一种甘蓝型油菜雄性不育基因BnMS5e、cDNA、蛋白、载体、工程菌及其应用

摘要

本发明涉及一种甘蓝型油菜雄性不育基因BnMS5e、cDNA、蛋白、载体、工程菌及其应用，属于生物育种技术领域。所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述基因BnMS5e功能缺失会严重影响雄配子减数分裂过程中染色体的行为，最终导致小孢子发育缺陷。该突变体结合保持系和恢复系可应用于油菜杂交新品种的培育。基因BnMS5e可作为一个油菜减数分裂调控的功能基因应用于油菜基因工程雄性不育系统的创制。

说明书

技术领域

本发明涉及生物育种技术领域，具体涉及一种甘蓝型油菜雄性不育基因BnMS5e、cDNA、蛋白、载体、工程菌及其应用。

背景技术

目前，我国油菜杂种优势利用的雄性不育系统主要是细胞质雄性不育系统和细胞核雄性不育系统，但是细胞质雄性不育系统在油菜生产应用上存在一些不尽人意的地方。而细胞核雄性不育系统不育性稳定彻底，不存在不育胞质负效应和胞质单一化的潜在风险，一般不受恢保关系的限制，很容易获得强优势组合，在杂种优势利用中具有广阔的前景。近年来，我国在油菜雄性不育研究领域不断取得突破，大量油菜育性相关分子标记的开发、育性相关基因的克隆与功能研究，不仅推动了雄性不育在油菜杂种优势利用中的应用，也为油菜光、温敏雄性不育的研究与应用指明了方向。

Yi等在油菜中首次利用图位克隆成功克隆了油菜隐性核不育S45AB的恢复基因BnMs1和BnMs2(Yi B,Zeng FQ,Lei SL,Chen YN,Yao XQ,Zhu Y,Wen J,Shen JX,Ma CZ,TuJX,Fu TD.Two duplicate CYP704B1-homologous genes BnMs1 and BnMs2 are requiredfor pollen exine formation and tapetal development in Brassica napus.PlantJ.2010,6:925-938)。油菜隐性上位互作型雄性不育系9012A的不育基因BnMs3与拟南芥基因AtTic40同源，BnMs3基因主要参与油菜雄蕊绒毡层发育(Dun XL,Zhou ZF,Xia SQ,WenJ,Yi B,Shen JX,Ma CZ,Tu JX,Fu TD.BnaC.Tic40,a plastid inner membranetranslocon originating from Brassica oleracea,is essential for tapetalfunction and microspore development in Brassica napus.Plant J.2011,68:532-545；Li J,Hong DF,He JP,Ma L,Wan LL,Liu PW,Yang GS.Map-based cloning of arecessive genic male sterility locusin Brassica napus L.and development ofits functional marker.Theor Appl Genet.2012,125(2):223-234；Dun XL,Shen WH,Zhou ZF,Xia SQ,Wen J,Yi B,Shen JX,Ma CZ,Tu JX,Fu TD,LagercrantzU.Neofunctionalization of duplicated Tic40 genes caused a gain-of-functionvariation related to male fertility in Brassica oleracea lineages.Plantphysiol.2014,166:1403-1419)。进一步研究认为，9012A的育性只受2个位点(Bnms3和Bnrf)互作控制，BnMs4、BnRf和Bnrf之间是复等位基因(董发明,洪登峰,刘平武,谢彦周,何庆彪,杨光圣.甘蓝型油菜隐性细胞核雄性不育系9012AB遗传模式新释.华中农业大学学报,2010,29(3):262-267；俎峰,夏胜前,顿小玲,周正富,曾芳琴,易斌,文静,马朝芝,沈金雄,涂金星,傅廷栋.基于分子标记的油菜隐性核不育7-7365AB遗传模式探究.中国农业科学,2010,43(15):3067-3075)。后期在成功克隆BnRf基因基础上，解析了BnRf基因的功能与作用机理，明确了BnMs4、BnRf和Bnrf之间的关系(Deng ZH,Li X,Wang ZZ,Jiang YF,WanLL,Dong FM,Chen FX,Hong DF,Yang GS.Map based cloning reveals the complexorganization of the BnRf locus and leads to the identification of BnRfb,amale sterility gene,in Brassica napus.Theor Appl Genet.2016,129(1):53-64；XiaSQ,Wang ZX,Zhang HY,Hu KN,Zhang ZQ,Qin MM,Dun XL,Yi B,Wen J,Ma CZ,Shen JX,FuTD,Tu JX.Altered transcription and neofunctionalization of duplicated genesrescue the harmful effects of a chimeric gene in Brassica napus.PlantCell.2016,28(9):2060-2078)。油菜显性细胞核雄性不育系宜3A(或由其转育的不育系)的育性受到同一位点的三个复等位基因控制，BnMS5

