用于癌症免疫疗法的重组单纯疱疹病毒

摘要

本发明提供了一种通过向患有癌症的对象给药治疗有效量的重组单纯疱疹病毒‑1(HSV‑1)治疗所述对象的方法，所述重组单纯疱疹病毒‑1仅表达γ134.5蛋白的C端部分(例如第147位至第263位氨基酸残基)而没有野生型或完整的γ134.5蛋白表达。本发明的重组HSV‑1诱导了免疫激活、在癌细胞内选择性地复制并抵抗干扰素的清除。

说明书

引言

本申请要求2018年6月8日提交的美国临时专利申请系列号62/682,202的优先权权益，其内容通过引用全部并入本文。

本发明在由美国国立卫生研究院授予的基金号AI112755的政府支持下完成。美国政府在本发明中具有特定权利。

背景技术

溶瘤性单纯疱疹病毒1(HSV-1)是有吸引力的用于癌症免疫疗法的药剂(Peters和Rabkin(2015)Mol.Ther.Oncolytics 2:15010；Chiocca和Rabkin(2014)CancerImmunol.Res.2:295-300)。一旦感染，HSV-1经历顺序的基因表达、DNA复制、组装和释放，导致肿瘤细胞的破坏。这伴随着危险信号和激活获得性抗肿瘤免疫的新抗原的释放。一系列的溶瘤性HSV正处于不同的研发阶段(Peters和Rabkin(2015)Mol.Ther.Oncolytics 2:15010)。临床上最前沿的药剂是由FDA批准用于治疗晚期黑色素瘤的talimogenelaherparepvec(T-VEC)(Andtbacka等，(2015)J.Clin.Oncol.33:2780-88)。已经经历临床试验或正在临床试验中的溶瘤性HSV的其他实例是G207、1716和ΔG47(Markert等，(2000)Gene Ther.7:867-74；Rampling等，(2000)Gene Ther.357:525-6；Streby等，(2017)Clin.Cancer Res.23:3566-74；Fukuhara等，(2016)Cancer Sci.107:1373-79)。尽管在骨架设计上有所区别，但这些溶瘤性HSV病毒在最初就已将编码毒力因子的γ

HSVγ

几条线的证据证明γ

使用减毒的有复制能力的病毒直接破坏肿瘤的主要限制一直是在多种细胞类型包括癌细胞中降低的生长。尽管有最初的溶瘤波，宿主防御限制了病毒载体成功复制足够长的时间段以根除整个肿瘤细胞群。此外，具有改进复制的溶瘤性病毒骨架经常损害抗肿瘤免疫所必需的天然免疫致敏。因此，存活的癌细胞增殖或重新建立它们对患者的控制。因此，需要裂解癌细胞并有效激活全身性抗肿瘤反应的病毒性抗肿瘤药剂。

发明内容

本发明提供了一种通过向患有癌症的对象给药治疗有效量的重组单纯疱疹病毒-1(HSV-1)治疗所述对象的方法，所述重组单纯疱疹病毒-1仅表达γ

附图说明

图1提供了证明ΔN146降低局部肿瘤生长的数据。将4T1细胞皮下植入到小鼠中(第-7天)。在第1天、第3天和第6天，用PBS、悬浮在PBS中的Δγ

图2提供了证明ΔN146降低转移的数据。将4T1细胞皮下植入到小鼠中(第-7天)。在第1天、第3天和第6天，用PBS、悬浮在PBS中的Δγ

图3提供了证明4T1肿瘤内病毒生长的数据。在第9天收集用PBS、悬浮在PBS中的Δγ

图4显示了ΔN146和EUs1的体外比较分析。分析了病毒对IFN-α1和Cxc19的表达的影响。模拟感染或用ΔN146或EUs11(5pfu/细胞)感染4T1细胞。在感染后6小时，通过定量聚合酶链式反应来分析RNA样品。数据代表三份重复样品的三次实验和标准偏差。

具体实施方式

病毒复制的最佳细胞内环境随着病毒附着于细胞膜开始发生的事件发展。单纯疱疹病毒与细胞膜受体结合之后跟随着一系列与细胞内的生化、生理和形态变化相关的事件。在敏感细胞内感染后，裂解性复制受到一系列在时间上协调的基因转录的调控。病毒对宿主细胞膜的结合激活立即早期(IE或α)基因(ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47)，这些是反式激活因子，允许产生待转录的下一组基因，即早期(β)基因。立即早期基因产物的表达之后是早期基因且随后是晚期(γ)基因编码的蛋白的表达。整个基因激活的级联和病毒复制在野生型病毒中要花费约18-24个小时并且总是导致细胞死亡。本发明的重组HSV突变体绕过了γ

