一种用于发酵过程中监测气体分子的设备

摘要

本发明描述了一种被配置为在远离实验室或工业环境中的发酵罐/生物反应器的位置处对发酵过程进行原位、实时、非侵入式监测的设备。该设备能够对发酵过程中来自任何尺寸或类型的发酵罐/生物反应器或管道直径的排气管或排气旁路的CO2进行高精度、连续和实时地监测和检测。

说明书

技术领域

本发明属于生物过程监测领域。具体而言，本发明属于发酵过程的原位、实时、非侵入式气体监测领域。

背景技术

在发酵过程中，在消耗碳源和其他营养物的新陈代谢过程中，特定的微生物物种被有意地引入到包含用作生长培养基的材料的发酵容器中。发酵容器置于合适的条件下(如pH、搅拌速率、温度等)和促进微生物生长和/或通过使用不同方法中的微生物生产所需产品的合适生长培养基中。

例如，生物技术工业中使用发酵过程来产生各种生物细胞，如：微生物细胞(如大肠杆菌)；真菌细胞、酵母细胞和生物物质如酶(过氧化氢酶、淀粉酶、蛋白酶等)；初级代谢产物(乙醇、柠檬酸、谷氨酸等)；重组蛋白和次生代谢产物(抗生素、重组产品：胰岛素、乙肝疫苗、干扰素等)。在食品和饮料行业中，在碳水化合物转化为酒精饮料的过程中，细胞通过新陈代谢循环产生CO

目前用于跟踪细胞或微生物生长并确定最佳生长条件的方法(例如使用光密度、活细胞计数或葡萄糖浓度/消耗量等技术)需要进行侵入性采样，因此容易出错。其他在线方法，如pH或dO

就预测过程阶段和趋势而言，高精度CO

典型地，气体入口连接到发酵容器以提供微生物代谢的合适条件，气体出口也连接到发酵容器以通过排气管排出废气。

在许多情况下，发酵过程的监测是通过在线和偶尔离线取样相结合的方式来完成的。对发酵罐/生物反应器中的材料进行取样和分析，以确定反映出过程中的微生物/细胞的浓度和/或产物的产量/效价的参数，其后利用该数据控制发酵过程。

用于监测一些发酵参数的常规技术不是连续进行的，并且可能不能以高精度实时进行。通常，这些测量涉及发酵罐/生物反应器的零星采样以及需要技术人员的专业知识和准确性的分析方法。这些技术包括光学/临界密度测量、活菌计数、以及通过测量产品的产量/滴定度计算在生长培养基中消耗的代谢物。使用这些方法，通常无法检测到过程收获的最佳时间点。其他连续方法，如pH、dO

本申请申请人的共同待决专利申请US 2017/0267964描述了一种系统和方法，该系统和方法通过以连续/程序化的方式对气体排放进行采样以提供对发酵过程的精确实时和连续/按计划的监测。根据从发酵罐/生物反应器中排出的代谢气体的速率和组成，收集的数据尤其基于其中包含的微生物/细胞的代谢气体产生速率或这种产生速率的变化。从这些数据可以确定微生物/细胞的数量、生物量或其生长速度的变化率。

US 2017/0267964中描述的方法是基于测量穿过与发酵材料流体连通的气态气氛(即在发酵材料上方的死空间(dead space)中)透射的照明光(通常在红外光谱中)的吸收量。活微生物在呼吸过程中会产生二氧化碳(CO

图1以方框图示意性地示出了根据US 2017/0267964中公开的一些实施例中用于检测发酵过程中的代谢气体系统10。系统10包括光学系统，该光学系统包括可调宽带红外(IR)光源12和检测模块15。可调宽带红外光源12被配置为并可操作的用于发射预定的基本窄光谱的光。可调宽带红外光源12被可控地操作用于发射至少第一和第二预定波长的光，其中第一波长对应于要检测的至少一种代谢气体(通常为CO

系统10中还提供了控制系统30(例如控制器)，其可连接到光学系统，即连接到光源12和检测模块15。控制器30被配置为并可操作的用于操作光源12以发射选定的至少第一和第二波长的光，并用于接收和分析来自检测模块的测量/检测的数据/信号，并生成指示感兴趣区域中代谢气体浓度的数据。

