生物学相关的正交细胞因子/受体对

摘要

本发明提供了工程化的正交细胞因子受体/配体对及其使用方法。

说明书

交叉引用

本专利申请案要求于2018年3月9日提交的编号为15/916,689的美国临时专利接续申请案的优先权，上述专利申请全文以引用方式并入本文中。

联邦资助的研究与开发

本发明专利获得了政府的支持，其中，美国国立卫生研究院的资助项目为AI513210。政府拥有本发明的某些权利。

背景技术

操纵细胞尤其是免疫细胞，以分化、开发特异性功能、扩大细胞数量，在临床上具有重要意义。本领域已知许多影响这些活性的蛋白质因子，特别是细胞因子和趋化因子。然而，这些信号分子对未靶向操纵的细胞也具有多效性，因此需要在靶细胞群中选择性激活信号传递的方法。尤其是工程化T细胞以进行受控行为是有意义的。例如，在过继性免疫疗法中，从血液中分离T细胞，离体处理，并重新注入患者体内。T细胞已被工程化应用于治疗，例如识别和杀死癌细胞、细胞内病原体和参与自身免疫的细胞。

基于细胞疗法中的一项关键挑战是在过继性转移的细胞中工程化期望的行为，例如激活，扩增等，其免受内源性信号传递途径的影响，不影响非靶向内源性细胞，且可受控曾给药的患者。这与T细胞工程化尤其相关，因为发育可塑性和环境因素在决定T细胞命运，功能和定位方面发挥巨大影响。

操纵蛋白质以独立于或正交于天然蛋白质或配体的影响的方式结合和响应修饰的配体的能力构成蛋白质工程化的重大挑战。迄今为止，已经产生了许多与类似的自然交互正交的合成配体-直接同源物-受体对。用于此研究的蛋白质包括了核激素受体和G蛋白偶联受体。尽管为设计由合成小分子配体激活的受体进行了大量工作，但生物学相关蛋白对的工程化仍然是一项重大挑战。

发明内容

本发明提供了工程化正交细胞因子受体/配体对及其使用方法。工程化(正交)细胞因子特异性结合对应的工程化(正交)受体。结合后，正交受体激活通过天然细胞元件转导的信号传递，以提供模拟该天然应答但对表达正交受体的工程化细胞特异的生物活性。正交受体表现出与内源性对应细胞因子(包括正交细胞因子的天然配对物)的结合显著降低，而正交细胞因子表现出与任何内源性受体(包括正交受体的天然配对物)的结合显着降低。在一些实施例中，正交细胞因子对正交受体的亲和力与天然细胞因子对天然受体的亲和力相当。

设计正交细胞因子-受体对的方法可包括以下步骤：(a)将氨基酸改变工程化为天然受体以破坏与天然细胞因子的结合；(b)产生多种细胞因子类似物，其具有选择性氨基酸改变受体结合的接触残基处的天然细胞因子，(c)选择与直接同源受体结合的细胞因子直接同源物；(d)丢弃与天然受体显着结合的直接同源细胞因子，或者可选地丢弃步骤(c)和(d)；(e)选择结合直接同源细胞因子的受体直接同源物；(f)丢弃与天然细胞因子结合的直接同源受体。在优选的实施例中，使用细胞因子/受体复合物结构的知识来选择用于定点或易错突变的氨基酸位置。酵母展示系统可以方便地用于选择过程，尽管其他显示和选择方法也是有用的。

在一些实施例中，提供了一种工程化细胞，其中通过引入本发明的正交受体来修饰细胞。任何细胞都可以用于此目的。在一些实施例中，细胞是T细胞，包括但不限于初始CD8

在一些实施例中，提供了包含编码正交受体的多核苷酸编码序列的载体，其中所述编码序列可操作地连接至在所需细胞中有活性的启动子。本领域已知各种载体并且可以用于此目的，例如病毒载体，质粒载体，微循环载体，其载体可以整合到靶细胞基因组中，或者可以维持附加体。所述受体编码载体可以在试剂盒中提供，与编码结合并激活受体的正交细胞因子的载体组合。在一些实施例中，所述正交细胞因子的编码序列可操作地与高表达启动子连接，并且可以针对生产进行优化。在其他实施例中，提供了一种试剂盒，其中编码正交受体的载体提供正交细胞因子的纯化组合物，例如以单位剂量包装用于患者给药(例如预填充注射器)。在一些其他实施例中，提供了一种试剂盒，其中向编码正交受体的载体提供编码正交细胞因子的载体，以使正交受体能够在细胞中表达，并且还表达旨在由同一细胞分泌的正交细胞因子以实现自分泌正交细胞因子受体信号传递。

在一些实施例中，提供了一种治疗方法，该方法包括向需要其的受体中引入工程细胞群，其中通过引入编码本发明正交受体的序列来修饰细胞群。所述细胞群可以离体工程化，并且通常相对于受体是自体的或同种异体的。在一些实施例中，在施用工程细胞后，引入的细胞群在体内与同源正交细胞因子接触。本发明的优点是正交细胞因子和天然受体之间缺乏交叉反应性。

附图说明

结合附图阅读以下详细说明，可获得对本发明最全面的理解。需要强调的是，根据惯例，附图的各种特征并非是按比例绘制的。相反，为了清楚起见，可任意扩大或缩小各个特征的尺寸。附图中包括以下图示：

图1-1(ii).正交IL-2/IL-2受体控制T细胞扩增。

图2.工程化正交IL-2/IL-2Rβ对的工作流程。

图3.正交小鼠IL-2Rβ变体的序列。

图4.mIL-2RβH134D Y135F突变消除了野生型mIL-2的结合。

图5.工程化正交IL-2/IL-2Rβ对的工作流程。

图6.表征的正交小鼠Il-2变体的序列。

图7.正交IL-2变体以与野生型IL-2和IL-2Rβ交互相似或更大的亲和力结合正交IL-2R。

图8.正交IL-2变体对野生型CD25阳性和CD25阴性脾细胞表现出钝化活性(磷酸化STAT5)

图9.表达正交IL-2R的小鼠CTLL-2T细胞的产生。

图10.第一组正交IL-2变体对正交T细胞具有选择性。

图11.正交IL-2变体在表达正交IL-2Rβ的CTLL-2细胞上诱导选择性STAT5磷酸化

图12.原发性淋巴结来源的T细胞经过工程化以表达正交IL-2Rβ(H134D Y135F)。

图13.正交IL-2变体在表达原代小鼠T细胞的正交IL-2Rβ上诱导选择性STAT5磷酸化。

图14.与野生型T细胞相比，正交IL-2变体诱导表达正交IL-2Rβ的CTLL-2细胞的选择性细胞生长。

图15.小鼠和人参考IL-2Rβ/IL-2序列的比对。人IL-2Rβ的部分序列作为SEQ IDNO:1，残基1-235提供；小鼠IL-2Rβ的部分序列作为SEQ ID NO:2，残基1-238提供。小鼠IL-2作为SEQ ID NO:3提供。人IL-2作为SEQ ID NO:4提供。

图16A-16D.正交人IL-2对的酵母进化。(图16A)酵母的FACS分析显示野生型人IL-2与野生型(蓝色直方图)结合，但不与正交(红色直方图)人IL-2RβH133D Y134F突变体四聚体结合。(图16B)将预测接近或接触人IL-2RβHY突变体的IL-2残基随机化的人IL-2突变体库(～1

图17.体内小鼠模型，用于证明小鼠中表达正交IL-2Rb的T细胞的选择性扩增或增加的生存。从表达CD45.2的野生型C57BL/6J小鼠的脾脏中分离供体细胞，用CD3/CD28离体活化，用编码正交IL-2Rb-IRES-YFP的逆转录病毒转导，在100IU/mL mIL-2中扩增2天，并使用小鼠CD8 T细胞分离试剂盒(Miltenyi)纯化。通过眼眶后注射，将野生型(CD45.2阳性，YFP阴性)和表达T细胞的正交IL-2Rb(CD45.2阳性，YFP阳性)的～1:1混合物过继转移到受体BL6.Rag2

图18A-18B.用于量化受体小鼠中供体T细胞扩增的门控策略。制备来自小鼠血液和脾脏的单细胞悬浮液，并在4℃下用Cd45.2-太平洋蓝染色1小时以鉴定供体T细胞。在流式细胞术之前，立即将细胞与1:2000稀释的碘化丙啶(PI)一起温育以进行活/死排除。基于前向和侧向散射(SSC-A v FSC-A)，单峰(FSC-A v FSC-H)，活细胞(PI阴性),以及野生型T细胞总数(CD45.2阳性，YFP阴性)和正交T细胞(CD45.2阳性，YFP阳性)，通过FACS定量对细胞进行门控。**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，使用Prism的单因素ANOVA测定。

图19.正交IL-2克隆1G12/149选择性地扩增小鼠中正交但不是野生型的T细胞。通过流式细胞术定量血液(10

图20A-20B.正交IL-2对正交IL-2RβT细胞具有选择性活性。(图20A)从IL-2KO NOD小鼠分离脾衍生的原代小鼠T细胞，进行病毒转染以表达正交IL-2Rβ的FACS分析，可以用IRES-YFP报告和IL-2Rβ的表面染色测定。T细胞还保留野生型IL-2Rβ的表达(图20B)正交IL-2在表达正交IL-2Rβ的T细胞上诱导选择性STAT5磷酸化，对野生型T细胞无活性。

图21A-21B.正交IL-2体外选择性扩增正交IL-2RβT细胞。(图21A)经病毒转染以表达正交IL-2Rβ的脾脏来源的原代小鼠T细胞的FACS分析，可以使用IRES-YFP进行确认。将转染的和未转染的T细胞的混合物在各种浓度的野生型，正交IL-2克隆1G12或3A10中培养5天，并通过FACS分析。IL-2扩增野生型和正交T细胞，而在正交IL-2 3A10中培养时仅正交T细胞扩增，而正交IL-2 1G12选择性扩增正交T细胞，对野生型T细胞的活性显著降低。显示的FACS图对应于在100nM IL-2,64pM正交IL-2 1G12和10μM正交IL-2 3A10中的培养物。(图21B)在增加浓度的细胞因子中培养5天后，对野生型和正交IL-2克隆1G12和3A10的野生型和正交T细胞增殖剂量反应。IL-2以相同的效力扩增野生型和正交T细胞，正交IL-2 1G12选择性扩增正交T细胞，正交IL-2 3A10特异性扩增正交T细胞。

图22A-22E.正交人IL-2在体外通过在YT细胞中表达的正交IL-2R发出信号。刺激20分钟后STAT5磷酸化的剂量反应。在表达人CD25(YT+)，不含(YFP-，WT)或含有(YFP+，正交)人正交IL-2Rb的YT人NK细胞系中测量Stat5磷酸化。(图22A)人IL-2或正交变体的小鼠血清白蛋白(MSA)融合物(图22B)1A1，(图22C)1C7，(图22D)SQVLKA或(图22E)SQVKqA在RPMI完全培养基中滴定并加入细胞中。将WT(YFP-)和正交Rb(YFP+)细胞的APC-pStat5染色的平均荧光强度(MFI)相对于细胞因子的浓度作图，并使用Prism 5(GraphPad)拟合对数(激动剂)与反应(三个参数)建模。1C7与其他蛋白质在另一天运行，并标准化为两天运行的野生型IL-2染色。所有数据均以平均值(n＝3)±标准差表示。

图23A-23B.正交人IL-2优先扩增表达正交IL-2R的人PBMC。用含有IRES-YFP(YFP+)的正交人IL-2Rβ的逆转录病毒分离，活化和转化人PBMC。YFP+细胞与总活细胞的初始比例为20％。在第1天用指定浓度的MSA-人IL-2(圆圈)或邻位变体MSA-SQVLKA(菱形)，MSA-SQVLqA(正方形)或MSA-1A1(三角形)铺板5x10

具体实施方式

为了更容易理解本公开内容，下面以及整个说明书中定义了某些术语和短语。本文提供的定义是非限制性的，并且应该考虑到本领域技术人员在发明时的所知。

定义

在进一步描述本方法和章节之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定方法或章节，因为在实际实施中一定会存在差异。还应当理解，本专利中使用的术语仅用于描述特定实施例，而无意限制本发明构思，本发明的范围将仅由所附权利要求书限定。

在提供数值范围的情况下，应当理解，该范围的上限和下限之间的每个中间值以及在该范围内的中间值都包含在本发明的范围内。除非上下文另有明确规定，否则每个中间值应低至下限单位的十分之一。本发明涵盖了在所述范围内的任何所述值或介入值与在该所述范围内的任何其他所述或介入值之间的每个较小范围。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在该范围内或排除在该范围内，并且也包括在本发明内，需遵守所述范围内任何特别排除的限值的要求。在所述范围包括一个或两个限值的条件下，排除了那些所包括限值中的任一个或两个的范围也包括在本发明内。

除非另有定义，否则本专利所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本专利所描述的方法和材料类似或等同的方法和材料也可用于本发明的实施或测试中，但下文描述了一些潜在和首选的方法和材料。本专利提及的所有出版物均以引用方式并入本文，以公开和描述与所引用出版物有关的方法和/或材料。应当理解，当存在矛盾时，本发明内容应取代所引用出版物中的任何公开内容。

需要注意的是，如本专利和所附权利要求书中所使用的，单数形式的“一”、“一个”和“所述/该”包括复数指代对象，除非上下文另有明确说明。因此，举例而言，“一个细胞”的指代对象包括多个此类细胞，而“所述肽”指的是一种或多种药剂及所属领域技术人员已知的等效物，例如多肽，等等。

本专利所讨论的出版物仅供在本专利的申请日之前披露。本文中没有任何内容可以解释为承认本发明凭借先前的发明没有权早于此类公开。此外，所提供的出版日期可能与实际出版日期不同，可能需要单独确认。

细胞因子受体和配体对包括但不限于以下受体：

“直接同源物”或“正交细胞因子/受体对”是指通过氨基酸改变而修饰的基因工程蛋白质对(a)对天然细胞因子或同源受体表现出显着降低的亲和力；和(b)特异性结合对应的工程化(正交)配体或受体。在正交配体结合后，正交受体激活通过天然细胞元件转导的信号传导，以提供模拟天然应答但对表达正交受体的工程细胞特异的生物活性。

正交受体表现出与其同源天然细胞因子配体的结合显着降低，而正交细胞因子表现出与其同源天然受体的结合显着降低。在一些实施例中，正交细胞因子对同源正交受体的亲和力与天然细胞因子对天然受体的亲和力相当，例如具有至少约1％天然细胞因子-受体对亲和力的亲和力，至少约5％、至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约100％，并且可以更高，例如天然细胞因子对天然受体的亲和力的2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多。

如本文所用，“不结合”或“不能结合”是指没有可检测的结合或不显着的结合，即具有远低于天然配体的结合亲和力。可以用竞争性结合实验确定亲和力，所述竞争性结合实验在各种浓度的未标记配体存在下测量受体与单一浓度的标记配体的结合。通常，未标记配体的浓度在至少六个数量级上变化。通过竞争性结合实验，可以确定IC

如本文所用，术语“特异性结合”是指一个分子与另一个分子结合的选择性或亲和力的程度。在结合对(例如配体/受体、抗体/抗原、抗体/配体、抗体/受体结合对)中，当结合对的第一分子不与样品中存在的其他组分显着量结合时，结合对的第一分子会特异性结合结合对的第二分子。当第一分子对第二分子的亲和力至少大两倍时，结合对的第一分子被称为特异性结合结合对的第二分子，至少十倍大，至少20倍大，或比第一分子对样品中存在的其他组分的亲和力大至少100倍。在一个具体实施例中，结合对的第一分子是抗体，如果该抗体对结合对的第二分子的亲和力大于约10

如本文所用，相对于正交配体与其同源受体的天然存在形式的结合，正交配体与正交受体结合的亲和力使用术语“表现出显著降低的结合”。在本发明的实践中，术语“表现出显着降低的结合”用于描述正交配体相对于天然存在的配体相对于天然存在的受体的比较结合和活性。如果正交配体与受体的天然形式结合少于20％，或者小于约10％，或者小于约8％，或者小于约6％，或者小于约4％，或者小于约2％，或者小于约1％，或者小于天然存在的配体的约0.5％，则正交配体相对于配体的天然形式表现出显著降低的结合。类似地，如果配体的天然形式以小于20％，或者小于约10％，或者小于约8％，或者小于约6％，或者小于约4％，或者小于约2％，或者小于约1％，或者小于天然存在的受体的约0.5％，与受体的正交形式结合，则正交受体相对于配体的天然形式表现出显着降低的结合。

