具有微流体装置的分析系统、微流体装置和相关方法

摘要

一种分析系统，其具有外壳，所述外壳具有室，将所述室定尺寸并且配置成接收至少一个微流体装置。所述系统还包括光学系统，其偶联到与所述至少一个微流体装置光学连通的所述外壳；控制器，其偶联到所述光学系统；热源，其偶联到所述光学系统并且热偶联到保持在所述外壳中的所述至少一个微流体装置；和子阵列选择模块，其与所述控制器连通。将所述子阵列选择模块配置成选择所述微流体装置的至少一个流体通道的微孔组的子组，用于在测定期间在反应步骤(例如，一个热循环)之后通过所述光学系统成像。

说明书

本申请要求于2018年11月13日提交的美国临时专利申请序号62/760,604和于2019年3月28日提交的美国临时专利申请序号62/825,523的益处和优先权，其内容通过引用并入本文，如同在本文中完全引用一样。

本发明在美国国防部(DARPA)授予的许可号HR0011-12-2-0001下由政府支持下进行。政府对本发明享有一定权利。

ASCII文本格式的序列表，在37 C.F.R. § 1.821下提交，标题为5470-860WO_ST25.txt，817字节大小，在2019年10月29日生成并通过EFS-Web提交，提供该电子序列表代替纸件副本。该序列表以其公开内容通过引用并入本说明书。

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技术领域

本发明涉及系统、流体装置(例如，高通量微流体装置)和使用它们的方法，例如，适于从编码的珠微孔阵列获得聚合酶链反应(PCR)数据。

背景技术

聚合酶链反应(PCR)是一种用于扩增基因组DNA (gDNA)或互补DNA (cDNA)的片段的高度灵敏的方法。PCR具有许多应用，例如，检测痕量核酸以确定致病生物体的存在、基因表达、基因分型、基因工程或修饰、以及法医学应用。PCR扩增在大范围的分析物浓度内提供突出的目标鉴定和定量。然而，通过PCR同时和定量分析许多分析物已证明是极具挑战性的。基于嵌入染料荧光的检测仅能够确定总dsDNA浓度，并因此使用该检测方法不可能在单个反应容器中同时分析多个模板。荧光探针技术(即TaqMan、分子信标或其它化学)可以用于反应的低水平多重化，因为可以使用不同颜色的荧光探针作为发信号报告物来扩增每个目标。探针也是序列特异性的，减少来自引物-二聚体形成或非特异性扩增的假阳性。用常规的微量滴定板或微流体实时-PCR (rt-PCR)进行多重化的典型方法是使用少量的反应孔，每个孔含有三种不同颜色的探针。然而，设计多重化的引物和探针组通常认为是具有挑战性的，因为它们需要另外水平的仔细设计和优化以确保彼此的相容性。尽管已经证明了使用至少六种染料的多重化，但是通过该方法的多重化最终受限于仪器和染料之间的光谱重叠，限于约四色检测，其中一种颜色通常保留用于内标染料。

发明内容

本发明的实施方案提供限制编码的珠阵列中光漂白的方法，任选地同时获得实时PCR数据。

本发明的实施方案提供PCR主混合物和磁性颗粒化学物质的制剂，其特别适用于编码的珠阵列。

本发明的实施方案涉及用于测定的样品分析装置、用于分析来自流体装置的微孔的阵列的信号的系统和测定方法。

本发明的实施方案涉及分析系统。所述系统包括：外壳，所述外壳包含室，将所述室定尺寸并且配置成接收至少一个微流体装置；光学系统，其偶联到与所述至少一个微流体装置光学连通的所述外壳；控制器，其偶联到所述光学系统；热源，其偶联到所述光学系统并且热偶联到保持在所述外壳中的所述至少一个微流体装置；和子阵列选择模块，其与所述控制器连通。将所述子阵列选择模块配置成选择所述微流体装置的至少一个流体通道的微孔组的子组，用于在测定期间在反应步骤(例如，一个热循环)之后通过所述光学系统成像。

所述系统可以包括保持在与至少一个微流体装置相邻的所述外壳中的至少一个磁体。所述磁体可以配置成在珠的负载操作期间沿至少一个流体通道平移以磁性偶联到珠，以引导珠沿所述流体通道行进并进入所述微孔的珠保留片段中。

所述微流体装置可以包括多个流体通道，每个流体通道具有多组微孔，所述多组微孔沿与样品输入端口和第二相对端口之间的方向相关联的长度维度定位。所述微孔组的所选的子组可以与多个所述流体通道的微孔的横向对准的第一子组的单行相关联，任选地与来自所述多个流体通道的每个流体通道的对准的微孔的一个子组相关联。

在初始图像获取和/或光激发之前，所述子阵列选择模块鉴定所述微孔组的子组，以限定所述微流体装置的所述微孔组的其它微孔组的位置。

所述子阵列选择模块可以在所述测定的不同的反应步骤(例如，所述测定的不同的热循环)选择所述微流体装置的所述微孔组的不同的子组，并引导所述光学系统仅激发所述不同的流体通道中的所述微孔组的当前选择的子组，然后引导所述光学系统的相机连续或并行获取所述当前选择的子组中的所述微孔组的不同的子组的图像。

所述子阵列选择模块可以在所述测定的至少一些不同的连续反应步骤(例如，所述测定的不同的热循环)选择微孔的相同的子组，并引导所述光学系统将光仅传输到所述微孔组的当前选择的子组，然后引导所述光学系统的相机连续或并行获取所述微孔组的不同的子组的图像，任选地获取微孔的当前选择的子组中的多对相邻的微孔组的图像。

所述光学系统可以具有至少第一滤波器和/或第二滤波器(任选地多于两个，例如在3-100个之间)，所述至少第一滤波器和/或第二滤波器限定对应于第一目标编码的珠和第二目标编码的珠的相应第一波长和/或第二波长的激发光，用于解码保持在所述微流体装置的至少一个流体通道的所述一组或多组微孔中的珠组。

所述系统可以具有整合在所述控制器中和/或偶联到所述控制器的信号分析模块。所述信号分析模块可以配置成获得所述微孔组的所选的子组中的每一个微孔的模拟信号。当振幅随所述测定的循环变化时，所述模拟信号可以提供PCR数据，并且通过所述模拟信号确定与所限定的珠类型相关联的反应的目标分子的浓度。

所述信号分析模块可以进一步配置成获得所述微孔组的一个或多个数字PCR信号。

当振幅随对于所述流体通道的所述一组或多组微孔中的输入材料的PCR循环数变化时，所述模拟信号可以提供实时PCR数据，并且所限定的珠类型的分子浓度约等于或大于1个分子/微孔。所述模拟信号可以限定阈值循环或循环阈值Ct和目标物质和/或分子类型的目标分子的数量/目标分子的浓度，对于给定数量的PCR循环，当荧光信号强度(Si)大于阈值时将微孔反应鉴定为阳性，或者如果所述荧光信号强度(Si)总是小于所述阈值将微孔反应鉴定为阴性。Ct是其中Si>>Bs的循环数，其中>>是比Bs大至少5-10%，任选地是Bs的两倍，和/或是Bs的标准偏差的5-10倍，并且其中Bs是背景荧光信号，任选地如在PCR阴性反应中测量的。

在所述测定的多个不同的反应步骤(例如，所述测定的不同的热循环)的每隔一个或每一个之后，可以仅针对每个流体通道中的所述微孔组的单个子组获得所述模拟信号。

所述模拟信号可以是Si的平均值(任选地排除异常值数据)、中值、众数值或加权值作为对应于每种所限定类型的珠的所述模拟信号，并且作为所述微流体装置的相应流体通道的其它微孔组的微孔中的类似反应的实时PCR曲线的估计值提供，从而即使在不同的或每个反应循环之后不是每个流体通道的所有微孔组都成像，也允许单循环分辨率。

所述光学系统可以具有含有视场(FOV)的相机，所述视场仅覆盖所述微流体装置的至少两个、任选地所有相邻的流体通道中的微孔的子组。

在一些特定实施方案中，所限定的FOV可以任选地覆盖在2-10个之间或更多个相邻的流体通道和/或所述微流体装置的流体通道总数的10-50%之间。

所述控制器和/或所述信号分析模块可以配置成引导所述光学系统获得PCR前和PCR后图像，并且比较它们之间的信号强度，任选地连同在所述测定的不同的反应步骤使用微孔组的所选的子组获得的模拟数据，以确定阳性和阴性PCR反应，任选地确定提供给所述流体通道的原始样品中的目标物质的一个或多个浓度和/或一个或多个分子浓度。

所述系统可以进一步包括保持器，将所述保持器配置成将多个微流体装置保持在所述外壳中的对准的网格中。

所述保持器可以由在相邻的微流体装置之间提供热障的绝热材料形成，任选地所述保持器可以保持所述多个微流体装置，其中所述流体通道的(样品/珠)输入端口面向外。

所述微流体装置可以进一步包括染料均匀剂，任选地所述染料均匀剂包含寡核苷酸。

所述染料均匀剂可以包括不可延伸的寡核苷酸和/或部分双链DNA。

所述染料均匀剂可以包括包含生物素和/或C1-C20烃链的部分双链DNA。

所述染料均匀剂可以存在于所述微流体装置中存在的主混合物中和/或所述染料均匀剂可以附着于所述微流体装置中存在的珠。

其它实施方案涉及分析样品的方法，例如用于鉴定目标物质和/或目标分子。所述方法包括：提供具有第一流体通道的流体分析装置，所述第一流体通道具有沿所述第一流体通道定位的多组微孔；仅从所述多组微孔的所限定的子组获得信号强度数据(任选地响应所述传输光激发信号)；和至少部分基于所获得的信号强度数据来鉴定对于与珠类型和/或目标分子相关联的目标物质和/或分子类型呈阳性的PCR反应。

所述方法可以包括(用经一种或多种样品预处理的珠浆料)负载，然后在所述获得步骤之前沿所述第一流体通道密封所述多组微孔，使得在密封之后，每组微孔与其它微孔组流体隔离。沿所述第一流体通道的所述多组微孔可以仅在所述负载期间、在所述密封步骤之前流体连通。

所述方法可以包括在测定的多个连续反应步骤中的每一个之后(例如，在所述测定的多个连续热循环中的每一个之后)，将所述多组微孔的所限定的子组变为不同的所限定的子组，由此在每个反应步骤之后一些微孔组不成像。

经测定的多个连续反应步骤(例如，在所述测定的多个连续热循环的每一个之后)，所限定的子组可以保持相同，由此在每个反应步骤之后一些微孔组不成像。

所述流体分析装置可以包括具有相应微孔(任选地，在2-100之间)的多个流体通道，包括但不局限于：第二流体通道，其具有沿所述第二流体通道间隔开的多组微孔；第三流体通道，其具有沿所述第三流体通道间隔开的多组微孔；和第四第二流体通道，其具有沿所述第四流体通道间隔开的多组微孔。所述第一、第二、第三和第四流体通道中的每一个的所述多组微孔的第一组微孔可以在第一行中对准。所述第一、第二、第三和第四流体通道中的每一个的所述多组微孔的第二组微孔可以在第二行中对准。所述第一、第二、第三和第四流体通道中的每一个的所述多组微孔的第三组微孔可以在第三行中对准。所述第一、第二、第三和第四流体通道中的每一个的所述多组微孔的第四组微孔可以在第四行中对准。所限定的子组可以是所述第一行、第二行、第三行和第四行中的单个(部分或全部)行。

所述第一、第二、第三和第四流体通道可以具有直的或弓形的片段，所述片段基本上彼此并行并且提供所述第一、第二、第三和第四组微孔。

所述方法可以进一步包括：在所述获得步骤之前，仅将光激发信号传输到所限定的子组；在所述传输和获得步骤之后、之前、或之前和之后，数字扫描所述多组微孔的所限定的子组，以获得所述微孔组的图像，用于鉴定与数字PCR相关联的阳性和阴性PCR反应；和在所述微孔处于成像温度时，在对一种或多种目标分析物分子呈阳性的所述微孔组中电子鉴定微孔。

