一种同时检测甲胎蛋白和癌胚抗原的试剂盒

摘要

本发明公开了一种同时检测甲胎蛋白和癌胚抗原的试剂盒。该试剂盒在时间分辨荧光免疫分析基础上结合高灵敏度的电感耦合等离子体质谱检测技术，可在一个循环中同时完成AFP和CEA两项指标的检测，缩短了临床获得AFP和CEA检测结果的时间，大大降低了检测成本。此外，采用稀土元素进行标记，ICP‑MS检测时不受标记物光学、电化学等特性的影响，使得检测结果更加稳定可靠。本发明可以同时检测两种具有重要临床价值的肿瘤标志物，能较好的用于肝癌的确诊、分型、观察疗效和预后的判断及监测复发。本发明具有重要的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种同时检测甲胎蛋白和癌胚抗原的试剂盒。

背景技术

肝癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，其早期症状不明显，就诊时往往处于肝癌晚期进而错过最佳治疗时期，因此提高早期肝癌患者的检出率显得尤为重要。由于肝癌起病较为隐匿，超声等方式在肝癌的临床诊断中应用十分有限。与之相比，血清学检测具有灵敏度高、检测时间短和检测结果可靠等优点，在肿瘤临床诊断中逐渐得到广泛应用。在肿瘤发生发展过程中众多基因和蛋白的表达发生异常，因此寻找到与肿瘤发生发展密切相关的标志物分子并将其应用于肿瘤的诊断和治疗中具有重要的临床意义。

甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein，AFP)属于白蛋白家族，一般只在胎儿体内产生，在成年人体内含量极低。临床研究发现，肝癌细胞可合成AFP，因此原发性肝癌和转移性肝癌均可检测出AFP的含量升高；检测其在血液中的含量，可以提高肝癌诊断灵敏度。

癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen，CEA)是一种膜蛋白，在正常人体中含量极低，广泛存在于的消化系统恶性肿瘤中，在胃癌、大肠癌、肝癌、胰腺癌、直肠癌等消化道肿瘤中表达量异常升高，临床上常应用于消化道肿瘤的辅助性临床诊断指标，与肿瘤细胞的增殖、细胞周期进程和肿瘤局部炎症反应密切相关。

以抗原-抗体为基础的标记免疫分析是实现AFP和CEA定量检测的最常用方法。目前的免疫分析技术中，无论是最早的放射免疫分析(RIA)还是后来逐渐发展起来的非放射性免疫分析方法(如酶联免疫分析(ELISA)和化学发光免疫分析(CLIA))，每次只能检测一种疾病标志物。如果需要检测多种疾病标志物，要将血清样品分别加入多个小孔，进行反应和检测，工作繁琐，费时费力，无法实现多指标的同时检测分析。因此，建立一种高通量、低成本的多指标免疫检测方法显的尤为重要。

发明内容

本发明的目的是高效且低成本的同时检测甲胎蛋白和癌胚抗原的含量。

本发明首先保护同时检测甲胎蛋白和癌胚抗原的试剂盒。

本发明所保护的同时检测甲胎蛋白和癌胚抗原的试剂盒，具体可为试剂盒甲，可包括名称为单克隆抗体A1的抗AFP单克隆抗体、名称为单克隆抗体A2的抗CEA单克隆抗体、名称为单克隆抗体B1的抗AFP单克隆抗体、名称为单克隆抗体B2的抗CEA单克隆抗体、磁珠、稀土元素C1和稀土元素C2；

所述单克隆抗体A1和所述单克隆抗体B1为不同的抗AFP单克隆抗体；

所述单克隆抗体A2和所述单克隆抗体B2为不同的抗CEA单克隆抗体；

所述稀土元素C1和稀土元素C2为不同的两种稀土元素。

所述试剂盒甲具体可由所述单克隆抗体A1、所述单克隆抗体A2、所述单克隆抗体B1、所述单克隆抗体B2、磁珠、稀土元素C1和稀土元素C2组成。

本发明所保护的同时检测甲胎蛋白和癌胚抗原的试剂盒，具体可为试剂盒乙，可包括名称为单克隆抗体A1的抗AFP单克隆抗体包被的磁珠、名称为单克隆抗体A2的抗CEA单克隆抗体包被的磁珠、稀土元素C1标记的名称为单克隆抗体B1的抗AFP单克隆抗体、稀土元素C2标记的名称为单克隆抗体B2的抗CEA单克隆抗体；