目前已经发现，表达C端一半的γ

如现有技术中已知的，γ

MARRRRHRGPRRPRPPGPTGAVPTAQSQVTSTPNSEPAVRSAPAAAPPPPPASGPPPSCSLLLRQWLHVPESASDDDDDDDWPDSPPPEPAPEARPTAAAPRPRSPPPGAGPGGGANPSHPPSRPFRLPPRLALRLRVTAEHLARLRLRRAGGEGAPEPPATPATPATPATPATPARVRFSPHVRVRHLVVWASAARLARRGSWARERADRARFRRRVAEAEAVIGPCLGPEARARALARGAGPANSV(SEQ ID NO:1)。

如本文所用，“重组HSV-1”指仅表达γ

RLRRAGGEGAPEPPATPATPATPATPATPARVRFSPHVRVRHLVVWASAARLARRGSWARERADRARFRRRVAEAEAVIGPCLGPEARARALARGAGPANSV(SEQ ID NO:2)。

在本发明的重组HSV-1的一些方面，内源的γ

可以通过γ

在某些实施方式中，所述重组HSV-1还包含HSV-1的一个或多个非必需基因的缺失。非必需基因要与在不存在时病毒不会复制的必需基因相区别。非必需基因可以是有益基因，在这种情况下这种有益基因的替换会导致以比野生型病毒低得多的速率复制的病毒。HSV-1的代表性非必需基因包括但不限于：在UL区中的UL2、UL3、UL4、UL9.5、UL10、UL11、UL12、UL13、ULI4、UL20、UL21、UL23、UL24、UL39、UL40、UL41、UL43、UL43.5、UL44、UL45、UL46、UL47、UL50、UL5l、UL53和UL55；在Us区中的Us1、Us1.5、Us2、Us3、Us4、Us5、Us7、Us8、Us8.5、Us9、Us10、Us11和Us12；以及在反向重复区中的ICP0。

在可选的实施方式中，用一个或多个编码且能够表达用于癌症疗法的治疗蛋白、酶、抗体、核酸(例如编码所述蛋白、酶、抗体或microRNA、核酶等的核酸)等的核酸替换一个或多个非必需基因。治疗蛋白指在癌症治疗中有治疗益处的功能性蛋白(即除了酶或抗体以外的那些)。适合的治疗蛋白的实例包括但不限于：rsCD40L(Eliopoulos等，(2000)Mol.Cell.Biol.20:5503-5515)；Fas配体(Sharma等，(2000)Pharmacol.Ther.88:333-347)；TRAIL(Golstein(1997)Curr.Biol.7:R750-753)；TNF(Baker和Reddy(1996)Oncogene12:1-9；Theys等，(1999)Appl.Environ.Microbiol.65:4295-4300；Lammertyn等，(1997)Appl.Environ.Microbiol.63:1808-1813)；用于治疗黑色素瘤、乳腺癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤和前列腺癌的GM-CSF(参见例如，Eubank等，(2009)Cancer Res.69(5):2133-40)；用于治疗卵巢癌和实体肿瘤的IFNα(参见例如，Goto等，(1996)Br.J.Cancer74:546–54)；用于治疗神经母细胞瘤和卵巢癌的IL-2(参见例如，Minor等，(2017)Gynecol.Oncol.Rep.22:43-44)；以及用于治疗乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌的G-CSF(参见例如，Omura等，(1996)Proc.Annu.Meet Am.Soc.Clin.Oncol.15:A755)。

治疗酶指在癌症治疗中有治疗益处的功能性酶。特殊用途的治疗酶包括能够将无毒性的前药转化为对肿瘤有细胞毒性的毒性药物的酶。适合的治疗酶-前药对的实例包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)+更昔洛韦(GCV)(Moolten(1986)CancerRes.46:5276-5281)；HSV-TK+A-5021(1’S,2’R)-9{[1’,2’-双(羟甲基)环丙-1’-基]甲基}鸟嘌呤(Hasegawa等，(2000)Cancer Gene Ther.7:557-562)；辣根过氧化物酶(HRP)+吲哚-3-乙酸(IAA)(Greco等，(2000)Cancer Gene Ther.7:1414-1420)；细菌酶羧肽酶G2(CPG2)+4-([2-氯乙基][2-甲磺酰氧乙基]氨基)苯甲酰-L-谷氨酸(CMDA)或+4-[N,N-双(2-碘乙基)氨基]苯氧羰基L-谷氨酸(ZD2767P)(Spooner等，(2000)Cancer Gene Ther.7:1348-1356；Webley等，(2001)Br.J.Cancer 84:1671-1676)；人类细胞色素P450 CYPIA2+对乙酰氨基酚(Thatcher等，(2000)Cancer Gene Ther.7:521-525)；兔细胞色素P450 4Bl(CYP4Bl)+4-甘薯醇(4-IM)(Mohr等，(2000)Cancer Gene Ther.7:1008-1014；Heuser等，(2000)CancerGene Ther.7:806-12)；兔细胞色素P450 4Bl(CYP2Bl)+氧杂磷杂苯孢菌素(oxaphosporines)例如异环磷酰胺(IFO)(Kammertoens等，(2000)Cancer Gene Ther.7:629-636)；大肠杆菌硝基还原酶(NTR)+CB1954(Djeha等，(2000)Cancer Gene Ther.7:721-731；Djeha等，(2001)Mol.Ther.3:233-240)；大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)、大肠杆菌尿嘧啶磷酸核糖转移酶(UPRT)+5-氟胞嘧啶(5-FC)(Kammertoens等，(2000)Cancer Gene Ther.7:629-636；Block等，(2000)Cancer Gene Ther.7:438-445；Bentires-Alj等，(2000)CancerGene Ther.7:20-6)；细胞色素P450酶+环磷酰胺(CPA)(Huang等，(2000)Cancer GeneTher.7:1034-42；Kan等，(2001)Cancer Gene Ther.8:473-82)；兔羧酸酯酶+7-乙基-10-[4-(1-哌啶基)-1-哌啶基]羰基氧基喜树碱(CPT-II)(Meck等，(2001)Cancer Res.61:5083-89)；蘑菇酪氨酸酶+双-(2-氯乙基)氨基-4-羟基苯基氨基甲酮28(Jordan等，(2001)Bioorg.Med.Chem.9:1549-58)；大肠杆菌β-半乳糖苷酶+l-氯甲基-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[E]吲哚(CC-1065)或+1-(1’-氯乙基)-5-羟基-l,2-二氢-3H-苯并[E]吲哚(Tietze等，(2001)Chembiochem.2:758-765)；羧肽酶G2的突变体(CPG2、谷氨酸羧肽酶+4-[双(2-碘乙基)氨基]苯基氧基羰基-L-谷氨酸或+3-氟-4-[双(2-氯乙基)氨基]苯甲酰-L-谷氨酸或+3,5-二氟-4-[双(2-碘乙基)氨基]苯甲酰-L-谷氨酸(Friedlos等，(2002)Cancer Res.62:1724-1729)。