在一些实施方式中，光源12和检测器14以间隔开的关系布置，由此限定出二者之间用于光谱测量的感兴趣区域。为此，光源12和检测器14被布置成使得发酵材料26的合适容器24和/或更具体地与该容器24相关联并与之流体连通的死空间28可以被放置。死空间28是代谢气体该通过由本发明的系统10执行的光学/光谱测量而被检测的地方。如上所述，容器的死空间28实际上是与发酵材料26上方的容器中的大气流体连通的任何空间。其可以包括以下任何一种：容器24中位于发酵材料上方的部分28，如图1所示，和/或任何合适的封闭气室，例如贮存器和/或连接到容器并与发酵容器24内的大气流体连通的出口管/导管。

测量数据的分析通常基于光谱学原理。特别选择第一和第二波长，以便能够精确和高灵敏度地测量代谢气体的浓度，只测量所需气体分子的特定吸收量，而不受测量体积中任何其他分子的交叉干扰。第一波长被选择为受感兴趣区域中的至少一种代谢气体的吸光度的高度影响，即与光谱吸收线重叠。另一方面，第二波长被选择为受代谢气体吸光度的影响较小，但是其仍被选择为在光谱上接近第一波长，使得其提供指示感兴趣区域中其他材料对第一波长的吸光度的参考数据。

在US 2017/0267964中详细描述了获取数据并对其进行分析的方法，以及系统的各种部件的所需特性。然而，该系统仅限于在发酵容器内进行测量。US 2017/0267964没有提供对可以连接到发酵容器以便在远离容器的位置进行在线测量的特定实用系统的描述，在实验室或工业环境中，发酵过程在该容器中进行。

因此，本发明的目的是提供一种设备，该设备被配置成在实验室或工业环境中远离发酵罐/生物反应器的位置对发酵过程进行原位、实时、非侵入式监测。

本发明的另一个目的是提供一种被配置为执行在线高分辨率测量的设备，该设备能够在所有规模或类型的发酵罐中进行实时监测、控制和优化基于发酵的生产过程。

随着描述的进行，本发明的其他目的和优点将会显现。

发明内容

本发明描述了一种被配置为在远离发酵罐/生物反应器的位置对发酵过程进行原位、实时、非侵入式监测的设备。该设备包括：

a)光源和检测模块(LSDM)；

b)排气管适配器(ETA)，其耦接到或插入到发酵罐/生物反应器的排气管中，并用螺栓固定在LSDM的前面；和

c)控制和显示模块，其通过有线或无线通信信道与LSDM进行通信。

在该设备的一个实施方式中，所述LSDM包括：

a)光源；

b)探测器；

c)操作光源所需的电气部件和处理来自检测器的输出信号所需的至少一些部件；和

d)光学部件，用于将来自光源的光束从LDSM引导到ETA中，并将从ETA返回到LDSM的光束引导到检测器上。

在该设备的一些实施方式中，所述光源是可调范围为至少2cm

在该设备的一些实施方式中，所述代谢气体是CO

在该设备的一些实施方式中，所述光源是可调量子级联激光器。

在该设备的一些实施方式中，所述ETA通过两件柔性管连接到排气管或排气管的旁路，其中第一件柔性管将代谢气体从发酵罐/生物反应器引入ETA，第二件柔性管将代谢气体引出ETA。

在该设备的一些实施方式中，所述ETA包括：

a)套管；

b)法兰，配置为螺栓连接至LSDM上的匹配法兰或螺纹孔；和

c)两个刚性管，所述两个刚性管彼此气体连通并且在它们最靠近所述LSDM的端部处用窗口气密地封闭，并且在它们的另一端处通过包括后面具有反射镜的共同窗口的布置封闭或通过反射镜封闭；

其中两个刚性管和反射镜被布置成使得离开LSDM的光束穿过其中一个刚性管，从反射镜反射，并通过第二刚性管返回到LSDM；和

第一件柔性管连接在发酵罐/生物反应器的排气管和一个刚性管的入口之间，以允许代谢气体进入两个刚性管，第二件柔性管连接在第二个刚性管的出口和发酵罐/生物反应器的排气管之间，以允许代谢气体离开两个刚性管。

在该设备的上述实施方式中，上述ETA可以与LSDM分离，并且可以在发酵过程后丢弃。

在该设备的一些实施方式中，所述ETA包括：

a)接口，配置为将所述ETA连接到LSDM；

b)外壳；和

c)用于光束的多程系统，该光束从LSDM的光源被引导到ETA中，并离开ETA被引导到LSDM的检测器上。

在该设备的上述实施方式中，所述ETA的外壳的两个相对侧包括孔，所述孔密封地连接到发酵罐/生物反应器的排气管中的间隙的相应端部，外壳的尺寸取决于ETA连接到的排气管的直径，并且接口对于所有尺寸的外壳具有相同的尺寸。

