一种基于核密度函数的量化胶质瘤侵袭性的可视化方法

摘要

本发明涉及一种基于核密度函数的量化胶质瘤侵袭性的可视化方法，基于ImageJ软件、R语言平台，使用核密度估计算法建立一套量化胶质母细胞瘤侵袭性方法。本发明利用R语言ggplot2包和MASS包封装的核密度估计算法和可视化功能来推断细胞核分布的核密度估计图。本发明可以帮助在科研工作中有效地从病理切片中判断肿瘤的侵袭情况，利用核密度统计每一区域的肿瘤核密度，从可视化图中可以大致判断肿瘤的侵袭趋势，进而从切片中来反映肿瘤侵袭能力的高低。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种基于核密度函数的量化胶质瘤侵袭性的可视化方法。

背景技术

胶质瘤的临床管理在很大程度上取决于手术和后续放射治疗的有效性。限制这些手术成功的关键问题是缺乏对手术中手术切除肿瘤中切缘的准确判断。而在胶质瘤中,其快速增殖和广泛浸润的生长特性导致肿瘤的侵袭边界较难确定，而切缘的确定极大决定了患者的复发情况，如何最大限度地切除肿瘤组织，同时保留正常组织区是减少术后复发的关键，也是胶质瘤治疗的最大难题。

对于胶质瘤侵袭性以及肿瘤侵袭边界的定量，目前主要依赖于核磁共振的手段去反映。但是问题是，在高级别胶质瘤周边水肿带上没有磁共振增强信号的，传统上不该列入切除范围，但在(荧光素钠)荧光上发现有荧光反应，切除后送病理检测发现确实有大量肿瘤细胞的浸润。这显示出仅通过核磁上并不能很好得把控侵袭的程度。肿瘤的细胞学边界是研究的热点，一般情况下，细胞学边界远大于影像学边界。胶质瘤的细胞学边界到底距离影像学界多远，虽有探索，目前尚无明确结论。

对于侵袭前沿区肿瘤边界的确定的金标准需要借助病理学诊断，这也是诊断胶质瘤的金标准。依赖于病理学诊断，病理医师应用病理学知识与方法，对临床的送检标本进行检查，取自机体内生前或死后的病变组织、细胞进行形态学观察分析做出的疾病诊断。结合病理组织切片，才能从细节上去了解侵袭前沿的组织中到底有多少的肿瘤细胞迁移过来，才能知道肿瘤的侵袭程度(侵袭的肿瘤细胞多少)，判断侵袭的浸润深度以侵袭的边界。

然而，在平时的科研工作中，尤其是面对胶质瘤组织切片，科研工作者感受到一个很重要的难点是怎么从切片中反映胶质母细胞瘤的侵袭状态。由于胶质瘤浸润型生长的特点，侵袭的肿瘤细胞往往是浸润在正常组织中的，和正常组织细胞很难区分。如果没有能够仔细阅片，或者没有丰富的临床病理诊断经验，很难去定义出侵袭区域。并且定义侵袭区域需要我们从更加宏观的视野上去识别，而不是从局部的特征入手。对于科研工作者，找到侵袭区的最简便的方式就是通过细胞核密度来判断，肿瘤区域由于有大量肿瘤细胞的增殖，与侵袭区稀疏的密度形成鲜明的对比，可以通过核密度减少的趋势去判断侵袭大致的方向。而这一方法的难点在于怎么去评价局部区域的细胞核密度特征，传统的方式是通过细胞计数去识别，然后再计算区域的直径。这样的方法姑且不论准确性如果，其密度的大小和拟定的区域的大小密切相关。如果区域选择过大，不能够很好地反映局部组织的密度特征。如果区域选择过小，这会增加更大的人力成本，耗时耗力。这提示科研工作者去建立一种量化切片中细胞核密度的方法用于评价胶质母细胞瘤的侵袭性。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于核密度函数的量化胶质瘤侵袭性的可视化方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种基于核密度函数的量化胶质瘤侵袭性的可视化方法，具体步骤如下：

(1)先将胶质瘤组织切片中各个细胞核转换为二值化图像；

(2)然后进行细胞核的核密度估计，得到细胞的核密度信息图；

(3)最后通过可视化结果判断肿瘤的侵袭趋势。

优选的，步骤(1)的具体方法如下：

(1-1)利用图像采集设备采集胶质瘤组织切片图像，并导入ImageJ软件，安装Fiji插件包；

(1-2)打开图片，运行Macro代码进行批处理，选择颜色阈值，选择Convert toMask栏得到二值化图像。

进一步优选的，步骤(1-1)中，所述胶质瘤组织切片图像为HE或免疫荧光图像。

进一步优选的，步骤(1-2)的具体流程如下：

(1-2-1)运行Fiji，打开HE图像或者共聚焦扫描图像；open("…/…/…")；

(1-2-2)自动选择颜色阈值；setAutoThreshold("Default dark no-reset")；或者手动选择；run("Threshold...")；