正交IL-2多肽通过天然IL-2Rβ表现出显著降低的活化。可以在增殖测定中测量活性，例如，使用CTLL-2小鼠细胞毒性T细胞的增殖测定,参见Gearing,A.J.H.and C.B.Bird(1987)in Lymphokines and Interferons,A Practical Approach.Clemens,M.J.等.(编辑)：IRL Press.295.重组人IL-2的比活性约为2.1x 10

如本文参考多肽或DNA序列所用，术语“同一性”是指两个分子之间的序列同一性。两个氨基酸或两个核苷酸序列之间的相似性是相同位置数目的直接函数。通常，比对序列以获得最高阶匹配。如有必要，可以使用公开的技术和广泛可用的计算机程序来计算同一性，例如GCS程序包(Devereux et al.,Nucleic Acids Res.12:387,1984),BLASTP,BLASTN,FASTA(Atschul et al.,J.Molecular Biol.215:403,1990)。可以使用序列分析软件以及其默认参数,例如威斯康星大学生物技术中心(1710University Avenue，Madison，威斯康星州，53705)的遗传学计算机组的序列分析软件包，来测量序列同一性。

术语“多肽”、“蛋白质”或“肽”是指任何氨基酸残基链，无论其长度或翻译后修饰(例如糖基化或磷酸化)。

本文中的“蛋白质变体”或“变体蛋白质”或“变体多肽”是指通过至少一种氨基酸修饰而与野生型蛋白质不同的蛋白质。亲本多肽可以是天然存在的或野生型(WT)多肽，或者可以是WT多肽的修饰形式。术语变体多肽可以指多肽本身，包含多肽的组合物或编码它的核酸序列。与亲本多肽相比，变体多肽理想情况下包含至少一个氨基酸修饰，例如与母体相比，约1至约10个氨基酸修饰，并且优选与亲本相比约1至约5个氨基酸修饰。变体可以与野生型蛋白质至少约99％相同，至少约98％相同，至少约97％相同，至少约95％相同，至少约90％相同。

本文所用的“亲本多肽”，“亲本蛋白”，“前体多肽”或“前体蛋白”是指未修饰的多肽，其随后被修饰以产生变体多肽。亲本多肽可以是野生型(或天然)多肽。亲本多肽可以指多肽本身，包含亲本多肽的组合物或编码它的氨基酸序列。

本文中的“野生型”或“WT”或“天然”是指自然界中发现的氨基酸序列或核苷酸序列，包括等位基因变异。WT蛋白，多肽，抗体，免疫球蛋白，IgG等具有未被人工修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。

术语“接收者”、“个人”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用，指的是需要诊断，治疗或治疗的任何哺乳动物主题，尤其是人类。用于治疗目的“哺乳动物”是指分类为哺乳动物的任何动物，包括人类，家畜和农场动物，以及动物园，体育运动或宠物动物，如狗、马、猫、牛、绵羊、山羊、猪等。哺乳动物优选为人。

如本文所用，“治疗有效量”是指足以预防，治疗或控制疾病或病症的治疗剂例如过继性T细胞或正交细胞因子的量。治疗有效量可指足以延迟或最小化疾病发作的治疗剂的量，例如延迟或最小化癌症的扩散，或减少或增加来自感兴趣受体的信号传导的量效应。治疗有效量也可以指在疾病的治疗或管理中提供治疗益处的治疗剂的量。此外，关于本发明治疗剂的治疗有效量是指单独或与其他疗法组合的治疗剂的量，其在疾病的治疗或管理中提供治疗益处。

如本文所用，术语“预防”、“预防的”和“防止”是指由于施用预防剂而预防受试者中一种或多种病症的复发或发作或治疗剂。

如本文所用，术语“组合”是指使用一种以上的预防剂和/或治疗剂。术语“组合”的使用不限制患有病症的受试者施用预防剂和/或治疗剂的顺序。可以在(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之前)之前施用第一预防剂或治疗剂，伴随或之后(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周后)向患有病症的受试者施用第二预防剂或治疗剂。

白细胞介素2(IL-2)是主要由活化的CD4+T细胞产生的多能细胞因子，并且在产生正常的免疫应答中起关键作用。IL-2促进活化的T淋巴细胞的增殖和扩增，增强B细胞生长，并激活单核细胞和自然杀伤细胞。正是由于这些活性，IL-2被测试并被用作批准的癌症治疗(aldesleukin，

IL-2通过在与IL-2受体(IL-2R)相互作用时启动细胞信号传导途径来支持T淋巴细胞的存活和分化。Il-2在临床上用于治疗许多人类疾病，包括癌症和自身免疫，并且作为过继性T细胞疗法的佐剂以促进移植的T细胞的存活。然而，IL-2也可以通过激活脱靶细胞类型而具有相应的作用。

为了将IL-2的活性指向特定的T细胞亚群，本发明提供了工程化的正交IL-2和IL-2受体对。当与细胞表达的正交IL-2受体结合时，正交IL-2通过诱导有效的STAT5磷酸化和工程化表达正交IL-2Rbeta的T细胞的体外增殖来概括野生型IL-2的活性。正交IL-2相对于离体培养的野生型CD25阳性或阴性小鼠T细胞具有显著降低的结合。本公开的研究表明，重塑细胞因子受体界面以产生自然界中不存在的相互作用是将混杂细胞因子的活性引导至感兴趣的T细胞亚群的可行策略，从而能够通过基因工程精确控制T细胞功能。

除IL-2外，IL-15和IL-7还调节淋巴稳态，也被用作佐剂以加强过继性T细胞治疗。IL-2和IL-15共享相同的IL-2R-beta链。可以针对用于使IL-2正交的相同正交IL-2R-beta选择正交IL-15。IL-7利用独特的IL-7R-alpha链，其是正交化的靶标。

在一些实施例中，正交细胞因子，例如正交IL2，可以与另外的分子缀合以提供期望的药理学性质，例如延长半衰期。在一个实施例中，正交IL-2可以与IgG，白蛋白或其他分子的Fc结构域融合以延长其半衰期，例如通过本领域已知的PEG化，糖基化等。在一些实施例中，正交细胞因子与聚乙二醇分子缀合或“聚乙二醇化”。与正交细胞因子配体缀合的PEG的分子量包括但不限于分子量在5kDa和80kDa之间的PEG，在一些实施例中，PEG具有约5kDa的分子量，在一些实施例中，PEG具有约10kDa的分子量，在一些实施例中，PEG具有约20kDa的分子量，在一些实施例中，PEG具有约30kDa的分子量，在一些实施例中，PEG具有约40kDa的分子量，在一些实施例中，PEG具有约50kDa的分子量，在一些实施例中，PEG具有约60kDa的分子量。在一些实施例中，PEG具有约80kDa的分子量。在一些实施例中，分子量为约5kDa至约80kDa，约5kDa至约60kDa，约5kDa至约40kDa，约5kDa至约20kDa。在优选的实施例中，(其中以表1为参考命名多肽)，正交配体是1A1的PEG化形式，1C7的PEG化形式，SQVLKA的PEG化形式和/或SQVLqA的PEG化形式，在每种情况下，PEG具有约5kDa的分子量，或者10kDa，20kDa，或者30kDa，或者40kDa，或者40kDa，或者50kDa，或者30kDa。与多肽序列缀合的PEG可以是线性的或分支的。PEG可以直接连接到正交多肽上或通过接头分子连接。实现生物化合物的PEG化所必需的方法和化学反应在本领域中是众所周知的。

可以使用本领域已知的方法，例如通过与N-末端乙酰转移酶和例如乙酰-CoA的酶促反应，在N-末端乙酰化正交IL-2。正交IL-2可以在一个或多个赖氨酸残基处乙酰化，例如通过与赖氨酸乙酰转移酶的酶促反应。参见，如Choudhary等(2009).Science.325(5942):834-840.

Fc融合还可以赋予体内替代的Fc受体介导的性质。“Fc区”可以是天然存在的或合成的多肽，其与通过用木瓜蛋白酶消化IgG产生的IgG C-末端结构域同源。IgG Fc具有约50kDa的分子量。直接同源物IL-2多肽可以包括整个Fc区或保留延长其所属嵌合多肽的循环半衰期的能力的较小部分。另外，全长或片段化的Fc区可以是野生型分子的变体。也就是说，它们可以含有可能影响或可能不影响多肽功能的突变；如下所述的情况下都不需要天然活性。

在其他实施例中，正交多肽可以包含用作抗原标签的多肽，例如FLAG序列。FLAG序列被生物素化的，高度特异性的抗FLAG抗体识别，(参见Blanar等人，Science 256:1014,1992；LeClair等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:8145,1992).在一些实施例中，嵌合多肽还包含C末端C-myc表位标签。

如上所述，本发明的正交蛋白质可以作为嵌合多肽的一部分存在。除了或代替上述异源多肽之外，本发明的核酸分子可以包含编码“标记”或“报告”的序列。标记或报告基因的实例包括β-内酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、腺苷脱氨酶(ADA)、氨基糖苷磷酸转移酶(neo1，G418r)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、潮霉素B磷酸转移酶(HPH)、胸苷激酶(Tk)、lacz(编码β-半乳糖苷酶)和黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(XGPRT)。与许多与本发明实践相关的标准程序一样，熟悉本领域的技术人员将知道其他有用的试剂，例如，可以服务于标记或报道分子功能的其他序列。

正交细胞因子和受体还可以包括在细胞因子其他位置(例如，正交工程化中涉及的位置以外的位置)的保守修饰和替代物。这种保守替代物包括Dayhoff在Atlas ofProtein Sequence and Structure 5(1978)和Argos在EMBO J.，8:779-785(1989)中描述的那些。例如，属于以下组之一的氨基酸代表保守变化：组I:ala，pro，gly，gin，asn，ser，thr；组II:cys，ser，tyr，thr；组III:val，ile，leu，met，ala，phe；组IV:lys，arg，his；组V:phe，tyr，trp，his；和组VI:asp，glu。在每种情况下，可以评估附加修饰的引入，以最小化修饰多肽在待施用修饰多肽的生物体中的抗原性的任何增加。

术语“T细胞”是指可以通过表达CD3和/或T细胞抗原受体来表征的哺乳动物免疫效应细胞，可以将其工程化以表达正交细胞因子受体。在一些实施例中，T细胞选自初始CD8

在本发明的一个实施例中，表达正交受体的T细胞是已被修饰以表面表达嵌合抗原受体(“CAR-T”细胞)的T细胞。如本文所用，术语“嵌合抗原受体T细胞”和“CAR-T细胞”可互换使用，是指已被重组修饰以表达嵌合抗原受体的T细胞。如本文所用，可以改造CAR-T细胞以表达正交IL-2Rβ多肽。如本文所用，术语“嵌合抗原受体”和“CAR”可互换地用于指包含在序列中从氨基到羧基末端排列的多个功能结构域的多肽：(a)抗原结合结构域(ABD)，(b)跨膜结构域(TD)；(c)一个或多个细胞质信号传导结构域(CSD)，其中前述结构域可以任选地通过一个或多个间隔结构域连接。CAR还可以进一步包含在翻译后加工和CAR在细胞表面上呈递期间常规去除的信号肽序列。本发明的实践中有用的CAR根据本领域公知的原理制备。可参阅以下文献：Eshhaar等，2010年6月22日发布的美国专利号7,741,465B1；Sadelain等(2013)Cancer Discovery 3(4):388-398；Jensen and Riddell(2015)CurrentOpinions in Immunology 33:9-15；Gross等(1989)PNAS(USA)86(24):10024-10028；Curran等(2012)J Gene Med 14(6):405-15.可以修饰以掺入本发明的正交受体的市售CAR-T细胞产物的实例包括axicabtagene ciloleucel(市售自Gilead Pharmaceuticals的Yescarta)和tisagenlecleucel(市售自Novartis的Kymriah)。

如本文所用，术语抗原结合结构域(ABD)是指特异性结合靶细胞表面上表达的抗原的多肽。ABD可以是特异性结合靶细胞表面上表达的一种或多种抗原的任何多肽。在某些实施例中，靶细胞抗原是肿瘤抗原。可被CAR的ABD靶向的肿瘤抗原的实例包括选自该组的一种或多种抗原，包括但不限于CD19、CD20、HER2、NY-ESO-1、MUC1、CD123、FLT3、B7-H3、CD33、IL1RAP、CLL1(CLEC12A)PSA、CEA、VEGF、VEGF-R2、CD22、ROR1、间皮素、c-Met、糖脂F77、FAP、EGFRvIII、MAGE A3、5T4、WT1、KG2D配体、叶酸受体(Fra)和Wnt1抗原。

在一个实施例中，ABD是单链Fv(ScFv)。ScFv是由通过肽接头共价连接的抗体的免疫球蛋白重链和轻链的可变区组成的多肽(Bird等(1988)Science 242:423-426；Huston等.(1988)PNAS(USA)85:5879-5883；S-z Hu等.(1996)Cancer Research,56,3055-3061.基于单克隆抗体序列的ScFvs的产生在本领域中是众所周知的。参见例如The ProteinProtocols Handbook,John M.Walker,Ed.(2002)Humana Press Section 150“BacterialExpression,Purification and Characterization of Single-Chain Antibodies”Kipriyanov,S.可以优化用于制备scFvs的抗体,以通过本领域公知的技术如噬菌体展示和定向进化来选择具有特定期望特征(例如增强的亲和力)的分子。在一些实施例中，ABD包含抗CD19 scFv、抗PSA scFv、抗HER2 scFv、抗CEA scFv、抗EGFR scFv、抗EGFRvIII scFv、抗NY-ESO-1scFv、抗MAGE scFv、抗5T4 scFv或抗Wnt1 scFv。在另一个实施例中，ABD是通过用靶细胞衍生的抗原，特别是肿瘤抗原免疫骆驼或美洲驼而获得的单结构域抗体。参见例如Muyldermans,S.(2001)Reviews in Molecular Biotechnology 74:277-302。或者，可以通过产生肽文库并基本上根据教导或Wigler等人分离具有所需靶细胞抗原结合特性的化合物来完全合成产生ABD。1999年11月12日发布的美国专利No.6303313B1；Knappik等人，2004年2月24日发布的美国专利No.6696248B1，Binz等人。(2005)Nature Biotechnology 23:1257-1268,and Bradbury等。(2011)Nature Biotechnology 29:245-254.

