A型超声波在研制近视相关药物中的应用

摘要

本发明公开了一种通过A型超声波技术测量非人灵长类（猴）的晶状体厚度变化，验证M受体拮抗剂对睫状体平滑肌的松弛作用的方法。用此方法可以测量不同浓度供试药品对晶状体厚度的影响，了解供试药品与晶状体厚度的量效关系，推测药物对屈光调节的影响，检测有效剂量，快捷有效地指导防治青少年近视眼新药的临床前研发工作。本发明的方法简单，技术稳定，可重复性好，对动物无组织创伤，对全身健康无损害。由于从猴（与人类最近似的动物）所获取的实验数据对临床试验具有其它动物无法比拟的指导意义，从而为创新药物的研发提供重要的转化医学信息。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药研发领域，具体涉及A型超声波在研制近视相关药物中的应用。

技术背景

青少年近视是我国常见的眼部疾病。由于升学压力、环境因素如电脑普及等影响，患病率逐年升高，是影响青少年健康的一个重要问题。如何切实有效地防治近视、保护青少年视力，是当前急需解决的大事。

除了遗传因素之外，造成青少年近视眼的主要因素包括学习任务繁重，照明不足或较长时间的近距离书写和阅读所引起的视觉疲劳。青少年的眼球正处于生长发育阶段，视觉的调节能力既晶状体的弹性很强，眼球壁的伸展性也比较大。用眼过度会使眼内睫状肌和眼外肌处于高度紧张状态。过度收缩的睫状肌会导致晶状体厚度和屈光力增加，焦点前移，是形成青少年近视的直接原因。如果上述情况持续存在，还会使眼轴变长，形成器质性近视眼。目前，控制青少年近视的三大主要措施包括增加户外活动，应用低浓度的阿托品类眼药水缓解睫状肌的紧张度和佩戴角膜塑形镜。其中增加户外活动和低浓度的阿托品眼药水的应用，均有利于缓解睫状肌的痉挛，减轻眼睛的疲劳状态，可以有效的缓解近视的进展。

阿托品是抗胆碱药的一种，为M受体阻滞剂，临床常用于解除胃肠平滑肌痉挛、抑制腺体分泌、兴奋呼吸中枢以及解除迷走神经对心脏的抑制，在眼科主要用于松弛睫状体平滑肌、减轻晶状体调节和散大瞳孔。近年来国内外相关研究证实，低浓度(0.01％)的阿托品滴眼液可以通过抑制青少年因近视引起的眼轴增长来延缓近视过快的进展。但由于阿托品是具有一定毒性的处方药，使用不当会给人们带来诸如瞳孔散大、畏光、视近模糊、眼压升高等副作用，所以在我国尚未获批上市。为此，国内眼科制药业正在努力研发阿托品的类似药，以图在保持其松弛睫状肌作用的同时减轻散大瞳孔等副作用。在临床前的动物实验中还要探索和确定有效剂量和安全性，以便在临床长期应用。

传统的测量睫状肌张力的方法是在高仿生的组织培养环境中使用包括微量张力换能器，电生理记录仪等一整套检测组织肌肉张力的系统测试离体组织对肌肉松弛剂或紧张剂的反应来完成的(Experimental Eye Research.2011 Sept；93(3):321-327.)。所需实验条件的门槛高、设备复杂、过程繁复费时、技术难度大和实验成本高，更重要的是这种实验所获得的仅仅是离体组织数据，模拟的培养环境与活体环境还存在很大距离，难以准确反应在体的实际情况。为了快速判断新药能否对睫状肌的紧张性产生效应，需要建立一种能够在活体动物中实施的简便、易行和有效的替代方法。

发明内容

本发明为了解决上述问题，公开了A型超声波在研制近视相关药物中的应用方案。本发明采用A型超声波活体检测技术，通过测量非人灵长类(猴)眼晶状体厚度在眼局部滴入M受体拮抗剂类药物(阿托品滴眼液)前后变化的方法验证M受体拮抗剂类药物对睫状体平滑肌的松弛作用。用此方法可以测量不同浓度供试药品对晶状体厚度的影响，了解供试药品与晶状体厚度的量效关系，推测药物对屈光调节的影响，检测有效剂量，快捷有效地指导防治青少年近视眼新药的临床前研发工作。

本发明的方案如下：

A型超声波在研制近视相关药物中的应用：通过使用A型超声波测量非人灵长类动物的晶状体厚度的变化，来验证M受体拮抗剂类药物对睫状体平滑肌的松弛作用，建立数据模型，指导近视相关药物的开发。