发明内容

本发明的目的在于提供一种甘蓝型油菜雄性不育基因BnMS5

本发明提供了一种甘蓝型油菜雄性不育基因BnMS5

本发明还提供了上述技术方案所述基因BnMS5

本发明还提供了上述技术方案所述基因BnMS5

本发明还提供了含上述技术方案所述基因或所述cDNA的表达盒、表达载体或克隆载体。

本发明还提供了含上述技术方案所述基因、所述cDNA或者所述表达盒、表达载体或克隆载体的工程菌。

本发明还提供了上述技术方案所述基因在制备转基因植物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述基因、所述cDNA、所述表达盒、表达载体或克隆载体或者所述工程菌在油菜及其它作物品种改良中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述基因、所述cDNA、所述表达盒、表达载体或克隆载体或者所述工程菌在油菜基因工程雄性不育系统创制中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述基因或所述cDNA、所述表达盒、表达载体或克隆载体或者所述工程菌在调控油菜雄配子发育中的应用。

本发明提供了一种甘蓝型油菜雄性不育基因BnMS5

生物保藏说明

甘蓝型油菜(Brassica napus L.)8029A，于2020年08月17日保藏在中国典藏培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：P202006；

甘蓝型油菜(Brassica napus L.)8029B，于2020年08月17日保藏在中国典藏培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：P202007。

附图说明

图1是甘蓝型油菜功能互补测验表达载体pC2300-BnMS5

图2是具有TK5遗传背景的T

具体实施方式

本发明提供了一种甘蓝型油菜雄性不育基因BnMS5

本发明通过甲基磺酸乙酯(EMS)诱变获得一个BnMS5

本发明所述甘蓝型油菜雄性不育基因BnMS5

本发明还提供了上述技术方案所述基因BnMS5

本发明还提供了上述技术方案所述基因BnMS5

本发明还提供了含上述技术方案所述基因或所述cDNA的表达盒、表达载体或克隆载体。本发明所述表达载体优选通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射或电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中(Weissbach，1998，Method for PlantMolecular Biology VIII，Academy Press，New York，第411-463页；Geiserson和Corey，1998，Plant Molecular Biology，2nd Edition)。

本发明还提供了含上述技术方案所述基因或所述cDNA或上述技术方案所述表达盒、表达载体或克隆载体的工程菌。

本发明还提供了上述技术方案所述基因在制备转基因植物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述基因或所述cDNA或所述表达盒、表达载体或克隆载体或所述工程菌在油菜及其它作物品种改良中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述基因或所述cDNA或所述表达盒、表达载体或克隆载体或所述工程菌在油菜基因工程雄性不育系统创制中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述基因或所述cDNA或所述表达盒、表达载体或克隆载体或所述工程菌在调控油菜雄配子发育中的应用。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种甘蓝型油菜雄性不育基因BnMS5

以下结合附图和实施例详细说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆：实验室指南》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory，1989)中所述的条件，或者按照生产厂商提供的操作手册中建议的条件。

