抗体定向标记多聚生物素的方法

摘要

本发明提供了一种抗体定向标记多聚生物素的方法，包括：利用生物素或其衍生物上的羧基与载体的表面的氨基反应，反应结束后去除游离的生物素，然后加入冻干保护剂进行冷冻干燥处理得到生物素多聚体；利用氧化剂将抗体的Fc段糖链上的邻羟基氧化为醛基，封闭剂封闭反应后，去除非蛋白物质，浓缩，得到醛基化抗体；使用复溶剂将冷冻干燥保存的生物素多聚体溶解，然后加入醛基化抗体进行交联反应一段时间，加入稳定剂，得到生物素化抗体。本发明的方法通用性强，适用范围广，获得的生物素化抗体亲和力强、特异性高、信号放大能力强。

说明书

技术领域

本申请涉及生物技术领域，具体地，涉及一种抗体定向标记多聚生物素的方法。

背景技术

抗体(antibody)是指机体由于抗原的刺激而产生的具有保护作用的蛋白质，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的蛋白质。Ig可形成“Y”字型结构，称为Ig单体，是构成抗体的基本单位。抗体根据其结构组成可分为IgA、IgG、IgD、IgE、IgM等不同不亚型，每种亚型的抗体在体内的作用及含量均有所不同。

抗体的整体结构可分为以下三部分：第一，重链和轻链：天然Ig分子含有四条异源性多肽链，其中，分子量较大的两条链称为重链(heavy chain，H)，而分子量较小的两条链称为轻链(Light chain，L)。第二，可变区(Fab)和恒定区(Fc)：Ig轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，简写为Fab段；靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constant region，C)，简写为Fc段。第三，铰链区：铰链区(hinge region)位于CH1与CH2之间，铰链区两条重链靠二硫键连接，组成抗体的二价(多价)结构。

抗体目前广泛应用于医药、诊断等多个领域，根据其应用场景及目的的不同，需对天然抗体进行进一步的修饰或与其他物质进行偶联。在诊断试剂领域，根据抗原抗体特异性反应用于不同待检物质的检测。抗体与相应标志物、载体的偶联技术是诊断试剂能够得以开发应用的基础。其应用场景可分为以下几类：一、抗体与酶(碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等)偶联，制备酶标抗体，用于诊断试剂信号物质的发光。二、抗体与载体偶联，包括磁微粒、乳胶微球等载体。三、抗体与小分子物质偶联，如荧光素、生物素、多肽类物质等。

生物素－亲和素系统(Biotin-Avidin—System，BAS)是70年代末发展起来的一种新型生物反应放大系统。目前，BAS广泛应用于医学各领域，生物素—亲和素系统几乎可与目前研究成功的各种标记物结合。生物素与亲和素之间高亲合力的牢固结合以及多级放大效应，使BAS免疫标记和有关示踪分析更加灵敏。它已成为目前广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术。

发明内容

针对现有技术的缺陷与不足，本发明主要目的包含两个方面：第一，实现抗体定向标记生物素；第二，提升生物素化抗体信号放大能力。本发明提供的方案无需破坏抗体天然结构，无需进行重组构建序列，利用天然抗体Fc段多糖链，人工合成生物素多聚体，即可实现抗体定向标记生物素。该方法通用性强，适用范围广，获得的生物素化抗体亲和力强、特异性高、信号放大能力强。

本发明提供了一种抗体定向标记多聚生物素的方法，包括：利用生物素或其衍生物上的羧基与载体的表面的氨基反应，反应结束后去除游离的生物素，然后加入冻干保护剂进行冷冻干燥处理得到生物素多聚体；利用氧化剂将抗体的Fc段糖链上的邻羟基氧化为醛基，封闭剂封闭反应后，去除非蛋白物质，浓缩，得到醛基化抗体；使用复溶剂将冷冻干燥保存的生物素多聚体溶解，然后加入醛基化抗体进行交联反应一段时间，加入稳定剂，得到生物素化抗体。

