一种包覆细胞膜的还原响应型碳点载药纳米团簇及其制备和应用

摘要

本发明涉及一种包覆细胞膜的还原响应型碳点载药纳米团簇及其制备和应用。该制备方法包括：荧光碳点制备，还原响应型碳点纳米团簇溶液制备，负载阿霉素的碳点纳米团簇制备，B16细胞膜悬液制备，包覆细胞膜的还原响应型碳点载药纳米团簇制备。该方法工艺简单，反应条件简单，易于操作分离，具有良好的发展前景；制备的包覆细胞膜的还原响应型碳点载药纳米团簇通过尾静脉注射进入小鼠体内后，具有显著的抗肿瘤效果，具有潜在临床应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于响应型纳米药物载体及其制备和应用领域，特别涉及一种包覆细胞膜的还原响应型碳点载药纳米团簇及其制备方法和应用。

背景技术

目前，癌症已成为威胁人类生存与健康的主要因素。对于中晚期癌症，化疗是最主要、最有效的治疗手段，但传统化疗在杀死癌细胞的同时对正常组织和器官造成了强烈的毒副作用。临床使用的化疗药物，如：阿霉素、紫杉醇等，由于水溶性差、代谢快等局限性大大降低了其疗效。因此，通过纳米材料负载化疗药物构建的纳米平台可向肿瘤部位靶向递送药物，并实现肿瘤微环境响应性释放药物，降低对正常组织的毒副作用，提高化疗疗效。在众多纳米材料中，碳点由于其荧光特性及可作为药物载体而备受青睐。

碳点是一类尺寸小于10nm的新型碳纳米材料，具有生物相容性好、水溶性好、稳定性好、高度荧光可调性等特点，因此在荧光成像方面具有很好的应用前景，已有文献将制备出的碳点用于脑胶质瘤的精准荧光成像(Min Qian,et al.ACS Appl.Mater.Interfaces,2018,10,4031-4040)。由于碳点表面有多种官能团，例如带负电的羧基、羟基等，因此可与表面带有正电荷的化疗药物(例如阿霉素等)通过非共价作用相互结合，作为药物载体用于肿瘤的化疗。本课题组之前的文献报道(Dan Li,et al.J.Mater.Chem.B,2019,7(2),277-285)，将第五代树状大分子与负载有阿霉素的碳点相结合，构建了杂化纳米平台用于克服多药耐药性化疗的研究。大多数纳米粒子在进入体内后只能停留在血管周围而无法进入到肿瘤中心区域，渗透性较差，这极大地限制了纳米药物的治疗效果。单分散的碳点尺寸较小，易在肿瘤组织中扩散，可促进负载的药物向肿瘤内部渗透，但其由于尺寸小而导致EPR效应较弱，且容易通过肾脏代谢而被迅速清除。因此，设计一种尺寸合适的团簇型碳点，在到达肿瘤微环境后能够响应解离，进而提高药物在肿瘤部位的释放量和渗透性非常关键。

近年来，生物仿生技术，尤其是细胞膜仿生伪装的纳米载体，由于其优异的生物相容性、低免疫原性，可有效避免单核巨噬细胞系统以及网状内皮系统对纳米载体的捕获清除，增加载体的体内循环时间，便于载体在肿瘤部位富集。恶性肿瘤细胞膜，基于肿瘤细胞的体外易培养性，便于收集大量肿瘤细胞，将细胞DNA等细胞器去除后，失去了致癌性，收集到的癌细胞膜可用于仿生伪装纳米载体。由于癌细胞膜表面存在免疫逃避蛋白和同源靶向蛋白，基于癌细胞膜包裹的纳米载体可以避免免疫清除并具备主动靶向至肿瘤部位的能力，从而实现对肿瘤的靶向治疗。例如Xie等制备了肿瘤细胞膜包裹的二氧化硅纳米颗粒用于靶向递送药物至肿瘤部位，以实现更好的抗肿瘤效果(Wei Xie,et al.ACS Nano,2019,13,2849-2857)。