实施例1

甘蓝型油菜细胞核显性不育材料遗传规律分析

1、实验材料

本实验所用的材料为甘蓝型油菜细胞核显性两型系8029AB，其中不育株称为8029A(保藏于中国典藏培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：P202006)，可育株称为8029B(保藏于中国典藏培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：P202007)，8029AB来源于中国农业科学院油料作物研究所。甘蓝型油菜细胞核显性两型系8029A材料来源：在甘蓝型油菜TE5经EMS诱变后的M

2、细胞核显性不育材料遗传规律

采用经典遗传学方法，对不育材料8029A与育性正常甘蓝型油菜的杂交F

表1显性细胞核雄性不育系8029A遗传分析

实施例2

甘蓝型油菜显性细胞核不育基因BnMS5

Zeng等(2014)在甘蓝型油菜中发现温敏细胞核雄性不育系TE5A，并利用图位克隆技术克隆了不育基因BnMS5

甘蓝型油菜显性细胞核不育基因BnMS5

利用生物信息学分析，根据甘蓝型油菜BnMS5

实施例3

甘蓝型油菜显性细胞核不育基因BnMS5

1、BnMS5

本实施例采用植物表达载体pCAMBIA2300作为甘蓝型油菜转基因载体。该载体编码一个细菌复制起点(ori)、卡那霉素抗性基因(Kan’)、CaMV35S启动子、NOS基因的终止子以及限制性内切酶多克隆位点。通过分析携带候选基因的BAC克隆序列的酶切位点和候选基因的关系，利用引物ZT-1L、ZT-1R和高保真PCR技术(PhusionTM High-Fidelity DNAPolymerse，来自New England Biolads公司)扩增获得一个3.951kb的片段，ZT-1L(正向引物)：CCGGAATTCCTATTAATAAATTAATGACTCAGCT(SEQ ID NO.4)；ZT-1R(反向引物)：CAACTGCAGCCAAGAAGAGAATTGATTCCACA(SEQ ID NO.5)。该片段包含Ecol I和Pst I酶切位点。片段包括基因上游非翻译区1,417bp的序列、基因区间1,394bp的序列和下游非翻译区的1,124bp的序列。扩增片段用胶回收试剂盒(购自上海生工生物工程有限公司)回收,用Ecol I和PstI双酶切后回收3.94kb的片段,连接到经Ecol I和Pst I双酶切的表达载体pCAMBIA2300上(图2，甘蓝型油菜功能互补测验表达载体pC2300-BnMS5

正确的重组质粒通过冻融法导入农杆菌菌株GV1301。油菜遗传转化采用常规的农杆菌转化法转化油菜自交系TE5，种子灭菌用70％浓度的酒精浸泡种子15min，0.1％升汞消毒15min，20％～30％的次氯酸钠消毒15min，无菌水清洗3次，每次间隔5min。将灭菌的种子播于Medium 0培养基(配方见表2)，于25℃暗培养7d。在超净工作台内将获得的试管幼苗下胚轴切成0.5～0.8cm的小段，接种至含有农杆菌(悬浮过夜至对数生长期)的Medium 1上(配方见表2)浸染25～30min后，吸干液体，于25℃黑暗条件下共培养3d。将外植体转到Medium 2上的愈伤组织诱导培养基(配方见表2)上，于25℃光照培养15～18d。在将外植体转入Medium 3上分化培养基培养，每15～18d继代1次，直至分化出幼苗。当幼苗长至2～3cm高时，将幼苗转入Medium 4生根培养基上培养。转化植株生根后，假植于混有腐质土的细土纸杯中，保持70％相对湿度，一个月后移入大田。

提取阳性植株提取叶片总DNA，用引物NPT-F(5’-ACTGGGCACAACAGACAATCG-3’，SEQID NO.6)和NPT-R(5’-GCATCAGCCATGATGGATACTTT-3’，SEQ ID NO.7)通过PCR进一步鉴定转化植株。用转基因T0代观察育性的表现，验证导入的候选基因的功能。结果显示在20株转基因T0代植株中，有5株表现为花丝变短，花药干瘪退化，败育(见图2中的A，B)，经碘-碘化钾染色后正常可育单株花粉可染色(见图2中的C)，而不育单株则无可染花粉(见图2中的D)。

表2在遗传转化步骤中所用的各种培养基的配方

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院油料作物研究所

<120> 一种甘蓝型油菜雄性不育基因BnMS5e、cDNA、蛋白、载体、工程菌及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1397

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus L.)

