化合物预防和/或治疗冠状病毒感染所致疾病的新用途

摘要

本发明发现去甲泽拉木醛和西地尼布能够有效地阻断RBD与ACE2蛋白的结合，从而可以用于预防和/或治疗冠状病毒感染所致的疾病。

说明书

技术领域

本发明涉及药物化学领域，特别涉及靶向SARS-CoV-2RBD和/或人ACE2蛋白的小分子抑制剂。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染引起的2019新型冠状病毒疾病 (COVID-19)

目前科学家们已经获得了有关SARS-CoV-2的详细生物学信息

疫苗是最有希望的治疗方法之一。抗病毒药物的开发是对抗COVID-19的另一个有效对策。然而目前尚未发现具有明确临床疗效的药物。SARS-CoV-2抑制剂的筛选现已全面展开，并已获得各种有前景的抑制剂

进入宿主细胞是病毒感染的第一步，因此阻止病毒进入宿主细胞是一种有效的抗病毒药物研发策略

表面等离子体共振(SPR)技术是上世纪90年代开发的用于分析生物分子相互作用的通用型生物物理检测技术

发明内容

本发明以SARS-CoV-2的RBD蛋白和ACE2蛋白为靶标，应用SPR技术筛选包含960个化合物的数据库。通过建立筛选模型及清库、结合水平筛选和亲和力测定实验，获得了7个K

根据本发明的一个方面，本发明涉及去甲泽拉木醛或西地尼布、或者其可药用盐、或者其或其可药用盐的溶剂化物、或者其或其可药用盐的水合物在制备用于预防和/或治疗冠状病毒感染所致疾病的药物中的应用。优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2。更优选地，所述疾病为新型冠状病毒疾病和/或其并发症。

根据本发明的另一个方面，本发明涉及一种预防和/或治疗冠状病毒感染所致疾病的方法，其特征在于，给予有需要的对象治疗有效量的去甲泽拉木醛或西地尼布、或者其可药用盐、或者其或其可药用盐的溶剂化物、或者其或其可药用盐的水合物。优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2。更优选地，所述疾病为新型冠状病毒疾病和/或其并发症。

根据本发明的另一个方面，本发明涉及一种消杀环境中冠状病毒的方法，其特征在于，施用去甲泽拉木醛或西地尼布、或者其盐、或者其或其盐的溶剂化物、或者其或其盐的水合物。优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2。

根据本发明的另一个方面，本发明涉及去甲泽拉木醛或西地尼布、或者其盐、或者其或其盐的溶剂化物、或者其或其盐的水合物用作SARS-CoV-2RBD 抑制剂的用途。

根据本发明的另一个方面，本发明涉及去甲泽拉木醛或西地尼布、或者其盐、或者其或其盐的溶剂化物、或者其或其盐的水合物用作ACE2抑制剂的用途。

本领域技术人员可以理解，去甲泽拉木醛的盐或可药用盐例如与无机碱或有机碱形成的盐。无机碱包括但不限于碱金属例如钠、钾等，碱土金属例如钙、镁等，有机碱包括但不限于有机胺例如乙醇胺、三甲胺、叔丁胺、吡啶、甲基吡啶、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇等，碱性氨基酸例如精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸等。西地尼布的盐或可药用盐例如与无机酸或有机酸形成的盐。无机酸例包括但不限于盐酸、硫酸、磷酸、氢溴酸、硝酸等，有机酸包括但不限于甲酸、乙酸、丙酸、戊酸、二乙基乙酸、三氟乙酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、庚二酸、富马酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、葡糖酸、抗坏血酸、烟酸、异烟酸、苯甲酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、萘二磺酸等。

根据本发明的另一个方面，本发明涉及一种药物组合物，含有去甲泽拉木醛或西地尼布、或者其可药用盐、或者其或其可药用盐的溶剂化物、或者其或其可药用盐的水合物。优选地，进一步含有可药用载体。优选地，所述药物组合物用于预防和/或治疗冠状病毒感染所致疾病。更优选地，所述冠状病毒为 SARS-CoV-2。更优选地，所述疾病为新型冠状病毒疾病和/或其并发症。