ABD可能对多种靶抗原具有亲和力。例如，本发明的ABD可以包含嵌合双特异性结合成员，即能够提供与第一靶细胞表达的抗原和第二靶细胞表达的抗原的特异性结合。嵌合双特异性结合成员的非限制性实例包括双特异性抗体，双特异性缀合的单克隆抗体(mab)

在一些实施例中，任选地将接头多肽分子掺入抗原结合结构域和跨膜结构域之间的CAR中以促进抗原结合。Moritz and Groner(1995)Gene Therapy 2(8)539-546.在一个实施例中，接头是来自免疫球蛋白的铰链区，例如来自IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4中任何一个的铰链，特别是人蛋白质序列。替代方案包括免疫球蛋白的CH2CH3区域和部分CD3。在ABD是scFv的情况下，可以使用IgG铰链。在一些实施例中，接头包含氨基酸序列(G

在本发明的实践中有用的CAR还包括将ABD(或接头，如果使用的话)连接到CAR的细胞内胞质结构域的跨膜结构域。跨膜结构域由在真核细胞膜中热力学稳定的任何多肽序列组成。跨膜结构域可以源自天然存在的跨膜蛋白的跨膜结构域，也可以是合成的。在设计合成跨膜结构域时，优选有利于alpha-螺旋结构的氨基酸。用于构建CARs的跨膜结构域由大约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、22、23或24个氨基酸组成，有利于形成具有alpha-螺旋二级结构。有利于alpha-螺旋构象的氨基酸在本领域中是众所周知的。参见例如Pace等。(1998)Biophysical Journal 75:422-427。在alpha螺旋构象中特别受青睐的氨基酸包括蛋氨酸，丙氨酸，亮氨酸，谷氨酸和赖氨酸。在一些实施例中，CAR跨膜结构域可以源自I型跨膜蛋白的跨膜结构域，例如CD3δ、CD4、CD8、CD28等。

CAR多肽的细胞质结构域包含一个或多个细胞内信号结构域。在一个实施例中，细胞内信号结构域包含T细胞受体(TCR)的细胞质序列和在抗原受体接合后启动信号转导的共受体及其功能性衍生物及其亚片段。衍生自T细胞受体ζ-链的细胞质信号传导结构域，用作CAR的一部分，以便在嵌合受体与靶抗原结合后产生T淋巴细胞增殖和效应子功能的刺激信号。细胞质信号传导结构域的实例包括但不限于CD27的细胞质结构域，CD28的细胞质结构域，CD137的细胞质结构域(也称为4-1BB和TNFRSF9)，CD278的细胞质结构域(也称为ICOS)，PI3激酶的p110α，β或δ催化亚基，人Cd3δ-链，CD134胞浆区(也称为OX40和TNFζRSF4)，FcεR1γ和β链，MB1(Igα)链，B29(Igβ)链等)，CD3多肽(δ，Δ和ε)，syk家族酪氨酸激酶(Syk，ZAP 70等)，src家族酪氨酸激酶(Lck，Fyn，Lyn等)和其他参与T细胞转导的分子，如CD2，CD5和CD28。

在一些实施例中，CAR还可以提供共刺激结构域。术语“共刺激结构域”是指CAR的刺激结构域，通常是内结构域，其提供次级非特异性激活机制，通过该机制传播初级特异性刺激。共刺激结构域是指增强记忆细胞增殖，存活或发育的CAR部分。共刺激的实例包括通过T细胞受体的抗原特异性信号传导后的抗原非特异性T细胞共刺激和通过B细胞受体的信号传导后的抗原非特异性B细胞共刺激。共刺激，例如T细胞共刺激，以及涉及的因素已进行了描述Chen&Flies.(2013)Nat Rev Immunol 13(4):227-42.在此公开的一些实施例中，CSD包含TNFR超家族的一个或多个成员CD28、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、Dap10、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、Lck、TNFR-1、TNFR-II、Fas、CD30、CD40或其组合。

CAR通常被划分为第一代，第二代，第三代或第四代。术语第一代CAR是指CAR，其中细胞质结构域仅通过单个信号传导结构域传递来自抗原结合的信号，例如衍生自IgE FcεRIγ或Cd3δ链的高亲和力受体的信号传导结构域。该结构域含有一个或三个用于抗原依赖性T细胞活化的基于免疫受体酪氨酸的活化基序[ITAM]。基于ITAM的激活信号赋予T细胞裂解靶肿瘤细胞和分泌细胞因子以响应抗原结合的能力。第二代CAR还包括共刺激信号，除了CD3δ信号之外。巧合传递递送共刺激信号，增强了由CART转导的T细胞诱导的细胞因子分泌和抗肿瘤活性。共刺激结构域通常相对于CD3δ结构域是膜近端的。第三代CARs包括三方信号传导结构域，其包含例如CD28，CD3δ，OX40或4-1BB信号传导区域。在第四代中，或“装甲车”CAR T细胞被进一步基因修饰以表达或阻断分子和/或受体以增强免疫活性。

本发明的CAR中包含的细胞内信号传导结构域的实例包括(氨基到羧基)：CD3δ；CD28–41BB-CD3δ；CD28–OX40–CD3δ；CD28–41BB–CD3δ；41BB–CD-28--CD3δ和41BB–CD3δ。

术语CAR包括CAR变体，包括但不限于分裂CAR，开关CAR，双特异性或串联CAR，抑制性CAR(iCARs)和诱导多能干(iPS)CAR-T细胞。

术语“分裂CAR”是指CAR的细胞外部分，ABD和细胞质信号传导结构域存在于两个单独的分子上。CAR变体还包括开关CAR，其是条件可活化的CAR，例如包含分裂CAR，其中分裂CAR的两部分的条件异二聚化在药理学上受到控制。CAR分子及其衍生物(即CAR变体),例如在PCT申请号US2014/016527，US1996/017060，US2013/063083；Fedorov等。Sci TranslMed(2013)；5(215):215ra172；Glienke等。Front Pharmacol(2015)6:21；Kakarla&Gottschalk 52Cancer J(2014)20(2):151-5；Riddell等。Cancer J(2014)20(2):141-4；Pegram等。Cancer J(2014)20(2):127-33；Cheadle等。Immunol Rev(2014)257(1):91-106；Barrett等。Annu Rev Med(2014)65:333-47；Sadelain等。Cancer Discov(2013)3(4):388-98；Cartellieri等,J Biomed Biotechnol(2010)956304；其公开内容全部通过引用并入本文。

术语“双特异性或串联CAR”是指包含可以扩增或抑制初级CAR活性的次级CAR结合结构域的CAR。

术语“抑制性嵌合抗原受体”或“iCARs”在本文中可互换使用，指的是一种CAR，其中结合iCARs使用双重抗原靶向，通过与第二抑制性受体结合而关闭活性CAR的激活，该第二抑制性受体配备有二级CAR结合的抑制性信号传导结构域导致抑制初级CAR活化。抑制性CAR(iCAR)被设计为通过抑制性受体信号传导模块激活来调节CAR-T细胞活性。该方法结合了两种CAR的活性，其中一种产生显性负信号，限制由活化受体激活的CAR-T细胞的反应。当与仅由正常组织表达的特异性抗原结合时，iCAR可以关闭抵消激活剂CAR的反应。这样，iCARs-T细胞可以将癌细胞与健康细胞区分开，并以抗原选择性方式可逆地阻断转导的T细胞的功能。iCARs中的CTLA-4或PD-1细胞内结构域触发T淋巴细胞上的抑制信号，导致较少的细胞因子产生，较低效的靶细胞裂解和淋巴细胞运动性改变。

术语“串联CAR”或“TanCAR”是指通过两种嵌合受体的接合介导T细胞的双特异性活化的CAR，所述嵌合受体被设计为响应于两种不同肿瘤相关抗原的独立接合而递送刺激或共刺激信号。

通常，嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)是T细胞，其已经通过基本上按照上述教导用编码CAR的表达载体转导而重组修饰。

可以使用患者自身的T细胞制备细胞用于工程。因此，待施用的细胞群对受试者必然是可变的。另外，由于CAR-T细胞剂是可变的，对这些药剂的反应也可以变化，因此涉及对所述治疗相关毒性在施用CAR-T细胞治疗前用药理学免疫抑制或B细胞耗竭过程的持续监测和管理。这种免疫抑制方案的。实例包括全身性皮质类固醇(例如甲基强的松龙)。B细胞耗竭的疗法包括通过既定的临床剂量指南静脉注射免疫球蛋白(IVIG)，以恢复血清免疫球蛋白水平的正常水平。在一些实施例中，在施用本发明的CAR-T细胞疗法之前，受试者可以任选淋巴消耗方案。这种淋巴清除方案的一个实例包括给予氟达拉滨(每天30mg/m

用于用本文所述构建体工程化的T细胞包括初始T细胞，中枢记忆T细胞，效应记忆T细胞或其组合。从受试者或捐赠者收集用于如上所述的工程化的T细胞，或者可以通过富集所需细胞的技术将供体与细胞混合物分离，或者可以在不分离的情况下进行工程化和培养。适当的溶液可用于分散或悬浮。所述溶液通常是平衡盐溶液，例如，生理盐水、PBS、汉克平衡盐溶液等，其中适当地补充胎牛血清或其他天然存在的因子，以及低浓度(例如，5-25mM)的可接受缓冲液。方便的缓冲液包括HEPES，磷酸盐缓冲液，乳酸缓冲液等。亲和分离技术可能包括磁分离，使用抗体包被的磁珠，亲和层析，与单克隆抗体连接或与单克隆抗体结合使用的细胞毒性剂，例如补体和细胞毒素，并用附着于固体基质(例如板)或其他方便技术的抗体“淘选”。提供准确分离的技术包括荧光激活细胞分选仪，其可以具有不同程度的复杂性，例如多色通道，低角度和钝光散射检测通道，阻抗通道等。可以通过使用与死亡细胞相关的染料(例如碘化丙啶)。可以采用不会对所选细胞的活力造成不适当的损害的任何技术。亲和试剂可以是上述细胞表面分子的特异性受体或配体。除抗体试剂外，还可使用肽-MHC抗原和T细胞受体对；肽配体和受体；效应物和受体分子等。

可以将分离的细胞收集在维持细胞活力的任何合适的培养基中，通常在收集管底部具有血清缓冲。可以购买各种培养基，并可根据细胞的性质使用，包括经常补充胎牛血清(FCS)的dMEM，HBSS，DPBS，RPMI，Iscove的培养基等。收集的和任选富集的细胞群可以立即用于遗传修饰，或者可以在液氮温度下冷冻并储存，解冻并能够重复使用。细胞通常储存在10％DMSO，50％FCS，40％RPMI 1640培养基中。

在一些实施例中，工程细胞包含免疫细胞的复杂混合物，例如从需要治疗的个体分离的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。参见例如Yang and Rosenberg(2016)Adv Immunol.130:279-94,“Adoptive T Cell Therapy for Cancer；Feldman等(2015)Semin Oncol.42(4):626-39“Adoptive Cell Therapy-Tumor-Infiltrating Lymphocytes,T-Cell Receptors,and Chimeric Antigen Receptors”；Clinical Trial NCT01174121,“ImmunotherapyUsing Tumor Infiltrating Lymphocytes for Patients With Metastatic Cancer”；Tran等。(2014)Science 344(6184)641-645,“Cancer immunotherapy based onmutation-specific CD4+T cells in a patient with epithelial cancer”。

在一些实施例中，工程化T细胞相对于被治疗的个体是同种异体的，例如参见临床试验NCT03121625；NCT03016377；NCT02476734；NCT02746952；NCT02808442。参见综述Graham等。(2018)Cells.7(10)E155.在一些实施例中，同种异体工程化T细胞是完全HLA匹配的。然而，并非所有患者都具有完全匹配的供体，并且适合于所有独立于HLA类型的患者的细胞产物提供了替代方案。通用的“现成”T细胞产品在收获和制造的均匀性方面具有优势。

如上所述从受试者或捐赠者收集的用于工程的T细胞可以通过富集所需细胞的技术从细胞混合物中分离，或者可以在不分离的情况下工程化和培养。适当的溶液可用于分散或悬浮。所述溶液通常是平衡盐溶液，例如，生理盐水、PBS、汉克平衡盐溶液等，其中适当地补充胎牛血清或其他天然存在的因子，以及低浓度(例如，5-25mM)的可接受缓冲液。方便的缓冲液包括HEPES，磷酸盐缓冲液，乳酸缓冲液等。亲和分离技术可能包括磁分离，使用抗体包被的磁珠，亲和层析，与单克隆抗体连接或与单克隆抗体结合使用的细胞毒性剂，例如补体和细胞毒素，并用附着于固体基质(例如板)或其他方便技术的抗体“淘选”。提供准确分离的技术包括荧光激活细胞分选仪，其可以具有不同程度的复杂性，例如多色通道，低角度和钝光散射检测通道，阻抗通道等。可以通过使用与死亡细胞相关的染料(例如碘化丙啶)。可以采用不会对所选细胞的活力造成不适当的损害的任何技术。亲和试剂可以是上述细胞表面分子的特异性受体或配体。除抗体试剂外，还可使用肽-MHC抗原和T细胞受体对；肽配体和受体；效应物和受体分子等。可以将分离的细胞收集在维持细胞活力的任何合适的培养基中，通常在收集管底部具有血清缓冲。可以购买各种培养基，并可根据细胞的性质使用，包括经常补充胎牛血清(FCS)的dMEM，HBSS，DPBS，RPMI，Iscove的培养基等。收集的和任选富集的细胞群可以立即用于遗传修饰，或者可以在液氮温度下冷冻并储存，解冻并能够重复使用。细胞通常储存在10％DMSO，50％FCS，40％RPMI 1640培养基中。工程细胞可以通过任何方便的给药途径(通常在血管内)在任何生理学上可接受的培养基中输注给受试者，尽管它们也可以通过其他途径引入，其中细胞可以找到合适的生长位点。通常，将施用至少1×10

本发明实践中使用的同种异体T细胞可以进行遗传修饰以减少移植物抗宿主病。例如，本发明的工程细胞可以是通过基因编辑技术实现的TCRαβ受体敲除。TCRαβ是异二聚体，α和β链都需要存在才能表达。单个基因编码α链(TRAC)，而有2个基因编码β链，因此TRAC基因位点KO已被删除用于此目的。已经使用许多不同的方法来实现这种删除，例如CRISPR/Cas9；大范围核酸酶；工程化的I-CreI归巢核酸内切酶等。参见例如Eyquem等(2017)Nature 543:113–117,其中TRAC编码序列被CAR编码序列取代；Georgiadis等(2018)Mol.Ther.26:1215–1227，它通过规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas9将CAR表达与TRAC碎片联系起来，而无需将CAR直接整合到TRAC基因位点中。预防GVHD的替代策略修饰T细胞以表达TCRαβ信号传导的抑制剂，例如使用截短形式的Cd3δ作为TCR抑制分子。

本发明的实践中有用的T细胞的制备通过用包含编码正交受体的核酸序列的表达载体转化分离的T细胞；任选与上述所述编码CAR的核酸序列组合来实现。编码CAR和正交受体的核酸序列可以各自提供在单独的表达载体上，每个核酸序列可操作地连接到一个或多个表达控制元件以实现CAR和正交受体在靶细胞中的表达，载体被共转染到靶细胞中。或者，编码CAR和正交受体的核酸序列可以各自在一个或多个表达控制元件控制下的每个核酸序列的单个载体上提供，以实现相关核酸序列的表达。或者，两种核酸序列都可以在单个启动子的控制下，其中插入或下游控制元件促进两种序列与载体的共表达。

离体T细胞活化可以通过本领域公认的程序实现，包括基于细胞的T细胞活化，基于抗体的活化或使用各种基于珠子的活化试剂的活化。基于细胞的T细胞活化可以通过将T细胞暴露于抗原呈递细胞如树突细胞或人造抗原呈递细胞如经照射的K562细胞来实现。用可溶性抗CD3单克隆抗体基于抗体的T细胞表面CD3分子活化也支持在IL-2存在下的T细胞活化。

通常，通过培养与表面接触的细胞来扩增本发明的T细胞，所述表面提供刺激CD3TCR复合物相关信号的试剂(例如抗CD3抗体)和刺激T细胞表面上的共刺激分子的试剂(例如抗CD28抗体)。基于磁珠的T细胞活化已经在本领域中被接受用于制备用于临床的CAR-T细胞。可以使用市售的T细胞活化试剂实现基于磁珠的T细胞活化，所述T细胞活化试剂包括但不限于

当正交受体或表达正交受体的CAR-T细胞是生长因子受体时，表达正交受体的CAR-T细胞也可以通过使用正交受体的配体从背景或转导和未转导细胞的混合群体中选择性扩增。在一个实施例中，正交受体是正交IL-2受体，用于扩增此类细胞的正交IL-2化合物是选自表1中组的正交IL-2。

在本方法中，可以通过重组方法产生正交蛋白，特别是正交细胞因子。可以将正交受体在表达载体上引入待工程化的细胞中。编码正交蛋白质的DNA可以从工程过程中设计的各种来源获得。

如本文所述，通过在编码序列中引入适当的核苷酸变化来制备氨基酸序列变体。此类变体代表所述残基的插入，取代和/或指定的删除。只要最终构建体具有如本文所定义的所需生物活性，就进行插入，取代和/或指定删除的任何组合以得到最终构建体。

为了实现重组蛋白的表达，将编码正交蛋白(和/或CAR)的核酸插入可复制载体中进行表达。许多这样的载体是可用的。载体组分通常包括但不限于以下一种或多种：复制起点，一种或多种标记基因，增强子元件，启动子和转录终止序列。载体包括病毒载体，质粒载体，整合载体等。

