一种DNA框架包裹的G-四链体结构及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种DNA框架包裹的G‑四链体结构及其制备方法与应用。本发明通过将组装框架结构所需的6条DNA序列、构成G‑四链体探针所需的Cy3序列和Cy5序列以终浓度0.6μM在缓冲液中混合均匀，将样品放入PCR仪中在3.5小时内从95℃程序退火到4℃，得到DNA框架包裹的G‑四链体纳米结构(G4‑F)，在靶序列(miR‑122a)缺失的情况下，仅出现来自Cy3的绿色荧光。而当靶序列存在时，则能够促进荧光共振能量转移过程，使得Cy3荧光减弱的同时Cy5荧光增强。本发明制备方法简单，成本低廉，所制备的G4‑F可以特异性地检测目的靶标，不受外界环境因素干扰，具有高度稳定性，DNA框架结构可以在细胞内有效保护G‑四链体探针不被细胞内物质降解，能够高效识别靶标序列并实现细胞内成像检测。

说明书

技术领域

本发明属于纳米技术领域，尤其涉及一种DNA框架包裹的G-四链体(G4-F)结构及其制备方法与应用。

背景技术

随着现代社会的发展，越来越迫切需要发展快速、灵敏的生物传感器，应用于临床样品快速准确的检测。虽然对生物传感器已经有着广泛的研究，但是开发准确且灵敏的生物传感器仍然面临严峻挑战。DNA纳米技术的发展为癌症的早期检测带来崭新的机遇，其中框架核酸(FNA)具有分子精确的空间组织特征以及出色的可编程性，在生物传感设备的构建方面具有巨大的潜力；而且它可以通过能量依赖的内吞作用内吞到细胞中去，因此具有的生物相容性和不可降解性赋予了DNA纳米结构作为载体进入细胞的巨大优势。

G-四链体富含串联重复鸟嘌呤(G)，Hoogsteen氢键将四个G连接起来形成一个环状平面，两个或更多个四分体通过π-π堆叠形成一个四链体。G-四链体可以表现出在过氧化反应中的催化能力，并增强某些卟啉衍生物(如原卟啉IX)的荧光。因此，它已被用作各种生物传感器中的信号报告基因。更重要的是，G-四链体可分割成多个独立的片段，在靶序列存在的情况下重新聚集。尽管G-四链体存在多个优势，但由于G-四链体细胞渗透性差和高背景信号，它用于细胞外生物传感及在活细胞中检测仍然是一个挑战。因此，设法将DNA纳米材料与G-四链体结合是增强细胞吸收及检测效率的另一种新颖的策略。

发明内容

为了克服现有技术的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种DNA框架包裹的G-四链体(G4-F)结构及其制备方法与应用。

本发明是这样实现的，一种DNA框架包裹的G-四链体结构，该G-四链体结构包括由DNA链构成的可进入细胞的框架结构以及包裹在该框架结构内的以miR-122a作为靶标的线性G-四链体探针，所述探针两端分别固定在框架一对角位置的边框上，所述探针中部断开以分别修饰Cy3和Cy5；其中，在靶序列miR-122a缺失的情况下，仅出现来自Cy3的绿色荧光；当靶序列存在时，则能够促进荧光共振能量转移(FRET)过程，使得Cy3荧光减弱的同时Cy5荧光增强。

优选地，所述框架结构具体为10×21×21个碱基构成的DNA框架。

本发明进一步公开了上述DNA框架包裹的G-四链体(G4-F)结构的制备方法，该方法包括以下步骤：将组装框架结构所需的6条DNA序列、构成G-四链体探针所需的Cy3序列和Cy5序列以终浓度为0.6μM在缓冲液中混合均匀，将样品放入PCR仪中在3.5小时内从95℃程序退火到4℃，得到G-四链体(G4-F)结构。

本发明进一步公开了上述DNA框架包裹的G-四链体(G4-F)结构在miR-122a检测物中的应用。

优选地，该DNA框架包裹的G-四链体(G4-F)结构在作为细胞内miR-122a的检测物中的应用。

本发明克服现有技术的不足，提供一种DNA框架包裹的G-四链体(G4-F)结构及其制备方法与应用。如图1所示，本发明通过将分裂为Cy3序列和Cy5序列的G4探针整合到DNA框架中来形成G4-F，并且在溶液中分布均匀，在这个空间取向可控的框架中，空间距离阻止了分离的G-四链体片段形成完整的结构；该G4-F以miR-122a为靶标，在没有miR-122a的情况下，仅出现来自Cy3的绿色荧光，表示没有FRET发生，当存在miR-122a后，Cy3序列和Cy5序列与miRNA杂交后，靶标将分裂的部分组装在一起以启动FRET，即存在靶标时，靶标促进了完整G-四链体探针的组装，导致受体和供体荧光团在空间上接近，从而使FRET处于有效发生状态。