检索国内外文献和专利，尚未发现关于包覆细胞膜的还原响应型碳点载药纳米团簇的制备，以及通过非共价作用负载阿霉素(DOX)用于生物体内肿瘤化疗的相关报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种包覆细胞膜的还原响应型碳点载药纳米团簇及其制备方法和应用，以克服现有技术中碳点载药治疗肿瘤效果不佳的缺陷。

本发明提供一种包覆细胞膜的还原响应型碳点载药纳米团簇，所述载药纳米团簇是将荧光碳点通过交联剂交联形成碳点纳米团簇，然后负载阿霉素，并进一步包覆黑色素瘤细胞膜得到。

所述荧光碳点是将4-氨基水杨酸悬浊液进行水热反应，离心、过滤，冷冻干燥得到。

本发明还提供一种包覆细胞膜的还原响应型碳点载药纳米团簇的制备方法，包括：

(1)将4-氨基水杨酸溶于超纯水中形成悬浊液，然后水热反应，冷却，离心、过滤，冷冻干燥，得到荧光碳点y-CDs(黄绿色)，其中4-氨基水杨酸与超纯水的比例为0.2g:8-15mL；

(2)将步骤(1)中y-CDs溶于超纯水中，加入EDC和NHS活化(活化羧基)，然后加入交联剂，搅拌反应，透析，得到还原响应型碳点纳米团簇y-CDs NCs溶液，其中交联剂与y-CDs的质量比为1-1.2：1-1.2；

(3)将盐酸阿霉素DOX

(4)将细胞裂解液加入到B16细胞沉淀中，反复冻融破碎，梯度离心提取B16细胞膜(CCM，cancer cell membrane)，重悬于PBS溶液中得到B16细胞膜悬液；

(5)将步骤(3)中y-CDs NCs/DOX与步骤(4)中B16细胞膜悬液混合，反复挤压，离心去除上清，得到包覆细胞膜的还原响应型碳点载药纳米团簇y-CDs NCs/DOX@CCM，其中y-CDs NCs/DOX与细胞膜悬液的比例为200μg：0.4-0.6mL。

所述步骤(1)中水热反应温度为170-190℃，水热反应时间为2-4h。

所述步骤(1)中过滤采用220nm孔径的微孔滤膜。

所述步骤(1)中离心转速为4000rpm，离心时间为20min。

所述步骤(2)中y-CDs、EDC、NHS和交联剂的质量比为1-1.2:5.5-6.5:3-4:1-1.2。

所述步骤(2)中交联剂为胱胺二盐酸盐Cystamine。

所述步骤(2)中搅拌反应温度为室温，搅拌反应时间为2-4天。

所述步骤(2)中加入EDC和NHS活化为：先加入EDC搅拌反应0.5h，再加入NHS，搅拌反应3h。

所述步骤(2)中透析为：选取截留分子量为500的透析袋，透析溶液为水溶液，体积为2L，24h内换水3次。

所述步骤(3)中溶剂为甲醇。

所述步骤(3)中搅拌温度为室温，搅拌时间为过夜。

所述步骤(4)中B16细胞与细胞裂解液的比例为1×10

所述步骤(4)中细胞裂解液含1％苯甲基磺酰氯PMSF。

所述步骤(4)中反复冻融破碎工艺参数为：-20℃冷冻，37℃融化，反复3次。

所述步骤(4)中梯度离心为：温度为4℃，先以700g离心力离心10min，去沉淀，再以14000g离心力离心30min，去上清，将沉淀重悬于1mL PBS溶液。

所述步骤(5)中反复挤压是使用滤膜孔径为400nm的Avanti微型挤出器反复挤压11次。

所述步骤(5)中离心转速为10000rpm，离心时间为6min。

本发明还提供一种包覆细胞膜的还原响应型碳点载药纳米团簇在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明通过水热法合成了黄绿色荧光碳点y-CDs，并使用胱胺二盐酸盐作为交联剂将碳点纳米颗粒交联成碳点纳米团簇y-CDs NCs。通过控制交联剂与碳点纳米颗粒的投料比，可以制得尺寸合适，结构稳定的碳点纳米团簇。通过非共价作用在碳点纳米团簇的内部空腔及表面负载化疗药物阿霉素DOX，同时通过物理挤压的方式在材料表面包覆B16细胞膜，制得y-CDs NCs/DOX@CCM。

