基于G-四链体DNA酶的传感器设计及分子拥挤条件下G-四链体的稳定性及识别研究

摘要

G-四链体DNA酶是G-四链体结合氯化血红素(Hemin)后形成的一种具有过氧化物酶活性的人工酶。与天然酶相比，G-四链体DNA酶由于具有价廉、易得、便于存储、修饰及设计灵活等优势，使其近年来在传感器的设计方面得到了广泛的应用。
　　就鸟嘌呤碱基G重复序列之间连接环长度对G-四链体形成的影响进行了研究。发现在连接环长度较长，寡核苷酸链不易形成G-四链体的情况下，可以通过将环序列设计成双链结构的方法促进G-四链体结构的重新形成。这就为传感器的设计提供了一个新的途径:利用靶标对双链结构的调节作用来控制G-四链体DNA酶的活性。为证明这一点，在双链结构区域引入T-T碱基错配，破坏双链结构使寡核苷酸链失去形成G-四链体的能力。Hg2+对T-T错配的稳定作用可以促进双链结构的形成，寡核苷酸链重新折叠成G-四链体。得到的G-四链体与氯化血红素(Hemin)结合后形成具有过氧化物酶活性的G-四链体DNA酶，从而实现了Hg2+传感器的设计。利用该Hg2+传感器，可在10～700 nM浓度范围内实现Hg2+的定量检测，检出限为8.7nM。在此基础上，利用半胱氨酸可以把Hg2+从T-Hg2+-T碱基对上竞争下来的能力，又设计了一种半胱氨酸的定量检测方法。该方法可以在20～600 nM的浓度范围内实现半胱氨酸的定量检测，检出限为14nM。该传感器设计策略可以很容易地扩展到其它一些金属离子及适配体靶标的检测当中。
　　生物体内的细胞环境不是简单的水溶液，胞内环境不仅包含着可溶的小分子物质，例如:各种代谢产物和金属离子，还包含着许多不可溶的大分子物质，例如:多糖，蛋白质，脂类物质和核酸等。这些大分子在细胞内的总浓度约为400 mg.mL-1，约占细胞体积的30～40％。分子拥挤(molecular crowding conditions)条件引起的“分子拥挤效应”不仅影响G-四链体的构型及稳定性，还对G-四链体与小分子的作用有着显著的影响。因此，在体外实验中加入分子拥挤试剂用以模拟体内的分子拥挤环境是非常有必要的。正是由于意识到了这一点，人们有关G-四链体的研究正逐渐由稀溶液条件向分子拥挤条件过渡。
　　本论文选择聚乙二醇PEG200作为分子拥挤试剂在体外模拟分子拥挤环境，利用圆二色光谱仪测定DNA链的构型以及紫外分光光度计测定DNA链的熔点(Tm)，考察了稀释条件下和分子拥挤条件下鼓环的大小、数目对G-四链体构型和稳定性的影响。结果表明:随着鼓环的增大，DNA链形成的G-四链体构型不发生改变，但熔点逐渐降低，表明G-四链体结构的稳定性逐渐降低;鼓环数目对G-四链体的构型和稳定性均有显著影响，数目越多，稳定性越低，G-四链体结构越不易形成，因此G-四链体结构中允许存在的鼓环数目应该是有一个限度的。通过对稀释条件和分子拥挤条件下的对比，本文还得出分子拥挤条件能显著提高G-四链体结构的稳定性。上述结论拓展了我们对能形成G-四链体的DNA序列的认识:非G3+NG3+NG3+NG3+N结构的序列仍有望形成稳定的G-四链体，为近生理条件下研究人体基因组中的G-四链体结构提供了可能性。
　　我们还选择葡聚糖dextran-70作为分子拥挤试剂，考察了分子拥挤条件下结晶紫、甲基紫、乙基紫和孔雀石绿这四种三苯甲烷类染料对G-四链体的荧光特异性识别。研究结果表明:分子拥挤条件下四种染料的荧光光谱可用于区分G-四链体、单链和双链DNA。结合对G-四链体DNA链与四种染料的化学计量比测定，我们发现分子拥挤环境中G-四链体DNA链与小分子染料的化学计量比为1∶2，提出了G-四链体/TPM染料/G-四链体结合模式。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

第一节 核酸简介

第二节 G-四链体介绍

1．2．1 G-四链体简介

1．2．2 G-四链体的多态性(polymorphism)

1．2．3 G-四链体的研究方法介绍

第三节 G-四链体-Hemin DNA酶介绍

1．3．1 G-四链体-Hemin DNA酶

1．3．2 G-四链体-Hemin DNA酶在传感设计中的应用

第四节 分子拥挤的介绍

1．4．1 理论基础

1．4．2 分子拥挤对生物反应的影响

1．4．3 分子拥挤对G-四链体的影响

1．4．4 分子拥挤试剂的选择

第二章 利用对G-四链体环部的构型调节进行传感器的设计

第一节 前言

第二节 实验部分

2．2．1 实验仪器与试剂

2．2．2 Hg2+的检测

2．2．3 半胱氨酸的检测

2．2．4 圆二色光谱的检测

2．2．5 实际样品中Hg2+回收率的检测

第三节 结果与讨论

2．3．1 连接环长度对G-四链体的形成及酶活性的影响

2．3．2 Hg2+传感器的设计

2．3．3 CD光谱对检测机理的验证

2．3．4 Hg2+传感器的灵敏度和选择性

2．3．5 半胱氨酸传感器的设计

第四节 结论

第三章 关于鼓环(bulges)对G-四链体构型和稳定性的研究

第一节 前言

第二节 实验部分

3．2．1 实验仪器与试剂

3．2．2 圆二色光谱(CD)实验

3．2．3 紫外分光光度计测定熔点的实验(UV-melting)

第三节 结果与讨论

3．3．1 圆二色光谱分析

3．3．2 紫外分光光度计测定熔点

第四节 结论

第四章 分子拥挤条件下三苯甲烷类染料对G-四链体的特异性识别作用

第一节 前言

第二节 实验部分

4．2．1 实验仪器与试剂

4．2．2 荧光光谱检测

4．2．3 圆二色光谱检测

4．2．4 荧光测定化学计量比

第三节 结果与讨论

4．3．1 分子拥挤条件下四种染料对G-四链体的荧光识别

4．3．2 圆二色光谱分析

4．3．3 化学计量比分析

第四节 结论

参考文献

致谢