本领域技术人员可以理解，本发明的药物组合物可以制成本领域的各种常用制剂形式，例如静脉、口服、吸入、眼用、直肠给药等制剂形式，包括但不限于片剂、胶囊、丸剂、颗粒剂、糖浆剂、乳剂、悬浮剂、气雾剂、注射剂、栓剂、滴眼液等等。

本领域技术人员可以理解，本发明的药物组合物中可以含有各种本领域常用的可药用载体。

本领域技术人员可以理解，可以根据体重、给药方式、个体对药物的反应、制剂类型、给药时间或间隔确定治疗有效量。

根据本发明的另一个方面，本发明涉及一种消杀环境中冠状病毒的消毒剂，含有去甲泽拉木醛或西地尼布、或者其可药用盐、或者其或其可药用盐的溶剂化物、或者其或其可药用盐的水合物。

本发明发现去甲泽拉木醛或西地尼布能够与RBD、ACE2结合，并且能够有效阻断RBD和ACE2相互作用，从而能够预防和/或治疗冠状病毒感染所致的疾病。

附图说明

图1为实施例1中RBD-mFc与捕获的ACE2-His相互作用的表面等离子体共振传感图。

图2为实施例3中结合水平筛选所得苗头化合物的固定化ACE2的传感图。化合物数据显示为实线，空白对照数据显示为虚线。

图3为实施例3中结合水平筛选所得苗头化合物的固定化RBD的传感图。化合物数据显示为实线，空白对照数据显示为虚线。

图4为实施例3中结合水平筛选所得苗头化合物结合ACE2蛋白的传感图。

图5为实施例3中结合水平筛选所得苗头化合物结合RBD蛋白的传感图。

图6为实施例4中02B05与RBD-His结合的ITC实验。

图7为实施例5中02B05对ACE2-RBD的竞争性抑制。图中，由上至下化合物的浓度分别为0μM、31.25μM、62.5μM、125μM。

图8为实施例5中03D12对ACE2-RBD的竞争性抑制。图中，由上至下化合物的浓度分别为0μM、31.25μM、62.5μM、125μM。

图9为实施例5中RBD蛋白(6.25、12.5和25nM，从上至下第一条线)、125μM 02B05和RBD蛋白(6.25、12.5和25nM，从上至下第二条线)、125μM 02B05(从上至下第三条线)和运行缓冲液(从上至下第四条线)与ACE2蛋白结合的传感图叠加。

图10为实施例6中化合物02B05的细胞毒性及其对293T-hACE2细胞中假型 VSV病毒或SARS-CoV-2病毒转导的影响。图中，*，P<0.05；**，P<0.01，左右Y轴分别代表Luc活性和细胞活力的平均百分比。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解，在阅读了本发明所记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。

由960种临床前化合物组成的化合物库由Targetmol(美国)提供。SARS-CoV-2 S蛋白的RBD蛋白(mFc标签，cat no:40592-V05H)和人类ACE2蛋白(His标签，cat no:10108-H08H)购自Sino Biological(中国)，带有His标签的SARS-CoV-2RBD 蛋白由中国医学科学院药物研究所提供。HBS-N缓冲液、氨基偶联试剂盒、NTA 试剂盒、醋酸盐缓冲液、CM5芯片和NTA芯片均购自Cytiva(前瑞典GE医疗公司)。二甲基亚砜(DMSO)、吐温20和氢氧化钠购自Sigma-Aldrich(德国)。

表达人ACE2的293T衍生细胞系(293T-hACE2)购自中吉当康基因技术有限公司，在5％CO

实施例1蛋白-蛋白相互作用测试

使用Biacore S200仪器，利用NTA芯片，测定ACE2和RBD蛋白的蛋白-蛋白相互作用。运行缓冲液为HBS-T+缓冲液(10mM HEPES,150mM NaCl,0.05％ tween 20,pH 8.0,0.22μm微孔滤膜过滤)。配体为ACE2-His，浓度为10mg/mL，捕获时间为100秒。配制一系列浓度为3.13、6.25、12.5、25、50和100nM的 S-RBD-mFc溶液，使其流过捕获的ACE2-His表面，并记录获得的响应单位(RUs)。流速设定为30μL/min，结合时间120s，解离时间500s。350mM EDTA为再生溶液，再生时间60秒。