可以进行所述激发和获得以在测定的多个连续反应步骤(例如热循环)中的每一个之后扫描微孔组的仅一个所限定的子组，其中所述一个所限定的子组的连续的子组可以彼此不同。

通过连续地或并行地获得微孔组的所限定的子组的不同的流体通道中的不同的所限定的邻近微孔组的图像，可以使用具有视场(FOV)的相机进行仅从所限定的子组获得所述信号强度，所述视场具有覆盖全部所述流体通道或相邻的流体通道的子组中的仅一组微孔或仅所述微孔组的子组。

所述微孔组中的每一个可以具有在1,000-1,000,000个范围内的微孔的微孔阵列。

所述流体分析装置可以具有多个间隔开的流体通道，每个流体通道具有含有所述微孔阵列的所述微孔组。在测定期间，所述流体通道可以流体隔离。所述微孔阵列的至少一些所述微孔可以含有单个珠，任选地一些或所有的所述微孔可以是无珠的或含有多于一个珠。

所述方法可以包括在所述传输和获得步骤之前电子鉴定位于所述微流体装置中的一个或多个位置中的一组或多组微孔的位置，并且基于所鉴定的位置的至少部分位置来限定所述微孔组的其它微孔组的位置。

权利要求20所述的方法，所述方法进一步包括在所述获得步骤之前仅向所限定的子组传输光激发信号，并且在所述传输之前，选择滤波器以提供用于所述传输步骤的编码波长。

所述获得信号强度可以包括获得模拟信号，当振幅相对于所述微孔组中的输入材料的PCR循环数变化时，所述模拟信号可以提供实时PCR数据，并且所限定的珠类型的分子浓度约等于或大于1个分子/微孔。所述模拟信号可以限定阈值循环或循环阈值Ct和目标物质和/或分子类型的目标分子的数量/目标分子的浓度，对于给定数量的PCR循环，当荧光信号强度(Si)大于阈值时将微孔反应鉴定为阳性，或者如果所述荧光信号强度(Si)总是小于所述阈值将微孔反应鉴定为阴性。

Ct可以是其中Si>>Bs的循环数，其中>>是比Bs大至少5-10%，任选地是Bs的两倍，和/或是Bs的标准偏差的5-10倍，并且其中Bs是背景荧光信号，任选地如在PCR阴性反应中测量的。

在所述测定的多个不同的反应步骤(例如，所述测定的不同的热循环)的每隔一个或每一个之后，可以针对一个或多个流体通道中的所述微孔组的仅单个子组获得所述模拟信号。

所述模拟信号可以是Si的平均值、中值、众数值或加权值(任选丢弃异常值数据)作为对应于每种所限定类型的珠的所述模拟信号，并且可以作为所述微流体装置的相应流体通道的其它微孔组的微孔中的类似反应的实时PCR曲线的估计值提供，从而即使在不同的反应步骤之后不是每个流体通道的所有微孔组都成像，也允许单循环分辨率。

通过使用具有视场(FOV)的相机可以获得所获得的信号强度，所述视场仅覆盖所述微流体装置的至少两个、任选地所有相邻的流体通道中的所述微孔组的子组。

在所述测定的多个不同的反应步骤(例如，所述测定的不同的热循环)之后，仅针对每个流体通道中的所述微孔组的单个组可以获得所述模拟信号，并且其中所述模拟信号包含Si的平均值、中值、众数值或加权值作为对应于每种所限定类型的珠的所述模拟信号，并且作为所述微流体装置的相应流体通道的其它微孔组的微孔中的类似反应的实时PCR曲线的估计值提供，从而即使在不同的反应步骤之后不是每个流体通道的所有微孔组都成像，也允许单循环分辨率。

具有所述第一流体通道的所述流体分析装置可以包含多个另外的流体通道，所述第一流体通道具有沿所述第一流体通道间隔开的所述多组微孔，每个另外的流体通道具有沿其相应的长间隔开的相应多组微孔。所述流体分析装置可以具有用于所述第一流体通道和所述多个另外的流体通道中的每一个的单独的材料输入端口，并且所述流体通道中的至少一些共享共同的相对的第二端口。所述方法可以进一步包括在所述获得步骤之前：将预先暴露于用于分析的相应样品的珠浆料流体负载到相应输入端口中；磁性引导所述珠浆料沿所述流体通道进入不同组的微孔中；使包含染料的流体主混合物从所述第二端口朝向所述第一端口流入所述流体通道中；和然后使密封油从所述第二端口朝向所述第一端口流入所述流体通道中，从而使所述微孔组和所述流体通道彼此密封。

所述主混合物可以任选地包括染料均匀剂。所述染料均匀剂可以任选地是或包含寡核苷酸(例如，不可延伸的寡核苷酸和/或部分双链DNA (例如，包含生物素和/或C1-C20烃链的部分双链DNA))。

所述方法可以包括与所述流体分析芯片相邻放置磁体，并且在所述流体主混合物和密封油流动之前使所述磁体朝向所述第二端口平移。

所述流体分析装置(任选地所述第一流体通道和/或所述多组微孔)可以包括染料均匀剂，任选地其中所述染料均匀剂包含寡核苷酸(例如，不可延伸的寡核苷酸和/或部分双链DNA (例如，包含生物素和/或C1-C20烃链的部分双链DNA))。

所述染料均匀剂可以存在于所述流体分析装置中存在的主混合物中(例如，存在于所述第一流体通道和/或所述多组微孔中)和/或所述染料均匀剂可以附着于所述流体分析装置中存在的珠(例如，存在于所述第一流体通道和/或所述多组微孔中)。

再其它实施方案涉及微流体装置。所述装置包括多个流体通道。所述多个流体通道中的每一个具有对应于第一端口和相对的第二端口之间的方向的长度维度，其中所述长度维度的至少一部分配置为直的或弓形的长度片段。所述流体通道中的每一个包括沿所述长度维度的所述直的或弓形的长度片段定位的多组微孔。

所述多个流体通道中的所述多组微孔可以在行、列、或行和列中布置。所述行或所述列对应于所述直的或弓形的长度片段。

所述多个流体通道中的至少一些在所述直的或弓形的长度片段上可以是基本上并行的。

所述多个流体通道中的至少一些可以是弓形的基本上并行的通道，并且可以提供所述弓形的长度片段。

所述多个流体通道中的至少一些可以是基本上并行的，并且在所述装置的外周部分与所述装置的中心之间径向延伸。

所述多个流体通道可以具有第一组流体通道和与所述第一组间隔开的第二组流体通道。所述第一组流体通道可以终止于第一主混合物端口作为所述第二端口，并且所述第二组流体通道可以终止于第二主混合物端口作为所述第二端口。

所述第一组流体通道和第二组流体通道可以周向间隔开。

所述多个流体通道可以包括限定第一邻近组的至少两个流体通道和限定与所述第一邻近组相邻的第二邻近组的至少两个通道，每个通道具有空间上对准的微孔组。

所述装置可以包括在所述第一邻近组和所述第二邻近组的第一流体通道和第二流体通道中的每一个之间的第一间隙空间。所述装置可以进一步包含在所述第一邻近组和所述第二邻近组之间的第二间隙空间，并且所述第二间隙空间可以具有大于所述第一间隙空间的横向伸展。

所述多个流体通道中的每一个的所述多组微孔可以具有共同的配置。所述流体通道中的每一个的所述多组微孔可以在行和/或列中彼此对准。所述多个流体通道可以保持相应输入材料彼此流体隔离。

用于相应流体通道的至少多组所述微孔可以各自包含具有在1,000-1,000,000范围内的量的微孔。可以将所述微孔组的所述微孔定尺寸并且配置成保持和保留单个珠，从而允许在所述微流体装置中1,000-1,000,000,000个反应。

来自至少第一流体通道和第二流体通道的第一组微孔和第二组微孔的组，任选成对的第一组微孔和第二组微孔，限定第一组相邻的微孔的子组。所述装置可以包括在所述流体通道的所述多组微孔上延伸的透明基材。

所述多个流体通道的每个流体通道可以具有在第一端处的单独的第一端口作为所述第一端口，并且所述多个第一端口中的交替的第一端口可以位于所述装置上的第一纵向位置处，并且交替的其它第一端口可以位于所述装置上的第二纵向位置处，所述第二纵向位置在所述长度维度上与所述第一纵向位置间隔开。

所述第一端口可以是材料输入端口并且可以位于相应流体通道的第一端处。所述装置可以进一步包括流体歧管，所述流体歧管将所述流体通道中的至少一些的相对的第二端与所述第二端口连接。

所述流体通道可以跨所述装置径向延伸。相应流体通道的所述入口端口可以位于所述装置的外周部分处。所述第二端口可以是位于连接到所述流体通道中的每一个的所述装置的中心处的单个第二端口。

所述流体通道中的至少一些可以作为流体通道的同心组提供，所述流体通道的同心组各自具有所述弓形的长度片段。

具有所述弓形的长度片段的流体通道的同心组可以作为多个周向间隔开的流体通道的同心组提供。

所述微流体装置可以进一步包括染料均匀剂。

所述染料均匀剂可以任选地包括寡核苷酸。

所述染料均匀剂可以包括寡核苷酸。(例如，不可延伸的寡核苷酸和/或部分双链DNA (例如，包含生物素和/或C1-C20烃链的部分双链DNA))。

所述染料均匀剂可以存在于所述微流体装置中存在的主混合物中和/或所述染料均匀剂附着于所述微流体装置中存在的珠。

其它实施方案涉及珠负载策略和如所示和/或所述的隔离的珠输入和共同的试剂储器/输入的用途。

其它实施方案涉及完全集成的流体分析芯片，其具有原始(生物)样品输入、样品制备和处理，随后将(用相应样品预饱和的)珠负载到微孔阵列、具有如所示和/或所述的预负载的试剂的相关试剂盒和微流体芯片中。

注意到，关于一个实施方案描述的任何一个或多个方面或特征可以并入不同的实施方案中，尽管没有相对于其具体描述。也就是说，所有实施方案和/或任何实施方案的特征可以以任何方式和/或组合来组合。申请人保留改变任何最初提交的权利要求或相应地提交任何新权利要求的权利，包括能够修改任何最初提交的权利要求以从属于和/或并入任何其它权利要求的任何特征的权利，尽管最初没有以该方式要求保护。本发明的这些和其它目标和/或方面将在下面阐述的说明书中详细解释。

附图说明

专利或申请文件含有至少一个彩色附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将由官方在请求并支付必要的费用后提供。

并入说明书并构成说明书的一部分的附图说明本发明的实施方案，并且与描述一起用于解释本发明的原理。

图1A是根据本发明的实施方案的实例流体装置的示意性说明。

图1B是根据本发明的实施方案的另一实例流体装置的示意性说明。

图2A是在图1A中所示的流体装置的俯视透视图。

图2B是对应于图2A的流体装置的原型的数字俯视透视照片视图。

图3A是根据本发明的实施方案的具有非圆柱形微孔的实例流体装置。

图3B是根据本发明的实施方案取自在图3A中所示的流体装置的一部分的几个微孔的极大放大的视图。

图3C是由在图3A中所示的流体装置的非圆柱形微孔产生的实例测定信号，说明根据本发明的实施方案的与珠背景信号分开的测定信号。

图4A是阴性和阳性珠的原始荧光相对于循环的图。

图4B是根据本发明的实施方案的微孔的阳性和阴性狭缝的荧光相对于循环的图。

图5A-5H是根据本发明的实施方案，通过在PCR期间组合来自不同的流体通道的微孔的不同的子组的实时PCR数据获得的原始数据随循环的图。

图6A-H是根据本发明的实施方案的在图5A-5H中所示的数据的标准化数据的图。

图7A-7H是根据本发明的实施方案的从不同的流体通道中的一行珠孔组收集的实时PCR数据的图。

图8是根据本发明的实施方案的实例分析系统。

图9-16是根据本发明的实施方案的具有不同的流体通道的配置的不同的实例装置的示意性俯视图。

图17是根据本发明的实施方案的实例分析方法的流程图。

图18是根据本发明的实施方案的数据处理系统。

图19是根据本发明的实施方案，在负载之后，可以进行的用珠负载流体装置，然后热循环的动作的流程图。

图20A-20D是根据本发明的实施方案的使用磁体的微芯片的实例负载操作的放大的侧透视图。

图21是根据本发明的实施方案的由绝热保持器保持的多个微芯片的俯视图。

图22是根据本发明的实施方案，来自两个8通道微芯片的一个通道的5阵列中的每个珠的初始珠荧光的箱形图，一个微芯片用含有10X SYBR的主混合物处理，而另一个微芯片用含有20X SYBR加上5 μM不可延伸的寡聚物的主混合物处理。

