一种定向引导视神经轴突再生复合支架的制备方法及其应用

摘要

一种定向引导视神经轴突再生复合支架的制备方法及其应用，复合支架主要组分为一种或多种可降解生物医用材料按不同比例组合通过梯度冷冻法制备，为增加支架力学性能或延长体内降解时间，可经生物交联剂交联得到，添加明胶A后制成的复合支架具有更好的力学性能，且具有较好的生物相容性。海藻酸钠能调节明胶A在梯度冰冻的过程中产生的溶解度不同问题，促使支架出现规整的定向管道形貌。复合支架在经京尼平交联后明显增强稳定性，其定向管道形貌能为视神经轴突再生提供攀附位点，引导视神经轴突定向再生。本发明所提供的复合支架具有引导视神经轴突定向再生的能力，可移植入视神经损伤部位促进视神经轴突定向再生，作为视神经损伤修复支架材料。

说明书

技术领域

本发明涉及视神经修复支架技术领域，具体涉及一种定向引导视神经轴突再生复合支架的制备方法及其应用。

背景技术

视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）胞体位于视神经内部，其轴突投射至眼球后补汇聚成视神经。每只眼的视神经大约有120万RGC轴突组成，并有眼动脉分支灌注。视神经功能受损统称为视神经病变（optic neuropath），可由青光眼、外伤性视神经病变（traumaticopticneuropathy，TON）以及各种缺血性、遗传性、神经性疾病等造成。TON是颅脑损伤的并发症之一，是指由于各种外力原因，造成面部、颅脑、眼眶或眼后部损伤的同时损伤视神经，损伤后可以没有外部或最初眼底镜下眼球或视神经损伤表现，却有不同程度视力的减退或视野的缺损，甚至视力的完全丧失。针对TON的治疗原则主要体现在保护损伤视神经避免凋亡以及促进视神经轴突再生及功能重建。视神经再生的限制因素可分为内在因素和外在因素。内在因素主要表现为2点：1.视神经损伤引起的RGCs凋亡会上调凋亡相关信号通路（P53、Bax）下游因子，增加RGCs氧化应激水平，进一步促进RGCs凋亡。2.RGCs在分化成熟的同时，其细胞内程序向抑制增殖转变。有报道表明许多的细胞内信号通路如cAMP、mTOR/PTEN、KLF4等可诱发转录级联和表观遗传改变，这些改变与中枢神经系统成熟密切相关。因此，在视神经损伤后RGCs轴突难以再生可能与这些分子的调控有关。外在因素主要包括缺乏神经营养因子、损伤端神经胶质瘢痕以及髓磷脂等。髓磷脂是胶质细胞产生的一种脂肪蛋白，作用是绝缘并加速电传导，其存在也被认为是中枢神经系统较外周神经系统再生能力差的一个原因。例如，Vajda F等人报道在中枢神经系统少突胶质细胞上高度表达的髓鞘相关蛋白（Nogo）是中枢神经系统轴突再生的一个主要抑制剂。此外，其他髓鞘相关蛋白如脑信号蛋白4D（semaphorin 4D）、髓鞘相关糖蛋白（MAG）、少突胶质细胞髓鞘相关糖蛋白（OMgp）、酪氨酸蛋白激酶B3（ephrin B3）等都被证明与抑制轴突生长相关。同时中枢神经系统损伤后髓磷脂清除效率降低容易导致外环境髓磷脂堆积，髓磷脂产物不仅能够限制轴突再生，更能够激活凋亡级联，进一步促进神经元凋亡。视神经损伤后视网膜胶质细胞包括少突胶质细胞、星形胶质细胞及视网膜小胶质细胞被激活，上调多种轴突生长抑制因子，并促进硫酸软骨素、蛋白多糖及反应性星形胶质细胞形成胶质瘢痕。神经胶质瘢痕是视神经轴突再生的不适宜环境，也是其生长的机械屏障，研究认为减少胶质瘢痕可以促进神经轴突再生。

针对以上因素，国内外做了较多的研究工作，主要包括以下几个方面：1、通过腺相关病毒（AAV）等基因治疗方式从基因层面打开细胞内程序的增殖抑制，从而促进视神经轴突再生；2、通过提供外源性神经营养因子，改善视神经损伤后营养因子缺乏的困境，从而促进轴突再生；3、通过抗炎抗凋亡药物应用，减少损伤后RGCs由于炎症及氧化应激造成的凋亡；4、通过炎症刺激激活RGCs细胞内在程序，促进视神经轴突再生。5、移植外周神经改善外界抑制环境，促进视神经轴突再生。但目前由于AAV等基因治疗安全性有待认证，同时再生轴突在增殖过程由于缺少定向引导因素常出现轴突折返现象，影响再生效果。提供外源性营养因子或抗炎抗凋亡药物由于药物代谢问题，在促进视神经轴突再生方面表现不佳。炎症刺激在促进轴突再生的同时，引起眼内炎容易促进RGCs细胞凋亡。而外周神经移植材料来源有限，异体移植容易存在排斥反应，因此以上方式均未向临床转化。目前临床对于TON的治疗方式主要包括手术、激素及联合治疗方式。手术治疗主要是视神经管减压术即通过清除视神经管骨折碎片和解除管壁对损伤和水肿的视神经的压迫，减少视神经外部及内部血管出血对视神经压迫的进一步损伤，以增加视神经血液供应，缓解视神经的肿胀和视神经管的相对缩窄，防止视功能进一步恶化，以达到恢复或部分恢复视神经轴束传导功能。但视神经发生损伤后，会启动内在的凋亡程序，即使及时通过手术解除视神经损伤的诱因并联合激素治疗，也无法阻止RGCs的慢性凋亡。因此目前亟需开发针对TON的新型治疗方式。