实验结果表明，不同循环的ACE2捕获量相对稳定(响应约为143RU，偏差不超过2RU)。此外，将相同浓度的RBD蛋白重复进样获得的传感图几乎重合，这表明捕获法具有较好的再现性和稳健性。使用这种稳健的相互作用方法，测量了ACE2-RBD相互作用(附图1)。测得的RBD最大响应信号为94.2RU。以上结果表明，两种蛋白在运行缓冲液中的活性保持良好。数据分析使用Biacore S200评估软件1.0版完成，经1:1数据拟合后，通过软件分析获得的亲和常数为0.37nM。

实施例2氨基偶联法SPR筛选模型的建立

通过氨基偶联法将RBD及ACE2蛋白固定在CM5芯片上。芯片首先与EDC和 NHS的混合物接触而被活化。然后将浓度为20μg/mL和16μg/mL的RBD和 ACE2-His蛋白分别溶解于醋酸钠溶液(分别为pH 5.0和pH 4.5)中，并流过芯片表面，最终分别固定在CM5芯片的Fc2和Fc4上。最后用乙醇胺封闭芯片。

经测，RBD蛋白的偶联量约为8500RUs，ACE2蛋白的偶联量约为9100RUs。将约20nM的ACE2或RBD流过固定有RBD或ACE2的芯片时，响应信号分别为 242RUs和319RUs。以上结果表明，两种靶标蛋白在固定后均能保持活性。

实施例3活性化合物筛选

化合物筛选的整个过程分为三个步骤：清库、结合水平筛选和亲和力测定。实验均采用Biacore T200或Biacore S200仪器，流速为30μL/min，数据采用Biacore T200/S200评估软件进行分析。使用HBS-T+缓冲液(10mM HEPES,150mM NaCl,0.05％tween 20,5％DMSO,pH 8.0,0.22μm微孔滤膜过滤)作为运行缓冲液。首先将化合物稀释至100μM，最终用5％DMSO的运行缓冲液稀释为25μM或 10μM。

基于溶解度的差异，将浓度为25μM或10μM的化合物流过芯片表面进行清库。通过清库，总共排除了13种高粘度化合物。然后对通过清库的化合物进行结合水平筛选，以便识别得到与靶标蛋白结合的化合物。

结合水平筛选时，化合物筛选浓度为10μM，结合和解离时间为60秒。在筛选过程中，运行缓冲液为阴性对照。根据GE Healthcare Laboratory指南，制备溶剂校正样品(8个点)。最终筛选获得了15个结合于RBD的化合物和15个结合于 ACE2的化合物。传感图如附图2和3所示。通过软件自动分析后，在结合水平筛选获得的苗头化合物中，8个结合ACE2的化合物(分别为01N12、02B05、02C19、 02D16、03D12、03E22、03I19和03P04)和5个结合RBD的化合物(分别为02B05、 02C15、02J06、03D12和03I14)被标记为慢解离化合物。

然后，对结合水平筛选所得苗头化合物进行亲和力测定，浓度范围为0.3125 至20μM。结合时间为60秒，解离时间为120秒。动力学和稳态亲和力的数据通过1:1结合模型获得。结果表明，有5个化合物(02B05，02C15，02J06，02M09， 03D12)对RBD显示出高结合亲和力，其K

表1不同化合物与ACE2以及RBD的亲和力测定结果

a动力学分析数据自动拟合为1:1结合模型

b稳态亲和力分析数据自动拟合为1:1结合模型

最后，利用动力学拟合模型，测量了上述化合物和ACE2和RBD的动力学常数。将浓度为0.31、0.63、1.25、2.5、5、10和20μM的化合物注入芯片表面。结合时间为60秒，解离时间为120秒。传感图如附图4和5所示。总的来说，化合物 02B05的解离速率常数最小，表明它具有最长的停留时间。一般来说，较长的停留时间与药效的大小和持续时间密切相关。上述研究结果表明，化合物02B05有望成为一种潜在的RBD-ACE2结合抑制剂。