图23是12重呼吸面板测定内支原体的平均分子/珠(数字阳性信号)的图(尽管与数字阳性信号相关，但它可以是数字和模拟的组合)。每个点代表来自8通道微芯片的单个通道中的5阵列之一的结果，其中每个阵列负载有来自根据本发明的实施方案的相同样品的珠。

图24是根据本发明的实施方案，用与SYBR或+NE寡聚物和SYBR处理的微芯片的5阵列中的每个珠相关联，来自12重呼吸面板中的支原体群的编码染料荧光信号的箱形图。

图25是根据本发明的实施方案，珠的pdsDNA的实例的示意图。

具体实施方式

现在将在下文中参考附图更全面地描述本发明，在附图中显示本发明的实施方案。然而，本发明可以以许多不同的形式体现，并且不应解释为局限于本文阐述的实施方案；而是，提供这些实施方案，使得本公开透彻和完整，并将本发明的范围完全传达给本领域技术人员。

相同的数字始终表示相同的元件。在附图中，为了清楚起见，某些线、层、部件、元件或特征的厚度可能被夸大。在文本和附图中，可以互换地使用单词“图”的缩写“图(FIG.)”和“图(Fig.)”。

本文所用的术语仅是为了描述特定实施方案的目的，而不旨在限制本发明。如本文所用，单数形式“一”、“一个”和“所述”旨在也包括复数形式，除非上下文另有明确指示。将进一步理解，术语“包含”和/或“包括”当在本说明书中使用时，指定存在所陈述的特征、步骤、操作、元件和/或组件，但不排除存在或加入一个或多个其它特征、步骤、操作、元件、组件和/或其群组。如本文所用，术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任何和所有组合。如本文所用，短语如“在X和Y之间”和“在约X和Y之间”应解释为包括X和Y。如本文所用，短语如“在约X和Y之间”是指“在约X和约Y之间”。如本文所用，短语如“从约X到Y”是指“从约X到约Y”。

除非另有限定，否则本文所用的所有术语(包括技术和科学术语)具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。应进一步理解，例如在常用词典中所定义的那些术语应解释为具有与它们在本申请和相关领域的上下文中的含义一致的含义，并且不应以理想化或过于正式的意义来解释，除非本文明确地如此限定。本文中在本发明的描述中使用的术语仅是为了描述特定实施方案的目的，而不旨在限制本发明。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献均通过引用以其整体并入本文。在术语冲突的情况下，以本说明书为准。

此外，如本文所用，“和/或”是指并包括一个或多个相关的所列项目的任何和所有可能的组合，以及当以替代形式(“或”)解释时缺乏组合。

除非上下文另外指示，否则特别旨在本文所述的本发明的各种特征可以以任何组合使用。此外，本发明还预期在本发明的一些实施方案中，本文阐述的任何特征或特征的组合可以被排除或省略。为了说明，如果说明书陈述复合物包含组分A、B和C，则特别旨在A、B或C中的任一个或其组合可以被省略和放弃。

如本文所用，过渡短语“基本上由……组成” (和语法上的变体)应解释为包括所叙述的材料或步骤“和本质上不影响所要求保护的发明的一个或多个基本和新颖特性的那些”。参见，在re Herz，537 F.2d 549, 551-52, 190 U.S.P.Q. 461, 463 (CCPA 1976)(在原始文献中强调)；也参见MPEP § 2111.03。因此，如本文所用的术语“基本上由……组成”不应解释为等同于“包含”。

还将理解，如本文所用，术语“实例”、“示例性”及其语法上的变体旨在指非限制性实例和/或本文所讨论的变体实施方案，并且不旨在指示与一个或多个其它实施方案相比，对本文所讨论的一个或多个实施方案的偏好。

当涉及可测量值(如量或浓度等)时，如本文所用的术语“约”是指包括指定值以及指定值的±20%、±10%、±5%、±1%、±0.5%或甚至±0.1%的变化。例如，“约X”(其中X是可测量值)是指包括X以及X的±20%、±10%、±5%、±1%、±0.5%或甚至±0.1%的变化。本文提供的可测量值的范围可以包括其中的任何其它范围和/或单个值。

如本文所用，术语“增加”、“增加”、“增加的”、“增加”、“增强”和类似术语指示指定参数升高至少约2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、150%、200%、300%、400%、500%或更高，除非文本中另有明确说明。

如本文所用，术语“降低”、“降低”、“降低的”、“降低”、“抑制”和类似术语是指指定参数降低至少约2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或100%，除非文本中另有明确说明。

应理解，当元件称为在另一元件“上”、“附着于”另一元件、“连接到”另一元件、与另一元件“偶联”、“接触”另一元件等时，其可以直接在另一元件上、附着于另一元件、连接到另一元件、与另一元件偶联或接触另一元件，或者也可以存在中间元件。相反，当元件称为例如“直接在另一元件上”、“直接附着于另一元件”、“直接连接到另一元件”、“直接与另一元件偶联”或“直接接触另一元件”时，则不存在中间元件。本领域技术人员还将理解，提及与另一特征“相邻”布置的结构或特征可以具有与相邻的特征重叠或位于相邻的特征之下的部分。

为了便于描述，本文可以使用空间相对术语如“下方”、“下”、“下面”、“上方”、“上”等来描述如在附图中说明的一个元件或特征与另外的一个或多个元件或一个或多个特征的关系。应理解，空间相对术语旨在包括除了图中描述的取向之外的装置在使用或操作中的不同的取向。例如，如果将图中的装置倒置，则描述为在其它元件或特征“下方”或“下面”的元件将被取向为在其它元件或特征“上方”。因此，示例性术语“下方”可以包括“上方”和“下方”的取向两者。装置可以以其它方式取向(旋转90度或处于其它取向)，并且本文所用的空间相对描述符相应地解释。类似地，除非另外特别指出，否则术语“向上”、“向下”、“竖直”、“水平”等仅用于解释的目的。

将理解，尽管术语“第一”、“第二”等可以在本文中用于描述各种元件，但这些元件不应受这些术语限制。这些术语仅用于将一个元件与另一个元件区分。因此，在不脱离本发明的教导的情况下，下面讨论的“第一”元件也可以称为“第二”元件。除非另外特别指出，否则操作(或步骤)的顺序不局限于在权利要求或附图中呈现的顺序。

一般而言，本发明的实施方案涉及分析系统、流体装置及其使用方法。在一些实施方案中，流体装置可以包括高通量流体装置。本发明的流体装置10可以用于从编码的珠微孔阵列120a (图3B)和/或不同的流体通道15中的微孔20的组或子组获得实时和数字聚合酶链反应(PCR)数据。在一些实施方案中，本发明的流体装置10、方法和/或分析系统可以用于应用，例如非PCR反应、环介导的等温扩增(LAMP)和/或用于蛋白质测定的酶反应。如本领域技术人员所熟知的，实时PCR定义为聚合酶链反应，其中在PCR的每个循环之后收集与扩增子浓度相关的信号，PCR的循环通常是指包括模板DNA的变性、引物与单链DNA模板的退火和通过聚合酶延伸引物的一整套步骤。参见Arya等人, Expert Rev. Mol. Diagn. 5(2),(2005), 第209-219页. 0.1586/14737 159.5.2.2，其内容通过引用并入本文，如同本文完全引用一样。

在一些实施方案中，本文所述的设计和方法可以减少大阵列(例如，编码的珠阵列，任选地包括约30,000个或更多个微孔)的数据收集时间，同时还减少光漂白的影响。本文所述的方法可以适用于其中在各个时间点收集变化信号的其它应用。

在一些实施方案中，本发明可以包括但不局限于，如在以下中描述的基材、装置、设计、固体支撑物(例如，编码的固体支撑物)、步骤和/或方法：标题为"Compositions,Devices, and Methods for Improving a Surface Property of a Substrate"的美国临时申请号62/673,343、标题为"Compounds, Compositions, and Methods for ImprovingAssays"的美国临时申请号62/736,525，和/或如在美国专利号9,617,589、美国申请公开号2015/0211048、国际公开号WO 2017/112025、国际申请号PCT/US2016/042913、国际申请号PCT/US2016/043463和/或国际申请号PCT/US2016/055407中所述的，各自的内容通过引用以其整体并入本文。

在一些实施方案中，本发明的方法包括使用珠(例如超顺磁珠)将试剂和/或目标递送到反应孔中的方法，例如在美国申请公开号2015/0211048和国际申请号PCT/US2016/042913中所述，各自的内容通过引用以其整体并入本文。

术语“微芯片”和“微流体芯片”可互换使用，并且是指基本上平面的、薄的装置。微流体芯片可以是刚性的、半刚性的或柔性的。术语“薄”是指厚度尺寸为10 mm或更小，例如在10 mm-0.1 mm之间，并且可以是约3 mm、约2.5 mm、约2 mm、约1.5 mm、约1 mm或约0.5mm。微芯片的宽度和长度通常小于约6英寸，更通常在约1英寸-6英寸之间。然而，在一些实施方案中，微芯片可以更长，例如长度和/或宽度为1英尺或更长。微芯片可以具有为多边形、矩形或圆形或其它所需形状的外周。微芯片可以任选地宽度维度小于长度维度。在一些实施方案中，微流体芯片的直径或宽度维度可以是约2.13英寸(54 mm)和/或直径或长度维度为约3.4英寸(85.5 mm)。微芯片可以包括毫米尺寸、微米尺寸和/或纳米尺寸的流体通道。

术语“主尺寸”是指流体通道的宽度和/或深度维度。

关于流体通道的术语“微米尺寸”和“微流体”是指具有毫米、亚毫米或更小尺寸的宽度和/或深度的流体流动通道(例如，该术语包括毫米、微米和纳米尺寸通道，包括由通道提供的片段或室)。通道可以具有至少一个片段，所述片段的宽度和/或深度在10毫米或更小的尺寸范围内，通常小于900微米并且大于1 nm。

术语“微孔”是指反应孔，将其定尺寸并且配置成具有约100微升或更小的小的反应体积，并且在一些实施方案中，可以任选地容纳单个珠，如下文将进一步讨论的。

术语“珠”是指固相部件，例如颗粒、细粒或微球，通常是磁性或超顺磁微球，其可以是多孔的、表面多孔的或非多孔的一种或多种材料，例如聚合物、光致抗蚀剂、塑料、玻璃、二氧化硅、金属或半金属氧化物(包括但不局限于氧化铝、氧化钛、氧化锆或其它氧化物)、量子点、金属颗粒等，其适用于反应孔。

术语“回路”是指完全硬件实施方案或组合软件和硬件的实施方案。术语“模块”是指包含软件和硬件或固件的实施方案。

术语“数字扫描”及其派生词是指通常通过相机获得微流体装置的一部分或全部的数字图像。

现在参考图1A、图1B和图2，显示实例流体装置10。流体装置10包含至少一个细长的流体通道15，其具有沿相应细长的流体通道15的长存在的多组间隔开的微孔20。沿相应流体通道15的每组邻近微孔20可以(但不是必须需要)被没有微孔的间隙空间21分开。图1B说明可以沿相应流体通道15连续布置的微孔20的组。图1B还说明第一端口16的邻近端口可以对准，而不是如在图1A中所示的纵向(在所示的取向上)偏移。

沿相应流体通道15的一组或多组微孔20可以具有不同的几何足迹。在使用如在图1A中所示的间隔开的微孔20的情况下，间隙空间21的长度可以小于微孔20的邻近组的足迹的长度L。

如在图1A和图2中所示，至少一个细长的流体通道15包含八个相邻的流体通道15

如在图1A中所示，每个或一些流体通道15可以配置多组微孔20以包括第一组微孔20

沿相应流体通道15的相邻的微孔组20之间的间隙21不需要由连续微孔20中的物理间隙或裂口提供，而是可以由成像系统的视场和/或辐射源的照明窗口确定。可以在相应流体通道15的长上提供微孔20的组作为微孔20的连续阵列，如在图1B中所示的。

可以在流体通道15中提供用于对准珠的气泡或收缩部。可以在微孔20的邻近组之间提供气泡或收缩部，其在流体通道15中提供微孔120的相应阵列120a，以控制流体运动/密封或促进或控制珠负载。