用于在T细胞中表达正交受体和任选CAR的表达载体可以是病毒载体或非病毒载体。质粒是非病毒载体的实例。为了促进靶细胞的转染，可以在促进非病毒载体摄取的条件下用非病毒载体直接暴露靶细胞。促进哺乳动物细胞摄取外源核酸的条件的实例在本领域中是众所周知的，并且包括但不限于化学手段(例如

在一个实施例中，可以在非病毒传递系统中提供非病毒载体。非病毒传递系统通常是促进用核酸货物转导靶细胞的复合物，其中核酸与诸如阳离子脂质(DOTAP，DOTMA)，表面活性剂，生物制剂(明胶，壳聚糖)，金属(金，磁性铁)和合成聚合物(PLG，PEI，PAMAM)。非病毒递送系统的许多实施例在本领域中是众所周知的，包括脂质载体系统(Lee等(1997)Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.14:173-206)；polymer coated liposomes(Marin d等,美国专利。1993年5月25日发布的第5213804号；Woodle等，美国专利。1991年5月7日发布的第5013556号)；阳离子脂质体(Epand等，美国专利。1994年2月1日发布的第5283185号；Jessee，J.A.，美国专利。1996年11月26日发布的第5578475号；Rose等，美国专利。1994年1月18日发布的第5279833号；Gebeyehu等，美国专利。1994年8月2日发布的5334761号)。

在另一个实施例中，表达载体可以是病毒载体。当病毒载体系统用于CAR并表达正交受体时，逆转录病毒或慢病毒表达载体是优选的。尤其是，病毒载体是gamma逆转录病毒(Pule,等(2008)Nature Medicine 14(11):1264-1270),self-inactivating lentiviralvectors(June,等(2009)Nat Rev Immunol 9(10):704-716)和逆转录病毒载体，正如之前所述，Naldini,等(1996)Science 272:263-267；Naldini,等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.93,pp.11382-11388；Dull,等(1998)J.Virology 72(11):8463–8471；Milone,等(2009)17(8):1453-1464；Kingsman,等2000年8月1日发布的美国专利号6096538和Kingsman等2005年8月2日发布的美国专利号6924123。在本发明的一个实施例中，CAR表达载体是可从Oxford Biomedica获得的慢病毒载体。

用表达载体转导T细胞可以使用本领域公知的技术完成，包括但不限于与宿主T细胞与病毒载体共孵育，电穿孔和/或化学增强传递。

正交蛋白质不仅可以直接重组产生，而且可以作为具有异源多肽的融合多肽，例如在成熟蛋白质或多肽的N-末端具有特异性切割位点的信号序列或其他多肽重组产生。通常，信号序列可以是载体的组件，或者它可以是插入载体的编码序列的一部分。优选选择的异源信号序列是宿主细胞识别和处理(即，被信号肽酶切割)的信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可以使用天然信号序列，或者其他哺乳动物信号序列，例如来自相同或相关物种的分泌多肽的信号序列，以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gD信号。

表达载体通常含有选择基因，也称为选择标记。该基因编码在选择性培养基中生长的转化宿主细胞的存活或生长所必需的蛋白质。未用含有选择基因的载体转化的宿主细胞将不能在培养基中存活。典型的选择基因编码的蛋白质(a)赋予对抗生素或其他毒素(例如氨苄青霉素，新霉素，甲氨蝶呤或四环素)的抗性，(b)补充营养缺陷型，或(c)提供复杂培养基无法获得的关键营养素。

表达载体将含有被宿主生物体识别并可操作地连接至正交蛋白质编码序列的启动子。启动子是位于结构基因起始密码子上游(5')的非翻译序列(通常在约100至1000bp内)，其控制与其可操作连接的特定核酸序列的转录和翻译。这样的启动子通常分为诱导型和组成型两类。诱导型启动子是响应于培养条件的一些变化(例如，营养物的存在或不存在或温度变化)从其控制下的DNA启动增加的转录水平的启动子。众所周知，多种潜在宿主细胞识别的大量启动子。

来自哺乳动物宿主细胞中载体的转录可以例如通过从病毒基因组获得的启动子来控制，所述病毒例如多瘤病毒，禽痘病毒，腺病毒(例如腺病毒2)，牛乳头瘤病毒，禽肉瘤病毒，巨细胞病毒，逆转录病毒(如鼠干细胞病毒)，乙型肝炎病毒和大多数优选地，来自异源哺乳动物启动子，例如肌动蛋白启动子，PGK(磷酸甘油酸激酶)或免疫球蛋白启动子的猿猴病毒40(SV40)，条件是这些启动子与宿主细胞系统相容。SV40病毒的早期和晚期启动子可方便地作为SV40限制性片段获得，其也含有SV40病毒复制起点。

高等真核生物的转录通常通过将增强子序列插入载体而增加。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约10至300bp，其作用于启动子以增加其转录。增强子是相对方向和位置独立的，已经在转录单元的5’和3'，内含子内以及编码序列本身内发现。现在从哺乳动物基因(珠蛋白，弹性蛋白酶，白蛋白，甲胎蛋白和胰岛素)已知许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括复制起点后期的SV40增强子，巨细胞病毒早期启动子增强子，复制起点后期的多瘤增强子和腺病毒增强子。增强子可以在编码序列的5’或3’位置剪接到表达载体中，但优选位于距启动子5'的位点。

用于真核宿主细胞的表达载体还将含有终止转录和稳定mRNA所必需的序列。这些序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA的5’和偶尔3’非翻译区域获得。含有一种或多种上述组分的合适载体的构建采用标准技术。

用于在本文载体中克隆或表达DNA的合适宿主细胞是上述原核生物，酵母或高等真核生物细胞。有用的哺乳动物宿主细胞系，例如小鼠L细胞(L-M[TK-]，ATCC CRL-2648)，由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(293或293细胞亚克隆用于悬浮培养中的生长；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO)；小鼠支持细胞(TM4)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；三细胞；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(HepG2)。

可以用上述表达载体转染宿主细胞，包括工程化T细胞，用于正交IL-2或IL-2R表达。可以在适合于诱导启动子，选择转化体或扩增编码所需序列的基因的常规营养培养基中培养细胞。哺乳动物宿主细胞可以在各种培养基中培养。市售培养基如Ham's F10(Sigma)，Minimal Essential Medium((MEM),Sigma)，RPMI 1640(Sigma)和Dulbecco'sModified Eagle's Medium((DMEM),Sigma)适用于培养宿主细胞。这些培养基中的任何一种都可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素，转铁蛋白或表皮生长因子)，盐(如氯化钠，钙，镁和磷酸盐)，缓冲液(如HEPES)，核苷(如腺苷和胸苷)，抗生素，微量元素，和葡萄糖或等效能源。任何其他必需的补充剂也可以以本领域技术人员已知的适当浓度包括在内。培养条件，例如温度，pH等，是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的培养条件，并且对于通常技术人员而言是显然的。

当与另一个核酸序列处于功能关系时，核酸被“可操作地连接”。例如，如果信号序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其可操作地与多肽的DNA连接；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则其可操作地与编码序列连接；或者如果核糖体结合位点被定位以促进翻译，则其可操作地连接至编码序列。通常，“可操作连接”是指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下是连续的并且处于阅读阶段。但是，增强器不必是连续的。

重组产生的正交多肽可以作为分泌多肽从培养基中回收，尽管它也可以从宿主细胞裂解物中回收。蛋白酶抑制剂，例如苯基甲基磺酰氟(PMSF)也可用于抑制纯化过程中的蛋白水解降解，并且可包括抗生素以防止外来污染物的生长。本领域已知各种纯化步骤并可用于,例如亲和层析。亲和层析利用通常存在于生物大分子中的高度特异性结合位点，分离分子结合特定配体的能力。共价键以明显地将配体呈递给蛋白质样品的方式将配体连接到不溶性多孔载体介质上，从而使用一种分子物质的天然生物特异性结合从混合物中分离和纯化第二种物质。抗体通常用于亲和层析。也可以使用尺寸选择步骤，例如使用凝胶过滤色谱法(也称为尺寸排阻色谱法或分子筛色谱法)根据其大小分离蛋白质。在凝胶过滤中，蛋白质溶液通过填充有半透性多孔树脂的柱。半透性树脂具有一系列孔径，可确定可与色谱柱分离的蛋白质大小。同样适用于阳离子交换色谱。

可以使用本领域已知的方法浓缩，过滤，透析等正交细胞因子组合物。对于治疗应用，可以将细胞因子施用于包含适当工程化正交受体的哺乳动物。静脉内给药，作为推注或通过连续输注一段时间。替代的给药途径包括肌内，腹膜内，脑脊髓内，皮下，关节内，滑膜内，鞘内，口服，局部或吸入途径。正交细胞因子也适当地通过肿瘤内，肿瘤周围，病灶内或病灶周围途径或淋巴施用，以发挥局部和全身治疗效果。

这种剂型包括生理上可接受的载体，其本质上是无毒的和非治疗性的。此类载体的实例包括离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白如人血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质如硫酸鱼精蛋白、氢二钠磷酸盐、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质和PEG。用于局部或基于凝胶的多肽形式的载体包括多糖，例如羧甲基纤维素钠或甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚氧乙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物、PEG和木蜡醇。对于所有给药，都适当使用传统的仓库形式。这些形式包括例如微胶囊、纳米胶囊、脂质体、膏药、吸入剂型、鼻喷雾剂、舌下片剂和缓释制剂。多肽通常以约0.1μg/ml至100μg/ml.的浓度配制在此类载体中。

如果本公开的直接同源物IL-2多肽是“实质上纯”，它们可以是目的多肽的重量至少约60％(干重)，例如含有直接同源物IL-2氨基酸序列的多肽。例如，多肽可以是感兴趣的多肽重量的至少约75％，约80％，约85％，约90％，约95％或约99％。纯度可以通过任何合适的标准方法测量，例如柱色谱，聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析。

在本发明的另一个实施例中，提供了含有用于处理上述条件的材料的制造物品。制造物品包括容器和标签。合适的容器包括例如瓶子，小瓶，注射器和试管。容器可以由各种材料形成，例如玻璃或塑料。该容器保持有效治疗病症的组合物并且可以具有无菌进入口(例如，该容器可以是静脉内溶液袋或具有可通过皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的活性剂是正交细胞因子。容器上或与容器相关的标签表明该组合物用于处理所选条件。另外的容器可以随制造物品提供，所述制造物品可以容纳例如药学上可接受的缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水，林格氏溶液或葡萄糖溶液。制造物品可以进一步包括从商业和用户的角度来看所需的其他材料，包括具有使用说明的其他缓冲液，稀释剂，过滤器，针头，注射器和包装插页。

如本文所用，术语“癌症”(或“癌症的”)，“过度增殖性”和“肿瘤性”是指具有自主生长能力的细胞(例如，以快速增殖的细胞生长为特征的异常状态或病症)。过度增殖和肿瘤疾病状态可以分类为病理性的(例如，表征或构成疾病状态)，或者它们可以分类为非病理性的(例如，作为偏离正常但与疾病状态无关)。这些术语旨在包括所有类型的癌性生长或致癌过程，转移组织或恶性转化的细胞，组织或器官，而与组织病理学类型或侵袭阶段无关。“病理性过度增殖”细胞发生在以恶性肿瘤生长为特征的疾病状态。非病理性过度增殖细胞的实例包括与伤口修复相关的细胞增殖。术语“癌症”或“肿瘤”是指各种器官系统的恶性肿瘤，包括影响肺、乳腺、甲状腺、淋巴腺和淋巴组织、胃肠器官和泌尿生殖道的恶性肿瘤，以及通常被认为包括恶性肿瘤的腺癌，例如大多数结肠癌、肾细胞癌、前列腺癌和/或睾丸肿瘤、肺的非小细胞癌、小肠癌和食道癌。

术语“癌”是领域所认可的，是指上皮或内分泌组织的恶性肿瘤，包括呼吸系统癌、胃肠系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、内分泌系统癌和黑素瘤。“腺癌”是指源自腺体组织或其中肿瘤细胞形成可识别的腺体结构的癌。

肿瘤细胞的例子包括但不限于AML、ALL、CML、肾上腺皮质癌、肛门癌、再生障碍性贫血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨转移、脑癌、中枢神经系统(CNS)癌症、周围神经系统(PNS)癌症、乳腺癌、宫颈癌、儿童非霍奇金淋巴瘤、结肠癌和直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、尤因氏肿瘤家族(例如尤因氏肉瘤)、眼癌、胆囊癌、胃肠道类癌、胃肠道间质瘤、妊娠滋养细胞疾病、霍奇金淋巴瘤、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌和下咽癌、肝癌、肺癌、肺癌、非霍奇金淋巴瘤、男性乳腺癌、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症、骨髓增生性疾病、鼻腔和鼻旁癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔和口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、黑素瘤皮肤癌、非黑素瘤皮肤癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫癌(例如子宫肉瘤)、移行细胞癌、阴道癌、外阴癌、间皮瘤、鳞状细胞或表皮样癌、支气管腺瘤、绒毛膜癌、头颈癌、畸胎癌或Waldenstrom巨球蛋白血症。与非癌细胞相比，癌细胞表现出增加的CD47表达的任何癌症是通过受试者方法和组合物治疗的合适癌症。

本发明的组合物和方法可以与另外的治疗剂组合。例如，当疾病，待治疗的病症或病症是肿瘤疾病(例如癌症)。本发明的方法可以与常规化学治疗剂或其他生物抗癌药物例如检查点抑制剂(例如PD1或PDL1抑制剂)或治疗性单克隆抗体(例如阿瓦斯汀，赫赛汀)组合。

本领域中鉴定为可用于治疗肿瘤疾病的化学剂的例子包括但不限于阿比曲沙、阿霉素、阿霉素、阿霉素、氨苄青霉素、天冬酰胺酶、蒽环类、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、BiCNU、硫酸博来霉素、白消安、博来霉素、喜树碱、喜树碱、卡铂、卡莫司汀、盐酸佐柔比星、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、更生霉素、阿糖胞苷、赛德萨、环磷酰胺、环磷酰胺、放线菌素、多西紫杉醇、多柔比星、柔红霉素、表阿霉素、爱施巴、表柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟达拉、吉西他滨、吉扎尔、美新、羟基脲、爱治、伊达霉素、伊达比星、异环磷酰胺、环磷酰胺、伊立替康、兰维斯、白细胞介素、亮抑素、甲基苄肼、氮芥、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、光神霉素、密吐霉素、马勒兰、阿托胞苷、诺维本、喷司他丁、盐酸米托恩醌、长春碱、奥沙利铂、紫杉醇、伯尔定、脱氧助间型霉素、顺氯氨铂、普卡霉素、甲苄肼、乐疾宁、雷替曲塞、泰索帝、泰素、替尼泊甙、硫鸟嘌呤、雷替曲塞、拓扑替康、戊柔比星、长春花碱、凡毕士、长春碱、长春地辛、长春新碱、长春瑞滨、VP-16和足叶噻吩昔。

可以联合给药的靶向治疗可能包括酪氨酸激酶抑制剂，如甲磺酸伊马替尼(Gleevec，也称为STI-571)、吉非替尼(Iressa，也称为Zd1839)、厄洛替尼(市售Tarceva)、索拉非尼(Nexavar)、舒尼替尼(Sutent)、达沙替尼(Sprycel)、拉帕替尼(Tykerb)、尼洛替尼(Tasigna)和硼替佐米(Velcade)，鲁索替尼(ruxolitinib)；Janus激酶抑制剂，如托法替尼；ALK抑制剂，如克唑替尼；Bcl-2抑制剂，如甲磺酸盐，维奈妥拉和棉酚；FLT3抑制剂，如米哚妥林(Rydapt)，IDH抑制剂，如AG-221，PARP抑制剂，如Iniparib和奥拉帕尼；PI3K抑制剂，如哌立福新；VEGF受体2抑制剂，如阿帕替尼；与[D-Lys(6)]-LHRH连接的AN-152(AEZS-108)多柔比星；Braf抑制剂，如维罗非尼，达拉菲尼和LGX818；MEK抑制剂，如曲美替尼；CDK抑制剂，如PD-0332991和LEE011；Hsp90抑制剂，如盐霉素；和/或小分子药物缀合物，如长春瑞滨；丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，如替西罗莫司(Torisel)、依维莫司(Afinitor)、维罗非尼(Zelboraf)、曲美替尼(Mekinist)和达拉菲尼(Tafinlar)。

