灵芝酸A及其衍生物或灵芝总三萜在制备治疗眼部疾病药物中的应用

摘要

本发明公开了灵芝酸A及其衍生物或灵芝总三萜在制备治疗眼部疾病药物中的应用。由灵芝酸A或其衍生物或灵芝三萜类物质组成的药物或功能性产品，使自然衰老的小鼠泪腺和角膜病变明显减轻，机体代谢水平更接近年轻态，具有防治白内障、眼部退行性病变等眼部疾病的作用，效果明确，安全性高。

说明书

技术领域：

本发明属于生物医药领域，具体涉及灵芝酸A及其衍生物或灵芝总三萜在制备治疗眼部疾病药物中的应用。

背景技术：

灵芝为多孔菌科赤芝Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst.或紫芝Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang的干燥子实体，具有补气安神，止咳平喘功效，常用于心神不宁，失眠心悸，肺虚咳喘，虚劳短气，不思饮食等症。在我国，灵芝药用已有2000年的历史，《神农本草经》将灵芝列为上品，有安神、利眠、益精气功效。药理学研究显示，灵芝三萜和多糖是灵芝两种主要药理活性组分，灵芝酸，灵芝烯酸是灵芝特有的一类三萜类物质，目前从灵芝中已分离得到的三萜类物质达100多种。灵芝酸A是灵芝中含量最为丰富的三萜酸之一，药理学研究显示灵芝酸A可抑制细胞组织胺的释放，增强消化系统各种器官的机能，具有降血脂、降血压、护肝等作用。

白内障是由于晶状体混浊导致的视觉障碍性疾病。晶状体是人眼球中重要的光学部件，正常下是透明的，由于老化、遗传、免疫与代谢异常等原因引起晶状体代谢紊乱，导致晶状体蛋白质变性而发生混浊，称为白内障。目前，白内障是全球首位致盲性眼病，据2019年屈光性白内障手术新进展国际会议公布的数据显示，我国60岁至89岁人群白内障发病率约为80％，90岁以上人群白内障发病率高达90％以上，是老年健康的一大杀手。白内障目前仍无有效的药物治疗，手术是目前惟一的治疗手段。灵芝酸A及其衍生物和灵芝三萜类物质未有报道其作为白内障和眼部退行性疾病的药物、功能性食品和保健品。实验发现灵芝酸A及其衍生物和灵芝三萜类物质可改善机体代谢水平，减轻自然衰老引起的泪腺和角膜病变，其可作为防治白内障、眼部退行性疾病的功能药品。

灵芝酸A，CAS号：81907-62-2，其结构如式I所示：

发明内容：

本发明的第一个目的是提供灵芝酸A或其衍生物、或灵芝总三萜在制备治疗眼部疾病药物中的应用，该药物具有防治或延缓白内障和眼部退行性疾病的发生的功能。

本发明通过试验发现，长期摄入灵芝总三萜或灵芝酸A的小鼠未发生白内障，正常小鼠(对照组)65周龄会发生白内障。长期摄入灵芝总三萜或灵芝酸A的小鼠，对比正常衰老小鼠，角膜完整性良好(图3)，上皮细胞排列整齐，角膜间质胶原纤维没有失去原有形态(图4)。长期摄入灵芝总三萜或灵芝酸A的小鼠，对比正常衰老小鼠，泪腺小叶结构排列整齐，泪腺上皮细胞没有萎缩，和出现空泡融合(图5)，长期摄入灵芝总三萜或灵芝酸A的小鼠，改善其代谢，其血清组分更接近年轻小鼠(图6，图7和图8)。

因此，本发明提供了灵芝酸A或其衍生物、或灵芝总三萜在制备预防和/或治疗眼部疾病药物或功能性产品中的应用。

本发明的第二个目的是提供一种预防和/或治疗眼部疾病药物或功能性产品，其含有灵芝酸A或其衍生物、或灵芝总三萜作为活性成分，和药学上可接受的辅料或辅助性成分，然后制备成药剂或功能性产品。