治疗抗体指在癌症治疗中有治疗益处的功能性抗体。适合的治疗抗体的实例包括但不限于：阿特珠单抗(Atezolizumab，用于治疗膀胱癌和乳腺癌、NSCLC、以及小细胞肺癌(SCLC))；阿维单抗(Avelumab，用于治疗膀胱癌和Merkel细胞癌(MCC))；德瓦鲁单抗(Durvalumab，用于治疗膀胱癌和NSCLC)；纳武单抗(Nivolumab，用于治疗膀胱癌、结肠癌、肾癌、肝癌、NSCLC、转移性SCLC、霍奇金淋巴瘤和黑色素瘤)；派姆单抗(Pembrolizumab，用于治疗膀胱癌、宫颈癌、结直肠癌、食管癌、肝癌、NSCLC、霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤和MCC)；贝伐单抗(Bevacizumab，用于治疗胶质母细胞瘤、宫颈癌、结直肠癌、肾癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和卵巢癌)；地努图希单抗(Dinutuximab，用于治疗神经母细胞瘤)；帕妥珠单抗(Pertuzumab，用于治疗乳腺癌)；曲妥珠单抗(Trastuzumab，用于治疗乳腺癌和食管癌)；西妥昔单抗(Cetuximab，用于治疗结直肠癌)；帕尼单抗(Panitumumab，用于治疗结直肠癌)、雷莫芦单抗(Ramucirumab，用于治疗结直肠癌和食管癌)；阿仑单抗(Alemtuzumab，用于治疗慢性淋巴细胞白血病(CLL))；博纳吐单抗(Blinatumomab，用于治疗急性成淋巴细胞白血病(ALL))；奥滨尤妥珠单抗(Obinutuzumab，用于治疗CLL和非霍奇金淋巴瘤)；奥法木单抗(Ofatumumab，用于治疗CLL)；利妥昔单抗(Rituximab，用于治疗CLL和非霍奇金淋巴瘤)；耐昔妥珠单抗(Necitumumab，用于治疗NSCLC)；伊匹单抗(Ipilimumab，用于治疗黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌和黑色素瘤)；达雷木单抗(Daratumumab，用于治疗多发性骨髓瘤)；艾洛珠单抗(Elotuzumab，用于治疗多发性骨髓瘤)；地诺单抗(Denosumab，用于治疗骨癌)；Olaratumumab(用于治疗骨癌)；西米普利单抗(Cemiplimab，用于治疗Merkel细胞癌(MCC))；MEDI0562；GSK3174998；PF-04518600；CP-870893；dacetuzumumab；ADC-1013；以及雷莫芦单抗(Ramucirumab，用于治疗胃癌或胃食道癌)。

用于制备重组病毒的方法是本领域已知的。简单地说，为了构建重组HSV，将目标基因克隆到转移质粒中。随后，将这个质粒与HSV-1基因组DNA(目标基因被HSV胸苷激酶基因替换)一起共转染到兔皮肤细胞中。选择重组病毒的后代并在培养基内在143TK突变体细胞上进行菌斑纯化，所述培养基包含增补有100μg的溴化脱氧尿苷/ml和2％胎牛血清的混合物199V。接下来，通过在HAT培养基中共转染后代病毒DNA和编码胸苷激酶基因的质粒来恢复胸腺激酶基因。病毒库的制备和感染性的滴定通过Vero细胞来完成。