所述单克隆抗体A1和所述单克隆抗体B1为不同的抗AFP单克隆抗体；

所述单克隆抗体A2和所述单克隆抗体B2为不同的抗CEA单克隆抗体；

所述稀土元素C1和稀土元素C2为不同的两种稀土元素。

所述试剂盒乙具体可由所述单克隆抗体A1包被的磁珠、所述单克隆抗体A2包被的磁珠、稀土元素C1标记的所述单克隆抗体B1、稀土元素C2标记的所述单克隆抗体B2组成。

上述任一所述试剂盒还可包括复合校准品溶液；

所述复合校准品溶液由标准品稀释液、AFP和CEA组成；

标准品稀释液的溶剂为水，溶质及其浓度为6.0-6.2g/L(如6.0-6.05g/L、6.05-6.2g/L、6.0g/L、6.05g/L或6.2g/L)tris、8.0-10.0g/L(如8.0-9.0g/L、9.0-10.0g/L、8.0g/L、9.0g/L或10.0g/L)氯化钠、1.0-3.0g/L(如1.0-2.0g/L、2.0-3.0g/L、1.0g/L、2.0g/L或3.0g/L)保护蛋白；pH值为7.7-7.9(如7.7-7.8、7.8-7.9、7.7、7.8或7.9)。

所述保护蛋白可为牛血清白蛋白、酪蛋白、动物血清中的一种或任意两种的混合。保护蛋白可以提供良好的稳定反应环境，使抗原/抗体保持天然构象。

上述任一所述试剂盒还可包括免疫清洗液和/或解离液。

所述解离液的溶剂可为1％(v/v)稀硝酸水溶液；所述解离液的溶质及其浓度可为0.8-1.2ng/mL内标元素。铼为电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)的内标元素。

所述免疫清洗液的溶剂可为水，溶质及其浓度可为6.0-6.2g/L(如6.0-6.05g/L、6.05-6.2g/L、6.0g/L、6.05g/L或6.2g/L)tris、8.0-10.0g/L(如8.0-9.0g/L、9.0-10.0g/L、8.0g/L、9.0g/L或10.0g/L)氯化钠、400-600μL/L(如400-500μL/L、500-600μL/L、400μL/L、500μL/L或600μL/L)吐温20；pH值可为7.7-7.9(如7.7-7.8、7.8-7.9、7.7、7.8或7.9)。

本发明还保护B1)或B2)。

B1)上述任一所述试剂盒在制备同时检测待测样本中甲胎蛋白和癌胚抗原的产品中的应用。

B2)上述任一所述试剂盒在制备用于筛查肝癌的产品中的应用。

本发明还保护A1)或A2)。

A1)名称为单克隆抗体A1的抗AFP单克隆抗体、名称为单克隆抗体A2的抗CEA单克隆抗体、名称为单克隆抗体B1的抗AFP单克隆抗体、名称为单克隆抗体B2的抗CEA单克隆抗体、磁珠、稀土元素C1和稀土元素C2在制备用于筛查肝癌的产品或制备同时检测待测样本中甲胎蛋白和癌胚抗原的产品中的应用。

A2)名称为单克隆抗体A1的抗AFP单克隆抗体包被的磁珠、名称为单克隆抗体A2的抗CEA单克隆抗体包被的磁珠、稀土元素C1标记的名称为单克隆抗体B1的抗AFP单克隆抗体、稀土元素C2标记的名称为单克隆抗体B2的抗CEA单克隆抗体在制备用于筛查肝癌的产品或制备同时检测待测样本中甲胎蛋白和癌胚抗原的产品中的应用。