再次参考图1A和图2，用于流体通道15的多组微孔20可以在对准的基本并行的行中布置，用位置标记来标记，例如行的字母数字标记，对于R

微孔20的组可以具有带矩形外周20r的足迹，其封闭单珠微孔120的相应组或阵列120a (图3B)。然而，可以使用其它几何形状。

每个流体通道15可以包含单独的、专用的流体第一端口16，其可以是输入端口，用于引入期望的输入材料，任选地包含样品。参考图2A、图2B，流体端口16可以包含具有穿过覆盖基材10u的通孔16v的储器16r，以将输入材料从储器16r引导到流体通道15的输入端口16。

每个流体通道15可以在与输入端口16相对的一端合并到第二端口18，所述第二端口18可以是主混合物/油端口18。第二端口18也可以通过通孔18v连接到储器18r。第二端口18可以与多于一个流体通道15流体连通。装置10可以包含与所有或一些流体通道15流体连通的流体歧管18m。因此，可以存在用于每个流体通道15的单独的输入端口16和比输入端口16更少数量的第二端口18，因为一些或所有的流体通道15可以经由歧管18m或直接从流体通道延伸部15e合并到共同的第二端口18中(图14，图15)。

虽然未显示，但是每个流体通道15可以具有其自己的单独的第二端口18。不同的流体通道15的组可以与相应不同的主混合物/油端口18流体连通(图16)。如下文将进一步讨论的，一旦用珠负载并密封，则相应流体通道15中的每组微孔20可以彼此流体隔离，并且每个流体通道15可以与其它流体通道15流体隔离。

如在图1A、图1B和图2中所示，对于相应通道阵列10a，流体通道15在包括多组间隔开的微孔20的直的长度片段上可以是基本上并行的。术语“基本上”当提及“并行”时，是指阵列10a中的流体通道15在长度片段的至少一部分上并行或名义上并行(即，可以从通过流体通道15的相应纵向延伸中心绘制的相邻的中心线C/L稍微成角度地变化10%或更小)：在图1、图2、图9、图10-15中显示为直的长度片段，而在图16中显示为弓形的长度片段。

参考图3A-3C，每组或一些微孔组20可以包含具有珠保留片段120w和测定信号片段120s的多个微孔120。测定信号片段120s可以与珠保留片段120w成直线，并且并行于和/或与装置10的顶部或覆盖基材10u (图2A)的主表面成直线。测定信号片段120s与相应微孔120的珠保留片段120w流体连通。测定信号片段120s可以产生窄尾测定信号122，其允许在孔保留片段120w处分离珠背景信号。在一些实施方案中，测定信号片段120s可以具有珠不能物理进入其中的几何形状。片段120w、120s流体连接，使得从保持在片段120w中的珠释放的试剂和/或分析物可以扩散或以其它方式混合在孔120w的整个共同的溶液体积中。通过在空间上将珠与检测区域120s分开，可以减少或消除珠荧光对信号的贡献，改进信噪比。孔120的几何形状可以允许反应孔的高的、通常是单珠占据的负载，同时增加相应反应体积，潜在地改进反应效率。

图9-11和图16说明装置10可以包含流体通道的多个间隔开的阵列10a

流体通道10的每个阵列10a可以具有单个共同的第二端口18，用于引入负载缓冲液、密封油和/或主混合物。

术语“主混合物”是指PCR主混合物，并且可以在将孔120 (图3B)彼此密封之前加入到流体通道15中以到达每组微孔20，在一些实施方案中，可以使用不混溶油作为密封油进行密封。本发明的主混合物可以不含引物。也就是说，本发明的PCR主混合物可以排除用于一些特定实施方案的引物，例如SiRCA平台。

作为另外一种选择或除此之外，顶部基材10u (图2A)可以包含柔性基材，例如有机硅(例如聚二甲基硅氧烷(PDMS))，并且通过将柔性基材平压在阵列10a上可以实现密封。

图16说明流体通道15可以是弓形的流体通道15a，并且围绕圆形几何布置的直径的至少一部分周向延伸。流体通道的不同的阵列10a

图11显示朝向中心延伸的流体通道15，所述中心限定第二端口18的位置，其中歧管18m的至少一个内腿18i朝向第二端口径向延伸，并且相应阵列A

图12-15显示流体通道15配置为径向向内延伸通道15r。通道15r从装置10的外周部分径向向内延伸，其中第一端口16朝向装置的中心至第二端口18。图14和图15显示流体通道15的尺寸沿其长度朝向装置10的中心至第二端口18减小，当微孔组接近第二端口18时，微孔20的组的尺寸从第一组微孔20

微芯片阵列10a可以限定对应于位置地址(例如行和列地址)的每个流体通道15的每组微孔20的阵列位置。例如，行和该行上的相关位置，例如1A (或A1)、2A (或A2)、7E (或E7)和8E (或E8)。阵列10a可以配置成提供一些微孔组20作为角微孔20c。在图1A和图2中所示的实施方案中，阵列位置A1、A2、A7、A8、E1、E2、E7和E8中的微孔20的组是微孔20的组的邻近角(子)组20c。此外，多于两个流体通道15可以配置成提供相邻的微孔组以限定微孔20的角组20c。

注意，在图1A和图2中所示的装置10具有矩形外周10p，其长度维度大于宽度维度(“W”)，任选地，宽度维度在15-30 mm宽之间。长度维度可以是宽度维度的2倍-4倍或更多。流体通道15的宽度维度可以对应于装置10的宽度维度W的方向。通道15显示为沿装置10的长度维度延伸而布置。然而，流体通道15可以备选地取向以跨装置10的宽度维度的至少一部分延伸。在一些实施方案中，一些流体通道15可以沿长度维度延伸，并且一些沿宽度维度延伸(图9，图10)。在一些实施方案中，流体通道15在径向方向延伸(图11-14)。在一些实施方案中，流体通道15周向延伸(图16)。

每个通道15中的微孔20的相应组可以对准以具有相同的纵向和横向伸展和位置，如在图1A中所示，例如，或者可以交错，其中微孔20的组的第一端在另一个流体通道15中的相邻的且至少部分横向对准的微孔组的相邻的第一端的上方或下方(未显示)。

相应流体通道15的一些组或每组微孔20的微孔120 (图3A)可以作为具有在1,000-1,000,000个之间或更多个微孔120，更通常1,000-100,000或1,000-50,000个微孔120的微孔的致密的阵列提供。

在一些实施方案中，微流体装置10的通道15可以用各自提供微孔120的阵列120a的微孔20的组分析相应样品，所述阵列可以在1,000-1,000,000或更大的范围内，任选地10,000-200,000。微流体装置10可以包含多个流体通道15，通常在10-100之间，在装置10中提供高达20,000,000个累积微孔120。

在实例实施方案中，每个通道15沿其长度可以具有在2-10组(或更多)之间的微孔20，在密封后流体隔离。一组微孔20可以具有任何合适数量的微孔120。在一些实施方案中，每组微孔20具有相同数量的微孔120。在一些实施方案中，一组或多组微孔20 (在一些实施方案中，每组)可以包含小于12,000个微孔120 (例如，1,000、2,000、5,000、8,000、10,000或12,000个微孔120)。在一些实施方案中，一组或多组微孔20 (在一些实施方案中，每组)具有至少1,000个微孔120 (例如，1,000,10,000或更多个，例如，12,000-50,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000,000、1,000,000,000或更多个微孔120)。每个微孔120 (图3B)通常容纳单个珠(一些可以不负载，而一些可以负载两个珠，这在一些应用中可能是不期望的)。

在一些实施方案中，微芯片10可以配置成在微孔120中用多于一个珠运行测定。参见例如在9,617,589和PCT/US2016/042913 (也是US 2019/0054470)中描述的实例多珠测定，其内容通过引用并入本文，如同本文完全引用一样。

用于相应通道15的不同组的微孔20可以具有相同或不同数量的微孔120 (图3B)。每个通道15的不同组的微孔20可以具有相同或不同数量的微孔120 (图3B)。

如在图1A中在位置A1、A2处指示单个视场(FOV) 25的虚拟框所示，装置10可以配置使得整个微孔阵列10a的子组或子阵列10s(显示为邻近组15n，任选地通道15的对15p)占据光学信号检测器(220，图8) (例如相机)的整个单个FOV。这允许光学信号检测器220 (图8)(例如至少一个相机)在任何一个时间点使微孔20的组的不同的子组10s (例如被FOV 25覆盖的多个不同的样品通道15的单个微孔阵列120a)成像。邻近组15n可以布置为具有微孔20的相应组的通道15的子组或全部(例如，部分或整行)。

如下文将进一步讨论的，光激发源225 (图8)可以配置成将具有所限定的波长范围的激发光传输至装置10的微孔20的组的整个阵列10a的所限定的子阵列10s(图1A，图1B)，其可以是微孔20的组的子组，并且含有来自样品通道15的多个相邻的样品通道的至少一组微孔20，但小于微芯片10的所有微孔组20。例如，所限定的波长范围可以与用于测定信号和/或编码荧光团的光相关联。

如在图1A中所示，所限定的子阵列10s可以与装置10的微孔的整个阵列10a的单个连续位置(例如整个单行)相关联。然后可以使所限定的子阵列10s成像或光学分析，通常通过在第一测定循环之后在单个位置使通道15的相应邻近通道15n中的微孔20的组的子组连续成像。也就是说，测定包含与热循环相关联的多个测定循环。被激发和成像的所限定的子阵列10s可以在每个测定循环之后(即，在第一测定循环结束时)改变。在一些实施方案中，在第一测定循环结束时，分析系统200 (图8)仅激发与第一行R1中的微孔20的子组相关联的阵列10a的子组10s并成像，而在第二测定循环结束时，分析系统200仅激发第二行R2中的微孔20的子组并成像。

装置10可以包含附着在一起的上基材10u和下基材10b (图2A，图2B)。上基材10u与下基材10b可以相同或不同。基材10u、10b中的任一个或两者可以是刚性的，并且包含例如玻璃、石英、硅或合适的金属。覆盖基材10u可以是视觉上透射的，通常是透明的。基材10u、10b中的任一个或两者可以是聚合物，例如有机硅或其它聚合物材料(例如PMMA、COC、COP、PDMS、PP、PE、PTFE或Kapton (聚酰胺)，以及许多其它材料)，并且其可以提供微孔10a的一个或多个阵列。在一些实施方案中，基材10u、10b中的任一个或两者可以包含硅(例如，可以是硅晶片)和/或可以用疏水化合物(例如烷基硅烷和/或烷基硫醇)来官能化(例如，硅烷化)。在一些实施方案中，基材10u、10b中的任一个或两者包含用烷基硅烷来硅烷化的硅。

具有多个微孔20的间隔开的组的流体通道15可以具有侧壁和底板，其中每组微孔20提供相应微孔阵列120a，所述底板在一个或多个基材10u、10b中形成，以具有开放的顶表面和封闭的底表面，侧壁在它们之间延伸。可以使用一个或多个间隔物、顶部基材、膜或覆盖物。顶部基材、膜或覆盖物可以密封、覆盖或以其它方式封闭一个或多个流体通道的上表面和/或反应孔的阵列。在一些实施方案中，通道15可以蚀刻到顶部基材10u中，并且底部可以提供微孔20的组，并且可以形成通道15的封闭的表面。

材料输入中的分析物可以是感兴趣的任何分析物，包括例如各种混合物，包括合成的和生物的大分子、纳米颗粒、小分子、DNA、核酸/多核酸、肽、蛋白质等。分析物可以是一个或多个分析物分子。

材料输入可以包含样品或样品的分析物，并且可以包括一种或多种极性代谢物，例如氨基酸或带电分子、分子、肽和蛋白质。样品和/或分析物还可以或备选地包括从生物流体、血液、血清、尿液、干血、细胞生长培养基、裂解细胞、饮料或食物中提取的分子。样品还可以或备选地包括环境样品，例如水、空气或土壤。