发明内容

为了解决现有技术的缺陷，本发明立足于通过改善视神经损伤微环境、构建促进视神经轴突定向再生组织工程支架，从而促进视神经再生修复的研究，提供了一种定向引导视神经轴突再生复合支架的制备方法及其应用，制备出具有良好的三维定向贯通管道结构、良好的生物相容性、优秀的生物降解能力、适宜的生物力学性能的定向管道复合支架，可移植入视神经损伤部位，能够在替换视神经损伤后局部环境的同时，支撑损伤视神经避免退化塌陷，贯通管道有利于营养物质流通及引导轴突生长，具有促进视神经定向再生功能。

本发明采用的技术解决方案是：一种定向引导视神经轴突再生复合支架的制备方法，包括以下步骤：

（1）将明胶A溶解在70℃的去离子水中，得到明胶A溶液；将海藻酸钠溶解在70℃的去离子水中，得到海藻酸钠溶液；将两种溶液按照1:1比例混合，并搅拌均匀，静置去除气泡；

（2）将混合溶液注入直径约为12 mm的特氟龙管状模具中，注入液氮进行梯度冷冻，需要稳定保持特氟龙模具上层温度为-80±20℃，下层温度为-180±20℃，温度差为100±20℃；

（3）将冷冻后的混合溶液放入-80±2℃条件下复冻24小时；

（4）将复冻的混合溶液放入冷冻干燥机，干燥48小时；

（5）在京尼平溶液中放入明胶A、海藻酸钠复合支架，并在转膜摇盘上摇24小时进行交联；

（6）24小时后关闭转膜摇盘，静置6天即可交联复合支架。

所述的步骤（1）得到的明胶A溶液的浓度为25 mg/ml。

所述的步骤（1）得到的海藻酸钠溶液的浓度为10 mg/ml。

所述的步骤（5）中的京尼平溶液为浓度为1 mg/ml的京尼平乙醇溶液，并置于棕色瓶中保存。

一种定向引导视神经轴突再生复合支架在作为视神经损伤修复材料上的应用。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种定向引导视神经轴突再生复合支架的制备方法及其应用，复合支架主要组分为一种或多种可降解生物医用材料按不同比例的组合，如明胶、海藻酸钠、丝素蛋白、壳聚糖等，但不限于上述所列材料，通过梯度冷冻法制备，为增加支架力学性能或延长体内降解时间，可经生物交联剂，如京尼平等交联得到。添加明胶A后制成的复合支架具有更好的力学性能，且具有较好的生物相容性。海藻酸钠能调节明胶A在梯度冰冻的过程中产生的溶解度不同问题，促使支架出现规整的定向管道形貌。复合支架在经京尼平交联后明显增强稳定性，其定向管道形貌能为视神经轴突再生提供攀附位点，引导视神经轴突定向再生。本发明所提供的复合支架具有引导视神经轴突定向再生的能力，可移植入视神经损伤部位促进视神经轴突定向再生，作为视神经损伤修复支架材料。

附图说明

图1为本发明合成后定向管道复合支架示意图。

图2为本发明在视神经损伤处应用原理图。

图3为本发明交联前后复合支架肉眼观察图。

图4为本发明定向管道复合支架的扫描显微镜图，其中A图为横截面，B图为纵截面。

图5为本发明通过京尼平交联后的支架的扫描显微镜图，其中A图为横截面，B图为纵截面。

图6为将长度为2 mm的视神经支架移植入大鼠视神经损伤模型结果图，其中红色箭头指向支架移植位置。

图7为支架移植3周后将大鼠视神经取出示意图。

图8为支架移植3周后做免疫荧光图，A图为本发明支架移植三周后的免疫荧光图，红色箭头指向移植的支架，白色箭头指向新生长入支架的视神经，B图为视神经损伤模型损伤后移出损伤视神经的免疫荧光图。

图9为本发明对照不同原料配比合成复合支架。

图10为本发明对照不同交联方式交联复合支架形貌、孔隙率及降解曲线图。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

下面结合附图以及具体实施例，可以更好地说明本发明。

本发明由A型明胶与海藻酸钠组成，其中A型明胶、海藻酸钠质量比为5:2，A型明胶颗粒型号为V900863，品牌为Sigma-Aldrich。海藻酸钠粉末型号为S817374，品牌为Macklin。