本发明还保护一种同时检测待测样本中甲胎蛋白和癌胚抗原含量的方法，可包括步骤(a)、步骤(b)和步骤(c)：

所述步骤(a)包括如下步骤：

(a-1)将名称为单克隆抗体A1的抗AFP单克隆抗体包被的磁珠、名称为单克隆抗体A2的抗CEA单克隆抗体包被的磁珠、稀土元素C1标记的名称为单克隆抗体B1的抗AFP单克隆抗体、稀土元素C2标记的名称为单克隆抗体B2的抗CEA单克隆抗体和待测样本混合，孵育；

(a-2)完成步骤(a-1)后，用所述免疫清洗液洗涤；

(a-3)完成步骤(a-2)后，加入所述解离液，采用电感耦合等离子体质谱检测解离后的上清液中稀土元素C1、稀土元素C2和内标元素的响应值——相应离子每秒计数值；

所述步骤(b)包括如下步骤：

(b-1)将名称为单克隆抗体A1的抗AFP单克隆抗体包被的磁珠、名称为单克隆抗体A2的抗CEA单克隆抗体包被的磁珠、稀土元素C1标记的名称为单克隆抗体B1的抗AFP单克隆抗体、稀土元素C2标记的名称为单克隆抗体B2的抗CEA单克隆抗体和所述复合校准品溶液混合，孵育；

(b-2)完成步骤(b-1)后，用所述免疫清洗液洗涤；

(b-3)完成步骤(b-2)后，加入所述解离液，采用电感耦合等离子体质谱检测解离后的上清液中稀土元素C1、稀土元素C2和内标元素的响应值——相应离子每秒计数值；

所述步骤(c)：根据所述复合校准品溶液中AFP的浓度和相应的稀土元素C1与内标元素的响应值比值绘制AFP标准曲线，将所述步骤(a-3)得到稀土元素C1与内标元素的响应值比值代入所述AFP标准曲线，得到待测样本中AFP的含量；

根据所述复合校准品溶液中CEA的浓度和相应的稀土元素C2与内标元素的响应值比值绘制CEA标准曲线，将所述步骤(a-3)得到稀土元素C2与内标元素的响应值比值代入所述CEA标准曲线，得到待测样本中CEA的含量；