本领域鉴定的用于治疗肿瘤疾病的生物制剂的实例包括但不限于细胞因子或细胞因子拮抗剂如IL-12、INFα或抗表皮生长因子受体、放射疗法、伊立替康；四氢叶酸抗代谢物如培美曲塞；抗肿瘤抗原的抗体、单克隆抗体和毒素、T细胞佐剂、骨髓移植或抗原呈递细胞(例如树突细胞疗法)，抗肿瘤疫苗、具有复制能力的病毒、信号转导抑制剂(例如，

可以与抗CD93ABD多肽或工程细胞组合施用的肿瘤特异性单克隆抗体可以包括但不限于利妥昔单抗(市售为MabThera或Rituxan)，阿仑单抗，帕尼单抗，伊匹单抗(Yervoy)等。

在一些实施例中，本发明的组合物和方法可以与免疫检查点疗法组合。免疫检查点疗法的实例包括PD1与PDL1和/或PDL2结合的抑制剂。PD1与PDL1和/或PDL2抑制剂在本领域中是众所周知的。干扰PD1与PDL1和/或PDL2结合的市售单克隆抗体的例子包括纳武单抗(

在其他实施例中，本发明的方法用于治疗感染。如本文所用，术语“感染”是指生物体(即受试者)的至少一个细胞中的任何状态被感染因子感染(例如，受试者具有细胞内病原体感染，例如慢性细胞内病原体感染)。如本文所用，术语“感染因子”是指在感染生物体的至少一个细胞中诱导增加的CD47表达的外来生物实体(即病原体)。例如，感染因子包括但不限于细菌，病毒，原生动物和真菌。细胞内病原体特别令人感兴趣。传染病是由传染媒介引起的疾病。一些传染因子在某些条件下不会引起可识别的症状或疾病，但在变化的条件下有可能引起症状或疾病。主题方法可用于治疗慢性病原体感染，例如包括但不限于病毒感染，例如逆转录病毒，慢病毒，肝炎病毒，疱疹病毒，痘病毒，人乳头瘤病毒等；细胞内细菌感染，例如分枝杆菌，衣原体，埃立克体，立克次体，布鲁氏菌，军团菌，弗朗西斯氏菌，李斯特菌，柯萨菌，奈瑟菌，沙门氏菌，耶尔森氏菌属，幽门螺杆菌等；和细胞内原生动物病原体，例如疟原虫属，锥虫属，贾第虫属，弓形虫属，利什曼原虫属等。

治疗可以与其他活性剂组合。抗生素类别包括青霉素，例如青霉素G、青霉素V、甲氧西林、苯唑西林、羧苄青霉素、萘夫西林、氨苄青霉素等；青霉素与β-lactamaseinhibitors,cephalosporins,例如头孢克洛、头孢唑林、头孢呋辛、莫沙内酰胺等组合；碳青霉烯类；单环胺；氨基糖苷类；四环素类；大环内酯类；lincomycins；多粘菌素；磺胺类；喹诺酮类；氯硝苯类；甲硝唑；壮观霉素；甲氧苄啶；万古霉素等。还可包括细胞因子，例如干扰素γ，肿瘤坏死因子α，白细胞介素12等。抗病毒剂，例如阿昔洛韦，更昔洛韦等也可用于治疗。

在其他实施例中，调节性T细胞被设计用于治疗自身免疫疾病。炎症性疾病和与炎症相关的疾病的范围很广，包括类风湿性关节炎(Ra)、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化症(MS)和自身免疫性肝炎等自身免疫性疾病；胰岛素依赖性糖尿病、退行性疾病，如骨关节炎(Oa)、阿尔茨海默氏病(AD)和黄斑变性。

许多(如果不是大多数的话)自身免疫和炎性疾病涉及多种类型的T细胞，例如TH1、TH2、TH17等。自身免疫性疾病的特征是T和B淋巴细胞异常靶向自身蛋白质，多肽，肽和/或其他自身分子，导致体内器官，组织或细胞类型的损伤和/或功能障碍(例如，胰腺、大脑、甲状腺或胃肠道)引起该疾病的临床表现。自身免疫疾病包括影响特定组织的疾病以及可影响多种组织的疾病，其可部分取决于反应是针对局限于特定组织的抗原还是针对广泛分布于体内的抗原。

本发明提供了工程化正交细胞因子受体/配体对及其使用方法。工程化(正交)细胞因子特异性结合对应的工程化(正交)受体。结合后，正交受体激活通过天然细胞元件转导的信号传递，以提供模拟该天然应答但对表达正交受体的工程化细胞特异的生物活性。正交受体表现出与内源性对应细胞因子(包括正交细胞因子的天然配对物)的结合显著降低，而正交细胞因子表现出与任何内源性受体(包括正交受体的天然配对物)的结合显着降低。在一些实施例中，正交细胞因子对正交受体的亲和力与天然细胞因子对天然受体的亲和力相当。

正交细胞因子和受体对可以选自任何目的细胞因子。设计正交细胞因子受体对的过程可能包括以下步骤：(a)将氨基酸变化工程化为天然受体以破坏与天然细胞因子的结合；(b)在受体结合的接触残基处将氨基酸工程化为天然细胞因子，(c)选择与正交受体结合的细胞因子直向同源物；(d)丢弃与天然受体结合的直向同源细胞因子，或(e)选择结合直向同源细胞因子的受体直向同源物；(f)丢弃与天然细胞因子结合的直向同源物受体。在优选的实施例中，使用细胞因子/受体复合物结构的知识来选择用于定点或易错突变的氨基酸位置。酵母展示系统可以方便地用于选择过程，尽管其他显示和选择方法也是有用的。

在某些情况下，通过亲和力成熟获得氨基酸变化。“亲和力成熟”多肽是在一个或多个残基中具有一个或多个改变的多肽，与不具有这些改变的亲本多肽相比，其导致正交多肽对同源正交受体的亲和力提高，反之亦然。与“亲本”多肽相比，可以进行亲和力成熟以使结合亲和力增加至少约10％至50-100-150％或更多，或1至5倍。如上所述，本发明的工程化正交细胞因子激活正交受体，但具有显着降低的天然受体的结合和活化，例如正交细胞因子在与相应天然细胞因子的竞争性抑制中可表现出小于约5％的抑制当评估时在合适的测定条件下使用足够量的分子通过ELISA和/或FACS分析。

在本发明的一些实施例中，正交受体是IL-2受体链，即选自白细胞介素2受体alpha(IL-2Rα；Cd25)，白细胞介素2受体beta(IL-2Rβ；CD122)和白细胞介素2受体γ(IL-2Rα；CD132；普通γ链)的多肽。在一些具体实施例中，正交受体是Cd132，其参与来自IL-2、IL-4、IL-7和IL-15的信号传导。在其他具体实施例中，正交受体是Cd122，其参与来自IL-2和IL-15的信号传导。正交受体通常与对应的正交细胞因子配对，例如IL-2、IL-4、IL-7、IL-15等。

在一些具体实施例中，正交受体是CD122。在一些这样的实施例中，将正交受体引入也可以表达CD25和/或CD132的T细胞或NK细胞。提供了修饰的CD122蛋白的核酸编码序列和蛋白质组成。在本发明中，CD122被工程化以通过在涉及与天然IL-2结合的位置用非天然氨基酸取代天然序列的氨基酸或通过删除天然氨基酸来破坏天然细胞因子的结合。在一些实施例中，氨基酸被非保守变化取代。取代或删除的目的位置包括但不限于人CD122(hCD122)R41、R42、Q70、K71、T73、T74、V75、S132、H133、Y134、F135、E136、Q214。取代或删除的目标位置包括但不限于小鼠CD122(mCD122)R42、F67、Q71、S72、T74、S75、V76、S133、H134、Y135、I136、E137、R215。

在一些实施例中，CD122在选自小鼠蛋白质中的Q71、T74、H134、Y135或人蛋白质中的Q70、T73、H133、Y134的位置之一或组合处被取代。在一些实施例中，工程化蛋白质包含在mCD122 H134和Y135；或hCD122 H133和Y134处的氨基酸取代。在一些实施例中，氨基酸取代是酸性氨基酸，例如天冬氨酸和/或谷氨酸。特定氨基酸取代包括但不限于mCD122取代Q71Y；T74D；T74Y；H134D，H134E；H134K；Y135F；Y135E；Y135R；和hCD122改变Q70Y；T73D；T73Y；H133D，H133E；H133K；Y134F；Y134E；Y134R。正交细胞因子的选择可以随正交受体的选择而变化。

在一些实施例中，正交受体是CD122，正交细胞因子是IL-2或IL-15。可以选择细胞因子与正交受体结合，例如通过酵母展示进化，易错或靶向诱变等。所选正交序列的代表性集合如图6所示。

在一些实施例中，正交细胞因子是IL-2。在一些实施例中，以下一个或多个氨基酸残基被天然蛋白质以外的氨基酸取代，或在该位置删除：小鼠IL-2(mIL-2)，H27，L28中的任何一个，E29、Q30、M33、D34、Q36、E37、R41、N103；人IL-2(hIL-2)、Q13、L14、E15、H16、L19、D20、Q22、M23、G27、R81、N88。在一些这样的实施例中，氨基酸取代组选自(对于mIL-2)E29、Q30、M33、D34、Q36和E37中的一个或多个；以及对于hIL-2、E15、H16、L19、D20、Q22、M23、R81。

在一些实施例中，mIL-2的氨基酸替代物是以下各物中的一或多个：[H27W]、[L28M,L28W]、[E29D,E29T,E29A]、[Q30N]、[M33V,M33I,M33A]、[D34L,D34M]、[Q36S,Q36T,Q36E,Q36K,Q36E]、[E37A,E37W,E37H,E37Y,E37F,E37A,E37Y]、[R41K,R41S]、[N103E,N103Q]；且hIL-2的氨基酸替代物是以下各物中的一或多个：[Q13W]、[L14M,L14W]、[E15D,E15T,E15A,E15S]、[H16N,H16Q]、[L19V,L19I,L19A]、[D20L,D20M]、[Q22S,Q22T,Q22E,Q22K,Q22E]、[M23A,M23W,M23H,M23Y,M23F,M23Q,M23Y]、[G27K,G27S]、[R81D,R81Y]、[N88E,N88Q]、[T51I]。在一些实施实施实施例中，该组氨基酸替代物包含以下mIL-2替代物组之一：[Q30N,M33V,D34N,Q36T,E37H,R41K]；[E29D,Q30N,M33V,D34L,Q36T,E37H]；[E29D,Q30N,M33V,D34L,Q36T,E37A],and[E29D,Q30N,M33V,D34L,Q36K,E37A]以及hIL-2的以下替代物：[H16N,L19V,D20N,Q22T,M23H,G27K]；[E15D,H16N,L19V,D20L,Q22T,M23H]；[E15D,H16N,L19V,D20L,Q22T,M23A]和[E15D,H16N,L19V,D20L,Q22K,M23A]；或其保守变体。

在一些实施例中，hIL-2的氨基酸替代物是以下各物的一或多个：[E15S,E15T,E15Q,E15H]；[H16Q]；[L19V,L19I]；[D20T,D20S,D20M,D20L]；[Q22K,Q22N]；[M23L,M23S,M23V,M23T]。在一些实施例中，hIL-2的共有突变组是[E15S，H16Q，L19V，D20T/S/M；Q22K；M23L/S]。在一些实施例中，hIL-2的共有突变组是[E15S，H16Q，L19V，D20L，M23Q/a]和任选的Q22K。

在一些实施例中，氨基酸替代物组包含以下hIL-2替代物组之一:[E15S；H16Q；L19V,D20T/S；Q22K,M23L/S]；[E15S；H16Q；L19I；D20S；Q22K；M23L]；[E15S；L19V；D20M；Q22K；M23S]；[E15T；H16Q；L19V；D20S；M23S]；[E15Q；L19V；D20M；Q22K；M23S]；[E15Q；H16Q；L19V；D20T；Q22K；M23V]；[E15H；H16Q；L19I；D20S；Q22K；M23L]；[E15H；H16Q；L19I；D20L；Q22K；M23T]；[L19V；D20M；Q22N；M23S]；[E15S,H16Q,L19V,D20L,M23Q,R81D,T51I],[E15S,H16Q,L19V,D20L,M23Q,R81Y],[E15S,H16Q,L19V,D20L,Q22K,M23A],[E15S,H16Q,L19V,D20L,M23A]。

通过引入本发明的正交受体工程化来自受体或供体的细胞，并通过使工程细胞与同源正交细胞因子接触来刺激正交受体，提供了用于增强细胞应答的方法。主题方法包括获得靶细胞的步骤，例如T细胞，造血干细胞等，其可以从生物样品中分离，或者可以从祖细胞来源体外衍生。用包含编码正交受体的序列的表达载体转导或转染细胞，该步骤可以在任何合适的培养基中进行。

在一些实施例中，提供了一种工程化细胞，其中通过引入本发明的正交受体来修饰细胞。任何细胞都可以用于此目的。在一些实施例中，细胞是T细胞，包括但不限于初始CD8

细胞，例如从受试者身上采集的细胞，可以通过丰富所需细胞的技术从混合细胞中分离出来。适当的溶液可用于分散或悬浮。所述溶液通常是平衡盐溶液，例如，生理盐水、PBS、汉克平衡盐溶液等，其中适当地补充胎牛血清或其他天然存在的因子，以及低浓度(例如，5-25mM)的可接受缓冲液。方便的缓冲液包括HEPES，磷酸盐缓冲液，乳酸缓冲液等。或者，工程细胞系，扩增的同种异体细胞等用于工程。

亲和分离技术可包括磁性分离，使用抗体包被的磁珠，亲和层析，与单克隆抗体连接或与单克隆抗体(例如补体和细胞毒素)结合使用的细胞毒性剂，以及与附着于固体基质(例如平板)的抗体“淘选”，或其他方便的技术。提供准确分离的技术包括荧光激活细胞分选仪，其可以具有不同程度的复杂性，例如多色通道，低角度和钝光散射检测通道，阻抗通道等。可以通过使用与死细胞相关的染料(例如，死亡细胞)来针对死细胞选择细胞(例如，碘化丙啶)。可以采用不会对所选细胞的活力造成不适当的损害的任何技术。亲和试剂可以是上述细胞表面分子的特异性受体或配体。除抗体试剂外，还可使用肽-MHC抗原和T细胞受体对；肽配体和受体；效应物和受体分子等。

可以将分离的细胞收集在维持细胞活力的任何合适的培养基中，通常在收集管底部具有血清缓冲。可以购买各种培养基，并可根据细胞的性质使用，包括经常补充胎牛血清(FCS)的dMEM，HBSS，DPBS，RPMI，Iscove’s培养基等。

收集的和任选富集的细胞群可以立即使用，或者可以在液氮温度下冷冻并储存，解冻并能够重复使用细胞通常储存在10％DMSO，50％FCS，40％RPMI 1640培养基中。

在一些实施例中，提供了包含编码正交受体的编码序列的载体，其中编码序列可操作地连接至在所需细胞中有活性的启动子。本领域已知各种载体并且可以用于此目的，例如病毒载体，质粒载体，微循环载体，其载体可以整合到靶细胞基因组中，或者可以维持附加体。所述受体编码载体可以在试剂盒中提供，与编码结合并激活受体的正交细胞因子的载体组合。在一些实施例中，正交细胞因子的编码序列可操作地与高表达启动子连接，并且可以针对生产进行优化。在其他实施例中，提供了一种试剂盒，其中编码正交受体的载体提供正交细胞因子的纯化组合物，例如单位剂量，包装用于患者给药。

在一些实施例中，提供了一种治疗方法，该方法包括向需要其的受体中引入工程细胞群，其中通过引入编码本发明正交受体的序列来修饰细胞群。所述细胞群可以离体工程化，并且通常相对于受体是自体的或同种异体的。在一些实施例中，在施用工程细胞后，引入的细胞群在体内与同源正交细胞因子接触。本发明的优点是正交细胞因子和天然受体之间缺乏交叉反应性。

