一种稳定性好的还原型烟酰胺辅酶测定试剂及其制备方法

摘要

本发明公开了一种稳定性好的还原型烟酰胺辅酶测定试剂，包括一种介质固定化酶、固化介质和烟酰胺辅酶稳定试剂，其中介质固化酶包括基质、固定涂层和酶分子；所述固定涂层的原料包括单宁酸和3‑氨丙基三乙氧基硅烷，本稳定性好的还原型烟酰胺辅酶测定试剂及其制备方法，可以将葡萄糖氧化酶固定于固相载体以后，酶的活性更加稳定；克服液体试剂使用低浓度酶以降解导致产品性能下降的缺点；由于酶固定于试剂瓶的侧壁，在使用过程中随着试剂的逐渐消耗，液面逐渐下降，能够起作用的酶也按比例逐渐减小，保证试剂在储存、运输和使用中始终如一的稳定性能；克服液体试剂中反向反应对检测的影响。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及还原型烟酰胺辅酶测定试剂及其制法，具体为一种稳定性好的还原型烟酰胺辅酶测定试剂及其制备方法。

背景技术

在诊断体内酶的变化方法学中，辅酶NAD+/NADH和NADP+/NADPH是两个非常重要的参与物。NAD+化学名叫尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸，也被称作辅酶I（Co I）。NAD+是体内很多脱氢酶的辅酶，它可以接受从代谢物上脱下的2H（2H++2e），然后传递给另一个递氢体--黄素蛋白。尼克酰胺中的吡啶氮为五价氮，能可逆接受电子成为三价氮。氮对位的碳也可以可逆的加氢脱氢。在此反应中尼克酰胺可以接受一个氢原子和两个电子，尚有一个质子留在介质中。NADP+化学名叫尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，也被称作辅酶II（Co II）。NADP+也是体内很多脱氢酶的辅酶，与NAD+相比较，NADP+主要的结构区别是它的核糖的2’羟基位上的氢被磷酸基取代。NADP+的作用与NAD+基本相同。

NADH/NADPH在260nm和340nm波长处均有吸收峰，而氧化型的NAD+/NADP+只在260nm波长处均有吸收峰，因此测定340nm波长处均吸收峰的变化可以观察反应体系中NADH/NADPH与NAD+/NADP+量的变化。它是生化试剂中对常用的一类方法。

例如测定血浆中氨的浓度，氨在谷氨酸脱氢酶作用下与α-酮戊二酸反应生成谷氨酸盐，同时，NADPH被氧化为NADP+,反应系统在340nm处的吸光度值下降，测定340nm处吸光度的下降值。就可以算出血浆中氨的浓度。

再例如血清样本中丙氨酸氨基转移酶（ALT）浓度的测定，样本中ALT催化丙氨酸氨基转换至α-氧代戊二酸，生成丙酮酸和L-乳酸，同时NADH被氧化为NAD,反应系统在340nm处的吸光度值下降。通过测定340nm处吸光度的下降值，就可以计算出样本中ALT的浓度。

在早期临床使用中，由于各实验室自己配制试剂，对于NADH或NADPH的稳定性要求不高，可以近期配制使用。随着商品化试剂盒的推广使用，NADH或NADPH在这类酶试剂中不稳定的影响越发明显，成为制约本类试剂的关键性因素之一。

采用冻干粉试剂保持NADH或NADPH的稳定是可行的，但是在生产过程中对工艺要求高，耗费大量能源，增加成本。并且使用不方便，需要使用前复溶。

提高液体试剂中NADH或NADPH的使用量，即使它们能缓慢氧化降解，也保证试剂使用时340nm处的吸光度值大于1.200。提高NADH或NADPH的量使试剂在货架期的不同时间的检测灵敏度和稳定性处于不确定状态，从而影响临床检测结果的稳定和可靠。

加入稳定剂辅助NADH或NADPH的稳定是另一种解决办法，如专利CN102863495通过加入海藻糖和甘油等，专利CN108845140通过加入EGTA和烷基糖苷（APG）来稳定NADH或NADPH。