本发明使用Zeta电势及动态光散射分析(DLS)、红外光谱(FT-IR)、紫外可见吸收光谱(UV-vis)、稳态/瞬态荧光光谱、透射电子显微镜(TEM)、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)等手段表征制备的包覆细胞膜的碳点载药纳米团簇的物理及化学性质。然后利用CCK-8法评价y-CDs NCs/DOX@CCM及相关对照材料的细胞毒性，测定其免疫逃避及同源靶向能力，同时测定其体外细胞荧光成像性能，利用流式细胞术检测细胞对材料的吞噬情况。最后建立裸鼠皮下肿瘤模型进行抗肿瘤实验。具体测试结果如下：

1.Zeta电势及水动力学直径测试结果

取合成的y-CDs、y-CDs NCs/DOX、y-CDs NCs/DOX@CCM各1mg，用超纯水稀释至50μg/mL，同时取50μL的y-CDs NCs溶于950μL的超纯水，用于测定表面电势和水动力学直径以及多分散性指数，结果如表1所示，y-CDs的电势为-26.9mV，将y-CDs交联制得的y-CDs NCs电势变为-4.5mV，水合粒径增加至236.7nm，电势及水合粒径的增加证明了y-CDs NCs的成功合成。当y-CDs NCs负载化疗药物DOX后，电势由负变正，上升至8.8mV，证明了DOX的成功负载。通过物理挤压包覆B16细胞膜得到的y-CDs NCs/DOX@CCM，电势为-11.7mV，水合粒径增加至254.8nm，证明了y-CDs NCs/DOX表面细胞膜的成功包覆。y-CDs NCs/DOX@CCM在各种溶液(水、生理盐水、1640培养基)中的水动力学直径几乎不变(如图2)，证明了y-CDs NCs/DOX@CCM具有良好的胶体稳定性。

2.红外(FT-IR)测试：

本发明通过FT-IR测试对制备的y-CDs、y-CDs NCs进行表征，如图3所示，曲线1代表y-CDs NCs，曲线2代表y-CDs。曲线2中3438cm

3.紫外(UV-vis)测试：

本发明通过UV-vis测试对制备出的y-CDs、y-CDs NCs、y-CDs NCs/DOX进行表征，如图4所示，y-CDs在282nm处存在特征峰，而y-CDs NCs/DOX在490nm处出现的特征峰证明了DOX的成功负载。

4.稳态/瞬态荧光光谱测试：

本发明通过荧光光谱对制备的y-CDs、y-CDs NCs、y-CDs NCs/DOX、y-CDs NCs/DOX@CCM的荧光特性进行表征。y-CDs的荧光激发光谱及不同激发波长下的发射光谱如图5(a)所示，y-CDs的最大激发波长为490nm，y-CDs的最大发射波长为547nm，且最大发射波长不会随着激发波长的变化而变化。如图5(b)所示，当形成纳米团簇之后，y-CDs NCs与游离的y-CDs相比，由于y-CDs的聚集使荧光强度有一定的减弱，在包覆细胞膜后荧光强度进一步降低。而当y-CDs NCs/DOX@CCM与还原性的谷胱甘肽(GSH)反应后，荧光强度恢复到了较高的强度，证明了制备的碳点载药纳米团簇在还原条件下发生解离。