如本文所证明的，仅表达γ

如本文所用，术语“治疗”等指在此治疗癌症的情形中消除、降低、减轻、逆转和/或改善疾病或病症和/或与之相关的症状。可以根据本文的方法治疗的实体和非实体肿瘤包括：膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌，包括鳞状细胞癌；腺癌，包括甲状腺癌和皮肤癌；白血病，包括急性淋巴细胞白血病、急性成淋巴细胞白血病、急性和慢性粒细胞白血病和早幼粒细胞白血病；淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤和Burkitt淋巴瘤；纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；黑色素瘤；以及神经母细胞瘤、星形细胞瘤和胶质瘤。在某些实施方式中，根据本文的方法治疗的癌症是实体肿瘤。在其它实施方式中，所述癌症选自乳腺癌、肝癌、肺癌、皮肤癌(黑色素瘤)、脑癌和结肠癌。

尽管不排除，但治疗疾病或病症并不要求完全消除该疾病、病症或与之相关的症状，包括治疗急性或慢性症候、症状和/或障碍。“治疗”等可包括“预防性治疗”，所述预防性治疗指在没有疾病或病症、但具有再次发生疾病或病症或疾病或病症复发的风险或对再次发生疾病或病症或疾病或病症复发敏感的对象中，降低再次发生疾病或病症或先前控制的疾病或病症复发的概率。因此，“治疗”也包括复发预防或阶段预防。术语“治疗”和同义词设想了将治疗有效量的本发明重组HSV-1给药于需要这种治疗的个体。治疗可以根据症状定位，例如，抑制症状。治疗可以在短期内进行，可以在中期内进行，或者可以是长期的治疗，例如在维持疗法的范围内。

如本文所用，术语“治疗有效量”或“有效剂量”是指活性成分的量，当向需要的个体给药时，所述活性成分的量足以有效地递送所述活性成分以治疗感兴趣的病症或疾病。在癌症或其他增殖障碍的情况下，所述治疗有效量的药剂可以降低(即在一定程度上延缓且优选停止)不想要的细胞增殖；降低癌细胞的数量；降低肿瘤尺寸；抑制(即在一定程度上延缓且优选停止)癌细胞浸润到外周器官中；抑制(即在一定程度上延缓且优选停止)癌症转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。在所给药的活性成分阻止现有的癌细胞生长和/或杀死现有的癌细胞的程度上，它可能是细胞抑制的和/或细胞毒性的。

本发明的重组HSV-1可以原样使用、通过活载体细胞提供，或配制在包含药学上可接受的赋形剂的药物组合物中。本发明提供的药物组合物可以特别地配制成用于以固体或液体的形式静脉内给药或用于静脉内注射。本领域技术人员可根据例如预期给药途径、递送形式和所需剂量来确定最佳的药物组合物。参见例如《雷明登药学大全(Remington'sPharmaceutical Sciences)》(1995年第19版)。

所述重组HSV-1可以并入常规的全身剂型例如注射制剂中。所述剂型还可以包括必要的生理上可接受的载剂材料、赋形剂、润滑剂、缓冲剂、表面活性剂、抗菌剂、增量剂(例如甘露醇)、抗氧化剂(抗坏血酸或亚硫酸氢钠)等。

药物组合物中主要的载剂或赋形剂可以是天然水性或非水性的。例如，适合的载剂或赋形剂可以是注射用水、生理盐水溶液或人工脑脊液，其可能增补有肠胃外给药的组合物中常见的其它材料。中性缓冲的盐水或混有血清白蛋白的盐水是其他示例性媒剂。药物组合物可以包含pH约7.0-8.5的Tris缓冲剂、或者pH约4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，还可以包含山梨醇或其适合的替代物。可以通过以冻干饼或水溶液的形式混合具有所需纯度的所选组合物与任选的配制药剂(《雷明登药学大全(Remington's PharmaceuticalSciences)》)来制备本发明的药物组合物用于储存。此外，所述重组HSV-1可以用适合的赋形剂例如蔗糖配制成冻干剂。

本发明的重组HSV-1或药物组合物的给药途径包括静脉内注射、腹腔注射、脑内注射(实质内注射)、侧脑室注射、肌内注射、眼内注射、动脉内注射、门内注射或病变内注射；通过缓释系统或植入装置。可以通过团注或连续输注或通过植入装置给药组合物。也可以通过植入其上已吸收或封装所需分子的膜、海绵或其他适合材料局部给药组合物。在使用植入装置的情况下，可以将所述装置植入任何适合的组织或器官中，并且可以通过扩散、定时释放团注或连续给药来递送所需分子。