进一步的，上述A型超声波在研制近视相关药物中的应用，所述应用包括：构建供试药品与晶状体厚度的量效关系，推测药物对屈光调节的影响，检测有效剂量。

进一步的，上述A型超声波在研制近视相关药物中的应用，所述应用包括以下步骤：

1)动物分组：对非人灵长类动物进行随机分组；

2)超声检查：每眼滴入对照品或者M受体拮抗剂类药物，并于给药前后分别进行眼部A型超声检查和瞳孔测量，获得相关数据；

3)数据分析：对上述相关数据进行数据分析。

进一步的，上述A型超声波在研制近视相关药物中的应用，所述步骤1中，所述非人灵长类动物为食蟹猴，其年龄相当于人类青春期。

进一步的，上述A型超声波在研制近视相关药物中的应用，所述步骤2中，所述超声检查包括以下具体步骤：

S1：麻醉动物，使之仰卧固定于检查台，用开睑器暴露受检眼，滴加对照品或者M受体拮抗剂类药物；

S2：将A超探头安置在一个可以三维调整的固定架上，使探头头部垂直接近并轻触角膜顶点；

S3.使用A型超声波分别检查眼前房深度、晶状体厚度、玻璃体厚度、眼轴长度，记录数据；

S4.步骤S3完成后，立即使用瞳孔尺目视测量瞳孔水平直径并记录数据。

进一步的，上述A型超声波在研制近视相关药物中的应用，所述步骤3中，所述数据分析方法包括：

a.数据标准化：对每眼实测数据进行标准化,即以每眼给药前实测数据为100％,药后各时间点测得的数据除以药前数据而后乘以100，求得药后各时间点的标准化数值。

b.多维度数据分析：所有统计分析采用双尾分析，统计学水平设在p≤0.05。首先用Levene Test对数据进行均一性检验，如果数据均一(p﹥0.05)，则进行单因素方差分析；如果方差分析显著(p≤0.05)，则进行LSD多重比较；如果Levene Test的结果显著(p≤0.05)，则进行Kruskal-Wallis非参数检验；如果Kruskal-Wallis非参数检验结果显著(p≤0.05)，则进一步采用Mann-Whitney U检验进行两两比较。

进一步的，上述A型超声波在研制近视相关药物中的应用，所述应用包括以下具体步骤：

I.动物分组：动物被随机分为6组，每组两只；

II.超声检查：使用移液枪对双眼结膜囊单次滴入30μl PBS、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％M受体拮抗剂类药物，并于给药前、药后1h、2h、6h、72h和168h分别进行眼A超生物检查，同时测量瞳孔大小；检查时，将麻醉动物呈仰卧位固定于检查台，用开睑器暴露受检眼，将A超探头安置在一个可以三维调整的固定架上，使探头头部垂直接近并轻触角膜顶点；每次检查使超声波从角膜顶点进入，并与眼轴重合，测量获取眼前房深度、晶状体厚度、玻璃体厚度和眼轴长度的8组数据和1组平均值，每个时间点重复测量3次，取3次的平均值，逐一完成对双眼的生物测量；在恒定的室内照明环境中，使用瞳孔尺目视测量瞳孔水平直径；

III.数据分析：包括2个步骤，

a.数据标准化：对每眼实测数据进行标准化,即以每眼给药前实测数据(mm)为100％,药后各时间点测得的数据除以药前数据而后乘以100，求得药后各时间点的标准化数值；

b.多维度数据分析：所有统计分析采用双尾分析，统计学水平设在p≤0.05。首先用Levene Test对数据进行均一性检验，如果数据均一(p﹥0.05)，则进行单因素方差分析；如果方差分析显著(p≤0.05)，则进行LSD多重比较；如果Levene Test的结果显著(p≤0.05)，则进行Kruskal-Wallis非参数检验；如果Kruskal-Wallis非参数检验结果显著(p≤0.05)，则进一步采用Mann-Whitney U检验进行两两比较。

进一步的，上述A型超声波在研制近视相关药物中的应用，所述近视相关药物为预防或治疗青少年近视的药物。

进一步的，上述A型超声波在研制近视相关药物中的应用，所述应用包括建立动物模型。

进一步的，上述A型超声波在研制近视相关药物中的应用，所述应用包括使用以下公式对晶状体厚度变化与屈光度进行换算：(1/f)＝(n–1)×{(1/R1)–(1/R2)+[(n–1)t/nR1R2]}，式中，f＝焦距，1/f＝屈光度(D)，n＝晶状体的屈光指数(折射率)，R1和R2代表晶状体前表面和后表面的曲率半径，t＝晶状体的厚度。