在体外细胞与正交细胞因子接触的情况下，将细胞因子以剂量和足以激活来自受体的信号传导的时间段添加到工程细胞中，所述受体可以利用天然细胞机制，例如辅助蛋白，共受体等。可以使用任何合适的培养基。因此，活化的细胞可用于任何期望的目的，包括与确定抗原特异性，细胞因子谱等有关的实验目的，以及用于体内传递。

体内进行接触时，将有效剂量的工程化细胞，包括但不限于经修饰以表达正交Il-2βreceptor,的CAR-T细胞与施用正交细胞因子(例如Il-2)组合并允许其在其原生环境中接触T细胞，例如在淋巴结等中，剂量和频率可以根据药剂，给药方式，细胞因子的性质等而变化。本领域技术人员将理解，这样的指导将根据个人情况进行调整。对于局部给药，例如鼻内，吸入等，或对于全身给药，例如肌肉注射，腹膜注射，静脉注射等，剂量也可以变化。通常施用至少约10

在工程细胞是T细胞的情况下，增强的免疫应答可以表现为T细胞对受体中存在的靶细胞的细胞溶解应答的增加，例如消除肿瘤细胞，感染细胞；减少自身免疫疾病的症状等等。

工程化T细胞可以适合于治疗用途的药物组合物形式提供，例如，适于人类治疗的药物组合物。包含这些细胞的治疗制剂可以冷冻，或制备成水溶液形式的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington，药学，第16版，Osol，A.Ed.(1980))混合来制备治疗性制剂，所述制剂以水溶液形式储存。细胞的配制、给药和施用方式应符合良好的医疗管理规范。在这种情况下需要考虑的因素包括正在治疗的特定疾病，正在治疗的特定哺乳动物，个体患者的临床状况，疾病的原因，药剂的传递部位，给药方法，给药时间表，以及医生已知的其他因素。

细胞可以通过任何合适的手段给药，通常是肠胃外给药。肠胃外输注包括肌内，静脉内(推注或缓慢输注)，动脉内，腹膜内，鞘内或皮下给药。

工程化T细胞可以在任何生理学上可接受的培养基中输注给受试者，通常在血管内，尽管它们也可以被引入任何其他方便的部位，其中细胞可以找到合适的生长部位。通常，将施用至少1x10

例如，用于本发明实践的细胞施用的典型范围为每疗程每kg受试者体重约1x10

一个疗程可以是一段时间内的单剂量或多剂量。在一些实施例中，细胞以单剂量施用。在一些实施例中，细胞以二或更多分割剂量在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、21、28、30、60、90、120或180天施用。在这种分次给药方案中施用的工程细胞的量在每次施用中可以是相同的，或者可以以不同的水平提供。考虑到受试者对治疗的反应，包括如上所述的治疗的不良反应及其调节，监测细胞给药的技术人员(例如医师)可以提供随时间推移的多日给药方案。

例如，在CAR-T细胞疗法的当前临床实践中，CAR-T细胞通常与淋巴细胞清除(例如通过施用阿仑单抗(单克隆抗Cd52)，嘌呤类似物等)组合施用以促进CAR-T细胞扩增至宿主免疫恢复之前。在一些实施例中，可以修饰CAR-T细胞以抵抗阿仑单抗。在本发明的一个方面中，目前与CAR-T疗法联合使用的淋巴细胞清除可以通过表达本发明的CAR-Ts的正交配体来消除或减少。如上所述，淋巴细胞清除通常用于CAR-T细胞扩增。然而，淋巴细胞清除也与CAR-T细胞疗法的主要副作用有关。因为正交配体提供了选择性扩增特定T细胞群的手段，所以可以减少在施用表达CAR-Ts的正交配体之前对淋巴细胞清除的需要。本发明能够在施用表达CAR-Ts的正交配体之前在没有或具有减少的淋巴细胞清除的情况下实施CAR-T细胞疗法。

在一个实施例中，本发明提供了治疗患有疾病的受试者的方法，在施用正交配体CAR-Ts之前，通过在不存在淋巴细胞清除的情况下施用表达CAR-Ts的正交配体，可以用CAR-T细胞疗法(例如癌症)治疗的病症或病症。在一个实施例中，本发明提供了一种治疗患有疾病的哺乳动物受试者的方法，所述疾病与存在异常细胞群(例如肿瘤)相关，所述细胞群的特征在于表达一种或多种表面抗原(例如肿瘤抗原))，该方法包括以下步骤：(a)从个体获得包含T细胞的生物样品；(b)富集生物样品以存在T细胞；(c)用一种或多种表达转染T细胞。载体包含编码CAR的核酸序列和编码正交受体的核酸序列，CAR的抗原靶向结构域能够结合存在于异常细胞群上的至少一种抗原；(d)离体扩增表达正交受体的CAR-T细胞群；施用(e)药学上有效的向哺乳动物表达正交受体的CAR-T细胞的量；和(f)使用选择性结合CAR-T细胞上表达的正交受体的配体调节表达正交受体的CAR-T细胞的生长。在一个实施例中，前述方法与CAR-T细胞治疗过程开始之前哺乳动物的淋巴细胞清除或免疫抑制有关。在另一个实施例中，上述方法在哺乳动物没有淋巴细胞清除和/或免疫抑制的情况下实施。

优选的制剂取决于预期的给药方式和治疗应用。取决于所需制剂，所述组合物还可以包括药学上可接受的无毒载体或稀释剂，其定义为通常用于配制用于动物或人给药的药物组合物的载体。选择稀释剂以不影响组合的生物活性。这种稀释剂的实例是蒸馏水，生理磷酸盐缓冲盐水，林格氏溶液，葡萄糖溶液和Hank’s溶液。另外，药物组合物或制剂还可以包括其他载体，佐剂或无毒，非治疗，非免疫原性稳定剂等。

在一些其他实施例中，药物组合物还可以包括缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多糖如壳聚糖、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚物(例如胶乳官能化的Sepharose

可接受的载体，赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对接受者无毒，包括缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵)；六甲铵氯化物；苯扎氯铵、氯化苄索铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯等对羟基苯甲酸烷基酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的抗衡离子，如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂如TWEEN

用于体内给药的制剂通常是无菌的。通过无菌过滤膜过滤可以完成本发明组合物的灭菌。

通常，组合物制备为注射剂，可以是液体溶液或悬浮液；也可以制备适合于在注射之前在液体载体中溶解或悬浮的固体形式。如上所述，该制剂还可以乳化或包封在脂质体或微粒如聚丙交酯，聚乙交酯或共聚物中以增强佐剂效果。Langer,Science 249:1527,1990and Hanes,Advanced Drug Delivery Reviews 28:97-119,1997.本发明的药剂可以以贮库注射或植入物制剂的形式施用，所述贮库注射或植入物制剂可以以允许活性成分持续或脉冲释放的方式配制。药物组合物通常配制成无菌的，基本等渗的并且完全符合美国食品和药物管理局的所有良好生产规范(GMP)规定。

还提供了用于方法的试剂盒。主题试剂盒包括编码正交细胞因子受体的表达载体或包含表达载体的细胞。试剂盒可以进一步包含同源正交细胞因子。在一些实施例中，组分以任何方便包装(例如棒包装，剂量包装等)的液体或固体形式以剂型(例如治疗有效剂型)提供。还可以提供用于选择或体外衍生细胞的试剂，例如生长因子，分化剂，组织培养试剂等。

除上述组件外，标的套件可能进一步包括(在某些实施例中)用于实施标的方法的说明书。这些说明书可能以各种形式存在于标的套件中，其中一种或多种可能存在于套件中。这些说明书可能存在的一种形式是印在合适的介质或基材(例如，其上印有信息的一张纸或几张纸)、套件包装、包装说明书等之上的印刷信息。这些说明书存在的另一种形式是其上已记录有信息的计算机可读介质，例如，软盘、光盘(CD)、便携式闪存驱动器等。这些说明书可能存在的另一种形式是网址，可以借此通过互联网访问远程网站上的信息。

在一些实施例中，主题组合物，方法和试剂盒用于增强T细胞介导的免疫应答。在一些实施例中，免疫应答针对需要消耗或调节靶细胞的病症，例如癌细胞，感染细胞，参与自身免疫疾病的免疫细胞等。

在一些实施例中，该病症是慢性感染，即在长达1周，2周等的时间内未被宿主免疫系统清除的感染。在一些情况下，慢性感染涉及将病原体遗传元件整合到宿主基因组中，例如逆转录病毒、慢病毒、乙型肝炎病毒等。在其他情况下，慢性感染，例如某些细胞内细菌或原生动物病原体，是由宿主细胞内的病原体细胞引起的。另外，在一些实施例中，感染与疱疹病毒或人乳头瘤病毒一样处于潜伏期。

本发明的方法提供了相对于在不存在处理的情况下去除，宿主生物体的T效应细胞更有效地杀死感染细胞，因此可以针对病原体生命周期的细胞内阶段。该方法可以进一步包括监测患者的治疗功效。监测可以测量感染的临床指标，例如发热，白细胞计数等，和/或直接监测病原体的存在。

在一些实施例中，病症是癌症。如本文所用，术语“癌症”是指由细胞的异常，不受控制的生长引起的各种病症。能够引起癌症的细胞，称为“癌细胞”，具有诸如不受控制的增殖，永生，转移潜能，快速生长和增殖速率和/或某些典型形态特征的特征。可以以多种方式检测癌症，包括但不限于检测肿瘤或肿瘤的存在(例如，通过临床或放射学手段)，检查肿瘤内或其他生物样品中的细胞(例如，来自组织活检)，测量指示癌症的血液标志物，并检测指示癌症的基因型。然而，在一种或多种上述检测方法中的阴性结果不一定表明没有癌症，例如，如随后的复发所证明的，已经表现出对癌症治疗的完全反应的患者可能仍然患有癌症。

本发明现在被充分描述，本领域普通技术人员显而易见的是，可以在不偏离本发明的精神或范围的情况下进行各种改变和修改。

实验

正交IL-2和IL-2Rβ

在这里，我们描述了一种涉及工程细胞因子和受体的发明，其能够在离体过继性细胞疗法的环境中选择性扩增所需的细胞亚群。本发明描述了细胞因子白细胞介素-2(IL-2)及其受体IL-2Rβ链(IL-2Rβ)，其能够在过继性细胞疗法中特异性扩增T细胞，从而解决未满足的需求在免疫治疗中。本文描述的方法可以推广到过继性细胞疗法的任何设置，其中细胞被特定的受体-配体对刺激，包括骨髓和干细胞移植，以及许多其他方式。

具体描述了正交IL-2和IL-2Rβ配体-受体对。IL-2的直接同源物版本和IL-2Rβ的直接同源物版本，彼此特异性结合，但不与野生型对应物结合。提供了多个正交IL-2变体序列，对正交IL-2Rβ具有不同程度的亲和力。显示了经工程改造以表达正交IL-2Rβ的T细胞的正交IL-2依赖性信号传导和T细胞增殖。

IL-2由于其分别促进效应T细胞和调节性T细胞的扩增的能力而成为治疗癌症和自身免疫的有吸引力的生物制剂。然而，IL-2的这种多效性以及脱靶毒性限制了其在临床中的使用。解耦IL-2的免疫刺激和免疫抑制特性的能力可以提供优异形式的IL-2免疫疗法。

本文证明了工程化T细胞表达正交IL-2Rβ的能力。示这些工程化T细胞响应正交Il-2，导致下游信号转导分子(例如STAT5)的磷酸化和T细胞增殖。与野生型IL-2的活性相比，正交IL-2对野生型T细胞的活性被完全消除或显着减弱。因此，证明了使用正交IL-2/IL-2受体对的选择性T细胞扩增。

正交IL-2/IL-2受体对的应用包括但不限于用于癌症治疗的肿瘤反应性细胞毒性T细胞选择性扩增，用于传染病和/或癌症的NK细胞选择性扩增和用于自身免疫性疾病的调节性T细胞的选择性扩增。

由于突变破坏但不完全消除与IL-2Rβ的结合，对中间体(IL-2Rβ和IL-2Rγ)或高亲和力野生型Il-2受体(IL-2Rα，Rβ，Rγ)具有钝化亲和力的IL-2变体也可用于选择性靶向直接同源物IL-2对IL-2Rα高细胞的活性，例如治疗自身免疫性疾病。对IL-2Rβ链具有消除亲和力但保留与IL-2Rα结合并因此通过抑制高亲和力IL-2R形成而与野生型IL-2竞争性拮抗剂的IL-2变体可用于治疗自身免疫或移植物抗宿主病。

产生和利用正交IL-2/IL-2受体对来控制T细胞扩增的总体概念如图1示意图所示。图2提供了工作流程，包括使用结构指导的诱变产生缺乏与野生型IL-2结合的IL-2Rβ直接同源物的步骤。使用基于酵母的筛选测定法通过实验证实了预计破坏IL-2Rβ与野生型IL-2结合的突变，并通过表面等离振子共振使用纯化的重组蛋白进一步验证了突变。使用这种方法，描述了许多破坏与野生型IL-2结合的IL-2Rβ点突变，并且这些受体变体中的每一个都可以充当正交受体。单点突变也可以与一个，两个或多个另外的点突变组合，以产生更大的IL-2Rβ直接同源物库。

正交小鼠IL-2Rβ变体的序列显示在图3。当组合的突变破坏野生型IL-2与这些突变结合，这些突变就可以用作单点突变或其任何组合，以产生具有1、2、3或更多点突变的IL-2Rβ直接同源物。

图4显示了mIL-2Rβ变体的特征，该变体包含消除野生型mIL-2结合的氨基酸变化H134D，Y135F。这两个残基是已知的IL-2相互作用热点(Ring A等，Nat Immunol(2012)13:1187-95)，我们证实了该突变通过表面等离振子共振(SPR)破坏了野生型IL-2的结合。

图5说明了工程正交IL-2/IL-2Rβ对的工作流程。产生的IL-2的直接同源库随机化与IL-2Rβ正交直接同源氨基酸残基接近或接触的残基。使用酵母展示，选择结合直接同源物IL-2Rβ且丢弃结合野生型IL-2Rβ克隆的IL-2变体。可以使用定点诱变或易错诱变重复该过程，以产生与直向同源物而非野生型IL-2Rβ具有不同结合特性的IL-2变体。使用这种方法，我们产生了IL-2直接同源物库：1)保留与IL-2Rα链的结合(绿色曲线)，表明酵母显示的正交IL-2变体的完整结构完整性，2)与正交结合IL-2Rβ(橙色曲线)，但是3)不与野生型IL-2Rβ(蓝色曲线)结合。

表征的正交小鼠IL-2变体的序列显示在图6中。图15显示了小鼠IL-2和IL-2Rβ与人类对应物的比对。这4个序列为天然或野生型序列提供了参考。改变以产生正交小鼠IL-2/IL-2Rβ对的氨基酸残基主要在人类中保守。因此，正交小鼠IL-2和IL-2Rβ序列可以翻译成人IL-2和IL-2Rβ蛋白。

如图7所示，正交IL-2变体以与野生型IL-2和IL-2Rβ相互作用相似或更大的亲和力结合正交IL-2Rβ。将可溶性正交IL-2或野生型IL-2蛋白流过涂有野生型或正交IL-2Rβ的传感器芯片。通过表面等离振子共振(SPR)确定结合，并使用1:1结合模型拟合曲线。如图8所示，正交IL-2变体对野生型CD25阳性和CD25阴性脾细胞表现出钝化活性(phosphoSTAT5)。

表达原代IL-2Rβ的小鼠CTLL-2T细胞的产生显示在图9中。我们创建了永生化小鼠T细胞系(CTLL-2)，其通过慢病毒转导用编码全长正交受体的基因表达正交IL-2Rβ(正交CTLL-2)。用嘌呤霉素选择转导的细胞，嘌呤霉素对未转导的细胞是毒素，产生稳定的CTLL-2细胞系，其表达野生型和正交IL-2Rβ。该细胞系对CD25和CD132也呈阳性，因此代表表达高亲和力IL-2受体复合物的T细胞。用于检测细胞表面IL-2Rβ(CD122)的抗体不区分野生型和原代IL-2Rβ。因此，野生型和原代IL-2RβCTLL-2细胞之间平均荧光强度的增加表明这些细胞表达正交受体。它们对嘌呤霉素的抗性进一步支持了这一点，嘌呤霉素由用于表达正交IL-2Rβ的相同载体编码。