术语“寡核苷酸”是指至少约5个核苷酸至约500个核苷酸(例如，5、6、7、8、9、10、12、15、18、20、21、22、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450或500个核苷酸)的核酸序列。在一些实施方案中，例如，寡核苷酸可以是约15个核苷酸至约50个核苷酸，或约20个核苷酸至约25个核苷酸，其可以例如用作聚合酶链反应(PCR)扩增测定的引物和/或用作杂交测定中或微阵列中的探针。本发明的寡核苷酸可以是天然的或合成的，例如DNA、RNA、PNA、LNA、修饰的主链等，或其任何组合，如本领域所熟知的。本发明的寡核苷酸可以是单链、双链或部分双链的。在一些实施方案中，寡核苷酸是不可延伸的(例如，通过PCR)。

探针和引物(包括用于扩增和/或检测的那些)是任何合适长度的寡核苷酸(包括天然存在的寡核苷酸如DNA以及合成的和/或修饰的寡核苷酸)，但通常长度为5、6或8个核苷酸，至长达40、50或60个核苷酸，或更长。这样的探针和/或引物可以固定在固体支撑物上或偶联到固体支撑物，所述固体支撑物例如珠、芯片、针或微量滴定板孔，和/或偶联到可检测基团或用可检测基团标记，所述可检测基团例如荧光化合物、化学发光化合物、放射性元素或酶。

聚合酶链反应(PCR)可以根据已知技术进行。参见，例如，美国专利号4,683,195；4,683,202；4,800,159；和4,965,188。通常，PCR包括，首先，在杂交条件下用一种寡核苷酸引物处理核酸样品(例如，在热稳定的DNA聚合酶存在下)，所述寡核苷酸引物用于待检测的特定序列的每一条链，使得合成与每个核酸链互补的每一种引物的延伸产物，其中引物与特定序列的每一条链充分互补以与其杂交，使得从每个引物合成延伸产物，当它与其互补物分离时，可以用作用于合成其它引物的延伸产物的模板，并然后在变性条件下处理样品，如果存在待检测的一个或多个序列，则从它们的模板分离引物延伸产物。将这些步骤循环重复，直到获得期望程度的扩增。扩增的序列的检测可以如下进行：通过向反应产物中加入能够与反应产物杂交的寡核苷酸探针(例如，本发明的寡核苷酸探针)，所述探针携带可检测的标记，并然后根据已知技术检测标记，或通过在凝胶上直接观察。也可以通过向反应混合物中加入嵌入染料并监测荧光信号强度来检测扩增的序列，所述荧光信号强度与双链DNA的总质量成比例。也可以使用非嵌入的其它染料，但在dsDNA存在下产生更高的荧光信号。尽管根据本发明的实施方案关于PCR反应描述，但应理解，可以使用其它核酸扩增方法，如逆转录PCR (RT-PCR)，包括等温扩增技术如滚环扩增或环介导的等温扩增(LAMP)，并且也可以使用核酸排序方法。另外，可以使用其它方法，例如酶扩增反应，如酶联免疫吸附测定(ELISA)。在这样的情况下，微孔温度控制可以用于控制扩增反应以优化微孔阵列的成像，并且一些区域可以仅使用完全反应之前和之后的图像(数字信号)成像，而其它区域或子阵列可以在反应期间成像以获得模拟信号。

DNA扩增技术(例如前述的)可以包括使用探针，三、四、五或六个或更多探针的一对或一组，或两对探针，其特异性结合含有感兴趣的多态性或突变的DNA，但在相同的杂交条件下不那么强地结合不含有感兴趣的多态性的DNA，并且其可以在扩增反应中用作用于扩增DNA或其部分的一种或多种引物。在本文中，这样的探针有时称为扩增探针或引物。在一些实施方案中，可以使用两种或更多种探针，例如在竞争性方法中用于检测单核苷酸多态性(SNP)和/或其它突变和/或稀有等位基因(如插入缺失)。

术语“试剂”是指任何物质或化合物，包括引物、核酸模板和扩增酶，将其加入到系统中以引起化学反应，或加入以观察是否发生反应。扩增试剂或试剂是指除了引物、核酸模板和扩增酶之外通常用于扩增的那些试剂(脱氧核糖核苷酸三磷酸、缓冲液等)。通常，将扩增试剂连同其它反应组分一起放置并容纳在反应容器(测试管、微孔等)中。

本文所用的术语“磁性”包括铁磁性、顺磁性和超顺磁性性质。

通常，用于检测含有感兴趣的多态性或突变的DNA的寡核苷酸探针是在相同的杂交条件下与编码该突变或多态性的DNA结合，但与不含该突变或多态性的DNA不能良好结合的寡核苷酸探针。寡核苷酸探针用合适的可检测基团标记，例如下面阐述的那些。在本文中，这样的探针有时称为检测探针或引物。

本发明的实施方案可以用于紧凑阵列中的单重反应(SiRCA)，这是用于灵敏的高度多重化的核酸(NA)和蛋白质定量的平台。SiRCA以大规模并行、高度多重化的格式将样品制备与数字PCR精度组合。NA-SiRCA是基于磁性珠的PCR变体，其中测定面板可以由用荧光染料独特编码的微珠组制成。在将各组组合之前，可以用针对特定目标NA的不同的引物对将每组官能化。在测定期间，珠上的引物可以与NA目标杂交，从样品基质中捕获、浓缩和纯化它们。可以洗涤珠并负载到微孔20的组中，每组包含含有数千个微孔120的阵列120a，通常其中一个珠占据一个珠孔120w。微孔120可以具有任何合适的体积容量。在一些实施方案中，微孔120的体积容量在约10微升或更小范围内，例如10飞升至小于约10微升，或约10、50或100飞升至约200、500或1,000飞升。在一些实施方案中，微孔120的体积容量为约100飞升。

在使用不混溶油将孔彼此密封之前，加入PCR主混合物(含有除引物之外的所有试剂)。加热后，珠释放引物组和捕获的目标，在每个微孔120中形成单重PCR。快速产生数千个空间上多重化的PCR，在引物组间无干扰。来自dsDNA嵌入染料的信号指示目标扩增，并且目标ID由珠的编码确定。在低浓度下，单分子计数(数字信号)允许精确的分析物定量。在较高浓度下，作为来自相同反应类型的所有孔的荧光信号的平均值测量的实时PCR (模拟信号)将定量范围延伸到数字信号饱和点以上。

使用非圆柱形微孔几何形状可以改进基于微珠阵列的技术中的检测。制造这些孔几何形状，使得孔的一个区域被优化用于磁性负载和珠保留，而孔的另一区域用于信号的检测。在将珠负载到孔的珠区域之后，使用例如不混溶流体密封的方法将小体积的试剂流体在孔中隔离。显示微孔120的具有插入物的实例单阵列芯片示于图3A中。其它实施方案可以包括设计的变体。在特定实施方案中，优选一个区域具有口袋或容器120w (图3B)，其直径为珠直径的约100%-约150%，深度为珠直径的约50%-约185%，并且具有由窄的口袋或狭缝120s (图3B)或标准珠不能物理地配合到其中的其它几何形状组成的流体连接的区域。两个区域都流体连接，使得从珠释放的试剂或分析物可以扩散或以其它方式混合遍及共同的溶液体积。通过将珠与检测区域在空间上分离，可以减少或消除珠背景荧光对信号的贡献，改进信噪比(图4B)。另外，这些几何形状允许反应孔的高单占据负载，同时增加其反应体积，潜在地改进反应效率。

使用具有微管格式的珠和/或芯片10上的微孔阵列120a可以进行NA-SiRCA，允许约35,000或甚至更多反应，例如高达约1,000,000,000个反应。

我们已经开发了使用合成目标的12重呼吸面板。使用组合的数字和模拟信号在10拷贝/μL至10,000,000拷贝/μL的整个范围内观察到优异的线性。在低浓度(50-150拷贝/μL)下的数字定量显示具有低方差的高精度，允许在区分小的拷贝数变化之间区分。我们已经显示，RNA可以用逆转录酶测定。正在开发的另外的测定包括使用具有亚pg/mL LOD的免疫PCR的多重蛋白质测定(细胞因子)。

通常，数字测定不需要在每个扩增循环之后使测定信号成像。然而，模拟测定依赖于阈值循环(Ct)的检测以确定有多少NA分子最初结合到珠。Ct通常被确定为第一循环，在所述循环信号显著高于背景信号(高5-10%或更高)。Ct的差异可以用于确定样品的初始浓度。假设PCR反应中扩增效率为100%，则来自目标样品的Ct (C

本领域技术人员将理解如何调整效率低于100%。

浓度测量的分辨率(即，可以确定浓度的精度)取决于测量荧光有多频率。通过在每个扩增循环之后成像(即，每次≈扩增子浓度的加倍)获得最大分辨率。然而，频繁的成像导致染料的光漂白，其方式取决于染料暴露于激发源。这对于用于SiRCA的小体积PCR反应是特别显著的。图4A显示实时PCR图的痕迹，其中光漂白的效果通过基线信号的负斜率而明显。

本发明的微流体装置可以任选地以高通量应用和/或方式提供一个或多个(例如，1、2、3、4或更多个)待测试的样品。本发明的微流体装置可以具有单个基材，其包括一个或多个阵列10a，所述阵列具有多组微孔20，所述微孔上具有相关联的微孔阵列120a (例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多)。在一些实施方案中，任选地在单个阵列10a或多个阵列10a (后者在图9-11和图16中显示)中提供的两个或更多个流体通道15，可以在基材上组装,以形成用于高通量应用的聚集的多样品装置10。在一些实施方案中，微流体装置10的一个或多个阵列10a中的多个流体通道15中的一组或多组微孔20可以同时热循环。

可以完成这样的格式中的数字PCR，因为阵列可以在PCR之前成像一次，并且在PCR之后成像一次，以获得数字PCR数据。在一些实施方案中，阵列(例如，包括约40,000个孔的阵列)由具有足够高的像素密度的传感器成像，使得来自一个孔的光被至少一个像素收集。在一些实施方案中，本发明的装置的每个微孔120可以通过约4-约20个像素，或约4-约100、150或200个像素成像。在一些实施方案中，本发明的系统、装置和/或方法在两个或更多个相邻的流体通道15中提供一组或多组对准的或部分对准的微孔20，以使用单个传感器成像而无需定制光学装置和/或精确对准。

定制光学装置的替代方案是使用精确定位台来水平、竖直和/或旋转地移动相机和/或微流体芯片，使得在每个PCR循环的延伸步骤之后可以以连续方式使阵列成像。该方法允许以增加的测定时间为代价使许多阵列成像。对于具有提供30,000-40,000或更多个微孔20的组的通道15，例如每个样品通道15有62.5k个微孔120，对于每个加入的阵列，平移和成像通常可以为每个循环增加约1秒至约10秒，尽管高性能硬件可以以显著的费用减少该时间。增加成像时间有效地增加了PCR循环的延长时间。尽管PCR反应速率是循环依赖性的而不是时间依赖性的，但是对大量阵列成像所需的热循环的长延迟可能是有问题的，因为如果给予足够的时间，活性聚合酶倾向于编写二聚体和非特异性产物。这可以导致背景信号增加和测定特异性降低。

本发明的一些实施方案提供这些成像和/或数据收集问题的解决方案，例如，通过利用根据本发明的实施方案的编码的微珠微孔阵列120a (图3B)的独特特征。

编码的珠阵列的性质可以允许模拟PCR数据收集和分析的独特方法。如果目标分子的浓度在模拟域中，则每种珠类型的分子的平均数将大致相同。因此，每个珠组的Ct将独立于阵列中珠的位置，并且阵列的不同的区域可以在PCR的不同的循环上成像，同时仍然获得单循环分辨率。也就是说，在PCR的每个循环之后，不必使整个阵列成像，只需阵列的代表性部分成像。在一些实施方案中，不是使用典型的近似正方形的阵列，而是可以使用细长的阵列，使得来自每个样品的阵列可以紧密接近地定位。这可以允许相机一次使两个或更多个样品阵列成像，并且在短时间段内使许多阵列成像，而不需要平移长距离或通过复杂路径。

该方法的一种实现方式可以通过使用在图1A中所示的装置10布局的以下实例来说明。在该设计中，将流体通道15分组(显示为对15p)，使得各具有来自两个或更多个流体通道15 (任选地具有两个或更多个不同的样品)的相应孔120 (图3B)的微孔20的组的阵列10s的子组可以由相机在单个框中成像(相机的视场由图1A、图1B中的1A、2A处的框盒25表示)。在该实例中，跨一行R