5.TEM测试：

本发明通过TEM测试对制备的y-CDs、y-CDs NCs、y-CDs NCs/DOX@CCM进行尺寸和形貌的表征。y-CDs的TEM图片和粒径分布直方图如图6(a-b)所示，y-CDs呈均匀的圆形，尺寸为7.2±0.7nm。如图6(c)，制备的y-CDs NCs尺寸约为150nm；如图6(d)，制备的y-CDsNCs/DOX@CCM尺寸约为200nm，包覆的细胞膜厚度约为10nm。

6.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测试：

通过BCA蛋白定量试剂盒测定制备的细胞膜悬液及y-CDs NCs/DOX@CCM中的蛋白含量，用PBS溶液调节蛋白含量为1mg/mL。将5μL蛋白Marker加入第一条蛋白泳道，再分别将15μL的y-CDs NCs/DOX(200μg溶于1mL PBS)、细胞膜悬液及y-CDs NCs/DOX@CCM加入蛋白泳道，电流设为100A，时间设为30min。如图7所示，y-CDs NCs/DOX组没有跑出具有蛋白条纹的泳道，而y-CDs NCs/DOX@CCM与细胞膜悬液(CCM)跑出了相似的蛋白条纹泳道，证明了细胞膜在y-CDs NCs/DOX表面的成功包覆。

7.体外药物释放测试：

分别配置pH＝7.4、pH＝7.4(GSH浓度：10mM)、pH＝5.5、pH＝5.5(GSH浓度：10mM)的缓冲溶液，将制备的y-CDs NCs/DOX@CCM用1mL上述不同缓冲溶液溶解为1mg/mL的溶液并置于透析袋中，将透析袋置于含有9mL上述不同缓冲溶液的容器中，于37℃恒温摇床中振荡。在不同时间点从透析袋外液中吸取1mL，再向容器中补充1mL对应的缓冲溶液，测量取出的液体在480nm处的吸光值。缓释结束后，绘制y-CDs NCs/DOX@CCM在不同条件下的药物释放曲线。如图8所示，y-CDs NCs/DOX@CCM在pH＝7.4(无GSH)的缓冲液中药物释放缓慢，药物释放率为19.13％，在pH＝5.5(无GSH)条件下药物释放率为39.33％，后者明显高于前者，这是由于DOX在酸性条件下会发生质子化，在水中有更好的溶解性。然而，在pH＝7.4(GSH浓度：10mM)的缓冲液中，DOX的释放率达到62.44％，并且在pH＝5.5(GSH浓度：10mM)的缓冲液中实现了最高释放率88％，说明y-CDs NCs/DOX@CCM中DOX的释放具有显著的还原响应性。这些数据证明y-CDs NCs/DOX@CCM的药物释放具有pH和GSH双重响应性，也证明了包覆细胞膜不会影响碳点载药纳米团簇的药物释放性能。

8.细胞毒性实验：

收集对数生长期的B16细胞，按照每孔1×10

9.免疫逃避和同源靶向能力测试：

以RAW 264.7细胞为细胞模型来评价y-CDs NCs/DOX@CCM的免疫逃避能力，同时以B16细胞为细胞模型来评价y-CDs NCs/DOX@CCM的同源靶向能力。将RAW 264.7细胞按照2×10

10.细胞吞噬实验：

收集对数生长期的B16细胞，按照每孔1×10

11.体内肿瘤治疗结果：

在裸鼠体内构建B16皮下瘤模型，将2×10

(1)本发明工艺简单，反应条件简单，易于操作分离，具有良好的发展前景。

(2)本发明制备的还原响应型碳点纳米团簇作为化疗药物的载体，具有生物相容性好、载药率高等优点，在肿瘤微环境响应解离释放药物，可进行细胞内荧光成像并在裸鼠体内显著抑制肿瘤生长，在肿瘤化疗领域具有潜在的应用价值。

(3)本发明制备的y-CDs NCs/DOX@CCM在体外表现出良好的还原响应性，在肿瘤还原性微环境中，团簇结构的碳点会解离成单个的碳点纳米颗粒并释放药物，在保留EPR效应的同时提高在肿瘤部位的渗透性，增强对肿瘤的抑制效果。