Joseph De Giorgio等（参见美国专利：5804402和5705356）发明了在测定试剂中加入NADH或NADPH的稳定酶系统，如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶及其专一性底物葡萄糖，将试剂保存过程中NADH或NADPH被氧化生成的NAD+或NADP+再缓慢还原为NADH或NADPH，从而保持测定试剂中有效的烟酰胺辅酶的浓度。本法虽然可以保证NADH或NADPH的稳定，由于反应体系中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶及其专一性底物葡萄糖的存在，在检测反应时存在逆反应，检测物在高浓度时影响不大，但是在低浓度，特别是检测限附近时，会影响试剂的检测灵敏度，造成低值偏低。

专利CN1548547则是在试剂生产或配制时加入将氧化型辅酶（NADP+或NAD+等）及其慢反应酶和底物（如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶及其专一性底物葡萄糖等），形成慢反应酶-底物-NAD/NADP等系统。测定试剂中有效的还原型烟酰胺辅酶（NADH、thio-NAD、NADPH或thio-NADPH）等的含量是由该系统生成的。由于该系统不断生成测定所需的还原型烟酰胺辅酶或其类似物，从而提高了试剂的稳定性。该系统与上述Joseph De Giorgio等的体系类似，只是将起始反应的还原型辅酶改为氧化型辅酶，其除了具有上述Joseph De Giorgio等的体系的缺点以外，在配制试剂以后不能立即使用，需要放置一定时间，使还原型辅酶的量达到一定程度才可以使用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种稳定性好的还原型烟酰胺辅酶测定试剂及其制备方法，本发明将慢反应酶固定于固相载体，置于液体试剂中，当试剂处于试剂瓶内时，处于固定状态的酶可以保障试剂的稳定性。上机检测时，液体试剂中不含有逆反应的酶，消除逆反应对低值酶活性的影响。本发明提供的方法能切实有效的提高本类试剂稳定性和灵敏度；提高不同批次试剂之间的一致性以及不同货架期试剂的一致性。本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种稳定性好，成本低的还原型烟酰胺辅酶（NADPH或NADH）测定试剂及其制法，同时，由于试剂配制时使用NADPH或NADH的量大大降低，从而大大降低了试剂的原料成本，可以有效解决背景技术中的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种稳定性好的还原型烟酰胺辅酶测定试剂，包括一种介质固定化酶、固化介质和烟酰胺辅酶稳定试剂，其中介质固化酶包括基质、固定涂层和酶分子；所述固定涂层的原料包括单宁酸和3-氨丙基三乙氧基硅烷。

进一步的，所述固定化介质既可以是试剂瓶内壁，也可以是添加入试剂瓶内的固体棒、球。

一种稳定性好的还原型烟酰胺辅酶测定试剂的制备方法，包括以下步骤：所述烟酰胺辅酶稳定试剂将能够生产还原型烟酰胺辅酶的酶，如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，固定于固相载体，NADH/NADPH和酶的底物置于液体试剂内，试剂储存过程缓慢氧化生成的NAD+或NADP+不断被固相酶及其底物还原为NADH或NADPH，从而保证试剂的稳定。

进一步的，所述本还原型烟酰胺辅酶测定试剂在制备的过程中可以结合测定试剂，加入缓冲液、防腐剂、重金属络合剂、表面活性剂和酶稳定剂，缓冲液包括Tris缓冲液、咪唑缓冲液、二乙醇缓冲液、磷酸盐缓冲液、Good’s缓冲液，缓冲液的浓度一般选择在10-200mM范围之内，采用的防腐剂为叠氮钠，重金属络合剂包括EDTA、EGTA、HEDTA，酶稳定剂采用牛血清白蛋白，甘露糖醇。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本稳定性好的还原型烟酰胺辅酶测定试剂及其制备方法，具有以下好处：