在本发明中，在靶标浓度在0～125nM范围时，荧光信号与靶标浓度成线性相关，该G4-F对靶标有高度的特异性，能特异性的识别完全匹配的靶标，对单碱基及多碱基突变特异性低。此外，本发明G4-F具有结构稳定性，在0.3U/mlDnaseI或者10％FBS存在下不会发生降解，另外，该G4-F具有生物相容性和检测稳定性，在复杂的生物环境中也能稳定工作，可以成功实现细胞内miR-122a的感测，相对于单独的G-四链体，能有效保护G-四链体探针，具有更高的细胞渗透性和靶标杂交能力。

相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明制备方法简单，绿色环保，成本低廉；

(2)本发明制备的G4-F可以特异性地检测目的靶标，不受外界环境因素干扰，具有高度稳定性；

(3)本发明G4-F可以在细胞内有效保护探针不被细胞内物质降解，能够高效识别靶标序列并实现细胞内成像检测。

附图说明

图1本发明G4-F的结构形成和检测策略的示意图；

图2是用6％的PAGE表征G4-F(0.5μM)的逐步组装所获产物的电泳图；

图3是用8％PAGE验证靶标与分裂G-四链体的杂交能力的结果图；

图4是制备的G4-F的AFM表征图；

图5是与不同浓度的miR-122a(0～250nM)反应后的G4-F(250nM)的荧光光谱图；其中，波长记录范围为530nm至750nm；

图6是Δ(F

图7是突变链的突变位置图示；

图8是靶标和突变链的归一化F

图9是G4-F在与DnaseI(0.3U/mL)或FBS(10％v/v)孵育不同的时间间隔后，通过PAGE分析G4-F的结构完整性；

图10是G4-F在含有不同浓度标靶的不同基质中的响应情况；

图11是使用共聚焦激光扫描显微镜表征G4-F对细胞的成像结果，比例尺：10μm；其中，图11A是HeLa细胞与靶标/G4-F孵育后细胞共聚焦显微镜图像；图11B是HeLa细胞与靶标/G4-a/G4-b孵育后的细胞共聚焦显微镜图像；图11C是HeLa细胞与G4-F孵育后的共聚焦显微镜图像；图11D是Mir-122a负载的HeLa细胞与G4-F孵育后的共聚焦显微镜图像。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

用于组装DNA框架的的8条序列先定量至100μM，其中，该8条序列包括组装框架结构所需的6条DNA序列C1～C6、构成G-四链体探针所需的Cy3序列C7a和Cy5序列C7b，线性G-四链体探针以miR-122a作为靶标，具体如下表1所示：

表1组装G-四链体框架相关DNA序列

然后以终浓度为0.6μM在100μL的1×TAMg缓冲液中混合均匀，将离心管放入PCR仪中从95℃程序降温4℃，降温时间历时3.5小时，即可得到DNA框架包裹的G-四链体结构，如图1所示。

实施例2

以5×TBE1.2mL、30％Arc.Bis.1.2mL、三蒸水3.6mL、过硫酸铵60μL、TEMED6μL为配方制备6％PAGE凝胶，室温放置30分钟使其凝固。将形成四面体DNA纳米框架的八条链、七条链、六条链、五条链、四条链、三条链、两条链和单链退火得到对应结构的样品。每10μL样品溶液中加入2μL上样缓冲液，混匀后加入10uL到上样孔内，在1xTBE缓冲液以90V电压运行1小时，然后凝胶在1％的gel-red水溶液中染色10分钟，最后在成像仪里显影。从图2中看出，随着条带的增加，迁移率逐渐降低说明G4-F的正确组装。为了验证靶标与分裂G-四链体的杂交能力，将C7a、C7b、miR-122a、C7a/miR-122a和C7a/C7b/miR-122a所对应的序列退火得到相应结构的样品，按上述同样方法用8％PAGE表征得到图3，从图中可以看出泳道3～5迁移率逐渐降低说明分离G-四链体可以与靶标发生杂交反应。