如图10所示，第一组正交IL-2变体对正交T细胞具有选择性。为了询问正交IL-2信号传导，我们利用CTLL-2细胞模型，未经操作(野生型)或转导也表达正交IL-2Rβ(正交)。然后，我们确定了野生型或各种正交IL-2克隆诱导STAT5磷酸化的能力(IL-2依赖性信号转导的定量读数)。我们鉴定了许多正交IL-2变体，与野生型细胞相比，其在正交IL-2Rβ表达细胞上诱导选择性STAT5磷酸化。选择克隆的剂量反应曲线如图11所示。

原发性淋巴结来源的T细胞经过工程化以表达正交IL-2Rβ(H134D Y135F)。除了我们的永生化小鼠T细胞模型外，我们还通过分离小鼠淋巴结和脾细胞，用CD3/CD28激活，然后逆转录病毒转导编码全长正交受体的基因，产生了表达原代小鼠T细胞的正交IL-2Rβ。该构建体还包含IRES，其后是荧光蛋白YFP，允许通过FACS分析YFP表达来确认转导。小鼠T细胞也表达高亲和力的IL-2受体复合物(例如CD25，CD122和Cd132)，如图12所示

正交IL-2变体在表达原代小鼠T细胞的正交IL-2Rβ上诱导选择性STAT5磷酸化，如图13所示。

与野生型CTLL-2细胞相比，通过正交IL-2Rβ选择性发出信号的正交IL-2变体(图11)也诱导表达正交IL-2Rβ的CTLL-2细胞的选择性扩增(图14)。

正交IL-2工程方法也应用于人IL-2和人IL-2Rβ。我们将用于创造小鼠正交IL-2Rβ的H133D Y134F突变引入人IL-2Rβ中，因为这些残基在小鼠和人之间高度保守。实际上，野生型hIL-2Rβ结合酵母显示出野生型Il-2，而hIL-2RβH133D Y134F突变体(正交-hIL-2Rβ)缺乏与野生型IL-2的可检测结合(图15)。我们通过随机化预测接触或接近H133D Y134F突变的残基，创建了显示在酵母表面的人IL-2突变体库，并选择了结合邻位但不结合野生型人IL-2Rβ的IL-2变体。该方案与用于设计小鼠IL-2正交对的方案相同，并且对于人对是成功的。该方法如图16所示。鉴定了一组共有的突变，表明能够结合邻位hIL-2Rβ的邻位hIL-2序列的会聚，如图16C所示。

本发明的多肽在体内也具有活性。小鼠模型用于证明小鼠中表达正交IL-2Rb的T细胞的选择性扩增或增加的存活，如图17-19所示。显示正交IL-2克隆1G12/149选择性地扩增正交但不是野生型小鼠T细胞。与PBS对照相比，用野生型IL-2处理导致野生型和正交T细胞的扩增，而正交IL-2克隆1G12/149处理选择性地扩增对野生型T细胞具有有限活性的正交T细胞。

示例2

人IL-2直接同源

蛋白质生产。将编码野生型人IL-2的DNA克隆到昆虫表达载体pAcGP67-A中，该载体包含用于亲和纯化的C端8xHIS标签。编码小鼠血清白蛋白(MSA)的DNA购自IntegratedDNA Technologies(IDT，Coralville，Iowa 52241)，并作为hIL-2的N末端和MSA的C末端之间的融合物克隆到pAcGP67-A中。从活性筛选中分离的正交人Il-2的变体合成为Gblocks(IDT)，并通过重叠延伸克隆到pAcGP67-A-MSA载体中。

利用

哺乳动物表达载体。将全长人CD25克隆到慢病毒载体pCDH-CMV-MSC-EF1-Puro(System Biosciences)中。使用引入H133D和Y134F突变的诱变引物，通过重叠延伸PCR，将编码全长人IL-2Rβ的cDNA用作模板，以克隆全长正交IL-2Rβ。将得到的PCR产物克隆到逆转录病毒载体pMSCV-MCS-IRES-YFP中。

细胞培养。YT-NK样细胞系由京都大学Yodoi Junji博士慷慨提供。用pCDH-CMV-MSC-EF1-Puro-hCD25慢病毒转导YT-细胞，并在10μg/mL嘌呤霉素中选择稳定表达全长人CD25(YT+)的YT细胞。用含有pMSCV-MCS-IRES-YFP-正交-human-Rβ的逆转录病毒转导YT+细胞，并通过FACS分选以使YFP+(正交)群体富集纯度。HEK293T细胞由斯坦福大学的IrvingWeissman博士实验室慷慨提供。将HEK293T细胞维持在补充有10％胎牛血清(FBS)，1％L-谷氨酰胺(L-glu)和1％青霉素和链霉素(P/S)的DMEM中。将YT细胞维持在RPMI完全(RPMI+GlutaMax+10％FBS，1％L-Glu，1％NaPyr，1％NEAA，18mM HEPES和1％pen/strep)中。

慢病毒和逆转录病毒生产。使用第三代包装载体在HEK293T细胞中生产慢病毒。简而言之，将HEK293T细胞以每10cm组织培养皿5x10

逆转录病毒在HEK293T细胞中产生。简而言之，将HEK293T细胞以每10cm组织培养皿5x10

酵母展示IL-2。通过使用在Aga2的C末端和IL-2的N末端之间具有3C蛋白酶切割位点的pCT302载体与Aga2的C末端融合，将人IL-2展示在酵母酿酒酵母菌株EBY100的表面上以及N末端cMyc表位标签。简而言之，将感受态EBY100用编码显示hIL-2的酵母的质粒电穿孔，并在30℃的SDCAA选择培养基中回收过夜。将转化的酵母在SDCAA中传代一次，沉淀对数期的酵母培养物，并以1.0的OD600重悬于含有10％SDCAA的SGCAA诱导培养基中，并在20℃下培养24小时。通过用

人IL-2突变酵母展示库的产生。

使用具有以下简并密码子的引物通过组装PCR创建定点库：库3(E15,H16,L19,D20,Q22,M23):(SEQ ID NO:10)5’-CAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGNHKNHKTTACTTNHKNHKTTANHKNHKATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTC-3’库4(E15,H16,L19,D20,M23,N88):(SEQ ID NO:11)5’-GTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGNHK NHKTTACTTNHKNHKTTACAGNHKATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGAATCC-3’,(SEQ ID NO:12)5’-CCCAGGGACTTAATCAGCNHKATCAACGTAATAGTTCTGGAACTAAAGGG-3’.

以下引物用于所有库：(SEQ ID NO:13)5’-CGGTAGCGGTGGGGGCGGTTCTCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGTCCGAGCGGCGGA-3’,(SEQ ID NO:14)5’-GTAGCTGTGTTTTCTTTGTAGAACTTGAAGTAGGTGCGGATCCGC CGCTCGGACCCTGG-3’,(SEQ ID NO:15)5’-CTTAAATGTGAGCATCCTGGTGAGTTTGGGATTCTTGTAATTATTAATTCCATTCAAAAT-3’,(SEQ ID NO:16)5’-CCAGGATGCTCA CATTTAAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAG-3’,(SEQ ID NO:17)5’-GAGGTTTGAGTT CTTCTTCTAGACACTGAAGATGTTTCAGTTCTGTGGCCTTCTTGGGC-3’,(SEQ ID NO:18)5’-CAGTGTCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGC-3’,(SEQ ID NO:19)5’-GATTAAGTCCCTGGGTCTTAAGTGAAAGTTTTTGCTTTGAGCTAAATT TAGCACTTCCTC-3’,(SEQ ID NO:20)5’-CAGCATATTCACACATGAATGTTGTTTCAGATC CCTTTAGTTCCAGAACTATTACGTTG-3’,(SEQ ID NO:21)5’-GAAACAACATTCATGTGTGAA TATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAAC-3’,(SEQ ID NO:22)5’-GAGATG ATGCTTTGACAAAAGGTAATCCATCTGTTCAGAAATTCTACAATGGTTGCTG-3’,(SEQ IDNO:23)5’-GATTACCTTTTGTCAAAGCATCATCTCAACACTAACTGCGGCCGCTTCTGGTGG CGAAC-3’,(SEQID NO:24)5’-GATCTCGAGCAAGTCTTCTTCGGAGATAAGCTTTTGTTC GCCACCAGAAGCGG-3’.

使用Pfu Ultra DNA聚合酶(Agilent)和每种引物的等摩尔混合物组装突变的IL-2基因PCR产物。使用Phusion DNA聚合酶(NEB)，使用引物(SEQ ID NO:25)5’-CGGTAGCGGTGGGGGCGGTTC-3’和(SEQ ID NO:26)5’-CGAAGAAGACTTGCTCGAGATC-3’进一步PCR扩增DNA产物。凝胶纯化所得组装的PCR产物，并用线性化的pCT302载体电转运到EBY-100酵母中，以产生～2x10

正交IL-2的进化。使用磁激活细胞分选(MACS)和FACS的组合进行特异性结合正交IL-2R的酵母克隆的选择。第一轮选择用2x10

基于酵母的结合和功能筛选。通过在SDCAA平板上培养和单菌落提取或单细胞FACS分离单酵母克隆到含有100μL SDCAA的96孔圆底组织培养板中，并在振荡培养箱中于30℃培养过夜。将酵母克隆在96孔深孔V底板的每孔1.5mL SDCAA中在30℃下进一步扩增24小时，然后在含有10％SDCAA的SGCAA培养基中在20℃下振荡培养箱中诱导72小时，起始OD600为1.0，也在1.5mL和96孔深孔V底板中。沉淀诱导的酵母，用PBS洗涤一次，并重悬于200μL/孔的切割培养基(含有25mM HEPES，0.2mM TCEP，20μg/mL 3C蛋白酶的RPMI)中，并在室温下搅拌孵育5分钟，在4℃下过夜孵育而不搅拌。将酵母沉淀并通过96孔0.45μm醋酸纤维素滤板(货号7700-2808，GE Healthcare)。如IL-2R信号传导方法部分所述接种Yt+(野生型和邻位表达)和Yt-，加入50μl含有突变IL-2克隆的澄清酵母上清液，在37℃温育20分钟。终止反应并如下所述定量pSTAT5。使用

人外周血单核细胞(PBMC)的逆转录病毒转导。白细胞减少室从斯坦福血液中心获得。将血液排入无菌的50ml锥形管(～7mL)中，并将PBS+2％FBS加入总共34mL中。将密度梯度培养基(15ml，Ficoll-Paque Plus，GE Healthcare，17-1440-03)加载到两个

通过旋转转染转导活化的人PBMC(参见Berggren WT，Lutz M，Modesto V.Generalspinfection Protocol2012年12月10日。在：StemBook[互联网]。剑桥(MA)：哈佛干细胞研究所；2008)使用未浓缩的逆转录病毒上清液(每孔约2mL)，其中含有10μg/mL聚丙烯和100IU/mL hIL-2，在32℃和2500RPM下放置1.5小时。轻轻吸出病毒上清液，并用含有100IU/mL hIL-2的新鲜RPMI完全培养基代替，并在37℃下培养24小时。通过轻轻移液收集细胞，并用磁铁除去

通过STAT5的磷酸化进行IL-2R信号传导。通过细胞内pSTAT5对IL-2和正交IL-2信号转导进行定量。将活跃生长的YT+和Yt+正交细胞沉淀，以50/50的比例合并，并以每孔5x10

体外原代人PBMC增殖试验。通过离心收集含有野生型和邻位转导的T细胞混合物的人外周血单核细胞，重悬于缺乏hIL-2的RPMI完全培养基中，并以每孔50000个细胞的密度接种(50μL))在96孔圆底组织培养板中(第1天)。通过添加野生型或正交IL-2(50μL)的连续稀释液至100μL的总体积刺激细胞生长，并在37℃下培养2天。在第3天，细胞另外加入新鲜细胞因子，在100μL体积再培养2天。在第5天，加入50μL DAPI至终浓度为0.5μg/mL，并使用配备有高通量取样器的

如图22所示，正交人IL-2在体外通过在YT细胞中表达的正交IL-2R发出信号。如图23所示，正交人IL-2优先扩增表达正交IL-2R的人PBMC。用含有正交人IL-2Rβwith an IRESYFP(YFP+).Initial ratio of YFP+cells to total live cells was20％.的逆转录病毒和IRES-YFP(YFP+)分离，活化和转化人PBMC。在第1天用指定浓度的MSA-人IL-2(圆圈)或邻位变体MSA-SQVLKA(菱形)，MSA-SQVLqA(正方形)或MSA-1A1(黑色三角形)铺板5x10

正交hIL-2蛋白中的氨基酸替代物如下表1所示。

表1

序列表

<110> 小利兰·斯坦福大学托管委员会和华盛顿大学

凯南·克里斯多夫·加西亚

乔纳森·绍克罗斯克

戴维·贝克

克里斯·金

<120> 生物学相关的正交细胞因子/受体对

<130> STAN-1246CIP

"<150> 62/217,364"

<151> 2015-09-11

"<150> 62/375,089"

<151> 2016-08-15

<150> PCT/US16/050511

<151> 2016-09-07

<160> 26

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 525

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Ala Val Asn Gly Thr Ser Gln Phe Thr Cys Phe Tyr Asn Ser Arg Ala

1 5 10 15

Asn Ile Ser Cys Val Trp Ser Gln Asp Gly Ala Leu Gln Asp Thr Ser

20 25 30

Cys Gln Val His Ala Trp Pro Asp Arg Arg Arg Trp Asn Gln Thr Cys

35 40 45

Glu Leu Leu Pro Val Ser Gln Ala Ser Trp Ala Cys Asn Leu Ile Leu

50 55 60

Gly Ala Pro Asp Ser Gln Lys Leu Thr Thr Val Asp Ile Val Thr Leu

65 70 75 80

Arg Val Leu Cys Arg Glu Gly Val Arg Trp Arg Val Met Ala Ile Gln

85 90 95

Asp Phe Lys Pro Phe Glu Asn Leu Arg Leu Met Ala Pro Ile Ser Leu

100 105 110

Gln Val Val His Val Glu Thr His Arg Cys Asn Ile Ser Trp Glu Ile

115 120 125

Ser Gln Ala Ser His Tyr Phe Glu Arg His Leu Glu Phe Glu Ala Arg

130 135 140

Thr Leu Ser Pro Gly His Thr Trp Glu Glu Ala Pro Leu Leu Thr Leu

145 150 155 160

Lys Gln Lys Gln Glu Trp Ile Cys Leu Glu Thr Leu Thr Pro Asp Thr

165 170 175

Gln Tyr Glu Phe Gln Val Arg Val Lys Pro Leu Gln Gly Glu Phe Thr

180 185 190

Thr Trp Ser Pro Trp Ser Gln Pro Leu Ala Phe Arg Thr Lys Pro Ala

195 200 205

Ala Leu Gly Lys Asp Thr Ile Pro Trp Leu Gly His Leu Leu Val Gly

210 215 220

Leu Ser Gly Ala Phe Gly Phe Ile Ile Leu Val Tyr Leu Leu Ile Asn

225 230 235 240

Cys Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn Thr

245 250 255

Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly Gly

260 265 270

Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe Ser

275 280 285

Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu Arg

290 295 300

Asp Lys Val Thr Gln Leu Leu Leu Gln Gln Asp Lys Val Pro Glu Pro

305 310 315 320

Ala Ser Leu Ser Ser Asn His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn Gln

325 330 335

Gly Tyr Phe Phe Phe His Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala Cys

340 345 350

Gln Val Tyr Phe Thr Tyr Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro Asp Glu

355 360 365

Gly Val Ala Gly Ala Pro Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln Pro

370 375 380

Leu Ser Gly Glu Asp Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp Asp

385 390 395 400

Leu Leu Leu Phe Ser Pro Ser Leu Leu Gly Gly Pro Ser Pro Pro Ser

405 410 415

Thr Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ala Gly Glu Glu Arg Met Pro Pro Ser