在一些实施方式中，所述多程系统被配置成使得光束的通过次数取决于外壳的尺寸，以实现所有尺寸的外壳的相同光路。

在该设备的一些实施方式中，所述控制和显示模块包括：

a)处理器；

b)专用软件，被配置为操作LSDM的光源，从LSDM接收数据，分析数据，并输出与发酵过程的状态相关的信息；

c)存储历史数据的数据库；和

d)输入、输出和显示设备，其中所述输入、输出和显示设备包括键盘、计算机显示器、打印机和触摸屏图形用户界面中的至少一个。

通过以下参考附图对本发明的实施例的说明性和非限制性描述，将进一步理解本发明的所有上述/其他特征和优点。

附图说明

图1以方框图示意性地说明了用于检测发酵过程中代谢气体的现有技术系统；

图2以方框图示意性地示出了本发明的检测系统，用于在发酵容器的排气处检测发酵过程中形成的代谢气体；

图3是显示ETA和与螺栓连接在一起的LSDM的实施例的外部视图；

图4A是LSDM的倾斜俯视图，其中外壳顶部被移除，以显示内部部件；

图4B是图4A中椭圆形区域A的放大图，更详细地显示了LSDM的光学部件；

图5示出了ETA的第一实施例，其外壳的顶部被移除，以显示内部部件；

图6显示了用螺栓连接在一起的ETA和LSDM；

图7和图8示意性示出了用于具有不同直径排气管的发酵容器的ETA的实施例；

图9示意性地示出了激光束在图7和图8所示的ETA外壳内部的路径。

具体实施方式

本文描述了一种设备，该设备被配置成在实验室或工业环境中远离发酵罐/生物反应器的位置对发酵过程进行原位、实时、非侵入式监测。

该设备能够对发酵过程中来自任何尺寸的发酵罐/生物反应器或管道直径的排气管或排气旁路的CO

该设备由非常灵敏的非侵入式计量设备组成，本文称为光源和检测模块(LSDM)，其可拆卸地连接到排气管适配器或发酵罐排气管的一次性旁路以及控制和显示模块。与发酵容器排气管成一直线组装的ETA具有不同的实施方式，所述ETA使LSDM能够提供连续的代谢气体检测，以高度精确地监控具有相同光路的任何大小的发酵罐/生物反应器中的过程。

LSDM记录并分析代谢气体浓度、呼吸过程中产生的CO

图2以方框图示意性地示出了本发明的用于检测在发酵容器40中进行的发酵过程中的代谢气体的系统。该系统由连接到发酵容器40的输出管的三个模块组成。光源模块和检测器模块(LSDM)48，顾名思义，包括光源、检测器、至少一些操作光源和检测器所需的电子部件、将来自光源的光束从LDSM引导到排气管适配器(ETA)44中并将从ETA返回到LDSM的光束引导到检测器上的光学部件，以及处理来自检测器的输出信号所需的至少一些部件。排气管适配器(ETA)44插入发酵容器40的排气管42中，并用螺栓固定在LSDM 48的前面。在发酵容器40中发生的发酵过程中产生的代谢气体通过排气管42排出发酵容器，并流经ETA44，在入口46a进入ETA44，在出口46b排出。本文将描述ETA的两个实施方式——第一个用于相对小直径的排气管42或通向排气管42的旁路，第二个用于可变直径的排气管42。ETA44可以被设置成耦接到具有宽直径范围的排气管中，例如从1”至8”(0.25”的步长)，尽管实际上的直径没有上下限。

该系统的第三个模块是控制和显示模块52，其通过电缆50象征性地示出的有线或无线通信信道与LSDM 48之间的通信。控制和显示模块52的部件的功能可以由包括处理器、通信功能和图形用户界面的部件或设备的任意组合来实现。一个适用于该系统的控制和显示模块52的例子是个人计算机，其包括专用软件，该软件被配置为操作和接收来自LSDM 48的数据，分析数据，并输出与发酵过程的状态相关的信息。

图3是显示螺栓连接在一起的ETA44和LSDM 48的第一实施例的外部视图。在ETA44的正面上看到的是端口60a和60b，软管或管子穿过端口60a和60b分别连接到入口46a和出口46b(见图2)，其将在下面进行描述。在所示的实施例中，快速释放扣54允许ETA的外壳的顶部在铰链56上枢转，以便轻松进入ETA44内部以连接到入口46a，并且如果需要的话连接到出口46b(在一些情况下，排出发酵容器40的气体可以在穿过ETA44之后被排放到大气中)。在其他实施方式中，外壳的顶部和底部可以用螺栓连接在一起。安装件58设置为支撑LSDM 48和ETA44。设置在LSDM 48的外壳侧的格栅60允许外壳内的光源和电子元件产生的热量被排放到周围环境中。