在上述方法中，其中，所述生物素或其衍生物为N-羟基琥珀酰亚胺酯。

在上述方法中，其中，所述载体为富含伯氨基的大分子化合物。

在上述方法中，其中，所述载体为牛血清白蛋白(BSA)。

在上述方法中，其中，所述氧化剂为高碘酸钠。

在上述方法中，其中，所用抗体包括Fc段含有多糖链的不同亚型、不同种属的单克隆或多克隆抗体。

在上述方法中，其中，所述冻干保护剂为质量百分比为0.2％-3％的蔗糖、海藻糖、葡萄糖中的一种或几种。

在上述方法中，其中，所述封闭剂为乙二醇。

在上述方法中，其中，所述复溶剂为碱性碳酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液。

在上述方法中，其中，所述稳定剂为硼氢化钠。

本发明建立的抗体定向标记生物素信号放大技术，能够实现常用抗体定向标记生物素技术，通用性强。该技术同时包含定向标记技术和多聚体信号放大技术，解决现有技术制备生物素化抗体存在的问题。根据本发明制备的生物素化抗体，由于生物素多聚体的聚集效应，能够起到信号放大作用。在用于诊断试剂包被时，在达到同样信号值时抗体用量仅为现有技术的1/2，大大提升了抗体的亲和力，同时减少抗体用量能够最为直观的减少产品成本。另外，根据本发明制备的生物素化抗体，与对照组相比，对于低值样本的检出率、检测结果相关性都有明显提升，说明该工艺制备的生物素化抗体灵敏度、特异性均优于现有工艺。对于产品整体性能的提升，起到重要作用。

附图说明

图1示出了对照组的浓度值与信号值的关系。

图2示出了本发明的实验组的浓度值与信号值的关系。

图3示出了实验组与参比试剂的相关性。

图4示出了对照组与参比试剂的相关性。

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本申请，但不以任何方式限制本申请。

随着生物素衍生物种类越来越丰富，抗体的生物素化技术日益成熟。常用技术为是利用生物素表面的羧基与抗体表面氨基直接偶联，这种方法的优势是操作简便，标记效率高。根据抗体的结构、特性所建立的定向标记技术已广泛应用于各大领域。利用生物素及其衍生物与抗体表面氨基酸残基直接反应实现抗体生物素化，虽然技术成熟，操作简单，但其弊端是无法实现抗体定向标记。如果生物素与抗体活性区域(Fab)氨基酸残基结合，会削弱抗体亲和力与特异性。另外，破坏抗体二价体空间结构、合成线性六肽、ProteinA/G、金属螯合等方法均有其局限性，利用抗体Fc段糖链实现抗体的定向标记具有通用性，但生物素与抗体偶联比较低，导致生物素化抗体信号放大能力差。

本发明提供了一种抗体定向标记多聚生物素信号放大方法，具体方案如下：

生物素多聚体的制备

利用生物素或其衍生物上的羧基与载体表面的氨基反应，反应结束后分子筛层析去除游离生物素，然后在溶液中加入冻干保护剂进行冷冻干燥处理得到生物素多聚体。

本发明所述所用生物素为商品化生物素衍生物：N-羟基琥珀酰亚胺酯，溶解在中性磷酸盐缓冲液与载体反应。本发明所用的载体为富含伯氨基大分子化合物，例如，牛血清白蛋白(BSA)、多聚赖氨酸、高分子氨基化合物及其它大分子物质。

本发明所述载体为生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯与牛血清白蛋白(BSA)反应摩尔比为10:1-20:1；反应时间为1h-1.5h；反应温度为室温反应。冷冻干燥时的冻干保护剂为在溶液中加入0.2％-3％的蔗糖、海藻糖、葡萄糖中的任意一种或几种，优选为1％。

醛基化抗体的制备

利用高碘酸钠(可以是将多糖链邻羟基氧化为醛基的其他氧化剂)将抗体Fc段糖链上的邻羟基氧化为醛基，封闭剂封闭反应后，分子筛层析去除非蛋白物质，浓缩后备用。本发明所用抗体为鼠源性单克隆抗体，但是本发明不限于此，还包含其它Fc段含有多糖链的单克隆、多克隆抗体。在一些实施例中，高碘酸钠与抗体反应摩尔比为30:1，室温反应时间为15min。在一些实施例中，所用封闭剂为乙二醇，其用量与高碘酸钠的摩尔比为2:1，反应时间为15min。