<400> 1

atgagtaatt ctgcgcctgg agggtcgatg aagaggaagg ggggtgggcg taagcgtaat 60

ccagatgagc taattgttgt tgattccgag tatcgtgcgc caggacgttc atatcggcgc 120

ttggaaaaga agcgagaggc tcgccgtaag gctcagaggg aggagattta tcgaagagaa 180

gaagagacta ttcgtaaggc cgaggaggtt ttttggcgta aagtggatga aacagatgta 240

tgttatttat ttcctactta cttttgattt gattatataa taatcttctg ctaattgtta 300

ttatatattt ttaattaggg cttcgatatc gagatcgagg gtgctccttg ttattttggt 360

ggtatgagtg tttataaagg tggagtagat tgtccccttg tagtgaagct ttatgcaacg 420

gtgggacttc atcgttacaa tatgctagag gtaacacttt tgtatccatc atctatatta 480

tatctcttgt ttgtcgctgt aataactctt cttactcctc cattgtcagg ggaccaactt 540

gtatcttcac aaaatagaga aatacgttgt agtttgcacc ctcatgcctg tctcgtataa 600

cattactttg attgctgagg atccagctac ctcctccttt gttgttttcg agactaatgt 660

tgaccaaaga agtttaggcc agattgattt cacttgttat atctcaagac ctaaaggttt 720

aaatttaccg cgcttttctt tgtaattaat tgattattaa taaactataa taaatggatt 780

aatgtatttt gacttgtctc tctcactcta gggatcaaga gtgagattta tccgaaccag 840

ttcttcgatg ccaaggactt gcctgacaag tggccttcaa aggaggcttt tgctgatcaa 900

agtcgatttt tgtacaaggt ataataactc tttgatgaat atgacaaatg tataataaga 960

atgtgctttc atttcgccat gttttgcttc gcagatgcag aaatcagatt gggaagaaca 1020

tgactggatt cgcttgtata tggaaatttc gttctttaac agacataggt gcctgaatgt 1080

aaggtctttt tttaaatggt taaacttttt tttaatggtt tcttgtttat atataaaatg 1140

tgtttcttct tgtgttgttg cagcacaaca tgtctgattt aaagattctg gacgtagtgg 1200

tagagactga ggaaaatgtg ccacatgaga ctgtactcaa gagtcttagg aatgtccttg 1260

tctacataag atatgatcaa gacttgggag cggatggtgt ttgcaaacac atagccattg 1320

ttcgaagaac tgtcgagccg acaactcact gcgtttgtct cttgggcgag tctcagcttg 1380

tgcccgactc tgagtaa 1397

<210> 2

<211> 981

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus L.)