所述方法用于非疾病的诊断和治疗。

上述方法中，所述孵育可为37℃孵育20min。

上述方法中，所述用所述免疫清洗液洗涤可为加入免疫清洗液，洗涤3次以上。

上述任一所述单克隆抗体A1的抗AFP单克隆抗体包被的磁珠是将生物素修饰的单克隆抗体A1与链霉亲和素修饰的磁珠通过生物素-链霉亲和素偶联反应得到的。

上述任一所述单克隆抗体A2的抗CEA单克隆抗体包被的磁珠是将生物素修饰的单克隆抗体A2与链霉亲和素修饰的磁珠通过生物素-链霉亲和素偶联反应得到的。

上述任一所述生物素修饰的单克隆抗体A1是通过NHS活性基团活化的生物素与所述单克隆抗体A1上的NH

上述任一所述生物素修饰的单克隆抗体A2是通过NHS活性基团活化的生物素与所述单克隆抗体A2上的NH

上述任一所述稀土元素C1标记的单克隆抗体B1是稀土元素C1-金属螯合物与所述单克隆抗体B1反应得到的。

上述任一所述稀土元素C2标记的单克隆抗体B2是稀土元素C2-金属螯合物和所述单克隆抗体B2反应得到的。

上述任一所述稀土元素C1可为钐。

上述任一所述稀土元素C2可为铕。

上述任一所述金属螯合物可为DTTA。

上述任一所述内标元素可为铼。

上述任一所述单克隆抗体A1的抗AFP单克隆抗体包被的磁珠具体可为AFP2AFP-28抗体包被的磁珠。

上述任一所述单克隆抗体A2的抗CEA单克隆抗体包被的磁珠具体可为CEA CEA-100抗体包被的磁珠。

上述任一所述稀土元素C1标记的单克隆抗体B1具体可为Sm标记的AFP 2AFP-27抗体。

上述任一所述稀土元素C2标记的单克隆抗体B2具体可为Eu标记的CEA 3CEA-23抗体。

AFP 2AFP-28抗体具体为菲鹏生物股份有限公司的编号为2AFP-28的AFP抗体。

CEA CEA-100抗体具体为菲鹏生物股份有限公司的编号为CEA-100的CEA抗体。

AFP 2AFP-27抗体具体为菲鹏生物股份有限公司的编号为2AFP-27的AFP抗体。

CEA 3CEA-23抗体具体为菲鹏生物股份有限公司的编号为3CEA-23的CEA抗体。

AFP 2AFP-28抗体包被的磁珠、CEA CEA-100抗体包被的磁珠、Sm标记的AFP 2AFP-27抗体和Eu标记的CEA 3CEA-23抗体的制备方法具体见实施例。

上述任一所述待测样本可为离体的血清。

上述任一所述肝癌可为原发性肝癌和/或转移性肝癌。

本发明提供的试剂盒在时间分辨荧光免疫分析基础上结合高灵敏度的电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)检测技术，可在一个循环中同时完成AFP和CEA两项指标的检测，缩短了临床获得AFP和CEA检测结果的时间，大大降低了检测成本。此外，采用稀土元素进行标记，ICP-MS检测时不受标记物光学、电化学等特性的影响，使得检测结果更加稳定可靠。本发明可以同时检测两种具有重要临床价值的肿瘤标志物，能较好的用于肝癌的确诊、分型、观察疗效和预后的判断及监测复发。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为实施例2绘制的AFP标准曲线。

图2为实施例2绘制的CEA标准曲线。

图3为实施例4采用AFP的血清比对试验结果示意图。

图4为实施例4采用CEA的血清比对试验结果示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中各原材料的选择标准及购买来源如下：

抗AFP单克隆抗体和抗CEA单克隆抗体：通过对外观、浓度、纯度、效价进行验证，选取无色透明澄清液体、无肉眼可见异物、无摇不散的沉淀的抗体；通过紫外吸收法检测抗体的蛋白质含量，选择蛋白质含量不低于4mg/mL的抗体。具体的，选择菲鹏生物股份有限公司的编号为2AFP-28的AFP抗体(简称为AFP 2AFP-28抗体)作为包被用抗AFP单克隆抗体，菲鹏生物股份有限公司的编号为CEA-100的CEA抗体(简称为CEA CEA-100抗体)作为包被用抗CEA单克隆抗体，菲鹏生物股份有限公司的编号为2AFP-27的AFP抗体(简称为AFP 2AFP-27抗体)作为稀土元素标记用抗AFP单克隆抗体，菲鹏生物股份有限公司的编号为3CEA-23的CEA抗体(简称为CEA 3CEA-23抗体)作为稀土元素标记用抗CEA单克隆抗体。

甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)抗原纯品均为菲鹏生物股份有限公司的产品。

磁珠：通过对磁珠的外观、粒径均一性、吸附一致性等方面进行分析，经多次分析研究，选取形貌规整、粒径均一、吸附一致性CV≤8％的磁珠。具体的，选用链霉亲和素修饰的磁珠，其为苏州海狸生物医学工程有限公司的产品。

稀土元素-金属螯合剂：通过对Sm-DTTA和Eu-DTTA的外观、纯度等方面进行分析，选择呈澄清透明液体、无杂质、无颗粒状的Sm-DTTA和Eu-DTTA。具体的，选用的Sm-DTTA和Eu-DTTA为PE公司的产品。

电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)检测用内标元素Re标准品：通过对内标元素铼(Re)标准品的外观、浓度、纯度进行验证，选择无色透明澄清液体、无肉眼可见异物、无摇不散的沉淀的Re标准品。具体的，选用的Re标准品为国家标准物质中心的Re标准品。

实施例1、同时检测甲胎蛋白和癌胚抗原的试剂盒的制备

一、AFP 2AFP-28抗体包被的磁珠和CEA CEA-100抗体包被的磁珠的制备

1、生物素修饰抗体的制备

(1)称取一定量的NHS活性基团活化的生物素溶于DMSO有机溶剂，配成浓度为10mM生物素母液备用。

(2)取1mg抗体用碳酸盐溶液稀释，得到浓度2mg/mL抗体溶液。

(3)向0.01MPBS缓冲液(pH7.4)中加入抗体溶液和生物素母液，混匀，得到混合液。混合液中，抗体和生物素的反应摩尔比为1:20。之后，常温反应30min，使得NHS活性基团活化的生物素与抗体上的NH