本发明的组合物可以肠胃外递送。当设想了肠胃外给药时，本发明所用的治疗组合物可以是无热原的肠胃外可接受的水溶液的形式，所述水溶液在药学上可接受的媒剂中包含所需的活性成分。特别适合于肠胃外注射的媒剂是无菌蒸馏水，其中所述活性成分被配制成妥善保存的无菌等渗溶液。制备可以包括用可提供所述活性成分的受控或持续释放的药剂例如可注射微球、生物可蚀颗粒、聚合物化合物(例如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠子或脂质体配制所需活性成分，其随后可以通过仓库注射递送。含有透明质酸的制剂具有促进在循环中持续时间的作用。可植入药物递送装置可用于引入所需的活性成分。

本发明还包括通过向需要的个体给药本发明的重组HSV-1和一种或多种对癌症治疗有用的第二治疗剂来治疗癌症的方法。所述重组HSV-1和所述第二治疗剂可同时或顺序给药。此外，所述重组HSV-1和所述第二治疗剂可从单一组合物或两个分开的组合物给药。

所述第二治疗剂以提供其所需治疗效果的量给药。每种第二治疗剂的有效剂量范围是本领域已知的，并且在这样已建立的范围内将所述第二治疗剂给药于有需要的个体。

在某些实施方式中，所述第二治疗剂是抗体。适合的抗体包括但不限于：阿特珠单抗(Atezolizumab)；阿维单抗(Avelumab)；德瓦鲁单抗(Durvalumab)；纳武单抗(抗PD1抗体，Nivolumab)；派姆单抗(抗PD1抗体，Pembrolizumab)；贝伐单抗(Bevacizumab)；地努图希单抗(Dinutuximab)；帕妥珠单抗(Pertuzumab)；曲妥珠单抗(Trastuzumab)；西妥昔单抗(Cetuximab)；帕尼单抗(Panitumumab)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)；阿仑单抗(Alemtuzumab)；博纳吐单抗(Blinatumomab)；奥滨尤妥珠单抗(Obinutuzumab)；奥法木单抗(Ofatumumab)；利妥昔单抗(Rituximab)；耐昔妥珠单抗(Necitumumab)；伊匹单抗(Ipilimumab，抗CTLA4抗体)；达雷木单抗(Daratumumab)；艾洛珠单抗(Elotuzumab)；地诺单抗(Denosumab)；Olaratumumab；西米普利单抗(Cemiplimab)；MEDI0562(抗OX40抗体)；GSK3174998(抗OX40抗体)；PF-04518600(抗OX40抗体)；CP-870,893(抗CD40抗体)；dacetuzumumab(抗CD40抗体)；ADC-1013(抗CD40抗体)；以及雷莫芦单抗(Ramucirumab)。

在其他实施方式中，所述第二治疗剂包含的是化疗剂、放射治疗剂、抗血管生成剂、凋亡诱导剂、抗微管蛋白药物，或者是肿瘤靶向的化疗剂、放射治疗剂、抗血管生成剂、凋亡诱导剂或抗微管蛋白药物。示例性的第二治疗剂包括但不限于：抗血管生成剂例如血管生成抑素、内皮抑制素、血管抑制素、血管能抑素和乳腺丝抑蛋白(maspin)；以及抗微管蛋白药物例如秋水仙碱、紫杉醇、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindescine)、康普立停(combretastatin)或其衍生物或前药。第二治疗剂的其他实例包括但不限于：烷化剂、氮芥类、环磷酰胺、三芥环磷酰胺(trofosfamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、亚硝基脲类、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、烷基磺酸盐类、白消安(busulfan)、苏消安(treosulfan)、三氮烯类、植物生物碱类、长春花生物碱类(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindescine)、长春瑞滨(vinorelbine))、紫杉醇类、DNA拓扑异构酶抑制剂、表鬼臼毒素类(epipodophyllins)、9-氨基喜树碱、喜树碱、克立那托(crisnatol)、丝裂霉素类、丝裂霉素C、抗代谢药类、抗叶酸类、DHFR抑制剂、三甲曲沙(trimetrexate)、IMP脱氢酶抑制剂、霉酚酸、噻唑呋林(tiazofurin)、利巴韦林(ribavirin)、EICAR、核糖核苷酸还原酶抑制剂、羟基脲、去铁胺、嘧啶类似物、尿嘧啶类似物、氟尿苷(floxuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、ratitrexed、胞嘧啶类似物、阿糖胞苷(ara C)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、氟达拉滨、嘌呤类似物、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、DNA抗代谢药类、3-HP、2'-脱氧-5-氟尿嘧啶、5-HP、α-TGDR、阿非迪霉素甘氨酸、ara-C、5-氮杂-2'脱氧胞苷、β氧TGDR、环胞苷、胍唑(肌苷糖二醛)、麦克菌素II(macebecin II)、吡唑并咪唑、激素疗法、受体拮抗剂、抗雌激素、他莫昔芬、雷洛昔芬、甲地孕酮，LHRH激动剂、戈舍瑞林(goserelin)、醋酸亮丙瑞林、抗雄激素、氟他胺、比卡鲁胺、类视黄醇类/德尔托伊德类、顺式视黄酸、维生素A衍生物、全反式视黄酸(ATRA-IV)、维生素D3类似物、CB1093、ICH1060、光动力疗法、维替泊芬(vertoporfin)、BPD-MA、酞菁、光敏剂Pc4、去甲氧基竹红菌素A(2BA-2-DMHA)、细胞因子类、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、肿瘤坏死因子、血管生成抑制剂、血管生成抑素(血纤维蛋白溶酶原片段)、抗血管生成抗凝血酶UI、血管酶、ABT-627、Bay 12-9566、氟草胺(benefin)、BMS-275291、软骨来源的抑制剂(CDI)、CD59补体片段、CEP-7055、Col 3、康柏斯达汀A-4(combretastatin A-4)、内皮抑制素(胶原蛋白XVIII片段)、纤连蛋白片段、Groβ、常山酮、肝素酶、肝素己糖片段、HMV833、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、IM-862、干扰素诱导蛋白、白细胞介素-12、kringle 5(血纤维蛋白溶酶原片段)、马立马司他(marimastat)、金属蛋白酶抑制剂(UMP)、2-甲氧雌二醇、MMI270(CGS27023A)、诺司达(neovastat)、NM-3、panzem、PI-88、胎盘核糖核酸酶抑制剂、血纤维蛋白溶酶原激活物抑制剂、血小板因子-4(PF4)、普啉司他(prinomastat)、催乳素161、增生相关蛋白(PRP)、类视黄醇类、索利司他(solimastat)、角鲨胺(squalamine)、SS3304、SU5416、SU6668、SU11248、四氢皮醇-S、四硫钼酸盐、沙利度胺(thalidomide)、凝血栓蛋白-l(TSP-l)、TNP-470、转化生长因子-β、血管抑制素、血管形成抑制素(钙网蛋白片段)、ZD6126、ZD6474、法尼基转移酶抑制剂(FTI)、双膦酸盐、抗有丝分裂剂、别秋水仙碱、软海绵素B、秋水仙碱、秋水仙碱衍生物、海兔毒素10、美登素(maytansine)、根瘤菌素(rhizoxin)、硫代秋水仙碱(thiocolchicine)、三苯甲基半胱氨酸、异戊二烯抑制剂、多巴胺能神经毒素、细胞周期抑制剂、十字孢碱、放线菌素类、放线菌素D、更生霉素、博来霉素类、博来霉素A2、博来霉素B2、派来霉素、蒽环霉素、阿霉素、表阿霉素、吡南阿霉素、佐柔比星、米托葸醌、MDR抑制剂、维拉帕米、Ca21ATP酶抑制剂和毒胡萝卜素。