图17是说明鉴定目标物质和/或目标分子的实例方法的流程图。提供具有第一流体通道的流体分析装置，所述第一流体通道具有沿第一流体通道间隔开的多组微孔(框600)。将光激发信号(任选地)仅传输到多组微孔的所限定的子组(框610)。响应于传输光激发信号，仅从多组微孔的所限定的子组(任选地)获得信号强度数据(框620)。至少部分基于信号强度数据来鉴定对于目标物质和/或目标分子呈阳性的珠类型(框630)。然而，在一些实施方案中，不需要光激发来获得信号。例如，在一些实施方案中，测定(例如蛋白质测定)可以产生化学发光信号，其可以在没有光激发的情况下检测和/或成像。

所述方法可以任选地包括负载，然后在传输步骤之前沿第一流体通道密封多组微孔，使得在密封之后，每组微孔与其它微孔组流体隔离。仅在负载期间、在密封步骤之前，沿第一流体通道的多组微孔流体连通(框602)。

任选地，所述方法可以包括在测定的多个连续反应步骤中的每一个之后(例如，在测定的多个连续热循环中的每一个之后)，将多组微孔的所限定的子组变为不同的所限定的子组，由此在每个反应步骤之后一些微孔组不成像(框612)。

任选地，经测定的多个连续反应步骤(例如，在测定的多个连续热循环中的每一个之后)，所限定的子组保持相同，由此在每个反应步骤之后一些微孔组不成像(框614)。

任选地，所述方法包括在传输和获得步骤之后、之前、或之前和之后，数字扫描多组微孔的所限定的子组；和当孔的阵列处于成像温度时，电子鉴定对一个或多个目标分析物分子呈阳性的孔(框624)。

任选地，使用具有视场(FOV)的相机进行仅从所限定的子组获得信号强度，所述视场仅覆盖相应样品通道15中的微孔20的组的子组以及仅覆盖一个或多个邻近的、相邻的流体通道15的子组，通过实例，第一、第二、第三和第四或更多个流体通道的流体通道中的2-10个或更多个相邻的流体通道，通过连续地获得占据微芯片10的单个物理位置的子组的图像，例如，连续地从第一、第二、第三和第四或更多个相应行的不同的单个行获得数据(框622)。

任选地，获得信号强度包括获得模拟信号。当振幅相对于流体通道的微孔组中的输入材料的PCR循环数变化时，模拟信号可以提供实时PCR数据，并且一种或多种所限定的珠类型的目标分子的浓度约等于或大于1个分子/微孔，并且其中模拟信号限定阈值循环或循环阈值Ct，对于给定数量的PCR循环，当荧光信号大于阈值时将微孔反应鉴定为阳性，或者如果荧光信号总是小于阈值将微孔反应鉴定为阴性，其中Ct是其中Si>＞Bs的循环数，其中>>是比Bs大至少5-10%，任选地是Bs的两倍，和/或是Bs的标准偏差的5-10倍，并且其中Si是荧光信号强度，并且Bs是背景荧光信号(框626)，如在PCR阴性反应中测量的。可以将Ct与参考反应相比较，以确定在PCR反应开始时目标分子的数量。

任选地，获得信号强度包括获得模拟信号，当振幅经流体通道的微孔组中的输入材料的测定的PCR循环数变化时，模拟信号可以提供实时PCR数据，并且当Si>>Bs，比Bs大至少10%、任选地是Bs的两倍，和/或是Bs的标准偏差的5-10倍时，确定对于目标分子PCR反应是否呈阳性。Si可以计算为对应于每种所限定类型的珠的模拟信号的平均值、中值、众数值或加权值。在一些实施方案中，Si可以通过首先剔除异常值(通常在早期PCR循环)并然后确定平均值或中值来计算。

在一些实施方案中，参考图19和图20A-20D，将珠负载到装置10中可以如下进行。装置10用负载缓冲液润湿并定位在偶联到或与线性磁体或磁体800的阵列协作的保持器900 (图21)上(框700)。输入端口16的通孔16v可以任选地在两个邻近的相邻的行中在位置上偏移，以允许以最小的交叉通道污染风险进行珠负载(框702)。当磁体800保持在奇数编号的通道下方时(图20A)，可以将来自材料输入的珠浆料移液到通孔16v中(框710)。然后移动磁体800，使其停留在偶数编号的通孔下方(图20B)，将珠拉入奇数编号的通道中(框720)。当然，在图2A和图20B中所示的步骤可以以相反的顺序进行。在将珠浆料加入到偶数编号的通孔中之后，使用磁体800将珠拉入微孔(阵列室)中(图20C) (框730)。通过使磁体在每组阵列20下方沿流体通道15朝向歧管通道和/或主混合端口18滑动，使微孔组(阵列片段)用珠负载，并且任选地用硬停止装置810 (图20C)控制运动，使得珠不进入共同的歧管通道(其可以允许样品之间的珠混合) (框740)。

在每个通道15中，存在分段的组，任选地物理上间隔开的微孔20 (框704)，在图1A中显示为五组微孔20

在流体通道15中的每组微孔20的微孔120 (图3B)用珠负载之后，通过将磁体800朝向通孔16v、输入端口16 (图20D)平移，朝向通孔16v磁性拖回剩余的珠(框750)。主混合物在施加于共同的储器18的压力下流动，直到其填充通道15 (框760)。然后在压力下泵送密封油，直到密封油密封微孔20的组并从通道15中置换过量的主混合物(框770)。

任选地，可以在储器16r和/或通孔16v上放置吸收垫，以在水性溶液从装置10中置换时收集水性溶液，或者可以使用部分真空在液体从通孔16v和/或储器16r渗出时去除液体(图2A) (框772)。

任选地，第二微流体通道、通道网络或储器可以用于储存废物流出物，而不是使其从通孔渗出。这样的废物储器，无论是微流体的还是作为单独的、任选地附着的储器或储器组，都可以通过蜡或石蜡阀或疏水收缩部以防止其在主混合物加入和/或密封步骤之前填充的方式流体连接到通道和/或通孔。在一些实施方案中，在珠加入之后，可以用膜密封通孔，使得膜阻挡水性流和/或油流，任选地允许空气通过膜逸出。在一些实施方案中，膜可以覆盖其它通孔或端口，并且充当空气从微流体通道、室或通孔逸出的路径。

然后将装置10放置在用于热循环、PCR和成像的测试系统200h (图8)的热循环显微镜载物台上(框780)。

流体通道15的微孔20的组的阵列10a被分成子阵列，即，A-E，本文是指行和流体通道数(即，A1是在装置左上角的微孔20

相机(222，图8)可以初始地对准并聚焦在A1-A2、A7-A8、E7-E8、并然后是E1-E2位置处的微孔20的组的子组上。这些X、Y和Z (聚焦高度)的微孔20的角20c子组的位置可以用于计算微孔20的所有内部组的位置。可以在阵列10a保持在成像温度(通常为约60℃至约72℃的延伸温度)时收集焦点以消除来自热膨胀的尺寸变化。然后在PCR热循环之前在成像温度下使每个通道15中的每组微孔20成像，以获得基线“PCR前”图像。

在PCR的第一循环之后，第一行(A1-A2、A3-A4、A5-A6和A7-A8)中的微孔20的组的子组在共计四个框中顺序成像。在PCR的第二循环之后，使第二行(B1-B2、B3-B4、B5-B6和B7-B8)成像。在第5次PCR循环之后使第E行成像之后，重复该系列，并在第6次PCR循环之后使第A行成像。如果该过程持续30个PCR循环，则每行将成像六次。为了减少载物台平移所需的时间，载物台将移动到下一行的位置，同时在进行下一个退火/延伸/成像步骤之前进行变性步骤。

在完成热循环之后，在成像温度下对整个阵列10a拍摄“PCR后”图像。将阵列10a冷却(通常冷却至约20℃-约25℃)，并拍摄另一组PCR后图像(以阐明芯片的问题区域，其中由于密封技术的失败，水性主混合物可能连接两个或更多个孔)。如果期望，可以在一系列温度下使阵列10a成像，以确定在PCR循环之后检测的扩增子的熔点和/或范围。将滤波器组(F

成像数据的处理可以分成两个域：数字和模拟。数字PCR信号可以通过比较PCR前和PCR后图像来确定，以确定对于每个孔，嵌入染料信号的增加是否超过设定的阈值。在一些实施方案中，可能仅需要PCR后图像来确定数字阳性或阴性。或者，可以使用PCR前和PCR后图像，任选地连同六个热循环图像，以确定荧光信号是否以与正确扩增子的PCR扩增一致的方式在图像过程中改变。例如，在目标的低浓度下，其中该目标的PCR反应群的一些部分是阴性的，预期在后期循环中信号增加，并且在循环早期显示强信号的异常值可以认为是非特异性扩增产物或错误鉴定的珠。

在大多数或所有PCR反应都是阳性的目标的高浓度下，使用实时模拟信号。尽管来自阵列10a中的微孔20的每个子组的信号具有五个循环的分辨率(因为每五个PCR循环，每个子阵列仅成像一次)，但在每个PCR循环之后，对于每个样品的阵列10a的通道15的微孔20的至少一个子组成像。由于目标分子应当同等地分布在给定的珠群上，可以组合来自图像的数据以重建具有单循环分辨率的Ct曲线，即使在每个循环之后相同的孔不成像。这通过对每个图像的每个样品的来自每个珠组的信号强度取平均而实现。然后可以将每种珠类型的平均信号绘制为实时PCR曲线，如在图5A-5H中所示。如在图5A中可见，用于循环1的实时信号来自微孔20在位置1A处的第一图像，而用于循环2、3、4和5的数据来自子阵列1B、1C、1D和1E的第一图像。在循环6，使用来自子阵列1A的第二图像的数据；在循环11，使用来自子阵列1A的第三图像的数据。该过程用于每个芯片10上的所有八个流体通道15 (并且每个通道可以具有相同的样品或不同的样品，即，八个样品)，以构建实时PCR曲线。

如在图5A-5H中可见，对于给定的流体通道15和/或样品，跨子阵列(微孔20的子组)的荧光强度基线不是完全均匀的。这可能是由于几个因素，包括嵌入染料的有效浓度、图像的焦点和/或装置的不同水平的硅烷化的影响。如果通过将PCR图像信号除以PCR前图像信号而使它们标准化(图6A-6H)，则基线更线性，并且循环阈值的调用可以更可再现。最大PCR信号的不规则性将对目标的定量影响低。有助于控制染料浓度并因此控制跨所有阵列的荧光信号强度的方案将在后面讨论。

在一些实施方案中，通过仅对所有PCR循环(在该非限制性实例中，为30个循环)的子阵列的组(微孔20的组的子组)成像，可以进行数据收集。在该方法中，使用如以上实例方法1中描述的角子阵列的位置，可以对准和聚焦相机。然后在PCR热循环之前在成像温度下使每组微孔20 (即，每个子阵列)成像以获得基线“PCR前”图像。

在PCR的第一循环之后，使一行微孔20的组(子阵列)成像，例如，使第C行的不同组的微孔20成像。将微孔20的组在C1-C2、C3-C4、C5-C6和C7-C8位置在共计四个框中依次成像。在PCR的第二循环之后，使同一行再次成像。该过程持续30个PCR循环，并且在该实例中，如图在7A-7H中所见，对于30个PCR循环，同一行将成像30次。

在热循环之后，在成像温度下对整个阵列拍摄“PCR后”成像。将阵列冷却(通常冷却至约20℃至约25℃)并拍摄另一组PCR后图像。如果期望，可以在一系列温度下使阵列成像，以确定在PCR循环之后检测的扩增子的熔点或范围。改变滤波器组(F

类似于实例方法1，成像数据的处理可以划分成两个域：数字和实时(模拟)。对于该方法，数字PCR信号可以仅通过比较PCR前和PCR后图像来确定，以确定对于每个孔，嵌入染料信号的增加是否超过设定的阈值(表1)。在一些实施方案中，数字可以单独从PCR后图像获得。

表1：使用如方法2所述的实时和数字处理的组合收集数据。具体地，第C行收集作为实时轨迹，而将其它区域数字分析。每个样品含有5,000拷贝/μL鼻病毒和掺入不同的样品通道的FluA合成的DNA序列。表中的值代表相应编码的珠组的阳性百分比。