(4)本发明制备的y-CDs NCs/DOX@CCM通过尾静脉注射进入小鼠体内后，具有显著的抗肿瘤效果，具有潜在临床应用价值。

附图说明

图1为本发明中纳米材料y-CDs NCs/DOX@CCM的合成及应用示意图；

图2为本实施例1中制备的y-CDs NCs/DOX@CCM在水中、生理盐水中以及1640培养基中的水动力学直径随时间变化的曲线图；

图3为实施例1中制备的y-CDs NCs(1)、y-CDs(2)的红外光谱图；

图4为实施例1中制备的y-CDs(1)、y-CDs NCs(2)、y-CDs NCs/DOX(3)的紫外光谱图；

图5为实施例1中制备的y-CDs的荧光激发(1)光谱图及在不同激发波长下的荧光发射(2-7)光谱图(a)，以及y-CDs(1)、y-CDs NCs(2)、y-CDs NCs/DOX(3)、y-CDs NCs/DOX@CCM(4)、y-CDs NCs/DOX@CCM+10mM GSH(5)的荧光发射光谱图(b)；

图6为实施例1中制备的y-CDs的TEM图像(a)和粒径分布直方图(b)，y-CDs NCs的TEM图像(c)，y-CDs NCs/DOX@CCM的TEM图像(d)；

图7为实施例1中制备的y-CDs NCs/DOX、细胞膜悬液(CCM)及y-CDs NCs/DOX@CCM的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图；

图8为实施例1中制备的y-CDs NCs/DOX@CCM在不同条件下的药物释放动力学曲线；

图9为实施例1中Free DOX、y-CDs NCs/DOX、y-CDs NCs/DOX@CCM与B16细胞共孵育24h后的细胞活力图；

图10为实施例1中制备的y-CDs NCs/DOX、y-CDs NCs/DOX@CCM及对比例1中制备的y-CDs NCs/DOX@RBCM分别与RAW 264.7(a)和B16(b)细胞共孵育6h后的激光共聚焦显微镜图；

图11为实施例1中制备的y-CDs NCs/DOX、y-CDs NCs/DOX@CCM及对比例1中制备的y-CDs NCs/DOX@RBCM与B16细胞共孵育6h后的流式细胞分析图；

图12为实施例1中制备的y-CDs NCs/DOX、y-CDs NCs/DOX@CCM及对比例1中制备的y-CDs NCs/DOX@RBCM与B16细胞共孵育6h后，DOX平均荧光的流式细胞分析数据；

图13为实施例12中经尾静脉注射Saline、y-CDs NCs、Free DOX、y-CDs NCs/DOX、y-CDs NCs/DOX@CCM后，记录14天内肿瘤体积变化图(a)和小鼠体重变化图(b)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

除非特殊说明，否则所有化学试剂都是可商购的，无需进一步纯化即可直接使用。4-氨基水杨酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)购自百灵威科技有限公司。胱胺二盐酸盐购自国药集团化学试剂有限公司(中国上海)。盐酸阿霉素(DOX·HCl)购自北京华丰科技有限公司(中国北京)。BCA assay kit、PMSF、细胞裂解液购自碧云天生物技术有限公司(中国上海)。Cell Counting Kit-8(CCK-8)购自上海七海生物科技有限公司(中国上海)。B16细胞(小鼠黑色素瘤细胞系)及RAW264.7细胞(小鼠巨噬细胞系)来自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。RPMI-1640培养基、胎牛血清、青-链霉素双抗和胰蛋白酶购自杭州吉诺生物医学技术有限公司(中国杭州)。裸鼠购自上海斯莱克实验动物中心(中国上海)。

实施例1

(1)将0.2g 4-氨基水杨酸溶解于10mL的超纯水中，然后将混合液转移至聚四氟乙烯反应釜中进行水热反应，反应温度为180℃，反应时间为3h；反应结束后，自然冷却至室温，将产物离心20min(4000rpm)去除过度碳化的颗粒，然后通过孔径为220nm的微孔滤膜过滤，最后冷冻干燥得到碳点纳米颗粒y-CDs。