420 425 430

Leu Gln Glu Arg Val Pro Arg Asp Trp Asp Pro Gln Pro Leu Gly Pro

435 440 445

Pro Thr Pro Gly Val Pro Asp Leu Val Asp Phe Gln Pro Pro Pro Glu

450 455 460

Leu Val Leu Arg Glu Ala Gly Glu Glu Val Pro Asp Ala Gly Pro Arg

465 470 475 480

Glu Gly Val Ser Phe Pro Trp Ser Arg Pro Pro Gly Gln Gly Glu Phe

485 490 495

Arg Ala Leu Asn Ala Arg Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser

500 505 510

Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val

515 520 525

<210> 2

<211> 513

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 2

Ala Val Lys Asn Cys Ser His Leu Glu Cys Phe Tyr Asn Ser Arg Ala

1 5 10 15

Asn Val Ser Cys Met Trp Ser His Glu Glu Ala Leu Asn Val Thr Thr

20 25 30

Cys His Val His Ala Lys Ser Asn Leu Arg His Trp Asn Lys Thr Cys

35 40 45

Glu Leu Thr Leu Val Arg Gln Ala Ser Trp Ala Cys Asn Leu Ile Leu

50 55 60

Gly Ser Phe Pro Glu Ser Gln Ser Leu Thr Ser Val Asp Leu Leu Asp

65 70 75 80

Ile Asn Val Val Cys Trp Glu Glu Lys Gly Trp Arg Arg Val Lys Thr

85 90 95

Cys Asp Phe His Pro Phe Asp Asn Leu Arg Leu Val Ala Pro His Ser

100 105 110

Leu Gln Val Leu His Ile Asp Thr Gln Arg Cys Asn Ile Ser Trp Lys

115 120 125

Val Ser Gln Val Ser His Tyr Ile Glu Pro Tyr Leu Glu Phe Glu Ala

130 135 140

Arg Arg Arg Leu Leu Gly His Ser Trp Glu Asp Ala Ser Val Leu Ser

145 150 155 160

Leu Lys Gln Arg Gln Gln Trp Leu Phe Leu Glu Met Leu Ile Pro Ser

165 170 175

Thr Ser Tyr Glu Val Gln Val Arg Val Lys Ala Gln Arg Asn Asn Thr

180 185 190

Gly Thr Trp Ser Pro Trp Ser Gln Pro Leu Thr Phe Arg Thr Arg Pro

195 200 205

Ala Asp Pro Met Lys Glu Ile Leu Pro Met Ser Trp Leu Arg Tyr Leu

210 215 220

Leu Leu Val Leu Gly Cys Phe Ser Gly Phe Phe Ser Cys Val Tyr Ile

225 230 235 240

Leu Val Lys Cys Arg Tyr Leu Gly Pro Trp Leu Lys Thr Val Leu Lys

245 250 255

Cys His Ile Pro Asp Pro Ser Glu Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Gln

260 265 270

His Gly Gly Asp Leu Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Val Pro Leu Ser

275 280 285

Phe Phe Ser Pro Ser Gly Pro Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val

290 295 300

Leu Asp Gly Asp Ser Lys Ala Val Gln Leu Leu Leu Leu Gln Lys Asp

305 310 315 320

Ser Ala Pro Leu Pro Ser Pro Ser Gly His Ser Gln Ala Ser Cys Phe

325 330 335

Thr Asn Gln Gly Tyr Phe Phe Phe His Leu Pro Asn Ala Leu Glu Ile

340 345 350

Glu Ser Cys Gln Val Tyr Phe Thr Tyr Asp Pro Cys Val Glu Glu Glu

355 360 365

Val Glu Glu Asp Gly Ser Arg Leu Pro Glu Gly Ser Pro His Pro Pro

370 375 380

Leu Leu Pro Leu Ala Gly Glu Gln Asp Asp Tyr Cys Ala Phe Pro Pro

385 390 395 400

Arg Asp Asp Leu Leu Leu Phe Ser Pro Ser Leu Ser Thr Pro Asn Thr

405 410 415

Ala Tyr Gly Gly Ser Arg Ala Pro Glu Glu Arg Ser Pro Leu Ser Leu

420 425 430

His Glu Gly Leu Pro Ser Leu Ala Ser Arg Asp Leu Met Gly Leu Gln

435 440 445

Arg Pro Leu Glu Arg Met Pro Glu Gly Asp Gly Glu Gly Leu Ser Ala

450 455 460

Asn Ser Ser Gly Glu Gln Ala Ser Val Pro Glu Gly Asn Leu His Gly

465 470 475 480

Gln Asp Gln Asp Arg Gly Gln Gly Pro Ile Leu Thr Leu Asn Thr Asp

485 490 495

Ala Tyr Leu Ser Leu Gln Glu Leu Gln Ala Gln Asp Ser Val His Leu

500 505 510

Ile

<210> 3

<211> 149

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 3

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ser Thr Ala Glu Ala Gln Gln

1 5 10 15

Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln His Leu Glu Gln Leu Leu

20 25 30

Met Asp Leu Gln Glu Leu Leu Ser Arg Met Glu Asn Tyr Arg Asn Leu

35 40 45

Lys Leu Pro Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Leu Pro Lys Gln Ala

50 55 60

Thr Glu Leu Lys Asp Leu Gln Cys Leu Glu Asp Glu Leu Gly Pro Leu

65 70 75 80

Arg His Val Leu Asp Leu Thr Gln Ser Lys Ser Phe Gln Leu Glu Asp

85 90 95

Ala Glu Asn Phe Ile Ser Asn Ile Arg Val Thr Val Val Lys Leu Lys

100 105 110

Gly Ser Asp Asn Thr Phe Glu Cys Gln Phe Asp Asp Glu Ser Ala Thr

115 120 125

Val Val Asp Phe Leu Arg Arg Trp Ile Ala Phe Cys Gln Ser Ile Ile

130 135 140

Ser Thr Ser Pro Gln

145

<210> 4

<211> 133

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 5

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 5

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Ser Gln

1 5 10 15

Leu Leu Val Leu Leu Gln Gln Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Ile Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Asp Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 6

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 6

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Ser Gln

1 5 10 15

Leu Leu Val Leu Leu Gln Gln Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Tyr Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 7

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 7

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Ser Gln

1 5 10 15

Leu Leu Val Leu Leu Lys Ala Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 8

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 8

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Ser Gln

1 5 10 15

Leu Leu Val Leu Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 9

<211> 525

<212> PRT

<213> 智人

<400> 9

Ala Val Asn Gly Thr Ser Gln Phe Thr Cys Phe Tyr Asn Ser Arg Ala

1 5 10 15

Asn Ile Ser Cys Val Trp Ser Gln Asp Gly Ala Leu Gln Asp Thr Ser

20 25 30

Cys Gln Val His Ala Trp Pro Asp Arg Arg Arg Trp Asn Gln Thr Cys

35 40 45

Glu Leu Leu Pro Val Ser Gln Ala Ser Trp Ala Cys Asn Leu Ile Leu

50 55 60

Gly Ala Pro Asp Ser Gln Lys Leu Thr Thr Val Asp Ile Val Thr Leu

65 70 75 80

Arg Val Leu Cys Arg Glu Gly Val Arg Trp Arg Val Met Ala Ile Gln

85 90 95

Asp Phe Lys Pro Phe Glu Asn Leu Arg Leu Met Ala Pro Ile Ser Leu

100 105 110

Gln Val Val His Val Glu Thr His Arg Cys Asn Ile Ser Trp Glu Ile

115 120 125

Ser Gln Ala Ser Asp Phe Phe Glu Arg His Leu Glu Phe Glu Ala Arg

130 135 140

Thr Leu Ser Pro Gly His Thr Trp Glu Glu Ala Pro Leu Leu Thr Leu

145 150 155 160

Lys Gln Lys Gln Glu Trp Ile Cys Leu Glu Thr Leu Thr Pro Asp Thr

165 170 175

Gln Tyr Glu Phe Gln Val Arg Val Lys Pro Leu Gln Gly Glu Phe Thr

180 185 190

Thr Trp Ser Pro Trp Ser Gln Pro Leu Ala Phe Arg Thr Lys Pro Ala

195 200 205

Ala Leu Gly Lys Asp Thr Ile Pro Trp Leu Gly His Leu Leu Val Gly

210 215 220

Leu Ser Gly Ala Phe Gly Phe Ile Ile Leu Val Tyr Leu Leu Ile Asn

225 230 235 240

Cys Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn Thr

245 250 255

Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly Gly

260 265 270

Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe Ser

275 280 285

Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu Arg

290 295 300

Asp Lys Val Thr Gln Leu Leu Leu Gln Gln Asp Lys Val Pro Glu Pro

305 310 315 320

Ala Ser Leu Ser Ser Asn His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn Gln

325 330 335

Gly Tyr Phe Phe Phe His Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala Cys

340 345 350

Gln Val Tyr Phe Thr Tyr Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro Asp Glu

355 360 365

Gly Val Ala Gly Ala Pro Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln Pro

370 375 380

Leu Ser Gly Glu Asp Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp Asp

385 390 395 400

Leu Leu Leu Phe Ser Pro Ser Leu Leu Gly Gly Pro Ser Pro Pro Ser

405 410 415

Thr Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ala Gly Glu Glu Arg Met Pro Pro Ser

420 425 430

Leu Gln Glu Arg Val Pro Arg Asp Trp Asp Pro Gln Pro Leu Gly Pro

435 440 445

Pro Thr Pro Gly Val Pro Asp Leu Val Asp Phe Gln Pro Pro Pro Glu

450 455 460

Leu Val Leu Arg Glu Ala Gly Glu Glu Val Pro Asp Ala Gly Pro Arg

465 470 475 480

Glu Gly Val Ser Phe Pro Trp Ser Arg Pro Pro Gly Gln Gly Glu Phe

485 490 495

Arg Ala Leu Asn Ala Arg Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser

500 505 510

Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val

515 520 525

<210> 10

<211> 98

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> 其它重要生物功能区

<222> (33)..(33)

"<223> 位于位置33 的N可以是a, c, g或 t"

<220>

<221> 其它重要生物功能区

<222> (34)..(34)

"<223> 位于位置34的N可以是a, c或 t"

<220>

<221> 其它重要生物功能区

<222> (35)..(35)

<223> 位于位置35的N可以是 g或 t

<220>

<221> 其它重要生物功能区

<222> (36)..(36)

"<223> 位于位置36的N可以是a, c, g或 t"

<220>

<221> 其它重要生物功能区

<222> (37)..(37)

"<223>位于位置37的N可以是 a, c或 t"

<220>

<221> 其它重要生物功能区

<222> (38)..(38)

<223> 位于位置38的N可以是g或 t

<220>

<221> 其它重要生物功能区

<222> (45)..(45)

"<223> 位于位置45的N可以是a, c, g或 t"

<220>

<221> 其它重要生物功能区

<222> (46)..(46)

"<223> 位于位置46的N可以是 a, c或 t"

<220>

<221> 其它重要生物功能区

<222> (47)..(47)

<223> 位于位置47的N可以是 g或 t

<220>

<221> 其它重要生物功能区

<222> (48)..(48)

"<223> 位于位置48的N可以是 a, c或 t"

<220>

<221> 其它重要生物功能区

<222> (49)..(49)

"<223> 位于位置49的N可以是a, c或 t"

<220>

<221> 其它重要生物功能区

<222> (50)..(50)

<223> 位于位置50的N可以是 g或 t

<220>

<221> 其它重要生物功能区

<222> (54)..(54)

"<223> 位于位置54的N可以是a, c, g或 t"

<220>

<221> 其它重要生物功能区

<222> (55)..(55)

"<223> 位于位置55的N可以是a, c或 t"

<220>

<221> 其它重要生物功能区

<222> (56)..(56)

<223> 位于位置56的N可以是g或 t

<220>

<221> 其它重要生物功能区

<222> (57)..(59)

"<223> n是 a, c, g或 t"

<400> 10

caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tgnnnnnntt acttnnnnnn ttannnnnna 60

ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactc 98

<210> 11

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> 其它重要生物功能区

<222> (30)..(30)

"<223> 位于位置30的N是 a, c, g或 t"

<220>

<221> 其它重要生物功能区

<222> (31)..(31)

"<223> 位于位置31的N是 a, c或 t"

<220>

<221> 其它重要生物功能区

<222> (32)..(32)

<223> 位于位置32的N是 g或 t

<220>

<221> 其它重要生物功能区

<222> (33)..(33)

"<223> 位于位置33的N是 a, c, g或 t"

<220>

<221> 其它重要生物功能区

<222> (34)..(34)

"<223> 位于位置34的N是 a, c或 t"

<220>

<221> 其它重要生物功能区

<222> (35)..(35)

<223> 位于位置35的N是 g或 t

<220>

<221> 其它重要生物功能区

<222> (42)..(42)

"<223> 位于位置 42的N是 a, c, g或 t"

<220>

<221> 其它重要生物功能区

<222> (43)..(43)

"<223> 位于位置 43的N是 a, c或 t"

<220>

<221> 其它重要生物功能区

<222> (44)..(44)

<223> 位于位置44的N是 g或 t

<220>

<221> 其它重要生物功能区

<222> (45)..(45)

"<223> 位于位置 45的N是 a, c, g或 t"

<220>

<221> 其它重要生物功能区

<222> (46)..(46)

"<223> 位于位置46的N是 a, c或 t"

<220>

<221> 其它重要生物功能区

<222> (47)..(47)

<223> 位于位置 47的N是 g或 t

<220>

<221> 其它重要生物功能区

<222> (54)..(54)

"<223> 位于位置54的N是 a, c, g或 t"

<220>

<221> 其它重要生物功能区

<222> (55)..(55)

"<223> 位于位置55的N是 a, c或 t"

<220>

<221> 其它重要生物功能区

<222> (56)..(56)

<223> 位于位置56的N是 g或 t

<400> 11

gttctacaaa gaaaacacag ctacaactgn nnnnnttact tnnnnnntta cagnnnattt 60

tgaatggaat taataattac aagaatcc 88

<210> 12

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> 其它重要生物功能区

<222> (19)..(19)

"<223> 位于位置19的N是 a, c, g或 t"

<220>

<221> 其它重要生物功能区

<222> (20)..(20)

"<223> 位于位置20的N是 a, c或 t"

<220>

<221> 其它重要生物功能区

<222> (21)..(21)

<223> 位于位置21 的N是 g或 t

<400> 12

cccagggact taatcagcnn natcaacgta atagttctgg aactaaaggg 50

<210> 13

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 13

cggtagcggt gggggcggtt ctctggaagt tctgttccag ggtccgagcg gcgga 55

<210> 14

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 14

gtagctgtgt tttctttgta gaacttgaag taggtgcgga tccgccgctc ggaccctgg 59

<210> 15

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 15

cttaaatgtg agcatcctgg tgagtttggg attcttgtaa ttattaattc cattcaaaat 60

<210> 16

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 16

ccaggatgct cacatttaag ttttacatgc ccaagaaggc cacag 45

<210> 17

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 17

gaggtttgag ttcttcttct agacactgaa gatgtttcag ttctgtggcc ttcttgggc 59

<210> 18

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 18

cagtgtctag aagaagaact caaacctctg gaggaagtgc taaatttagc tcaaagc 57

<210> 19

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 19

gattaagtcc ctgggtctta agtgaaagtt tttgctttga gctaaattta gcacttcctc 60

<210> 20

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 20

cagcatattc acacatgaat gttgtttcag atccctttag ttccagaact attacgttg 59

<210> 21

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 21

gaaacaacat tcatgtgtga atatgctgat gagacagcaa ccattgtaga atttctgaac 60

<210> 22

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 22

gagatgatgc tttgacaaaa ggtaatccat ctgttcagaa attctacaat ggttgctg 58

<210> 23

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 23

gattaccttt tgtcaaagca tcatctcaac actaactgcg gccgcttctg gtggcgaac 59

<210> 24

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 24

gatctcgagc aagtcttctt cggagataag cttttgttcg ccaccagaag cgg 53

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 25

cggtagcggt gggggcggtt c 21

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 26

cgaagaagac ttgctcgaga tc 22