实施例3

云母与40μL((3-氨基丙基)三乙氧基硅烷，APTES)(0.5％)孵育5分钟后，用Milli-Q水冲洗云母，并用N

实施例4

将退火完的G4-F与不同浓度的靶标序列在100μL的中室温孵育1小时后记录荧光信号，发射波长为488nm，波长范围为530～750nm。从图5中可以看出，随着靶标浓度的逐渐增加，Cy3荧光逐渐降低，Cy5荧光逐渐增加，从图6中可以看出在靶标浓度在0～250nM范围内，相对荧光强度与靶标浓度呈正相关。

实施例5

为了验证G4-F对靶标的特异性识别能力，设计了6个碱基突变序列，各序列如下表2所示：

表2碱基突变序列

对应突变位点如图7中框选碱基所示，将制备的G4-F分别与靶标和不同的突变序列孵育1小时后记录荧光信号，发射波长为488nm，波长测量范围为530～750nm。从图8中可以看出，miR-122a的荧光强度显著高于其他突变序列，说明本发明制备的G4-F对正确靶标有特异性的识别能力。

实施例6

为了验证G4-F的稳定性，通过非变性PAGE的方法对G4-F的稳定性进行表征。以5×TBE1.2mL、30％Arc.Bis.1.2mL、三蒸水3.6mL、过硫酸铵60μL、TEMED6μL为配方制备6％PAGE凝胶，室温放置30分钟使其凝固。将0.5μM的G4-F样品与0.3U/mlDnaseI或10％FBS分别孵育0、10、20、30、40、50、60分钟。加入到凝胶上样孔中，在1xTBE缓冲液以90V电压运行1小时，然后凝胶在1％的gel-red水溶液中染色10分钟，最后在成像仪里显影。从图9中可以看出，60分钟内条带强度没有发生明显变化，说明G4-F在复杂生物基质中不易被降解，稳定性较好。

实施例7

人宫颈癌细胞(HeLa)用添加了10％的胎牛血清、100U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素的DMEM培养基在37℃含5％CO

实施例8

人宫颈癌细胞(HeLa)用添加了10％的胎牛血清、100U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素的DMEM培养基在37℃含5％CO

为了监测细胞中miRNA，使用LipoHigh转染试剂将miR-122a序列(140nM)转染到细胞中。用PBS冲洗后，将其与相应的DNA框架孵育2小时。使用共聚焦激光扫描显微镜对miR-122a负载的细胞进行成像，结果如图11所示。从图中可以看出，图11B中靶标/G4-a/G4-b的荧光相对于图11A中靶标/G4-F弱，说明单独的G-四链体探针容易被细胞内物质降解，而DNA纳米框架可以有效保护探针。由于HeLa细胞中miR-122a浓度低，所以图11C中荧光强度较低，图11D中使用miR-122a负载的HeLa细胞，G4-F在miR-122a负载的HeLa细胞中能有效感应靶标，FRET效应明显，可以看到明显增强的Cy5荧光。说明G4-F能在细胞内成功感应靶标并在细胞内成像。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 南通大学

<120> 一种DNA框架包裹的G-四链体结构及其制备方法与应用

<141> 2020-10-09

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 68

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ccagccgccg ttctcctgga tccaaggctc taggtggtca ttcaggtaag tggccatcca 60

agctgcga 68

<210> 2

<211> 70

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ccactcccgt ttctgggatg ccatactcta actcagattc gctgattctg aatgaccttt 60

agcgttggct 70

<210> 3

<211> 67

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gataaggatt taggtctgcc ctttcgcagc ttggatggcc actttttcag cgaatctgag 60

ttagagt 67

<210> 4

<211> 68

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

gagacagcca ggagaaatca aacagaggcc gcatgctggg gccgtacagt tccacaaagg 60

catcccag 68

<210> 5

<211> 70

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

aatccttatc tttgcggcct ctttccgtat attcacgaaa aggagttcgg cggctggttg 60

ggcagaccta 70

<210> 6

<211> 67

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

ctccttttcg tgaatatacg gtattgattt ctcctggctg tctcttacgg gagtggagcc 60

aacgcta 67

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

tggaactgta catgaaacaa acaccatttt tgggtaggg 39

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

gggttgggtt ttcacactcc atgaaaattg gatccagg 38

<210> 9

<211> 22

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

ugguguguga caaugguguu ug 22

<210> 10

<211> 22

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

uggagugaga caaugguguu ug 22

<210> 11

<211> 22

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

uggaguguga caaucguguu ug 22

<210> 12

<211> 22

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

uggaguguga caauggugau ug 22

<210> 13

<211> 22

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

uggugugaga caaugguguu ug 22

<210> 14

<211> 22

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

uggugugaga caaucguguu ug 22

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

aactatacaa cctactacct ca 22

<210> 16

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

ggagugugac aaugguguuu g 21