(2)取30mg y-CDs溶解在15mL超纯水中，室温搅拌，向溶液中滴加EDC(174mg，1mL超纯水)，30min后，再向溶液中滴加NHS(95mg，1mL超纯水)，搅拌3h，活化y-CDs上的羧基。随后，向溶液中加入胱胺二盐酸盐(30mg，3mL超纯水)溶液，搅拌反应3天，然后使用截留分子量为500的透析袋于超纯水中透析3天，得到碳点纳米团簇y-CDs NCs溶液。

(3)将5mg盐酸阿霉素溶于600μL甲醇溶液中，加入10μL三乙胺中和，然后逐滴加入到3mL y-CDs NCs溶液中，避光敞口搅拌过夜，8000rpm离心20min，取上清液冷冻干燥，得到负载阿霉素的碳点纳米团簇y-CDs NCs/DOX。同时，通过紫外测量沉淀在480nm处的吸光度，从而计算出药物上载率为40.5％，包封率为81％。

(4)取对数生长期的B16细胞1×10

(5)将200μg y-CDs NCs/DOX溶于0.5mL的B16细胞膜悬液中，使用Avanti微型挤出器将溶液挤出11次，10000rpm离心6min，除去多余的细胞膜，制得y-CDs NCs/DOX@CCM。

实施例2

取实施例1中合成的y-CDs、y-CDs NCs/DOX、y-CDs NCs/DOX@CCM各1mg，用超纯水稀释至50μg/mL，同时取50μL的y-CDs NCs溶于950μL的超纯水，用于测定表面电势和水动力学直径及分散系数，结果如表1所示，y-CDs的电势为-26.9mV，将y-CDs交联制得的y-CDsNCs电势变为-4.5mV，水合粒径增加至236.7nm，电势及水合粒径的增加证明了y-CDs NCs的成功合成。当y-CDs NCs负载化疗药物DOX后，电势由负变正，上升至8.8mV，证明了DOX的成功负载。通过物理挤压包覆B16细胞膜得到的y-CDs NCs/DOX@CCM，电势为-11.7mV，水合粒径增加至254.8nm，证明了y-CDs NCs/DOX表面细胞膜的成功包覆。y-CDs NCs/DOX@CCM在各种溶液(水、生理盐水、1640培养基)中的水动力学直径几乎不变(如图2)，证明了y-CDsNCs/DOX@CCM具有良好的胶体稳定性。

表1

实施例3

取实施例1中制备的y-CDs、y-CDs NCs进行FT-IR表征，如图3所示，曲线1代表y-CDs NCs，曲线2代表y-CDs。曲线2中3438cm

实施例4

取实施例1中制备的y-CDs、y-CDs NCs、y-CDs NCs/DOX进行UV-vis表征，如图4所示，y-CDs在282nm处存在特征峰，而y-CDs NCs/DOX在490nm处出现的特征峰证明了DOX的成功负载。

实施例5

取实施例1中制备的y-CDs、y-CDs NCs、y-CDs NCs/DOX、y-CDs NCs/DOX@CCM表征荧光特性。y-CDs的荧光激发光谱及不同激发波长下的发射光谱如图5(a)所示，y-CDs的最大激发波长为490nm，y-CDs的最大发射波长为547nm，且最大发射波长不会随着激发波长的变化而变化。如图5(b)所示，当形成纳米团簇之后，y-CDs NCs与游离的y-CDs相比，由于y-CDs的聚集使荧光强度有一定的减弱，在包覆细胞膜后荧光强度进一步降低。而当y-CDsNCs/DOX@CCM与还原性的谷胱甘肽(GSH)反应后，荧光强度恢复到了较高的强度，证明了制备的碳点载药纳米团簇在还原条件下发生解离。