(3)生物素修饰的抗体用层析纯化系统进行分类、纯化，通过紫外检测器监测蛋白质的峰，得到纯化的生物素修饰的抗体。

AFP 2AFP-28抗体和CEA CEA-100抗体按照上述步骤分别标记生物素，得到纯化的生物素修饰的AFP 2AFP-28抗体和生物素修饰的CEA CEA-100抗体。

2、生物素-链霉亲和素偶联反应

(1)用移液器移取100uL链霉亲和素修饰的磁珠到离心管中，利用磁性分离器进行磁珠分离，用移液器吸去上清液，从磁性分离器上取下离心管。

(2)向上述离心管中加入1mL0.01MPBS缓冲液(pH7.4)，再加入20μL步骤1制备的生物素修饰抗体，充分震荡重悬磁珠；将上述离心管置于旋转混合仪上，室温旋转混合60min；磁性分离，吸走上清液，用免疫清洗液(制备方法见下文)清洗磁珠3次，得到抗体包被的磁珠。抗体包被的磁珠悬浮于Tris-HCl缓冲液中，4℃保存。

生物素修饰的AFP2AFP-28抗体和生物素修饰的CEACEA-100抗体按照上述步骤分别与链霉亲和素修饰的磁珠进行生物素-链霉亲和素偶联反应，依次得到AFP抗体包被的磁珠和CEA抗体包被的磁珠。

3、采用棋盘法分别确定AFP抗体包被的磁珠和CEA抗体包被的磁珠的最佳工作浓度为0.5mg/mL。之后用标准品稀释液(制备方法见下文)分别稀释AFP抗体包被的磁珠和CEA抗体包被的磁珠，得到浓度为0.5mg/mL的AFP2AFP-28抗体包被的磁珠(以下简称AFP 2AFP-28抗体包被的磁珠)和浓度为0.5mg/mL的CEA CEA-100抗体包被的磁珠(以下简称CEA CEA-100抗体包被的磁珠)，置于2-8℃保存。

二、Sm标记的AFP 2AFP-27抗体和Eu标记的CEA 3CEA-23抗体的制备

1、向0.1M碳酸盐缓冲液(pH9.6)中加入Sm-DTTA螯合物探针和AFP 2AFP-27抗体，混匀，得到混合液。混合液中，Sm-DTTA螯合物探针和AFP 2AFP-27抗体的摩尔比为30：1。之后，25℃反应20h，得到稀土元素Sm标记的AFP 2AFP-27抗体。

2、将稀土元素Sm标记的AFP 2AFP-27抗体用层析色谱纯化，通过紫外检测器监测蛋白质的峰，得到纯化的稀土元素Sm标记的AFP 2AFP-27抗体。冷冻干燥后-20℃保存。

按照上述步骤，将Sm-DTTA螯合物探针替换为Eu-DTTA，AFP 2AFP-27抗体替换为CEA 3CEA-23抗体，其他步骤均不变，得到纯化的稀土元素稀Eu标记的CEA 3CEA-23抗体。冷冻干燥后-20℃保存。

3、采用棋盘法分别确定稀土元素Sm标记的AFP 2AFP-27抗体和稀土元素稀Eu标记的CEA 3CEA-23抗体的最佳工作浓度为1μg/mL。之后用标准品稀释液(制备方法见下文)分别稀释稀土元素Sm标记的AFP 2AFP-27抗体和稀土元素稀Eu标记的CEA3CEA-23抗体，得到浓度为1μg/mL的Sm标记的AFP 2AFP-27抗体(以下简称Sm标记的AFP 2AFP-27抗体)和浓度为1μg/mL的Eu标记的CEA 3CEA-23抗体(以下简称Eu标记的CEA 3CEA-23抗体)，置于2-8℃保存。