(1-2-3)设置颜色区间范围，需要手动调整；因为苏木素染色时间以及染料的新鲜程度会影响细胞核的颜色深浅，所以不同批次间的染色需要调整阈值，以尽可能的选中图片里所有的细胞核；setThreshold(…,…)；setOption("BlackBackground",true)；

(1-2-4)选中细胞核区域后，将图像变为二值化的图像，即将图片转化为黑白版，转换为黑色前景色和白色背景色的值，以便于后续二值化图像的各种操作；run("Convertto Mask")。

优选的，步骤(2)的具体方法如下：

(2-1)对二值化图像进行去除杂点以及分水岭法处理，得到细胞核的定位信息；

(2-2)将步骤(2-1)所得细胞核定位信息导入到Rstudio中，下载ggplot2和RColorBrewer包，使用ggplot2的多种基于核密度估计算法的参数来执行作图，得到细胞的核密度信息图。

进一步优选的，步骤(2-1)中，如果是HE染色的图片，因为苏木素染色深度会影响筛选效果，需要反复调整色彩阈值到一个最佳的值；必要条件下可以分块调整，直到选择到所有的细胞核；如果是荧光的图片，只要利用Photoshop提取蓝色通道的图片即可。

进一步优选的，步骤(2-1)的流程如下：

(2-1-1)去除杂质，一种中值滤波器，替代像素以其临域3×3个像素的平均像素值；run("Despeckle")；

(2-1-2)执行扩张操作，然后腐蚀，以平滑对象并填充空缺；run("Close-")；

(2-1-3)分水岭法分割连接在一起的细胞核；run("Watershed")。

(2-1-4)分析粒子，点击Analyze，Analyze Particles,选中record starts,得到结果XM,YM为质心坐标，File，Save as质心坐标结果至Excel表格。

优选的，步骤(2-2)中，所述核密度信息图可设置为二维统计直方图或二维核密度直方图，其中，二维统计直方图可设置的可视化类型为方块形或者六方形，二维核密度直方图可设置的可视化类型为栅格形或者多边形。二维核密度直方图方法参照本例的附图所示，此外，如果想得到简单的二维统计直方图来反映区域的核密度。可将图片区域分割成许多小的正方形格子，格子的多少通过设置bin值来实现，利用ggplot2的geom_bin2d()进行格子中细胞核频数进行统计，并执行可视化步骤。

优选的，步骤(2-2)中，使用R语言ggplot2包的stat_density_2d()函数可视化，其可联合MASS包中kde2d()函数进行细胞核的核密度估计，并利用结果进行可视化；主要执行操作步骤和执行代码：

df代表细胞核的坐标点矩阵，V1,V2分别代表X，Y轴的坐标

#(2-2-1)散点图函数

ggplot(df,aes(x,y))；

#(2-2-2)绘制2D密度图函数，geom＝"raster"表示生成经典的栅格图，也可以设置为"polygon"生成多边形轮廓图；使用..density..将密度曲面的高度映射给等高线的颜色；contour代表轮廓线(F为不设置)；

+stat_density_2d_filled(geom＝"raster",aes(fill＝..density..),contour＝F)

#(2-2-3)scale_fill_gradientn()设置根据对应的密度估计值以填充密度图中的颜色；colormap设置梯度颜色区间；limits设置可视化的密度值范围；breaks表示breaks参数重新定义色条范围并根据break范围划分颜色范围；oob＝scales::squish表示超过阈值范围按照极限值的颜色进行填充；这些步骤可以在不同组间设置成同一量度，方便进行组间侵袭性的比较；

+scale_fill_gradientn(colours＝colormap,limits＝c(2e-07,2e-06),

breaks＝seq(2e-07,2e-06,by＝1e-09),oob＝scales::squish)。

进一步优选的，步骤(2-2)还包括：

(2-2-4)设置主题参数

+theme_classic()；

(2-2-5)设置图片背景坐标轴线的大小和文字的大小等

+theme(panel.background＝element_rect(fill＝"white",

colour＝"black",size＝0.25),#设置面板的背景

axis.line＝element_line(colour＝"black",size＝0.25),

#设置坐标轴线颜色、大小

axis.title＝element_text(size＝13,face＝"plain",color＝"black"),

#设置坐标轴标题文本大小、颜色

axis.text＝element_text(size＝12,face＝"plain",color＝"black"),

legend.position＝"right")