制备方法：

可引导视神经定向再生的复合支架是通过明胶A颗粒混合海藻酸钠粉末经由梯度冷冻法制备，并通过京尼平交联得到。具体步骤如下：

（1）将明胶A溶解在70℃的去离子水中，浓度为50 mg/ml；

（2）将海藻酸钠溶解在70℃的去离子水中，浓度为20 mg/ml；

（3）将两种溶液按照1:1比例混合，并搅拌均匀，静置去除气泡；

（4）将混合溶液注入直径约为12 mm的特氟龙管状模具中，通过特制的冷冻装置注入液氮进行梯度冷冻。梯度冷冻需要稳定特氟龙模具上层温度为-80℃，下层温度为-180℃，温度差为100℃，此温度差得到的复合支架具有较好的管道形貌。

（5）将冷冻后的混合溶液放入-80℃冰箱复冻24小时。

（6）将复冻的混合溶液放入冷冻干燥机，干燥48小时。

（7）将得到的明胶A、海藻酸钠复合支架通过京尼平进行交联。

（8）将京尼平溶于90%的乙醇溶液中，浓度为1 mg/ml，并注入棕色瓶中；

（9）在棕色瓶中放入复合支架，并在转膜摇盘上摇24小时；

（10）24小时后关闭转膜摇盘，静置6天即可交联复合支架。

定向管道复合支架的扫描显微镜图4所示，A图为横截面，B图为纵截面，可以看出具有较好的定向管道结构。

本发明复合支架采用明胶A和海藻酸钠制备，通过梯度冷冻法复合形成的，具有较好的定向管道取向，以及具有较好的生物相容性、极好的亲水性以及蛋白构架，适合细胞生长攀附（来源于第3部分组成及结构）。明胶A是通过胶原蛋白部分水解产生，是天然的蛋白高分子材料，具有较好的生物相容性。海藻酸钠是一种从藻类中提取的天然多糖，性质稳定、安全，具有较好的生物相容性。通过梯度冷冻方式，能够在明胶A、海藻酸钠溶液中制造定向冰晶，之后通过冷冻干燥机升华冰晶，得到具有定向管道的复合支架。复合支架具有较为均匀的定向管道，直径约为20 μm，适合视神经轴突长入及营养物质流通,明胶A：海藻酸钠质量比为5:2时，合成支架具有最好管道形貌。京尼平是一种优良的天然交联剂，其毒性远低于戊二醛和其他的常用化学交联剂。使用京尼平交联，保证复合支架酷游良好的稳定性和力学性能的同时，也具有较好的生物相容性。

实施例.

本发明是通过将合成的定向管道复合支架移植入视神经损伤位置，替换视神经损伤处的抑制微环境，从而促使视神经轴突定向再生。动物试验结果如下图6所示，将长度为2 mm的视神经支架移植入大鼠视神经损伤模型当中。红色箭头指向支架移植位置。

支架移植3周后将大鼠视神经取出，结果如下图7所示，视神经损伤处移植支架降解，新生轴突长入填充。

支架移植3周后做免疫荧光，结果如下图8所示。A图为本发明支架移植三周后的免疫荧光图，红色箭头指向移植的支架，白色箭头指向新生长入支架的视神经。可见支架植入有利于视神经轴突再生。B图为视神经损伤模型损伤后移出损伤视神经的免疫荧光图，可见损伤处无视神经再生。标尺为150 μm。

对比例1

本发明对照不同原料配比合成复合支架，选取定向管道形貌最佳的组别为原料配比。结果如下图9，A组（明胶A 50 mg/ml、海藻酸酸钠10mg/mlA）、B组（明胶A25 mg/ml、海藻酸酸钠1 mg/ml）、C组（明胶A 50 mg/ml、海藻酸酸钠1 mg/ml）、D组（明胶25 mg/ml、海藻酸酸钠10mg/ml）。Bar=80 μm。选取D组作为定向管道复合支架的原料配比。

对比例2

本发明对照不同交联方式交联复合支架形貌、孔隙率及降解曲线，结果如下图10所示，A、B、C分别为京尼平、EDC+NHs、戊二醛三种方式交联后的支架SEM，孔隙率约为94.1%。京尼平交联对定向管道形貌保持最好，同时京尼平交联膨胀率为31.3%±10.6%，避免了支架移植入视神经后发生较大的吸水膨胀，引起对视神经的挤压。在降解实验中，京尼平与戊二醛均表现出了较好的稳定性，因此最终选择京尼平作为支架的交联方式。

本发明基于改善视神经损伤微环境、调控轴突再生不利因素、构建可引导轴突定向生长通道之思路，制备出具有三维定向贯通管道结构、良好的生物相容性、适宜的生物力学性能的定向管道复合支架，能够在替换损伤视神经抑制环境的同时，支撑损伤视神经避免退化塌陷，贯通管道有利于营养物质流通及轴突生长，具有引导视神经定向再生功能。实施例中所制备的明胶A、海藻酸钠复合支架具有良好生物相容性，一定的力学性能以及体内稳定性，能同时提供视神经轴突再生攀附的媒介，并引导其定向生长，因此被认为是一种极具潜力的视神经修复支架材料。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。