实施例6

取实施例1中制备的y-CDs、y-CDs NCs、y-CDs NCs/DOX@CCM进行尺寸和形貌的表征。y-CDs的TEM图片和粒径分布直方图如图6(a-b)所示，y-CDs呈均匀的圆形，尺寸为7.2±0.7nm。如图6(c)，制备的y-CDs NCs尺寸约为150nm；如图6(d)，制备的y-CDs NCs/DOX@CCM尺寸约为200nm，包覆的细胞膜厚度约为10nm。

实施例7

通过BCA蛋白定量试剂盒测定实施例1中制备的细胞膜悬液及y-CDs NCs/DOX@CCM中的蛋白含量，用PBS溶液调节蛋白含量为1mg/mL。将5μL蛋白Marker加入第一条蛋白泳道，再分别将15μL的y-CDs NCs/DOX(200μg溶于1mL PBS)、细胞膜悬液及y-CDs NCs/DOX@CCM加入蛋白泳道，电流设为100A，时间设为30min。如图7所示，y-CDs NCs/DOX组没有跑出具有蛋白条纹的泳道，而y-CDs NCs/DOX@CCM与细胞膜悬液(CCM)跑出了相似的蛋白条纹泳道，证明了细胞膜在y-CDs NCs/DOX表面的成功包覆。

实施例8

分别配置pH＝7.4、pH＝7.4(GSH浓度：10mM)、pH＝5.5、pH＝5.5(GSH浓度：10mM)的缓冲溶液，将制备的y-CDs NCs/DOX@CCM用1mL上述不同缓冲溶液溶解为1mg/mL的溶液并置于透析袋中，将透析袋置于含有9mL上述不同缓冲溶液的容器中，于37℃恒温摇床中振荡。在不同时间点从透析袋外液中吸取1mL，再向容器中补充1mL对应的缓冲溶液，测量取出的液体在480nm处的吸光值。缓释结束后，绘制y-CDs NCs/DOX@CCM在不同条件下的药物释放曲线。如图8所示，y-CDs NCs/DOX@CCM在pH＝7.4(无GSH)的缓冲液中药物释放缓慢，药物释放率为19.13％，在pH＝5.5(无GSH)条件下药物释放率为39.33％，后者明显高于前者，这是由于DOX在酸性条件下会发生质子化，在水中有更好的溶解性。然而，在pH＝7.4(GSH浓度：10mM)的缓冲液中，DOX的释放率达到62.44％，并且在pH＝5.5(GSH浓度：10mM)的缓冲液中实现了最高释放率88％，说明y-CDs NCs/DOX@CCM中DOX的释放具有显著的还原响应性。这些数据证明y-CDs NCs/DOX@CCM的药物释放具有pH和GSH双重响应性，也证明了包覆细胞膜不会影响碳点载药纳米团簇的药物释放性能。

实施例9

收集对数生长期的B16细胞，按照每孔1×10

实施例10

以RAW 264.7细胞为细胞模型来评价y-CDs NCs/DOX@CCM的免疫逃避能力，同时以B16细胞为细胞模型来评价y-CDs NCs/DOX@CCM的同源靶向能力。将RAW 264.7细胞按照2×10

实施例11

收集对数生长期的B16细胞，按照每孔1×10

实施例12

在裸鼠体内构建B16皮下瘤模型，将2×10

对比例1

(1)取小鼠全血，3000rpm离心5min，用PBS清洗三次除去血清，将红细胞沉淀重悬于0.2mM EDTA溶液中诱导膜破裂。设置离心温度为4℃，12000rpm离心15min，去除上清液，将沉淀重悬于1mL PBS中，可得红细胞膜(RBCM，red blood cell membrane)悬液。

(2)将200μg实施例1中制备的y-CDs NCs/DOX溶于0.5mL的红细胞膜悬液中，使用Avanti微型挤出器将溶液挤出11次，10000rpm离心6min，除去多余的细胞膜，制得y-CDsNCs/DOX@RBCM。