<400> 2

atgagtaatt ctgcgcctgg agggtcgatg aagaggaagg ggggtgggcg taagcgtaat 60

ccagatgagc taattgttgt tgattccgag tatcgtgcgc caggacgttc atatcggcgc 120

ttggaaaaga agcgagaggc tcgccgtaag gctcagaggg aggagattta tcgaagagaa 180

gaagagacta ttcgtaaggc cgaggaggtt ttttggcgta aagtggatga aacagatggc 240

ttcgatatcg agatcgaggg tgctccttgt tattttggtg gtatgagtgt ttataaaggt 300

ggagtagatt gtccccttgt agtgaagctt tatgcaacgg tgggacttca tcgttacaat 360

atgctagagg ggaccaactt gtatcttcac aaaatagaga aatacgttgt agtttgcacc 420

ctcatgcctg tctcgtataa cattactttg attgctgagg atccagctac ctcctccttt 480

gttgttttcg agactaatgt tgaccaaaga agtttaggcc agattgattt cacttgttat 540

atctcaagac ctaaagggat caagagtgag atttatccga accagttctt cgatgccaag 600

gacttgcctg acaagtggcc ttcaaaggag gcttttgctg atcaaagtcg atttttgtac 660

aagatgcaga aatcagattg ggaagaacat gactggattc gcttgtatat ggaaatttcg 720

ttctttaaca gacataggtg cctgaatcac aacatgtctg atttaaagat tctggacgta 780

gtggtagaga ctgaggaaaa tgtgccacat gagactgtac tcaagagtct taggaatgtc 840

cttgtctaca taagatatga tcaagacttg ggagcggatg gtgtttgcaa acacatagcc 900

attgttcgaa gaactgtcga gccgacaact cactgcgttt gtctcttggg cgagtctcag 960

cttgtgcccg actctgagta a 981

<210> 3

<211> 326

<212> PRT

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus L.)

<400> 3

Met Ser Asn Ser Ala Pro Gly Gly Ser Met Lys Arg Lys Gly Gly Gly

1 5 10 15

Arg Lys Arg Asn Pro Asp Glu Leu Ile Val Val Asp Ser Glu Tyr Arg

20 25 30

Ala Pro Gly Arg Ser Tyr Arg Arg Leu Glu Lys Lys Arg Glu Ala Arg

35 40 45

Arg Lys Ala Gln Arg Glu Glu Ile Tyr Arg Arg Glu Glu Glu Thr Ile

50 55 60

Arg Lys Ala Glu Glu Val Phe Trp Arg Lys Val Asp Glu Thr Asp Gly

65 70 75 80

Phe Asp Ile Glu Ile Glu Gly Ala Pro Cys Tyr Phe Gly Gly Met Ser

85 90 95

Val Tyr Lys Gly Gly Val Asp Cys Pro Leu Val Val Lys Leu Tyr Ala

100 105 110

Thr Val Gly Leu His Arg Tyr Asn Met Leu Glu Gly Thr Asn Leu Tyr

115 120 125

Leu His Lys Ile Glu Lys Tyr Val Val Val Cys Thr Leu Met Pro Val

130 135 140

Ser Tyr Asn Ile Thr Leu Ile Ala Glu Asp Pro Ala Thr Ser Ser Phe

145 150 155 160

Val Val Phe Glu Thr Asn Val Asp Gln Arg Ser Leu Gly Gln Ile Asp

165 170 175

Phe Thr Cys Tyr Ile Ser Arg Pro Lys Gly Ile Lys Ser Glu Ile Tyr

180 185 190

Pro Asn Gln Phe Phe Asp Ala Lys Asp Leu Pro Asp Lys Trp Pro Ser

195 200 205

Lys Glu Ala Phe Ala Asp Gln Ser Arg Phe Leu Tyr Lys Met Gln Lys

210 215 220

Ser Asp Trp Glu Glu His Asp Trp Ile Arg Leu Tyr Met Glu Ile Ser

225 230 235 240

Phe Phe Asn Arg His Arg Cys Leu Asn His Asn Met Ser Asp Leu Lys

245 250 255

Ile Leu Asp Val Val Val Glu Thr Glu Glu Asn Val Pro His Glu Thr

260 265 270

Val Leu Lys Ser Leu Arg Asn Val Leu Val Tyr Ile Arg Tyr Asp Gln

275 280 285

Asp Leu Gly Ala Asp Gly Val Cys Lys His Ile Ala Ile Val Arg Arg

290 295 300

Thr Val Glu Pro Thr Thr His Cys Val Cys Leu Leu Gly Glu Ser Gln

305 310 315 320

Leu Val Pro Asp Ser Glu

325

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccggaattcc tattaataaa ttaatgactc agct 34

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caactgcagc caagaagaga attgattcca ca 32

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

actgggcaca acagacaatc g 21

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcatcagcca tgatggatac ttt 23