1、将葡萄糖氧化酶固定于固相载体以后，酶的活性更加稳定。克服液体试剂使用低浓度酶以降解导致产品性能下降的缺点；

2、由于酶固定于试剂瓶的侧壁，在使用过程中随着试剂的逐渐消耗，液面逐渐下降，能够起作用的酶也按比例逐渐减小，保证试剂在储存、运输和使用中始终如一的稳定性能；

3、克服液体试剂中反向反应对检测的影响。酶直接加入试剂中，虽然量很少，对大部分检测影响不大，但是，当检测标本中的标的酶含量比较低的时候，其影响不可忽视；

4、克服应用氧化型烟酰胺辅酶（NADPH或NADH）试剂不能立即使用的缺点。本发明的试剂，由于使用还原型烟酰胺辅酶（NADPH或NADH），试剂配制后可以立即使用；

5、有效克服液体双试剂/单试剂中还原型烟酰胺辅酶（NADPH或NADH）的用量（为一般试剂的1/5～1/10），有效降低试剂成本；

6、由于降低了还原型烟酰胺辅酶（NADPH或NADH）的起始剂量，试剂的反应性和灵敏度大大提高，线性范围加大。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例1-3，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供一种技术方案：一种稳定性好的还原型烟酰胺辅酶测定试剂，包括一种介质固定化酶、固化介质和烟酰胺辅酶稳定试剂，其中介质固化酶包括基质、固定涂层和酶分子；所述固定涂层的原料包括单宁酸和3-氨丙基三乙氧基硅烷，所述固定化介质既可以是试剂瓶内壁，也可以是添加入试剂瓶内的固体棒、球。

一种稳定性好的还原型烟酰胺辅酶测定试剂的制备方法，包括以下步骤：所述烟酰胺辅酶稳定试剂将能够生产还原型烟酰胺辅酶的酶，如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，固定于固相载体，NADH/NADPH和酶的底物置于液体试剂内，试剂储存过程缓慢氧化生成的NAD+或NADP+不断被固相酶及其底物还原为NADH或NADPH，从而保证试剂的稳定；本还原型烟酰胺辅酶测定试剂在制备的过程中可以结合测定试剂，加入缓冲液、防腐剂、重金属络合剂、表面活性剂和酶稳定剂，缓冲液包括Tris缓冲液、咪唑缓冲液、二乙醇缓冲液、磷酸盐缓冲液、Good’s缓冲液，缓冲液的浓度一般选择在10-200mM范围之内，采用的防腐剂为叠氮钠，重金属络合剂包括EDTA、EGTA、HEDTA，酶稳定剂采用牛血清白蛋白，甘露糖醇。

实施例1：

配制丙氨酸氨基转移酶试剂，由下述两部分组成：S11试剂I处理试剂瓶和S12试剂II处理试剂瓶。

S11：试剂I处理试剂瓶：将3-氨丙基三乙氧基硅烷溶解于无水乙醇中，得到浓度为10g/L的3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液；加入试剂瓶中，超声反应1小时，无水乙醇清洗2次，烘干，加入浓度为0.05mol/L含有1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、浓度为0.1mol/L 的N-羟基琥珀酰亚胺和浓度为0.05mol/L，pH为5.0的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液混合30分钟，弃去液体，用浓度为0.05mol/L，pH为5.0的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液洗一次，加入浓度为0.05mol/L，pH为5.0的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液1ml，加入葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 5mg，超声混匀1小时，弃去液体；用PBS洗两次；在试剂瓶中盛入液体试剂I，液体试剂I的成分及相应含量为：

100mmol/L Tris缓冲液PH7. 20

500mmol/L L丙氨酸

0.18mmol/L NADH

1700U/L LDH

0.1mmol/L 磷酸吡哆醛

6.0mmol/L EDTANa2

5.0mmol/L磷酸氢二钾

80mmol/L D-葡萄糖

1.5mmol/L叠氮钠

其溶剂为纯化水。

S12：试剂II处理试剂瓶，试剂II的成分及相应含量为：

15mmol/L ɑ-酮戊二酸

根据S11和S12配制试剂溶液的方法，以上丙氨酸氨基转移酶剂配制完成后，试剂空白吸光度大于1.20，340nm，10cm光径测定样本时，采用速率法，样本100微升，加试剂I 1000微升，温度37 ℃温浴300秒，然后加入试剂II 100微升，混匀，启动ALT催化反应，在波长340nm，延迟时间30秒，连续测定吸光度下降速率180秒，读数次数大于6点；根据线性期的-ΔA/Min，计算出ALT活力。