进一步的，上述A型超声波在研制近视相关药物中的应用，所述M受体拮抗剂类药物包括但不限于阿托品。

根据上述发明方案，本发明公开了A型超声波在研制近视相关药物中的应用，至少具有以下有益效果：

(1)本发明利用睫状肌和晶状体之间的偶连光学调节原理，使用A型超声波诊断技术，通过对非人灵长类动物(食蟹猴)眼局部给予不同浓度的M受体拮抗剂类药物(阿托品)滴眼液，测量给药前、后晶状体厚度的变化，建立非人灵长类动物(食蟹猴)晶状体厚度变化与阿托品之间的量效关系曲线。进而，利用此方法，以M受体拮抗剂类药物(阿托品)作为阳性对照药，快速检测研发的新药对睫状肌的药效和量效关系；还可以利用屈光学的数学公式，测算供试药品引起的屈光度的变化，有力地指导药物防治青少年近视眼进展的新药研发工作。

(2)本发明的方法简单，技术稳定，可重复性好，对动物无组织创伤，对全身健康无损害。由于从猴(与人类最近似的动物)所获取的实验数据对临床试验具有其它动物无法比拟的指导意义，从而为创新药物的研发提供重要的转化医学信息。目前阿托品滴眼液在眼科临床以及非临床实验的应用主要包括1.眼内非感染性炎症如色素膜炎的治疗；2.青少年的验光检查；3.低浓度滴眼液延缓青少年近视眼的发展(仍属实验阶段)。本发明通过A超生物测量的方法检测阿托品(可用作标准对照药)对晶状体厚度的影响和量效关系，进而作为新型实验方法用于类似药物的非临床药效评价在国内外尚属首创。

附图说明

图1为实施例中自动模式下A型超声波检测结果的截图；

图2为实施例中PBS和多剂量阿托品滴眼液对食蟹猴晶状体厚度的影响(Mean±SD,4眼/组)

图3为实施例中各实验组的平均晶状体厚度与各剂量间的线性关系图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1

1.实验材料和方法：

实验动物：选择12只健康未成年眼部正常的食蟹猴，年龄45.9月±2.4月(相当于人类青春期年龄)，均值±标准差(后同)，体重3.8±0.6公斤，雌雄各半。

供试药品：1.0％硫酸阿托品滴眼液(日点，名古屋)和以中性磷酸缓冲液稀释的0.5％、0.1％、0.05％和0.01％阿托品滴眼液。

对照品：中性磷酸缓冲液(PBS，pH＝7.4)。

给药方法：单次局部滴眼，每眼30μl，双眼同时给药。

检测仪器：眼科A/B型超声诊断仪(ODM-2100S，天津迈达医学科技)

ODM-2100S眼科A型眼轴生物参数测量部分技术指标：

超声频率10MHz

A型超声生物参数测量精度:眼轴长度(AL)误差≤±0.06mm；前房深度(AC)的示值误差≤±0.06mm；晶状体厚度(LEN)、玻璃体厚度(VITR)的示值误差≤±0.12mm。显示分辨力：0.01mm

A型眼轴生物参数测量范围：

眼轴长度(AL)：15.0mm–39.0mm

前房深度(AC):2.0mm–6.5mm

晶状体厚度(LEN):2.0mm–6.5mm

玻璃体厚度(VITR):12.0mm–33.0mm

光照度测量仪：S400B光度仪(顺科达，北京)

检测时间：给药前，药后1h、2h、6h、72h和168h(7天)。

麻醉方法：动物在实验之日禁食，称体重，肌肉注射舒泰50(

2.实验步骤：

动物被随机分为6组，每组两只(4眼)。使用移液枪对双眼结膜囊单次滴入30μlPBS、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％阿托品滴眼液，并于给药前、药后1h、2h、6h、72h和168h分别进行眼A超生物检查，同时测量瞳孔大小。检查时，将麻醉动物呈仰卧位固定于检查台，用开睑器暴露受检眼，将A超探头安置在一个可以三维调整的固定架上，使探头头部垂直接近并轻触角膜顶点。为保证测量精度，每次检查使超声波从角膜顶点进入，并与眼轴重合。测量采用自动模式，仪器可在每次测量中自动产生包括眼前房深度、晶状体厚度、玻璃体厚度和眼轴长度的8组数据和1组平均值(如附图1所示)，每个时间点重复测量3次，取3次的平均值，逐一完成对双眼的生物测量。在恒定的室内照明环境中(450勒克斯)，使用瞳孔尺(巡野，宁波)目视测量瞳孔水平直径(每次A超检查后即刻进行)。实验结束后，动物于绒毯下保温，恢复清醒后被送回。