在PCR期间未成像的微孔20的组 (即，子阵列)将具有非常少的光漂白，而成像的子阵列可能显示显著的光漂白。在一些实施方案中，这可能需要不同的阈值来区分数字阳性与数字阴性。

成像的子阵列的模拟信号处理类似于传统的全阵列成像方法。将每个珠群的信号取平均，并针对PCR循环数作图(图7A-7H)。对于其中目标分子超过1拷贝/珠的模拟信号，来自几百个珠的平均信号应该足以准确和精确地确定Ct。

本发明的方法(例如，上述实例方法1和方法2)可以具有优于其中阵列中的所有孔在每个PCR循环都成像的典型的数据收集方案的优点。在一些实施方案中，本发明的方法减少数据收集时间，同时产生用于模拟定量的单循环实时PCR分辨率。孔阵列的紧凑、窄设计可以允许在单个图像中对来自多个样品的流体分离的阵列成像。

跨多个子阵列收集模拟数据(例如，如关于实例方法1所描述的)的优点可以包括减少的光漂白。例如，实例方法1可以提供显著减少的光漂白，因为每个子阵列仅暴露于用于标准收集方案的照明的20%。在几个循环中收集的数据，即使在较低的循环分辨率下，对于鉴定用于数字定量的假阳性珠可能更可靠，因为仅比较PCR前和PCR后图像。另外，较低程度的光漂白可以允许在比所有30个循环成像所需的那些更低嵌入染料(例如SYBR GreenI)浓度下有足够的信号。由于嵌入染料可以抑制PCR，对于一些目标，较低的浓度可以改进PCR效率或熔点确定。

从单行的微孔20的组收集模拟数据(即，关于实例方法2描述的微孔的子阵列或子组)的优点可以包括较少依赖于用于Ct确定的数据的标准化，使得分析更直接。另外，PCR前图像可以用于确定哪一行具有用于模拟实时PCR分析的最佳珠负载。这可以帮助改善如果一个或几个子阵列没有负载足够的珠用于模拟分析可能发生的问题(尽管该问题可以通过其它手段解决，例如严格控制阵列尺寸、几何形状、位置、珠群尺寸和珠尺寸)。

实例方法1和实例方法2仅是本发明的装置设计和数据收集方法的说明性实例，并且可以使用各种组合和/或修改。例如，在不同的流体通道15中的单行的微孔20组可以在每个循环或每隔一个循环中成像，与以各种不同的间隔的其它子阵列的成像组合。虽然一些组合可能需要更多的获取时间，但是在一些实施方案中，数字数据或模拟数据的改进的质量可能值得这样的权衡。在一些实施方案中，可以在一些PCR循环(并且通常不是每一个和/或不是每个PCR循环)使所有或大多数组微孔20成像。

所示的装置10仅是设计概念的示范(即，将珠/反应孔阵列分成一系列子阵列，将它们隔开并定位，使得它们可以以有利的方式成像)，并且在本发明的实践中可以使用其它设计。在一些实施方案中，本发明的装置10可以包括流体通道15的一个或多个阵列10a，用于多于八个流体通道15，例如9-1,000个流体通道15，包括16、32、64、96、384等或更多个流体通道15，每个装置10具有微孔20的相应组。在一些实施方案中，本发明的装置10可以在硅、玻璃、聚合物(例如，注塑的和/或热浮雕的塑料)和/或金属膜中制造。在一些实施方案中，本发明的装置10可以是复合结构。在一些实施方案中，本发明的装置10可以仅含有珠/反应孔阵列和阵列室，或者可以包括其它结构，例如样品处理微流体回路和/或进行测定所需的标记或扩增试剂。

电气和/或机械回路、致动器和/或传感器可以集成、附着和/或组装到装置10中和/或装置10上，任选地用于执行测定和/或读出测定。

聚苯乙烯珠可以从水性溶液中吸收疏水性分子以及带电分子。微孔阵列20的长而窄的几何形状可以导致当主混合物流过通道15时，主混合物中某些组分(例如嵌入染料)的消耗。第一个子阵列中的珠遇到主混合物时可以吸收更大量的组分(例如嵌入染料)，而最后的阵列可以从部分消耗的溶液中吸收较少的组分。当组分是染料时，这可以导致跨芯片的染料浓度的梯度，并因此，当比较通道中的阵列时，可以导致初始珠荧光(图20)。染料吸收的这些差异可以导致测定的若干复杂性，因为太多的染料可能抑制PCR，而太少的染料导致弱的扩增信号。另外，嵌入染料浓度的变化可能引起编码染料的表观荧光强度的不期望的变化，这可能使得解码阵列更加困难。这种效应可能是在图5和图6中观察到的一些子阵列中较低强度信号的原因之一。

通过包括(例如，加入)各种试剂以引起跨整个阵列更均匀的染料(例如，SYBR)吸收/分配，可以修改珠的染料吸收。这些试剂(本文也称为“一种或多种染料均匀剂”)可以包括但不局限于各种长度的寡核苷酸，例如单链DNA、RNA、双链DNA (任选具有低熔融温度，使得试剂在加入到通道和密封孔期间是双链的，但是在PCR的成像步骤期间是单链的，并因此不与嵌入染料相关联)、部分双链DNA、离子或非离子聚合物例如硫酸葡聚糖或聚胺、表面活性剂、洗涤剂、相转移催化剂、葡聚糖、环糊精、有机硅、聚硅氧烷、氟碳化合物、多氟烃、氟硅氧烷、烃、醇、氢氟烃、生物分子例如肽、蛋白质、脂质、碳水化合物、聚糖、复合分子、核酸和/或修饰的核酸。具有已知的PCR相容性和当与嵌入染料相关联时具有低荧光信号的试剂和/或化合物特别良好地适用于该目的。染料均匀剂可以与主混合物混溶。在一些实施方案中，染料均匀剂存在于主混合物中和/或加入到主混合物中。染料均匀剂(例如，部分双链DNA)可以以约100 nM至约100 μM范围或其中的任何范围和/或值(例如，约1、5或10 μM至约15、25、50或100 μM)的浓度存在于主混合物中。在一些实施方案中，染料均匀剂可以附着于(例如，共价和/或非共价)珠的一部分。在一些实施方案中，珠可以包含约300 pM、1 nM或3 nM至约300 μM或3 mM范围内的量的染料均匀剂。

例如，寡核苷酸(寡聚物)例如任选地包含生物素(例如，在3'端包含生物素)的不可延伸的寡聚物(NE寡聚物)可以在主混合物加入期间改变(例如，减少)染料(例如SYBR)结合。在一些实施方案中，染料均匀剂可以包含ssDNA分子，所述ssDNA分子具有3'附着通过六碳链连接的生物素，但其它修饰和/或接头(例如C1-C20烃链，例如C1-C20烷基支链或非支链)也可以起作用。在一些实施方案中，不可延伸的寡聚物可以用作染料均匀剂，因为它比能够形成二聚体的另外的引物更不可能负面影响PCR。如在图22中所示，可以看出，与单独的SYBR (CV 4.8%)相比，向含有SYBR Green I的主混合物中加入NE寡聚物减少平均初始珠荧光的变化(CV 0.7%)。由于SYBR吸收(并因此PCR反应中SYBR的浓度)的变化可以修改目标扩增和荧光信号，阵列之间的SYBR吸收的变化导致阳性反应数量(即，数字PCR信号)变化。在图23中，在芯片的通道中的5个子阵列之间比较支原体目标序列的每个珠的目标分子的平均数，所述芯片在主混合物中具有单独的SYBR (CV 23%)或具有SYBR加上NE寡聚物(CV4%)。减少的变化可以导致更准确地确定每个珠的平均分子，并因此更准确地测定支原体的浓度。另外，控制跨整个阵列的嵌入染料浓度可以潜在地导致dsDNA熔融温度的较小变化，并因此可以使得能够更准确地确定扩增子熔点。

在一些实施方案中，来自编码染料的荧光信号可能受嵌入染料的浓度的影响，并且当珠对染料吸收存在大的差异时，可能变得难以解码阵列(例如，在编码分析期间将珠分配为簇)。在图24中，在主混合物中具有单独的SYBR的样品显示在不同的子阵列之间的编码染料荧光通道中观察到的荧光信号的位移(CV 14%)。当在溶液中加入不可延伸的寡聚物时，表观编码染料荧光信号的变化较小(CV 5%)。

作为另外一种选择或除此之外，在用主混合物负载阵列期间染料吸收的差异可以通过其它手段解决。例如，在一些实施方案中，在将珠负载到微孔阵列中之前，可以将珠浸泡在含有嵌入染料的缓冲液中。可以在与样品孵育之前、期间和/或之后浸泡珠。作为另外一种选择或除此之外，可以将珠的表面官能化以改变染料的吸收。例如，当更多的引物结合到珠的表面时，与结合较少引物时相比，染料的吸光度增加。可以使用部分双链寡核苷酸(pdsDNA)，其任选地通过可以从IDT获得的生物素-TEG连接化学连接到珠，因为dsDNA比ssDNA更强地与嵌入染料相关联。在一些实施方案中，在测定前，将具有pdsDNA寡聚物的珠浸泡在含有嵌入染料的缓冲液中。然后将珠与样品在杂交缓冲液中孵育，洗涤，并负载到微孔阵列中。在一些实施方案中，在将反应孔彼此密封之前，可以将含有PCR所需的所有试剂(除了引物和嵌入染料以外)和任选地包括染料均匀剂的主混合物引入微孔阵列的通道中，任选地用不混溶密封油。pdsDNA的实例示于图25。

图25显示得自IDT的5'生物素TEG连接(顶部)。显示部分双链DNA引物的实例(底部)。所示的DNA引物具有序列为SEQ ID NO:1的第一链；和序列为SEQ ID NO:2的第二链。

可以优化可以用于改变染料吸收的pdsDNA的熔点，使得在存储和/或杂交条件下，pdsDNA可以保持部分双链；然而，在PCR期间，pdsDNA可以解离，以产生具有低背景荧光的ssDNA引物，因为它与嵌入染料的关联不是那么强。在一些实施方案中，将引物附着于生物素官能团的接头(例如，碳链，任选地C1-C20烃)可以被修饰以调节其疏水性和/或离子电荷，并因此调节其对染料或其它试剂的吸收特性。

在一些实施方案中，本发明的装置10可以使用保持多个微芯片10或装置的保持器900来制造，任选地在网格900g中配置，如在图21中所示。保持器900可以包含封闭网格900g的外周910，并且可以在相邻的装置10的侧面和端之间限定横向和纵向绝热阻挡区域920、930。主混合物端口18可以跨阻挡片段930彼此面对地存在。输入端口16可以面向保持器900的外周910存在。在一些实施方案中，保持器900由绝热材料制成，并且芯片10可以包含导热基材。网格900g中的每一个较小的微阵列芯片/装置10可以独立地热循环。网格900g中的微阵列芯片/装置10的热循环和/或成像可以由测试系统200同步，使得每个微阵列芯片/装置10以所限定的序列成像。

在一些实施方案中，本发明的装置10可以由是绝热体的基材(例如塑料)制造，并且任选地，相同基材的不同的区域、面积或位置可以按所限定的序列热循环和/或成像。

本发明的装置10可以与市售可得的自动化的样品制备(例如移液机器人和/或珠洗涤机器人，例如Tecan、Hamilton、Beckman或其它自动化系统)一起使用，或者其可以使用定制的和专用的读取器设备或平台来操作。本发明所使用的读取器可以包括适合于高体积体外测试的大格式设计、适合于临床实验室或医师办公室的台式格式、针对生产场地或消费者或法医测试而优化的手持式格式、或者并入到其它系统中的格式。

可以使用的光学系统220 (图8)包括但不局限于双光或多光成像系统，其中装置10的整个阵列部分(或其大部分)可以以低分辨率成像，并且微孔的子组20的所选的子组的较小部分以高分辨率成像，或者允许视场快速变化的透镜系统，例如变焦透镜。或者，可以使用其它检测系统，包括电化学、吸收和/或化学发光检测。

本发明的装置和/或方法可以用于免疫PCR、逆转录酶PCR、紧凑阵列中的蛋白质单重反应(蛋白质-SiRCA)，以及PCR或核酸扩增的许多其它变体。可以使用检测扩增子的不同的手段，例如分子信标或水解探针(例如TaqMan探针)，或本领域技术人员已知的任何这样的手段。用于确定每个珠的身份的解码图像可以在热循环图像之前、期间和/或之后获取。