所述的预防和/或治疗眼部疾病药物或功能性产品是预防和/或治疗白内障或其他眼部退行性疾病的药物、功能性产品。

所述的灵芝酸A的衍生物可以灵芝酸A的药用盐。

本发明的效果在于：由灵芝酸A或其衍生物或灵芝三萜类物质组成的药物或功能性产品，使自然衰老的小鼠泪腺和角膜病变明显减轻，机体代谢水平更接近年轻态，具有防治白内障、眼部退行性病变等眼部疾病的作用，效果明确，安全性高。

附图说明：

图1是灵芝总三萜HPLC色谱指纹，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分别对应灵芝酸C、灵芝酸C2、灵芝酸G、灵芝酸B、灵芝酸B、灵芝酸A、灵芝酸H、灵芝烯酸D、灵芝酸D、灵芝酸F；

图2是灵芝总三萜主要成分结构式；

图3是小鼠眼睛外观观察结果；

图4是眼角膜HE染色结果；

图5是泪腺HE染色结果；

图6是灵芝总三萜对正常衰老小鼠血清代谢物的通路富集图；

图7是灵芝总三萜对正常衰老血清代谢产物影响的PCA图，其中Con是对照组，LZ是灵芝总三萜处理组，Young是年轻小鼠对照组；

图8是灵芝总三萜对正常衰老小鼠血清差异代谢产物热图，其中Con是对照组，LZ是灵芝总三萜处理组，Young是年轻小鼠对照组。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1灵芝总三萜的制备

取灵芝子实体，70℃干燥6h，粉碎，过3号筛，得粗粉。取粗粉，入层析柱，使柱高比在12:1之间，加入10倍量石油醚，浸泡24h，收集渗漏液，而后依次加入10倍量乙醇、水，分别收集渗漏液，合并石油醚和乙醇浸提的渗漏液；合并后的渗漏液过ADS-8大孔树脂，依次用20％、30％、40％、50％、75％和100％乙醇溶液洗脱，流速1.5bv，收集体积分数50％以上乙醇洗脱下来的洗脱液，减压回收溶剂。通过制备级OSD-C18柱子，进一步精制，收集10种灵芝酸(灵芝酸C、灵芝酸C2、灵芝酸G、灵芝酸B、灵芝酸B、灵芝酸A、灵芝酸H、灵芝烯酸D、灵芝酸D、灵芝酸F，具体结构式见图2)组分的洗脱峰，干燥，即为灵芝总三萜。灵芝总三萜的HPLC图谱见(图1)。

实施例2药效学实验

1.仪器与试剂

1.1饲料制作

将小鼠维持饲料(北京华福康生物科技有限公司)粉碎，加入灵芝总三萜和适量的水，混合均匀。饲料中含有灵芝酸C、灵芝酸C2、灵芝酸G、灵芝酸B、灵芝酸B、灵芝酸A、灵芝酸H、灵芝酸D、灵芝酸D、灵芝酸F，具体含量如表1所示，由此得到含灵芝总三萜类的饲料。

表1

将小鼠维持饲料(北京华福康生物科技有限公司)粉碎，加入灵芝酸A和适量的蒸馏水，混合均匀。饲料中含有灵芝酸A为每克饲料含0.005mg，由此得到含灵芝酸A的饲料。

1.2实验动物

成年小鼠(25周龄)48只，雌雄各半(SYXK[Yue]2008-0085)，和年轻小鼠(12周龄)16只，雌雄各半(SYXK[Yue]2008-0085)，置于塑料笼中，置于恒温(25℃)集落室，光照/暗周期12/12h。食物和水可以随时获得。所有实验方案均经广东省微生物研究所实验动物中心批准。