#设置坐标轴刻度文本大小、颜色。

优选的，步骤(3)的具体方法为：根据核密度信息图颜色的深浅判断该区域的肿瘤细胞分布密度，并且大致判断肿瘤的侵袭趋势。

本发明的有益效果在于：

在密度函数估计中有一种方法是被广泛应用的——二维直方图。可以通过设置bin值和R语言的geom_bin2d函数来统计每个区域块中核数量。该图的特点是简单易懂，通过计算机方法也较好实现，统计的值能够客观反映区域内的细胞核数量。但缺点在于以下三个方面：密度函数是不平滑的；bin的宽度是认为指定的，密度函数受子区间面积影响很大，同样的原始数据如果取不同的bin值，那么展示的结果可能是完全不同的。其得到的结果存在不连续的表现，对于肿瘤侵袭特性的反映上和实际情况可能存在差异。

本发明涉及的核密度估计图用于显示数据在X轴连续数据段内的分布状况，是直方图的变种，它使用平滑的曲线来绘制分布的趋势。相比于直方图，它不受到所使用分组数量的影响，所以能更好地界定分布形状。

本发明所应用的核密度估计是在概率轮中用来估计未知的密度函数，属于非参数检验的方法，由Rosenblatt和Emanuel Parzen提出，又叫Parzen窗。它采用平滑的峰值函数来拟合观察到的数据点，对真实的概率分布曲线进行模拟。核密度估计(Kernel densityestimation)，是一种用于估计概率密度函数的非参数方法，x

K(.)为核密度函数(非负、积分为1，符合概率密度性质，并且均值为0)；h>0为一个平滑参数，称作带宽。核密度估计其实就是通过核函数将每个数据点的数据+带宽当作核函数的参数，得到n个核函数，再线性叠加就形成了核密度的估计函数，归一化后就是核密度概率密度函数了。

简单来说，在已知某一事物的概率分布的情况下，如果某一个数在观察中出现了，可以认为这个数的概率密度很大，那么和这个数比较近的数的概率密度也会比较大，而那些离这个数远的数的概率密度会比较小。基于这一考虑，针对观察中的第一个数，可以用K去拟合我们想象中的那个远小近大概率密度。对每一个观察数拟合出的多个概率密度分布函数，取平均。如果某些数是比较重要的，则可以取加权平均。

申请人基于FUJI软件、R语言平台，使用核密度估计(Kernel DensityEstimation,KDE)算法建立一套量化胶质母细胞瘤侵袭性方法。本发明利用R语言ggplot2包和MASS包封装的核密度估计算法和可视化功能来推断细胞核分布的核密度估计图。本发明可以帮助在科研工作中有效地从病理切片中判断肿瘤的侵袭情况，利用核密度统计每一区域的肿瘤核密度，从可视化图中可以大致判断肿瘤的侵袭趋势，进而从切片中来反映肿瘤侵袭能力的高低。

与传统的通过机械重复阅片来判断侵袭前沿和量化侵袭性相比，本发明采用计算机算法，效率高，时间快，并且准确，减少大量阅片计数等大量重复性工作；与核磁共振图像判断相比，本发明的精确性高，克服了核磁技术并不能在微观上找到肿瘤细胞的弱点，分辨率比核磁共振更高，对侵袭区肿瘤细胞的判读更为精准。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为本发明的流程图；

图2为细胞核密度法量化免疫缺陷鼠移植瘤的流程示意图，其中，A为HE显示免疫缺陷鼠移植瘤，B为二值化图像将每个细胞核泛化为二值化点，C为生成的二维核密度估计图；

图3为细胞核密度法量化人胶质母细胞瘤侵袭侵袭前沿的流程图，其中，A为免疫荧光原始图片，蓝色信号代表细胞核，B为生成的二维核密度估计图，不同的细胞核密度用彩虹色块梯度代表。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1：

如图1所示的一种基于核密度函数的量化胶质瘤侵袭性的可视化方法，具体步骤如下：

(1)将胶质瘤组织切片中各个细胞核转换为二值化图像；

步骤(1)的具体方法如下：

(1-1)利用图像采集设备采集胶质瘤组织切片图像，并导入ImageJ软件；(图2中A)

(1-2)打开图片，运行FUJI的Macro代码进行批处理，选择颜色阈值，选择Convertto Mask栏得到二值化图像。

步骤(1-1)中，所述胶质瘤组织切片图像为HE或免疫荧光图像。

步骤(1-2)的具体流程如下：

(1-2-1)运行FUJI软件，打开HE图像或者共聚焦扫描图像；open("…/…/…")；

(1-2-2)自动选择颜色阈值；setAutoThreshold("Default dark no-reset")；或者手动选择；run("Threshold...")；

(1-2-3)设置颜色区间范围，需要手动调整；因为苏木素染色时间以及染料的新鲜程度会影响细胞核的颜色深浅，所以不同批次间的染色需要调整阈值，以尽可能的选中图片里所有的细胞核；setThreshold(…,…)；setOption("BlackBackground",true)；