提供以下非限制性实施例以进一步说明本发明。

实施例1：材料和方法

细胞和病毒：从美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection)获得Vero、HT-29、SW480、C32、A375、MDA-MB-231、4T1、HepG2和A549细胞。在增补有10％胎牛血清的杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)中传代Vero、SW480、C32、A375、MDA-MB-231和A549细胞。在增补有10％胎牛血清的RPMI1640培养基中传代HT-29、4T1和HepG2细胞。HSV-1(F)是在本研究中使用的原型HSV-1病毒株(Ejercito等，(1968)J.Gen.Virol.2:357-364)。在重组病毒Δγ

病毒感染：在指定的感染复数下进行病毒感染(Verpooten等，(2009)J.Biol.Chem.284:1097-1105)。然后收集细胞并处理以进行免疫印迹、实时PCR分析或病毒生长分析(Ma等，(2012)J.Virol.86:2188-96；Wu等，(2016)J.Virol.90:10414-22)。根据制造商流程通过CELLTITER-

免疫印迹分析和ELISA：收集细胞，用磷酸缓冲盐水(PBS)冲洗，并在冰上用冰冷的缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.4、150mM NaCl、5mM EDTA、1.0％Triton

转录组分析：模拟感染或用病毒(5pfu/细胞)感染单层的4T1细胞。在感染后6小时，用RNase plus mini试剂盒(Qiagen)从细胞中提取RNA并用DNase I(New EnglandBioLabs)处理。重复的RNA样品用伊利诺伊大学芝加哥分校基因组研究中心的Clariom

定量实时PCR分析：模拟感染或用病毒感染细胞。在感染后6小时，用RNase plusmini试剂盒(Qiagen)从细胞中收集总RNA并让其经历DNase I(New England BioLabs)消化。使用高容量cDNA反转录试剂盒(Applied Biosystems)来合成cDNA。使用AppliedBiosystems ABI Prism 7900HT仪器和ABI

表1

小鼠研究：从Harlan Sprague Dawley Inc.购买了5周龄小鼠BALB/c小鼠，并在无特定病原体的条件下在生物安全等级2级的隔离饲养箱中饲养。所有涉及动物的实验程序均获得伊利诺伊大学芝加哥分校动物护理和使用委员会的批准。在6周龄时，将悬浮于0.1ml PBS中的1x10