图4A是LSDM 48的倾斜俯视图，其中外壳的顶部被移除以显示内部部件。此处对理解本发明不重要的电子电路和其他部件不再进行描述。

图4B是图4A中椭圆区域A的放大图，其更详细地示出了图4A的椭圆区域A中的光学部件。在两个图中可以看到激光器62、镜座66、两个折叠镜68和聚焦光学器件74，其将从ETA44返回的光束聚焦到检测器64上。在图4A中可以看到电源线72和外壳前壁上的两个窗口70，其对于所使用的波长是透明的，通过该窗口激光束可以从LSDM 48射出进入ETA44，并从ETA44重新进入LSDM 48。LSDM的一些实施方式可以包括一个大开口，而不是图4A所示的两个。窗口70可以具有不同的形状，例如椭圆形或矩形。在图4B中，虚线示出了激光束在到达ETA44的途中从激光器到开口70的路径。

图5示出了ETA44的第一实施例，其外壳的顶部被移除以露出内部部件。如图6所示，法兰78被配置成螺栓连接到LSDM 48上的匹配法兰或螺纹孔。为了提供足够长的光路以允许精确测量代谢气体的浓度，ETA44包括两个彼此流体连通的刚性管80a和80b。两个管80a和80b中的每一个在最靠近LSDM的一端分别由窗口76a和76b密封，另一个窗口76c在两个管的另一端密封其端部。含有待测量浓度的代谢气体的气态流出物从发酵容器40流到ETA44，并通过入口46a进入管80a，流到管80a的端部，其中管80b的共同开口允许气体通过管80b流到出口46b，并被排放回发酵容器40的排气管42，或者如果当地环境法规允许，排放至大气。对于ETA44的这个实施方式，发酵容器40的排气管42到入口46a和从出口46b返回到排气管42(或大气)之间的连接是通过挠性管(图中未示出)实现的，该挠性管通过ETA壁中的适当尺寸的开口60a和60b(见图3)进入ETA44的内部。

当ETA44和LSDM 48如图6所示螺栓连接在一起时，窗口76a和76b面对着LSDM 48壁中的窗口70。位于ETA44中的窗口76c后面的是镜座84中的折叠式反射镜82。来自激光器62的光被反射镜66反射，反射镜66引导光穿过窗口76b。然后，激光束穿过管80b，直到其到达反射镜82，反射镜82重新引导激光束穿过管80a并离开窗口76a到达透镜74和检测器64。在一些其他的实施方式中，所述ETA窗口76c可以是反射镜，这消除了对反射镜82和镜座84的需求。

为了将空气路径保持在最小长度，以将CO

确定发酵过程进程的方法是基于通过光学/光谱测量来监测ETA中代谢气体(通常是CO

为了获得确定代谢气体浓度所需的两个波长，光源必须是具有至少2cm

在一个用于测量CO

LSDM 48的实施方式包括电子信号处理器/锁相放大器(其部件在图中被示出但未被标记)，其从红外探测器64和控制和显示模块52接收信号。使用锁相放大器能够进一步提高系统提供的信噪比，从而进一步提高与代谢气体浓度相关的测量的灵敏度和准确度，进而控制发酵过程。为此，在这样的实施方式中，所述控制系统52适于操作可调宽带红外光源62，用于对以至少两个(第一和第二)波长中的一个或多个(例如每个)波长发射的光的强度进行时间调制，并且还可以操作锁相放大器，以基于该调制以高精度确定/测量发射光的检测强度。因此，感兴趣区域对第一和第二波长(即，对测量中使用的所有波长)的透射率可以基于强度调制以高精度确定，而噪声通常被丢弃，因为通常不以相同的方式对其进行调制。应当注意的是，各种类型的锁相放大器的配置和操作在信号处理领域中是公知的，因此在此不进行具体描述。本领域技术人员将容易理解这种锁相放大器的各种可能的配置，其对将在本发明的系统中使用的发射照明进行适当的调制。