三、AFP和CEA复合校准品溶液的制备

1、标准品稀释液的制备

(1)称取三羟甲基氨基甲烷(tris)6.05g、氯化钠9g于1L的容器中，加入800ml去离子水中充分搅拌使其完全溶解；

(2)用塑料滴管加盐酸溶液至上述1L容器中，调节pH值为7.8；

(3)称取牛血清白蛋白2g，加入上述1L容器中，搅拌均匀，使其充分溶解；

(4)用去离子水定容至1L，得到标准品稀释液。

标准品稀释液于2-8℃无菌环境下储存。

2、AFP和CEA复合校准品溶液的制备

(1)用标准品稀释液稀释AFP抗原纯品，得到AFP溶液；

(2)用标准品稀释液稀释CEA抗原纯品，得到CEA溶液；

(3)将AFP溶液和CEA溶液混合，得到AFP和CEA复合校准品溶液A、B、C、D、E、F，各个AFP和CEA复合校准品溶液中，AFP和CEA的浓度见表1。

表1.AFP和CEA复合校准品溶液中AFP和CEA的浓度

四、解离液和免疫清洗液的制备

1、解离液的制备

(1)用超纯水将高纯度的浓硝酸稀释为1％(v/v)稀硝酸水溶液；

(2)向1％(v/v)稀硝酸水溶液中加入铼(Re)标准品，得到Re浓度为1ng/mL的溶液；该溶液即为解离液。

2、免疫清洗液的制备

(1)称取三羟甲基氨基甲烷(tris)6.05g，氯化钠9g于1L的容器中，加入800ml去离子水中充分搅拌使其完全溶解；

(2)用塑料滴管加盐酸溶液至上述1L容器中，调节pH值为7.8；

(3)移取吐温20液体500μL，加入上述1L容器中，搅拌均匀，使其充分溶解；

(4)用去离子水定容至1L，用0.2μm滤器过滤，得到免疫清洗液。

免疫清洗液于2-8℃无菌环境下储存。

五、同时检测甲胎蛋白和癌胚抗原的试剂盒的制备

同时检测甲胎蛋白和癌胚抗原的试剂盒由AFP 2AFP-28抗体包被的磁珠、CEACEA-100抗体包被的磁珠、Sm标记的AFP 2AFP-27抗体、Eu标记的CEA 3CEA-23抗体、AFP和CEA复合校准品溶液、解离液和免疫清洗液组成。

实施例2、采用实施例1制备的试剂盒同时检测待测样本中甲胎蛋白和癌胚抗原的浓度

一、绘制AFP标准曲线和CEA标准曲线

1、将50μL AFP 2AFP-28抗体包被的磁珠、50μL CEA CEA-100抗体包被的磁珠、50μL Sm标记的AFP 2AFP-27抗体、50μL Eu标记的CEA 3CEA-23抗体和50μL AFP和CEA复合校准品溶液(A、B、C、D、E或F)混合，之后加入96孔板的孔中，37℃孵育20min。

2、完成步骤1后，每孔加入200μL免疫清洗液；自动洗板机洗涤3次。

3、完成步骤2后，每孔加入100μL解离液，1min后将解离液的上清液导入到电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)中进行检测，采集稀土元素Sm、稀土元素Eu和内标元素Re的响应值—相应离子每秒计数值(cps)。

以AFP和CEA复合校准品溶液中AFP的浓度为横坐标，稀土元素Sm与内标元素Re的响应值比值为纵坐标，绘制AFP标准曲线。AFP标准曲线见图1。

以AFP和CEA复合校准品溶液中CEA的浓度为横坐标，稀土元素Eu与内标元素Re的响应值比值为纵坐标，绘制CEA标准曲线。CEA标准曲线见图2。

二、同时检测待测样本中甲胎蛋白和癌胚抗原的含量

1、将50μL AFP 2AFP-28抗体包被的磁珠、50μL CEA CEA-100抗体包被的磁珠、50μL Sm标记的AFP 2AFP-27抗体、50μL Eu标记的CEA 3CEA-23抗体和20μL待测样本混合，之后加入96孔板的孔中，37℃孵育20min。