实施例4应用iTC进行相关作用测定

将浓度为15μM的S-RBD-His置于iTC200(英国马尔文)样品池中。将化合物 02B05由2mM的储备溶液(溶解于DMSO)稀释至100μM(溶剂为运行缓冲液) 中。在25℃下以8的参考功率进行实验。最初注射0.2μL，然后注射15×2μL。通过将相同浓度的化合物注射到缓冲液中来测量化合物的稀释热。数据符合1:1的结合等温线。

结果如附图6所示，由iTC测量的亲和力是2.09μM，接近于实施例3中SPR测得的亲和力。这一结果表明化合物02B05可以在缓冲溶液中与S-RBD-His结合，进一步证明了SPR筛选方法的可靠性和准确性。

实施例5基于SPR的竞争分析

苗头化合物对RBD蛋白以及ACE2蛋白的抑制效应通过NTA芯片进行测定，运行缓冲液与亲和筛选实验缓冲液一致。ACE2-His捕获浓度为5μg/mL，捕获时间保持不变。分析溶液为溶解于运行缓冲液中且含有0～125μM(0,31.25,62.5, or 125μM)化合物的20nM RBD溶液。在结合时间为120s、解离时间为500s条件下将分析溶液注入流过ACE2-His。在分析之前，在室温下将RBD与化合物孵育一个小时。在单次进样分析时，分析物改为含有0至25nMRBD的125μM化合物溶液。

化合物02B05显示出最强的阻断作用，其次是03D12。响应信号和化合物浓度之间的关系如附图7和8所示。02B05和03D12以剂量依赖的方式显著降低了反应，而其他化合物(125μM)的竞争性抑制不明显。为了确定结果，我们比较了缓冲溶液、化合物溶液、RBD溶液、RBD溶液和化合物混合溶液单独流过ACE2蛋白表面时的响应。从附图9可以看出，当单独注射RBD溶液(6.25、12.5和25μM) 时，观察到明显的信号变化。然而，当将125μM化合物02B05和RBD(6.25、12.5 和25nM)混合后注射时，信号响应下降，并且传感图类似于通过单独分析化合物获得的传感图。这表明一旦化合物02B05与RBD结合，RBD与ACE2的结合就被阻断了。数据表明02B05能有效阻断ACE2-RBD相互作用。

实施例6假型慢病毒颗粒进入人类细胞和荧光素酶测定

为了研究化合物02B05是否抑制病毒进入宿主细胞，在化合物02B05存在的情况下，将293T-hACE2细胞用萤光素酶报告病毒感染，该病毒为表达 SARS-CoV-2刺突包膜蛋白或VSV G蛋白的假病毒。

首先，使用PrestoBlue细胞生存力试剂检测02B05在293T-hACE2细胞中的细胞毒性。将细胞接种到96孔板中，并用不同浓度的02B05处理。在37℃孵育24小时后，向每个孔中加入10μL的PrestoBlue(10×)，并与培养基充分混合。在37℃下再次孵育1小时后，使用560nm的激发波长和590nm的发射波长(Perkin Elmer, Waltham,MA,USA)读取荧光信号。结果表明，在293T-hACE2细胞中化合物 02B05的最大无毒浓度小于1μM。如附图10所示，02B05浓度为1.1μM时，大约 12％的细胞死亡。

在化合物02B05不存在或存在的情况下，用假型VSV病毒或SARS-CoV-2病毒感染接种在白壁和透明底部96孔板中的293T-hACE2。选择氯化铵作为阳性对照。在感染后24小时，用20μL/孔的细胞裂解缓冲液裂解细胞15分钟，然后加入 50μL/孔的荧光素酶底物。萤火虫荧光素酶活性通过PerkinElmer EnSpire仪器中的发光测定法测量。使用荧光素酶活性表征病毒的进入效率。结果见附图10，化合物02B05适度降低了VSV假病毒的感染，但显著抑制了SARS-CoV-2假病毒的感染。此外，0.37μM的化合物02B05大约抑制7％的SARS-CoV-2假病毒的转导，但对VSV假病毒的转导没有影响。这些结果反映了化合物02B05在非常低的浓度下对SARS-CoV-2假病毒的进入表现出抑制活性。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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