2、方法

2.1实验动物分组及长期预防性给药

2.1.1成年小鼠(25周龄)的分组；

对照组小鼠饲喂标准饲料(图3、4、5中的正常组，图7、8中的对照组)，饲料随时获得；

用药组1小鼠饲喂含灵芝总三萜类的饲料(LZ组)，饲料随时获得；

用药组2小鼠饲喂含灵芝酸A的饲料(LZA组)，饲料随时获得；

每组16只，并给予蒸馏水，水也可以随时获得，疗程40周。

2.1.2年轻小鼠(12周龄)的处理

小鼠饲喂标准饲料(图7、8中的Young组)，饲料和水随时获得；

2.2组织病理学

取角膜、泪腺置于4％多聚甲醛固定。常规石蜡包埋，切片，苏木素-伊红染色，显微镜观察

2.3免疫组织化学

(1)石蜡切片置于65℃烘箱中，烘片2小时，脱蜡至水，用pH7.4的PBS冲洗三次，每次3分钟。

(2)取一定量pH＝6.0柠檬酸盐缓冲液，加入微波盒中，微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档微波处理10分钟，取出微波盒流水自然泠却，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS冲洗2次。(注：不是所有的抗体都需要微波修复的，视具体情况而定)

(3)每张切片加1滴3％H

(4)甩去PBS液，每张切片加1滴相应的第一抗体(相应稀释倍数)，室温下孵育2小时。

(5)PBS冲洗5min，3次。除去PBS液，每张切片加1滴聚合物增强剂，室温下孵育20分钟。PBS冲洗3min，3次。

(6)除去PBS液，每张切片加1滴酶标抗鼠/兔聚合物，室温下孵育30分钟。PBS冲洗5min，3次。

(7)甩去PBS液，每张切片加1滴新鲜配制的DAB液(二氨基联苯胺)，显微镜下观察5分钟。

(8)苏木素复染，0.1％HCl分化，自来水冲洗，蓝化，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干后观察。

2.4血清代谢组分析

本次LC-MS分析的仪器平台为赛默飞世尔科技公司的超高效液相色谱-双分压线性阱-静电场轨道阱串联质谱仪(UHPLC-LTQ Orbitrap)色谱条件为：色谱柱为BEH C18柱(100mm×2.1mm i.d.,1.7μm；Waters,Milford,USA)；流动相A为水(含0.1％甲酸)，流动相B为乙腈(含0.1％甲酸)；梯度洗脱程序为0–1.5min：5％–25％B，1.5–10.0min：25％–100％B，10.0-13.0min：100％B，13.0-13.5min：100％-5％，5％B维持1.0min。流速为0.40mL/min，进样量为3μL，柱温为45℃。质谱条件为：样品质谱信号采集分别采用正负离子扫描模式，电喷雾毛细管电压，进样电压和碰撞电压分别为:3.0kV，40V和30eV。毛细管和离子温度温度分别为：350℃，载气流量：45L/h，质谱扫描范围：50-1000m/z，分辨率为：30000.

使用在线软件MetaboAnalyst(版本4.0)(http://www.metaboanalyst.ca/)进行差异代谢物途径分析。

3、结果

长期摄入灵芝总三萜或灵芝酸A的小鼠未发生白内障，正常小鼠(对照组)65周发生白内障的小鼠有5只。

角膜上皮的完整有利于泪膜的附着，而泪膜的正常对角膜生理功能的发挥也有重要的作用。随着小鼠衰老，小鼠角膜上皮逐渐失去整齐紧密的细胞排列结果，细胞层次紊乱、增多，表层细胞破坏脱落，失去支撑和稳定泪膜的作用，将造成泪膜的不稳定。长期摄入灵芝总三萜或灵芝酸A的小鼠，对比正常衰老小鼠，角膜完整性良好(图3)，上皮细胞排列整齐，角膜间质胶原纤维没有失去原有形态(图4)。长期摄入灵芝总三萜或灵芝酸A的小鼠，对比正常衰老小鼠，泪腺小叶结构排列整齐，泪腺上皮细胞没有萎缩，和出现空泡融合(图5)。

视黄醇代谢和谷胱甘肽代谢可影响白内障发生发展，长期摄入灵芝总三萜或灵芝酸A的小鼠，改善其代谢，其血清组分更接近年轻小鼠(图6，图7和图8)。