胡蜂毒液样品与对照图谱相似度在0.989～0.999之间， 均大于0.950，表明药材质量相对稳定。

表27 20批样品指纹图谱相似度评价结果

实施例4

1、基胡蜂毒液指纹图谱的方法建立

(1)仪器及试剂：同实施例1。

(2)高效液相色谱的色谱条件：同实施例1。

(3)供试品溶液的制备：精密称定基胡蜂毒液15mg，按照实施例1的方法制备 供试品溶液。

(4)对照品溶液的制备：按照实施例1的方法制备对照品溶液。

(5)参照物的确定

通过对比供试品溶液与对照品溶液的HPLC色谱图，可知供试品溶液中的S峰与 五羟色胺保留时间相同(如图13所示)；利用DAD检测器对其图谱分别进行扫描， 结果显示，供试品溶液中S峰与五羟色胺的紫外吸收图谱相同，进一步确定供试品溶 液的HPLC图谱中的S峰为五羟色胺(如图14所示)。由于供试品溶液中的五羟色胺 峰面积较大，出峰位置合理，且保留时间的重现性良好，故选择五羟色胺作为基胡蜂 毒液的参照峰(S)。

2、方法学考察

(1)精密度试验

取基胡蜂毒液依照“1、基胡蜂毒液指纹图谱的方法建立”中方法制备供试品溶液并进行高效液相色谱分析，连续进样6次(S1、S2、S3、S4、S5、S6)，以五羟色胺 峰(峰S)为参照峰，分别对共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积进行考察，结果 见表28和表29。由表28和表29可知，各共有指纹峰的相对保留时间的RSD均<1.0％， 相对峰面积的RSD均<3％，表明仪器精密度良好。

表28精密度试验相对保留时间(n＝6)

表29精密度试验相对保留峰面积(n＝6)

(2)重复性试验

取基胡蜂毒液6份，分别依照“1、基胡蜂毒液指纹图谱的方法建立”中方法制备供试品溶液并进行高效液相色谱分析(R1、R2、R3、R4、R5、R6)，以五羟色胺峰(峰 S)为参照峰，分别对共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积进行考察，结果见表30 和表31。由表30和表31可知，各共有指纹峰的相对保留时间的RSD均<1.00％，相对 峰面积的RSD均<5.00％，表明本发明方法重复性良好。

表30重复性试验相对保留时间(n＝6)

表31重复性试验相对峰面积(n＝6)

(3)稳定性试验

随机取“精密度试验”中的供试品溶液1份，分别于0、2、4、6、8、12h依照“1、 基胡蜂毒液指纹图谱的方法建立”中方法进行高效液相色谱分析，以五羟色胺峰(峰S) 为参照峰，分别对共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积进行考察，结果见表32和 表33。由表32和表33可知，各共有指纹峰的相对保留时间的RSD均<1.00％，相对峰 面积的RSD均<6.00％，表明供试品溶液在12h内基本稳定。

表32稳定性试验相对保留时间(n＝6)

表33稳定性试验相对峰面积(n＝6)

3、20批基纹胡蜂毒液指纹图谱的建立及数据分析

取分布于云南省、广西省、贵州省等7个不同产地、不同年份的20批基胡蜂毒液(S1～S20)，依照“1、基胡蜂毒液指纹图谱的方法建立”中方法制备供试品溶液并进 行高效液相色谱分析，得20批样品的高效液相色谱图。

采用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012.130723版)软件导入20批基胡蜂毒液的高效液相色谱图数据，将3号峰(五羟色胺)作为参 照峰，确定了12个共有峰。样品色谱峰经多点校正，以中位数法生成对照指纹图谱， 时间窗宽度为0.5，参数设定后进行色谱峰自动匹配，建立对照指纹图谱，其中，20批 基胡蜂毒液的指纹图谱见图15，指纹图谱共有模式对照图谱见图16。

对各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积进行计算，结果见表34和表35。由表34可知，各共有指纹峰相对保留时间的RSD均<5.00％，说明本发明所建立的基胡 蜂毒液指纹图谱的10个共有指纹峰非常吻合，在不同产地、不同时间采收的基胡蜂毒 液的指纹图谱特征峰高度一致；由表35可知，各共有指纹相对峰面积的RSD均较大， 说明不同产地的基胡蜂毒液各成分含量有差异。

表34 20批基胡蜂毒液样品相对保留时间(n＝20)

表35 20批基胡蜂毒液样品相对峰面积(n＝20)

4、20批基胡蜂毒液指纹图谱相似性评价

取布于云南省、广西省、贵州省等7个不同产地、不同年份的20批基胡蜂毒液 (S1～S20)，依照“1、基胡蜂毒液指纹图谱的方法建立”中方法制备供试品溶液并进 行高效液相色谱分析，得20批样品的高效液相色谱图；采用中国药典委员会推荐的计 算机辅助相似度评价软件(中南大学中药现代化研究中心编制)计算，相似度见表36。 由表36可知，20批基胡蜂毒液样品与对照图谱相似度在0.985～1.000之间，均大于 0.950，表明药材质量相对稳定。

表36 20批样品指纹图谱相似度评价结果

从以上实施例可以看出，本发明提供的方法操作简便，准确可靠，检测时间合理，能真实的反应胡蜂毒液所含特征物质，从而也可作为测定胡蜂毒液中化学组分的方法， 并可对胡蜂毒液进行鉴别真伪和质量控制，能全面、准确地评价胡蜂毒液的质量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润 饰也应视为本发明的保护范围。