在一些实施例中，本发明的浓缩方式可为超滤、中空纤维方式中的一种或几种。

抗体生物素化

在进行抗体生物素化标记时，使用复溶剂将冷冻干燥保存的生物素多聚体溶解，然后加入醛基化抗体进行交联反应一段时间，加入稳定剂，得到生物素化抗体。生物素化抗体在保存液中透析，置换缓冲液后备用。本发明所述复溶剂为碱性碳酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液。本发明所述醛基化抗体与生物素多聚体反应摩尔比为1:1，反应温度为室温，反应时间为1.5h，交联反应结束后加入稳定剂。本发明所述稳定剂为硼氢化钠，稳定剂用量与抗体摩尔比为100:1。本发明所述保存缓冲液为中性磷酸盐缓冲液。应该理解，以上溶液或材料仅是示例性的，而不用于限制。

本发明所述置换缓冲液方式为透析或中空纤维洗滤中的一种或几种。

下面描述具体的实验过程以更好地理解本发明。

一、材料与方法

1.材料

1.1试剂

生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯、乙二醇、高碘酸钠购自sigma公司；海藻糖、蔗糖购自国药；分子筛凝胶购自GE公司；单克隆抗体购自Hytest公司；亲和素磁珠购自thermo公司；

1.2仪器

冷冻干燥剂购自上海东富龙；

2.方法

2.1生物素多聚体制备

1)用中性磷酸盐缓冲液将牛血清白蛋白(BSA)和生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS-Bio)溶解为1mg/ml。

2)BSA和NHS-Bio摩尔比按照1:10，室温反应30min。

3)G25分子筛过滤，去除游离NHS-Bio。

4)生物素化BSA溶液中，加入1％蔗糖在冷冻干燥剂中冷冻干燥保存。

2.2抗体醛基化

1)高碘酸钠用酸性柠檬酸缓冲液溶解为1mg/ml

2)按照高碘酸钠与抗体摩尔比为30:1的量加入到抗体溶液中，室温反应15min。

3)按照乙二醇与高碘酸钠摩尔比为1:1的量，加入相应的乙二醇，室温反应15min。

4)G25分子筛凝胶层析，去除非蛋白类物质，收集醛基化抗体备用，浓缩备用。

2.3抗体生物素化

1)用pH为8.5的硼酸复溶剂将生物素多聚体溶解为1mg/ml。

2)按照抗体与生物素化多聚体摩尔比为1:1的量，将醛基化抗体加入到生物素多聚体溶液中，室温反应1h。

3)稳定剂硼氢化钠用水溶解为浓度1mg/ml，按照稳定剂用量与抗体摩尔比为100:1加入相应的稳定剂，室温反应30min。

4)反应结束后，在中性磷酸盐缓冲液中透析过夜，期间换液2-3次即可。

三、实验结果

对照组生物素化抗体为现有通用技术，将生物素单体直接与抗体偶联反应，进行非定向标记，得到生物素化抗体。

实验组为通过本发明专利制备的生物素化抗体。

3.1亲和力

按照单样本测试抗体用量为0.15ug，将亲和素磁珠和生物素化抗体进行反应，去除游离未结合的生物素化抗体，测定相同梯度样本，结果如下表1和图1与图2所示：

表1

由表1、图1和图2可知，在同等投料情况下，实验组反应性约为对照组的2倍，说明实验组生物素化抗体亲和力更强，理论上在达到同等反应性的情况下，实验组可节约一倍以上的抗体用量。从梯度样本相关系数来说，实验组也更有优势，有助于线性范围的提升。

3.2空白限

空白限在一定程度反应检测体系的背景噪音，检测体系背景噪音越小，空白限越低，对于低值样本的检测越有优势。计算公式按照空白限＝M+2SD进行计算；M-平均值；SD为标准差；

进行空白限检测时，首先以梯度样本为准，调整实验组、对照组信号值，以两组反应性信号值偏差不超过10％为准，作为各组最终包被浓度。然后检测待检抗原量为0的空白样本，每组检测20次，然后进行结果分析，如下表2所示。

表2

由表2可知，实验组空白信号值低于对照组，说明采用本发明制备的生物素化抗体能够减少反应体系的非特异吸附，提升反应体系的灵敏度。

3.3相关性

分别用对照组和实验组，测定梯度阳性样本，计算各组检测结果与阳性样本标准值的相关性，结果如下表3、图3和图4所示。

表3

由表3、图3和图4可知，与阳性样本标准值的相关性，实验组优于对照组。另外，对照组出现一例漏检样本，而该样本在实验组中仍可检出，说明通过本发明制备的生物素化抗体对于抗体本身的特异性、灵敏度影响较小，有利于产品性能的提升。

本领域技术人员应理解，以上实施例仅是示例性实施例，在不背离本申请的精神和范围的情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。