控制和显示模块52被配置用于操作宽可调红外光源以调制至少第一和第二波长的光强度，并操作锁相放大器或励磁/振荡时钟，以基于所述调制来确定所述感兴趣区域向具有高信噪比的至少第一和第二波长的透射。控制和显示模块52还包括包含用于将来自检测器的原始数据转换成感兴趣的代谢气体浓度的方程和算法的软件、存储历史数据的数据库以及输入、输出和显示设备，例如键盘、计算机显示器、打印机和触摸屏图形用户界面。

上文描述的ETA的实施方式被设计用于具有不同直径排气管的发酵容器。当用于例如病原性培养物时，该实施方案的ETA可以从LSDM分离并在每次发酵过程后丢弃，节省了耗时的清洁和灭菌过程。LSDM从来不与发酵容器排出的气体接触，因此不需要清洗，并且可以连接到另一个ETA，以监测在相同或不同的发酵容器中发生的另一个过程。

图7是显示通过接口88连接到LSDM 48前面的ETA44’的照片。LDSM 48与上面描述的相同。在ETA44’的相对端可以看到凹槽98，下文所述的多程光学系统的反射镜容纳在该凹槽98中。

ETA的这个实施方式安装在排气管42的间隙中，排气管42将代谢气体从发酵容器40带走。外壳90的两个相对侧包括孔，这些孔允许ETA44’的内部充满通过排气管42排出发酵容器的代谢气体。ETA44’的外壳90通过如图7所示的焊接或者通过螺栓连接的法兰密封地连接到排气管42的相应端部，以便于ETA44’的移除和连接到不同的发酵容器。在两个过程之间，ETA44’没有从排气管中取出进行消毒。

图8是仅示意性的示出了ETA44’和LSDM 48的关键部件的水平截面图。ETA44’的外壳90通过接口88螺栓连接到LSDM 48的前部86。接口88被设计成在LSDM 48的前部86使用，其与连接ETA44的法兰78使用相同的螺栓孔。来自激光器62的光束由两个折叠式反射镜68引导，并通过红外透射窗70离开LSDM 48，红外透射窗70由例如蓝宝石或硅制成，用于中红外光谱内的波长。光束从窗口70通过一个窗口进入ETA44’的内部。为了提供足够长的光路以允许精确测量代谢气体的浓度，ETA 44’的内部包括两个反射镜M1和M2的布置，其形成了图中示意性示出的多程系统92。在ETA44’内部经过预定次数的通过(pass)后，光束通过窗口离开ETA44’，并通过聚焦光学器件74和针孔/狭缝96(为了降低功率)进入LSDM 48到达检测器64。通过在红外透射窗的内表面的中心部分添加反射涂层来方便地提供M1，在M1周围留下透明的边界，光束可以通过该边界进入和离开ETA44’的内部。盖板94密封ETA44’的外壳90的顶部，并将M2保持在凹槽98中的适当位置(见图7)。

为了连接到具有更大直径的排气管42，必须增加/增加ETA44’的外壳90的尺寸。接口88的尺寸对于所有外壳90的尺寸都是相同的，以便能够将相同的LSDM 48用于具有大直径范围的排气管的发酵容器。

随着外壳90尺寸的增加，可以减少激光束穿过外壳中气体的次数。在许多情况下，这可以在不改变光学系统的情况下实现，但是在某些情况下，为了在光束进入和离开ETA44’的外壳90的位置之间保持相同的光路，光束进入的角度必须通过在LSDM 48中旋转折叠镜68而稍微改变(通常为1-3度)。

图9示意性地示出了对于四种不同的外壳尺寸，激光束在ETA44’的外壳90内部的路径。ETAs 44’的内部包括两个反射镜M1和M2，形成图8所示的多通道系统92。确定M1和M2之间的通过次数和距离，使得激光束穿过ETA内部的距离相同。不管ETA连接到的发酵容器的排气管的直径如何，ETA的大小都可以确定。在图9所示的示例中，对于最小的外壳尺寸，反射镜M1和M2之间的距离是X，这是图8所示的尺寸。其他尺寸是2X、3X和4X。需要注意的是，对于距离为4X的ETA44’，不需要反射镜M1，因为光束只需要通过ETA44’的内部往返一次。Y是外壳90的入口和出口窗口之间的距离，Z是盖板94的直径。对于所有尺寸的外壳，Y和Z都是相同的。激光束进入外壳的入射角由α和β表示。如图所示，对于三种尺寸的外壳，入射角是相同的，从而允许对这些尺寸的任何一种使用相同的LSDM。

尽管已示出和描述了本发明的优选实施例，可以设想，本领域的技术人员可在所附权利要求的精神和范围内设计对本发明的各种修改。