(1-2-4)选中细胞核区域后，将图像变为二值化的图像，即将图片转化为黑白版，转换为黑色前景色和白色背景色的值，以便于后续二值化图像的各种操作；run("Convertto Mask")。

(2)进行细胞核的核密度估计，得到细胞的核密度信息图

步骤(2)的具体方法如下：

(2-1)对二值化图像进行去除杂点以及分水岭法处理，得到细胞核的定位信息；(图2中B)

(2-2)将步骤(2-1)所得细胞核定位信息导入到Rstudio中，下载ggplot2和RColorBrewer包，使用ggplot2的多种基于核密度估计算法的参数来执行作图，得到细胞的核密度信息图。

(图2中C)

步骤(2-1)中，如果是HE染色的图片，因为苏木素染色深度会影响筛选效果，需要反复调整色彩阈值到一个最佳的值；必要条件下可以分块调整，直到选择到所有的细胞核；如果是荧光的图片，只要利用Photoshop提取蓝色通道的图片即可。

步骤(2-1)的流程如下：

(2-1-1)去除杂质，一种中值滤波器，替代像素以其临域3×3个像素的平均像素值；run("Despeckle")；

(2-1-2)执行扩张操作，然后腐蚀，以平滑对象并填充空缺；run("Close-")；

(2-1-3)分水岭法分割连接在一起的细胞核；run("Watershed")。

(2-1-4)分析粒子，点击Analyze，Analyze Particles,选中record starts,得到结果XM,YM为质心坐标，File，Save as质心坐标结果至Excel表格。

步骤(2-2)中，所述核密度信息图可设置为二维统计直方图或二维核密度直方图，其中，二维统计直方图可设置的可视化类型为方块形或者六方形，二维核密度直方图可设置的可视化类型为栅格形或者多边形。二维核密度直方图方法参照本例的附图所示，此外，如果想得到简单的二维统计直方图来反映区域的核密度。可将图片区域分割成许多小的正方形格子，格子的多少通过设置bin值来实现，利用ggplot2的geom_bin2d()进行格子中细胞核频数进行统计，并执行可视化步骤。

步骤(2-2)中，使用R语言ggplot2包的stat_density_2d()函数可视化，其可联合MASS包中kde2d()函数进行细胞核的核密度估计，并利用结果进行可视化；主要执行操作步骤和执行代码：

df代表细胞核的坐标点矩阵，V1,V2分别代表X，Y轴的坐标

#(2-2-1)散点图函数

ggplot(df,aes(x,y))；

#(2-2-2)绘制2D密度图函数，geom＝"raster"表示生成经典的栅格图，也可以设置为"polygon"生成多边形轮廓图；使用..density..将密度曲面的高度映射给等高线的颜色；contour代表轮廓线(F为不设置)；

+stat_density_2d_filled(geom＝"raster",aes(fill＝..density..),contour＝F)

#(2-2-3)scale_fill_gradientn()设置根据对应的密度估计值以填充密度图中的颜色；colormap设置梯度颜色区间；limits设置可视化的密度值范围；breaks表示breaks参数重新定义色条范围并根据break范围划分颜色范围；oob＝scales::squish表示超过阈值范围按照极限值的颜色进行填充；这些步骤可以在不同组间设置成同一量度，方便进行组间侵袭性的比较；

+scale_fill_gradientn(colours＝colormap,limits＝c(2e-07,2e-06),

breaks＝seq(2e-07,2e-06,by＝1e-09),oob＝scales::squish)。

(2-2-4)设置主题参数

+theme_classic()；

(2-2-5)设置图片背景坐标轴线的大小和文字的大小等

+theme(panel.background＝element_rect(fill＝"white",

colour＝"black",size＝0.25),#设置面板的背景

axis.line＝element_line(colour＝"black",size＝0.25),

#设置坐标轴线颜色、大小

axis.title＝element_text(size＝13,face＝"plain",color＝"black"),

#设置坐标轴标题文本大小、颜色

axis.text＝element_text(size＝12,face＝"plain",color＝"black"),

legend.position＝"right")

#设置坐标轴刻度文本大小、颜色。

(3)通过可视化结果判断肿瘤的侵袭趋势

步骤(3)的具体方法为：根据核密度信息图颜色的深浅判断该区域的肿瘤细胞分布密度，并且大致判断肿瘤的侵袭趋势。

实施例2：

选取另一张人胶质母细胞瘤免疫荧光图像，按照实施例1的方法进行可视化。结果显示这套系统可以很好地反应局部区域细胞核的密度(图3)，并且可以从图3中准确得识别出肿瘤侵袭的趋势。图中右上角为核密度大的区域，为肿瘤核心区域，而左边为肿瘤侵袭区，可以明显发现有深色的色块在侵袭前沿覆盖，代表此区域密度相对较高。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。