实施例2：

配制氨试剂：包括S21固体酶载体--塑料管的处理、S22酶固定和S23氨试剂制备；

S21：取内径0.5cm长7cm的塑料管三支，侵入10g/L的3-氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液中，室温超声混匀30分钟，塑料管全部侵入溶液中，注意排除气泡，然后取出塑料管，用无水乙醇清洗两次，烘干。

S22：取浓度为0.05mol/L的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，浓度为0.05mol/L，pH为5.0的2-（N-吗啉）乙磺酸缓冲溶液各500ml混合在一起，津湿经步骤S21处理后的塑料管，取出塑料管，在混合溶液中加入葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 50mg快速混匀，再次津入塑料管，超声结合30分钟；然后取出塑料管用浓度为0.05mol/L，pH为5.0的2-（N-吗啉）乙磺酸缓冲溶液洗两次，随后将塑料管甩干，备用。

S23氨试剂制备：取Tris缓冲液100mM，取PH为8.0的α - 酮戊二酸15mM，取浓度为5g/L的牛血清白蛋白溶液10 mM，取二磷酸腺苷钾盐3mM，取谷氨酸脱氢酶 5000U/L，NADPH0.20mM，D-葡萄糖 50mM，KH2PO4 5mM，EDTANa2 5mM，叠氮钠 4.0mM混合；将混合后的试剂在试剂瓶中放入标记葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的塑料管一支，置2-8°C保存一年，NADPH无降解。

实施例3：

配制CO2试剂，包括以下两个步骤：S31固体酶载体--塑料球的处理、S32酶固定和S33CO2试剂的制备；

S31：固体酶载体--塑料球的处理：取直径1.0cm的塑料球四个，侵入10g/L的3-氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液中，室温超声混匀30分钟，塑料球全部侵入溶液中，结合过程中不断翻转，然后取出塑料球用无水乙醇清洗两次，烘干。

S32：酶固定，取浓度为0.05mol/L 的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和浓度为0.05mol/L，pH为5.0的2-（N-吗啉）乙磺酸缓冲溶液各500ml混合在一起，用混合溶液津湿步骤S41中的塑料球，取出塑料球，在混合溶液中加入葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 50mg快速混匀，再次津入塑料球，超声结合30分钟，塑料球全部侵入溶液中，结合过程中不断翻转；取出塑料球用浓度为0.05mol/L，pH为5.0的2-（N-吗啉）乙磺酸缓冲溶液洗两次，甩干，备用。

S33：制备CO2试剂：取Tris缓冲液 50mM , PH 为8.0的磷酸烯醇式丙酮酸2.0mM，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 600U/L，苹果酸脱氢酶1500U/L，牛血清白蛋白2g/L，MgSO4 8mM，草氨酸钠 2.5mM，NADH 0.18mM，D-葡萄糖 50mM，KH2PO4 5mM，叠氮钠 4mM，混合在一起；试剂配制完成后在试剂瓶中放入标记葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的塑料球6个，置2-8°C保存一年，NADH无降解。

由于环境中CO2广泛存在，建议配制CO2试剂时采用新鲜去离子水煮沸冷却后配制，配制后试剂完全密闭保存。

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种稳定性好，成本低的还原型烟酰胺辅酶（NADPH或NADH）测定试剂及其制法，本发明同时公开了一种节约和改良的测定试剂配制和生产方法，由于试剂配制时使用NADPH或NADH的量大大降低，从而大大降低了试剂的原料成本，本发明同时公开了一种改良的测定试剂，包括ALT、AST、CO2试剂等。

上述实施例1-3试剂配制完成后，其应用方法与相关领域中的普通试剂应用方法相同，在此不再赘述。

上述实施例1-3试剂的配制方法仅用于说明本发明的原理及其应用，本发明并不局于。上述举例的应用范围；此外，尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。