组织分析：在最后的肿瘤内注射后的选定天数处死来自每个处理组的6只小鼠以收集肿瘤、肺、肝脏、脾脏和血液。为了测量病毒载量，将样品粉碎、均质并珠打，冻融三次，并在DMEM中超声处理。离心后，肿瘤上清液用于菌斑试验。来自肺、肝脏、脾脏和血液的上清液用于实时定量PCR分析。简而言之，将所述上清液悬浮在含有1％SDS、50mM Tris(pH 7.5)和10mM EDTA的缓冲液中。在37℃下用蛋白酶K(50μg/ml)温育后，提取病毒DNA并使用HSV-1gD特异性引物：TACAACCTGACCATCGCTTG(SEQ ID NO:21)和GCCCCCAGAGACTTGTTGTA(SEQ IDNO:22)通过实时PCR定量。

对于转移性形成分析，将来自小鼠的肺切碎并固定在福尔马林中。通过在光学显微镜下计数来定量肺转移的数量。

免疫组化分析：对组织切片进行处理，并用抗HSV-1抗体(Dako)检测HSV-1抗原。根据制造商流程使用CD4(Cell Signaling Technology,Inc.)和CD8(Cell SignalingTechnology,Inc.)抗体。将样品与第一抗体温育，然后添加生物素化抗兔免疫球蛋白第二抗体、亲和素-辣根过氧化物酶以及在0.05M Tris HCl(pH 7.4)和0.025％H

实施例2：ΔN146突变体在肿瘤细胞中复制

已显示仅含第147-263位氨基酸的HSVγ

随后，检查病毒生长的动力学。随着感染的进展，HSV-1在野生型4T1细胞中稳定生长，在感染后72小时滴度增至1x10

实施例3：γ

随着α、β和γ基因的顺序表达，HSV感染以时间方式前进。在没有γ

因为eIF2α的磷酸化与蛋白质合成偶联，在4T1和MDA-MB-231肿瘤细胞中监测由应激激酶PKR、PERK或GCN2引起的eIF2α磷酸化。该分析表明，在模拟或病毒感染的肿瘤细胞中，eIF2α的表达是类似的。令人感兴趣的是，磷酸化的eIF2α存在于模拟感染细胞中，可能是由于致癌应激。尽管在4T1和MDA-MB-231肿瘤细胞中，野生型HSV-1消除了eIF2α的磷酸化，但但Δγ

实施例4：ΔN146刺激肿瘤细胞中的干扰素反应

为了评估肿瘤细胞对病毒感染的反应，在4T1细胞中进行了转录组分析。观察到在多种细胞通路中的大量基因在模拟感染和病毒感染的4T1细胞中差异化表达。值得注意的是，对ΔN146作出反应，许多在天然免疫通路中的基因明显上调。在46个测试的基因中，大部分在模拟感染或野生型病毒感染的细胞中保持不变或少量表达。然而，它们在用Δγ

为了证实这些结果，通过实时PCR测定了选择的细胞因子和干扰素刺激基因的表达。如同预期的那样，野生型病毒激发了极少的IFN-α1、IFIT1、Ccl5和Cxcl9的表达，而Δγ

实施例5：ΔN146对IFN有抵抗力

I型IFN是引发抗肿瘤的免疫所必需的。另一方面，它介导了抗病毒反应。为了确定ΔN146是否对IFN清除有抵抗力，检测了病毒生长。作为概念证据，病毒对IFN的反应首先是在缺乏IFN-α/β基因的Vero细胞中进行的。IFN-α处理对HSV-1(F)的复制影响不大，但使Δγ

实施例6：ΔN146降低了体内原发性肿瘤的生长和转移

根据在实施例2至5中呈现的结果，假设所述ΔN146复制并激活炎症的能力会增强体内的肿瘤破坏。为了证明这点，选择自发转移的侵袭性4T1乳腺癌，所述自发转移过程类似于人类乳腺肿瘤。作为比较，还使用了Δγ

为了评估病毒对转移的影响，在第24天分析了肺肿瘤形成。图2显示了在对照小鼠中可轻易检测到肺转移，通过显微镜分析测量到平均每只动物25个结节(nodule)。用Δγ

实施例7：ΔN146在原发性肿瘤中复制但不在正常组织中复制

为了评估病毒复制，在第9天收集的原发性肿瘤中测定了病毒产率。该分析表明，如通过菌斑试验测量的，Δγ

为了评估病毒是否传播到正常组织，通过qPCR试验测定了Δγ

为了证实病毒复制确实在肿瘤中活跃发生，进行了4T1原发性肿瘤的三次治疗并在第7天、第9天和第15天测定了病毒产率。该分析表明通过菌斑试验可以在第7天检测到约2x10

实施例8：ΔN146诱导CD4+和CD8+ T细胞浸润到原发性肿瘤中

之前的证据表明具有γ

实施例9：ΔN146和EUs11与肿瘤细胞的相互作用不同

为了确定ΔN146和EUs11与肿瘤细胞的相互作用是否不同，进行了体外试验。如图4中所示，ΔN146感染刺激了IFN-α1和cxcl9基因的转录。相反，EUs11抑制了基因表达。这与通过ELISA测量的细胞因子的产生水平平行。一致地，ΔN146刺激了IRF3的磷酸化，而EUs11不能刺激IRF3的磷酸化，表明EUs11在病毒感染后介导了免疫抑制。