根据一些实施方案，可以进行用于获得高分辨率实时PCR数据的方法，同时降低紧凑阵列(SiRCA)中单重反应中光漂白对测定信号的影响。本发明的装置10可以包含两个或更多个流体通道15，每个通道具有微孔20的组，任选地用于一个或多个样品，并且阵列10可以使用微孔20的组的子组成像。不同组的微孔20的子组可以按顺序成像，其中在每个扩增循环之后使一个片段成像。对于每个图像，可以计算每个样品的每种类型的反应的平均信号。通过对每个扩增循环绘制来自每个反应类型的平均信号，可以用单循环分辨率确定每个反应类型的循环阈值，而不需要在每个PCR循环之后使整个阵列成像的时间。例如，具有通道15的14 mm长×1.25 mm宽的流体装置10可以分成五个(行)片段A、B、C、D和E。在PCR的循环1之后，片段A成像。在PCR循环2之后，片段B成像，等等。在30个PCR循环之后，每行/片段可以成像六次。尽管对于每个PCR循环可以/将获得来自每种珠类型的信号，但是每行/片段(并因此每个反应)将仅接收1/5剂量的用于记录荧光数据的激发能量。因此，该方法降低光漂白的影响，同时保持信号循环实时PCR分辨率。另外，通过将相应样品流体通道15中的微孔20的组窄至一维，具有微孔20的相应子组的两个或更多个通道15可以足够接近地放置，使得它们可以快速成像(例如，一个框可以含有多于一个阵列)，促进以单循环分辨率收集多个样品的实时PCR数据的能力，具有合理的成像时间。

本发明的方法可以应用于编码的反应的任何阵列，使得可以确定反应的身份，通常是实时的。

在一些实施方案中，本发明的装置可以用于代替任何多重化的PCR或免疫测定面板。本发明的实施方案的应用包括但不局限于生物医学或生物学研究、通过核酸或蛋白质生物标志物诊断疾病(包括传染病和/或肿瘤学)、兽医应用、法医分析或基因分型、环境监测、伪造品检测和/或生物制药生产或质量控制应用。

图8是实例分析系统200的示意性说明。系统200可以包括与光学系统220连通的至少一个控制器210 (通常包含至少一个处理器)，所述光学系统220包括电子信号检测器222，例如包含相机或其它成像装置或其它信号检测装置的光学检测器。系统200还可以包括外壳200h、用于在测定循环期间向一个或多个流体装置10施加热的热源240。

光学系统220可以任选地包括激发源225和一个或多个滤波器，所述滤波器可以包含不同的滤波器(或滤波器组) F

系统200还可以包括信号分析模块260。信号分析模块260可以分析来自不同组的微孔的测定信号数据。

系统200可以获得限定阈值循环或循环阈值“Ct”的模拟信号，当荧光信号大于阈值时，所述阈值循环或循环阈值“Ct”将目标物质和/或分子类型的PCR反应鉴定为阳性，或者当荧光信号没有上升到阈值以上时，将目标物质和/或分子类型的PCR反应鉴定为阴性。也就是说，Ct是其中Si>>Bs的循环，其中>>是比Bs大至少5-10 %，任选地是Bs的两倍，并且其中Si是荧光信号强度，并且Bs是背景荧光信号。可以将未知浓度的样品的Ct与已知浓度的样品的Ct相比较，以计算初始目标浓度。

控制器210可以与配置成在不同的测定循环期间选择不同组的微孔的子阵列选择模块250 (即，包含计算机程序代码)连通。模块250和/或260可以全部或部分地在控制器和/或光学系统220上或远离所述控制器和/或光学系统。分析系统200可以包括至少一个处理器(即，数字信号处理器)并且可以包括收发器214。

子阵列选择模块250可以配置成鉴定两个、三个、四个、五个或更多个相邻的流体样品通道中的(对准的)微孔的子组以提供位置数据，任选地，所鉴定的子组包含两个或更多个相邻的流体通道中的微孔的邻近组(即，角组)。模块250可以使用具有已知间距尺寸和阵列配置的信息来限定其它微孔组20的位置。作为另外一种选择或除此之外，在装置10的一个或多个位置处的对准标记27 (图1)可以用于该位置数据。

模块250或260可以在分析系统200上或分布在一个或多个服务器300中。服务器300可以体现为独立服务器或者可以被包含作为其它计算基础设施的一部分。服务器300可以体现为一个或多个企业、应用、个人、普及和/或嵌入式计算机系统，其可以是独立的或通过包括因特网的公共和/或私人的、真实和/或虚拟的、有线和/或无线的网络互连，并且可以包括各种类型的有形、非暂时性计算机可读介质。服务器300还可以经由有线或无线连接与网络连通，并且可以包括各种类型的有形非暂时性计算机可读介质。

在使用时，可以使用云计算来提供服务器300，所述云计算包括经由计算机网络按需提供计算资源。资源可以体现为各种基础设施服务(例如，计算、存储等)以及应用、数据库、文件服务、邮件等。在传统的计算模型中，数据和软件两者通常完全包含在用户的计算机上；在云计算中，用户的计算机可以含有很少的软件或数据(可能是操作系统和/或网络浏览器)，并且可以仅仅用作用于在外部计算机网络上发生的过程的显示终端。云计算服务(或多个云资源的聚集)通常可以称为“云”。云存储可以包括联网计算机数据存储的模型，其中将数据存储在多个虚拟服务器上，而不是被托管在一个或多个专用服务器上。

控制器210可以经由收发器214和/或计算机网络或蜂窝网络与服务器410或计算机连通。对于计算机网络，这可以包含局域网(LAN)、广域网(WAN)中的一个或多个，并且可以包括私人内联网和/或公共因特网(也称为万维网或“网络”或“因特网”)。

如在图18中说明的，本发明的实施方案可以配置为数据处理系统1116，其可以包括(一个或多个)处理器500、存储器536和输入/输出回路546。一个或多个处理器500可以是图像处理回路500c的一部分。数据处理系统可以被并入例如个人计算机、数据库、工作站W、服务器、路由器等中的一个或多个中。系统1116可以位于一个机器上或者分布在多个机器上。处理器500经由地址/数据总线548与存储器536连通，并且经由地址/数据总线549与输入/输出回路546连通。输入/输出回路546可以用于在存储器(存储器和/或存储介质) 536和另一个计算机系统或使用例如因特网协议(IP)连接的网络之间传输信息。这些组件可以是常规组件，例如在许多常规数据处理系统中使用的那些组件，其可以配置成如本文所述来操作。

特别地，处理器500 (其可以被并入控制器210中，图8)可以是市售可得的或定制的微处理器、微控制器、数字信号处理器等。存储器536可以包括任何存储器装置和/或存储介质，其含有用于实现根据本发明的实施方案使用的功能回路或模块的软件和数据。存储器536可以包括但不局限于以下类型的装置：ROM、PROM、EPROM、EEPROM、闪存、SRAM、DRAM和磁盘。在本发明的一些实施方案中，存储器536可以是内容可寻址存储器(CAM)。

如在图18中进一步说明的，存储器(和/或存储介质) 536可以包括在数据处理系统中使用的若干种类的软件和数据：操作系统552；应用程序554；输入/输出装置驱动器558；和数据556。如本领域技术人员将理解的，操作系统552可以是适于与数据处理系统一起使用的任何操作系统，例如IBM®、OS/2®、AIX®或zOS®操作系统，或Microsoft®Windows®95、Windows98、Windows2000或WindowsXP操作系统、Unix或Linux

数据556可以包括(存档或存储的)数字图像数据集522。如在图18中进一步说明的，根据本发明的一些实施方案，应用程序554包括微孔子组选择模块250和信号分析模块260。应用程序554可以位于本地服务器(或处理器)和/或数据库或远程服务器(或处理器)和/或数据库中，或者本地和远程数据库和/或服务器的组合中。

尽管参考图18中的应用程序554以及模块250和260说明本发明，但是本领域的技术人员将理解，其它配置也落入本发明的范围内。例如，这些回路和模块也可以被并入操作系统552或数据处理系统的其它这样的逻辑划分中，而不是作为应用程序554。此外，虽然应用程序或模块250、260在单个数据处理系统中说明，但是本领域技术人员将理解，这样的功能可以例如以上述类型的客户端/服务器布置跨一个或多个数据处理系统分布。因此，本发明不应解释为局限于在图18中说明的配置，而是可以由数据处理系统之间的功能的其它布置和/或划分来提供。例如，尽管图18说明为具有各种回路和模块，但是这些回路或模块中的一个或多个可以被组合或分离，而不脱离本发明的范围。

为了开发方便，可以用高级编程语言(Python、Java、AJAX (AsynchronousJavaScript)、C和/或C++)来编写用于进行本文讨论的数据处理系统、方法步骤或动作、模块或回路(或其部分)的操作的计算机程序代码。此外，用于进行示例性实施方案的操作的计算机程序代码也可以用其它编程语言来编写，例如但不局限于解释语言。一些模块或例程可以用汇编语言或甚至微代码来编写，以增强性能和/或存储器使用。一些模块或例程也可以用脚本语言编写，包括开放源脚本语言。然而，实施方案不局限于特定编程语言。如上所述，任何或所有程序模块的功能也可以使用离散的硬件组件、一个或多个专用集成电路(ASIC)或编程的数字信号处理器或微控制器来实现。程序代码可以完全在一个(例如工作站)计算机上执行，部分在一个计算机上执行，作为独立软件包执行，部分在工作站的计算机上执行，以及部分在另一台本地和/或远程计算机上执行，或者完全在另一台本地或远程计算机上执行。在后一种情况下，另一台本地或远程计算机可以通过局域网(LAN)或广域网(WAN)连接到用户的计算机，或者可以连接到外部计算机(例如，通过使用因特网服务供应商的因特网)。

部分地参考根据本发明的实施方案的方法、设备(系统)和计算机程序产品的流程图说明和/或框图来描述本发明。将理解，流程图说明和/或框图的每个框以及流程图说明和/或框图中的框的组合可以由计算机程序指令实现。可以将这些计算机程序指令提供给通用计算机、专用计算机或其它可编程数据处理设备的处理器以产生机器，使得经由计算机或其它可编程数据处理设备的处理器执行的指令创建用于实现流程图和/或框图的一个或多个框中指定的功能/动作的装置。

这些计算机程序指令还可以存储在计算机可读存储器中，其可以引导计算机或其它可编程数据处理设备以特定方式运行，使得存储在计算机可读存储器中的指令产生包括实现流程图和/或框图的一个或多个框中指定的功能/动作的指令手段的制品。

计算机程序指令还可以负载到计算机或其它可编程数据处理设备上，以在计算机或其它可编程设备上引起一系列操作步骤，以产生计算机实现的过程，使得在计算机或其它可编程设备上执行的指令提供用于实现流程图和/或框图的一个或多个框中指定的功能/动作中的一些或全部的步骤。

本文的某些附图的流程图和框图说明本发明的实施方案的可能实现的示例性架构、功能和操作。在这点上，流程图或框图中的每一个框代表代码的模块、片段或部分，其包含用于实现指定的一个或多个逻辑功能的一个或多个可执行指令。还应当注意，在一些备选实现中，框中所标注的功能可以不按图中所标注的顺序发生。例如，连续显示的两个框实际上可以基本上同时执行，或者这些框有时可以以相反的顺序执行，或者两个或更多个框可以组合，这取决于所涉及的功能。

特别地，控制器210 (图8)和/或处理器500 (图18)可以包括任何市售可得的或定制的微处理器、微控制器、数字信号处理器等。存储器可以包括任何存储装置和/或存储介质，其含有用于实现根据本发明的实施方案使用的功能回路或模块的软件和数据。存储器可以包括但不局限于以下类型的装置：ROM、PROM、EPROM、EEPROM、闪存、SRAM、DRAM和磁盘。在本发明的一些实施方案中，存储器可以是内容可寻址存储器(CAM)。

以上说明本发明，而不应解释为对本发明的限制。本发明由所附权利要求限定，权利要求的等同物包括在其中。本文引用的所有出版物、专利申请、专利、专利出版物和其它参考文献都通过引用以其整体并入本文，用于与其中呈现参考文献的句子和/或段落相关的教导。