3数据分析和统计方法：

首先，对每眼实测数据进行标准化,即以每眼给药前实测数据(mm)为100％,药后各时间点测得的数据(mm)除以药前数据(mm)而后乘以100，求得药后各时间点的标准化数值(％)。具体统计方法如下：本试验采用统计学软件SPSS13.0对数据进行处理。所有统计分析采用双尾分析，统计学水平设在p≤0.05。首先用Levene Test对数据进行均一性检验，如果数据均一(p>0.05)，则进行单因素方差分析；如果方差分析显著(p≤0.05)，则进行LSD多重比较。如果Levene Test的结果显著(p≤0.05)，则进行Kruskal-Wallis非参数检验。如果Kruskal-Wallis非参数检验结果显著(p≤0.05)，则进一步采用Mann-Whitney U检验进行两两比较。和PBS组比较，a表示p<0.05，aa表示p<0.01，aaa表示p<0.001；和1％阿托品组比较，b表示p<0.05，bb表示p<0.01，bbb表示p<0.001；和0.5％阿托品组比较，c表示p<0.05，cc表示p<0.01，ccc表示p<0.001；和0.1％阿托品组比较，d表示p<0.05，dd表示p<0.01，ddd表示p<0.001；和0.05％阿托品组比较，e表示p<0.05，ee表示p<0.01，eee表示p<0.001。

4.实验结果

(1)前房深度:药前前房平均深度为2.70mm±0.21mm(n＝24眼)，药后PBS组和阿托品各剂量组动物的前房深度均呈现非剂量相关的、无规律性轻度变化，统计学分析除了阿托品各剂量组在药后72h出现非剂量相关的无序变化外，均未见显著性差异(如所示表1)

表1.PBS和阿托品对食蟹猴前房深度的影响(％平均数±标准差，4眼/组)

(2)晶状体厚度：药前晶状体平均厚度为3.30mm±0.08mm(n＝24眼)。PBS组药前晶状体平均厚度为3.30mm±0.03mm，药后1h-72h仅有-0.02mm(-0.66％)的轻微变化，在168h为3.29mm±0.02mm，是药前水平的99.65％。与给药前相比，阿托品各剂量组的晶状体厚度在药后1h、2h和6h均呈现与剂量负相关的逐渐下降趋势，在药后6h分别下降7.43％(1％组)、5.11％(0.5％组)、3.20％(0.1％组)、0.82％(0.05％组)和0.88％(0.01％组)，并在药后72h和168h呈现与剂量相关的逐步恢复的趋势，在药后168h(7天)分别恢复到药前水平的95.83％(1％组)、99.07％(0.5％组)、98.05％(0.1％组)、100.03％(0.05％组)和99.85％(0.01％组)。

晶状体厚度(％)变化的单因素方差分析(见表2所示)：

1)与PBS组同期比较：1％组药后各时间点，0.5％组和0.1％组药后2h、6h、72h均有显著性差异(p≤0.05,符号a)。

2)与1％阿托品组同期比较：0.1％组药后6h和72h，0.05％组和0.01％组药后各时间点均有显著性差异(p≤0.05,符号b)。

3)与0.5％组同期比较：0.05％组药后1h、2h、6h、72h，0.01％组药后各时间点均有显著性差异(p≤0.05,符号c)。

4)与0.1％组同期比较：0.05％组在药后2h,6h和72h，0.01％组在药后6h和72h均有显著性差异(p≤0.05,符号d)。

5)与0.05％组同期比较：0.01％组在药后1h有显著性差异(p≤0.05,符号e)。

表2.PBS和阿托品对食蟹猴晶状体厚度的影响(％，平均数±标准差，4眼/组)

上述晶状体厚度变化与阿托品剂量相关并在药后6h出现所观察的各时间点中的最大药效(见附图2)。以药后6h晶状体厚度的变化(％)为例，各组的平均晶状体厚度与剂量间呈现高度的线性相关(R

(3)玻璃体厚度:给药前玻璃体平均厚度为12.35mm±0.18mm(n＝24眼)，药后PBS组和阿托品各剂量组动物的玻璃体厚度均呈现小于2％的非剂量相关的、无规律性微弱变化，统计学(单因素方差分析)均无显著性差异(见表3所示)。

表3.PBS和阿托品对食蟹猴玻璃体厚度的影响(％，平均数±标准差，4眼/组)

(4)眼轴长度：给药前平均眼轴长度为18.36mm±0.33mm(n＝24眼)，药后PBS组和阿托品各剂量组动物的眼轴长度均在小于3％的范围内呈现非剂量相关的、无规律的轻度变化，统计学分析(单因素方差分析)均未见显著性差异(见表4所示)。