为了评估病毒破坏肿瘤细胞的能力，测量了细胞活力。该分析表明，与EUS11类似，ΔN146在74小时前裂解了大约95％的4T1细胞。因此，ΔN146和EUs11两者都有效地裂解肿瘤细胞。此外，测定了有或没有IFN处理时4T1细胞内的病毒复制。该分析表明，在没有IFN-α时，ΔN146和EUs11两者都有效地复制，滴度达到约1x10

序列表

<110> 伊利诺伊大学理事会（THE BOARD OF TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OFILLINOIS）

<120> 用于癌症免疫疗法的重组单纯疱疹病毒

<130> UIC0078WO

<150> US 62/682,202

<151> 2018-06-08

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 248

<212> PRT

<213> 单纯疱疹病毒1

<400> 1

Met Ala Arg Arg Arg Arg His Arg Gly Pro Arg Arg Pro Arg Pro Pro

1 5 10 15

Gly Pro Thr Gly Ala Val Pro Thr Ala Gln Ser Gln Val Thr Ser Thr

20 25 30

Pro Asn Ser Glu Pro Ala Val Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Pro Pro

35 40 45

Pro Pro Pro Ala Ser Gly Pro Pro Pro Ser Cys Ser Leu Leu Leu Arg

50 55 60

Gln Trp Leu His Val Pro Glu Ser Ala Ser Asp Asp Asp Asp Asp Asp

65 70 75 80

Asp Trp Pro Asp Ser Pro Pro Pro Glu Pro Ala Pro Glu Ala Arg Pro

85 90 95

Thr Ala Ala Ala Pro Arg Pro Arg Ser Pro Pro Pro Gly Ala Gly Pro

100 105 110

Gly Gly Gly Ala Asn Pro Ser His Pro Pro Ser Arg Pro Phe Arg Leu

115 120 125

Pro Pro Arg Leu Ala Leu Arg Leu Arg Val Thr Ala Glu His Leu Ala

130 135 140

Arg Leu Arg Leu Arg Arg Ala Gly Gly Glu Gly Ala Pro Glu Pro Pro

145 150 155 160

Ala Thr Pro Ala Thr Pro Ala Thr Pro Ala Thr Pro Ala Thr Pro Ala

165 170 175

Arg Val Arg Phe Ser Pro His Val Arg Val Arg His Leu Val Val Trp

180 185 190

Ala Ser Ala Ala Arg Leu Ala Arg Arg Gly Ser Trp Ala Arg Glu Arg

195 200 205

Ala Asp Arg Ala Arg Phe Arg Arg Arg Val Ala Glu Ala Glu Ala Val

210 215 220

Ile Gly Pro Cys Leu Gly Pro Glu Ala Arg Ala Arg Ala Leu Ala Arg

225 230 235 240

Gly Ala Gly Pro Ala Asn Ser Val

245

<210> 2

<211> 102

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽

<400> 2

Arg Leu Arg Arg Ala Gly Gly Glu Gly Ala Pro Glu Pro Pro Ala Thr

1 5 10 15

Pro Ala Thr Pro Ala Thr Pro Ala Thr Pro Ala Thr Pro Ala Arg Val

20 25 30

Arg Phe Ser Pro His Val Arg Val Arg His Leu Val Val Trp Ala Ser

35 40 45

Ala Ala Arg Leu Ala Arg Arg Gly Ser Trp Ala Arg Glu Arg Ala Asp

50 55 60

Arg Ala Arg Phe Arg Arg Arg Val Ala Glu Ala Glu Ala Val Ile Gly

65 70 75 80

Pro Cys Leu Gly Pro Glu Ala Arg Ala Arg Ala Leu Ala Arg Gly Ala

85 90 95

Gly Pro Ala Asn Ser Val

100

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 3

gccttgacac tcctggtaca aatgag 26

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 4

cagcacattg gcagaggaag acag 24

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 5

caaggcaggt ttctgaggag 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 6

aagcagattc tccatgacct g 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 7

ctgctgcttt gcctacctct 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 8

cacttcttct ctgggttggc 20

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 9

tccttccttc cttccttcct tcc 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 10

aggctctttt tcaccctgtc tgg 23

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 11

ggccttgacc tttgctttac tg 22

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 12

cacagagcag cttgacttgc a 21

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 13

cctccttggg ttcgtctaca 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 14

agtggctgat atctgggtgc 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 15

cctgctgctt tgcctacatt 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 16

acacacttgg cggttctttc 20

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 17

ccctgtttct tccacagtgc cta 23

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 18

gagacaatgg tctggttgcc atc 23

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 19

cctgcggctt aatttgactc 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 20

aaccagacaa atcgctccac 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 21

tacaacctga ccatcgcttg 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 22

gcccccagag acttgttgta 20