2、完成步骤1后，每孔加入200μL免疫清洗液；自动洗板机洗涤3次。

3、完成步骤2后，每孔加入100μL解离液，1min后将解离液的上清液导入到电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)中进行检测，采集稀土元素Sm、稀土元素Eu和内标元素Re的响应值——相应离子每秒计数值(cps)。

4、计算稀土元素Sm与内标元素Re的响应值比值和稀土元素Eu与内标元素Re的响应值比值。根据AFP标准曲线和CEA标准曲线，计算获得待测样本中AFP和CEA的浓度。

实施例3、实施例1制备的试剂盒同时检测甲胎蛋白和癌胚抗原的性能

一、最低检出限

以AFP和CEA复合校准品溶液A作为待测样本，按照实施例2的方法进行检测。重复检测20次，得出20次检测结果的响应值-相应离子每秒计数值(cps)，计算平均值(M)和标准偏差(SD)，得出M+2SD。

以AFP和CEA复合校准品溶液B作为待测样本，按照实施例2的方法进行检测。重复检测3次取平均值，得到响应值-相应离子每秒计数值(cps)。

根据AFP和CEA复合校准品溶液A和AFP和CEA复合校准品溶液B之间的浓度-cps结果进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD的cps带入上述方程中，求出对应的AFP和CEA浓度值，即为最低检出限。

检测结果如表2所示。

表2

二、准确度

将AFP和CEA复合校准品溶液E(以下简称A液)加入血清样本(以下简称B液)，得到待测样本。待测样本中，A液的体积不超过总体积(A液+B液)的10％。

按照实施例2的方法检测待测样品。重复检测3次取平均值，根据如下公式计算回收率：

其中，R为回收率，V为加入A液的体积，V

检测结果如表2所示。

三、线性

将接近线性范围上限的高值样本按一定比例稀释分为至少5个浓度，其中最低浓度样本应接近线性区间的下限。每个浓度梯度样本按照实施例2的方法重复检测3次，取平均值，获得每个浓度梯度样本中AFP和CEA的检测浓度。

将测定浓度的平均值与理论浓度用最小二乘法进行直线拟合，分别计算AFP或CEA对应的线性相关系数r。

检测结果如表2所示。

四、批内精密度

以AFP和CEA复合校准品溶液B或AFP和CEA复合校准品溶液E作为待测样本，用实施例1制备的同一个试剂盒按照实施例2的方法进行检测。重复测定10次，计算10次测量结果的平均值M和标准差SD。

根据如下公式计算变异系数CV：

CV＝SD/M×100％；

其中CV为变异系数，SD为检测结果的标准差，M为检测结果的平均值。

检测结果如表2所示。

五、批间精密度

以AFP和CEA复合校准品溶液B或AFP和CEA复合校准品溶液E作为待测样本，用实施例1制备的三个不同批次的试剂盒按照实施例2的方法进行检测。分别重复测定10次，计算同一浓度30次测量结果的平均值(M)和标准差(SD)。

根据如下公式计算变异系数CV：

CV＝SD/M×100％；

其中CV为变异系数，SD为检测结果的标准差，M为检测结果的平均值。

检测结果如表2所示。

上述结果表明，采用实施例1制备的试剂盒同时检测甲胎蛋白和癌胚抗原的性能优良。

实施例4、实施例1制备的试剂盒的临床应用

本实施例中的100份人血清样本采自301医院检验科。血清样本的提供者均知情同意。

1、按照实施例2的方法分别检测100份人血清样本中AFP和CEA的浓度。

2、采用电化学发光试剂盒(罗氏公司的产品)分别检测100份人血清样本中AFP和CEA的浓度。

3、将步骤1和步骤2的结果采用最小二乘法进行拟合分析对比。

AFP的血清比对试验结果见图3(化学发光方法为采用电化学发光试剂盒的检测结果)，其拟合相关性r为0.9958。

CEA的血清比对试验结果见图4(化学发光方法为采用电化学发光试剂盒的检测结果)，其拟合相关性r为0.9925。

由此可见，本发明制备的试剂盒与电化学发光试剂盒(罗氏公司的产品)具有良好的相关性，即本发明试剂盒可以准确的同时检测AFP和CEA浓度。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。