表4.PBS和阿托品对食蟹猴眼轴长度的影响(％，平均数±标准差，4眼/组)

(5)瞳孔直径：在450勒克斯恒定光照度下，药前瞳孔的直径均为2.0mm。PBS组的瞳孔直径在给药前后无变化。各阿托品给药组的瞳孔直径在药后1h、2h和6h呈现与剂量正相关的逐渐增大趋势，且在药后72h和168h呈现与剂量相关的逐步恢复的趋势。其中，两个最低剂量组(0.05％和0.01％)动物的瞳孔直径到药后168h(7d)已经基本或完全恢复至药前水平(见表5所示)。

表5.PBS和阿托品对食蟹猴瞳孔直径的影响(mm，平均数±标准差，4眼/组)

5.实验结果讨论

晶状体厚度变化与屈光度的换算：

晶状体是一个双凸透镜，前表面曲率半径(R)大于后表面曲率半径。根据光线向三角形屈光介质(如玻璃)的底部偏转的光学原理，光在经过晶状体时会在光路上发生向心性折射，在视网膜上聚焦的既正视眼，聚焦于视网膜前的谓之近视眼，聚焦视网膜后的则是远视眼。晶状体通过厚度的变化来调整焦距。晶状体变厚则焦距变短，成像前移，变薄则焦距变长，成像后移。阿托品通过松弛睫状肌使睫状肌环变大，通过悬韧带的牵拉增强对晶状体的牵张力，晶状体受到牵拉而变薄，屈光力减弱，焦距变长，成像后移，聚焦在视网膜从而达到预防和减缓近视眼的作用。在影响眼屈光的所有其他因素不变的情况下，晶状体厚度变化对屈光度的影响可以通过以下公式进行计算：

(1/f)＝(n–1)×{(1/R1)–(1/R2)+[(n–1)t/nR1R2]}

公式中f＝焦距，1/f＝屈光度(D)，n＝晶状体的屈光指数(折射率)，R1和R2代表晶状体前表面和后表面的曲率半径，t＝晶状体的厚度。在这个公式中最重要的两个因素是晶状体厚度(t)和焦距(f)。焦距是公式右侧的倒数。换句话说，如果公式的右侧越小，则焦距越长。(屈光指数：光线由一种介质进入另一种不同折射率的介质时，会发生前进方向的改变，在眼光学中即称为“屈光”。眼球内能够产生屈光作用的组织被称为屈光间质，如角膜、房水、晶状体、玻璃体等。眼球内屈光间质的折射指数被称为屈光指数。真空环境的屈光指数被定为1。人类眼内各屈光间质的屈光指数如下：角膜1.33，晶状体1.43，房水和玻璃体与水相同约为1.33。正常情况下，屈光指数不会发生明显变化。)

在上述公式中代入相关指标既可以计算出因晶状体厚度变化产生的焦距(f)或屈光度(1/f)的改变，指导药物研发。

1.本实验通过眼科A型超声诊断技术检测到了不同剂量阿托品滴眼液对食蟹猴眼产生的剂量相关性的减低晶状体厚度的作用，验证了阿托品(M受体阻断剂)对睫状体平滑肌的松弛作用以及通过减低晶状体厚度(改变晶状体的曲率半径)产生屈光调节的视觉生理作用。

2.本实验中还观察到阿托品对食蟹猴瞳孔引起的剂量相关的不同程度和持续时间的散瞳作用。

3.本实验使用的晶状体厚度检测方法操作简单、技术稳定、可重复性好、对组织无创伤、对动物健康无损害、可根据实验的需要在单眼或双眼进行。从猴获取的实验数据对临床试验具有其它动物无法比拟的指导作用，为创新药物的研发提供重要的转化医学信息。

4.本方法可用于评估和验证新型M受体拮抗剂对睫状体平滑肌的松弛作用，检测最低有效剂量，快捷有效地指导防治青少年近视眼新药的临床前研发工作。

5.本专利申请公开了利用晶状体厚度变化计算屈光度改变的数学公式的使用方法以及相关指标来有效地指导防治青少年近视眼新药的临床前研发工作。

需要指出的是，上述实验是在3个不同的时间阶段开展和完成的，即：2020.8.3开始PBS组和05％组；2020.8.18开始0.1％组和1％组；2020.9.1开始0.01％组和0.05％组。在不同的时间，对不同的动物个体，检测不同剂量的阿托品滴眼液所引起的晶状体厚度变化的数据能够呈现如此高度的线性量效关系(R