检测新型冠状病毒S蛋白独特性抗体的多肽-ELISA试剂盒

摘要

本发明公开了一种检测新型冠状病毒表面棘突蛋白S独有特异性抗体的多肽‑酶联免疫吸附试剂盒。本发明试剂盒包含包被SARS‑CoV2表面棘突蛋白S独有特异性优势线性B细胞抗原多肽的酶标板、样品稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、辣根过氧化物酶标记的抗体、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液。本发明试剂盒特异性高、重复性好，能够简单方便地用于新型冠状病毒独特性抗体的检测，减少假阳性，能用于大规模血清学检测和流行病学调查，评估新型冠状病毒的感染情况。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别地，涉及一种用于检测新型冠状病毒(SARS-CoV2)表面棘突蛋白S独有特异性抗体的多肽-酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒。

背景技术

冠状病毒是一类具有囊膜基因组为线性单股正链RNA病毒，新型冠状病毒SARS-CoV2是第7种已知可感染人并引发相关疾病的冠状病毒，目前正呈全球大流行态势。前6种可引发人类疾病的冠状病毒包括HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV，其中前4种主要在全球范围内引起局部流行性轻度自限性疾病，占成人上呼吸道感染的10％到30％，而后两种可引发重症呼吸综合征，致死率分别为10％和36％。冠状病毒表面棘突蛋白(spike protein，S)与病毒的感染能力相关，是最重要的表面结构蛋白。S蛋白包含S1和S2两个功能性亚基，S1包含受体结合区域(RBD)，负责识别和结合细胞受体，S2含有膜融合过程所需的基本元件，负责将S蛋白锚定在病毒膜上并介导病毒膜与宿主细胞膜的融合。因此S蛋白是介导冠状病毒进入宿主细胞的主要蛋白，也是感染后引起宿主免疫系统产生抗体包括中和性抗体的主要靶标。

新型冠状病毒SARS-CoV2表面棘突蛋白S(含1273个氨基酸)以三聚体形式位于病毒颗粒表面，包含诱导产生特异性抗体的线性和空间构象性B细胞抗原决定簇位点/抗原表位。线性B细胞抗原决定簇由连续的氨基酸序列组成，可以与由完整抗原诱导产生的特异性抗体发生结合作用，因此可以利用这些抗原表位来捕获特异性抗体实现检测目的。序列对比显示SARS-CoV2表面棘突蛋白S与上述其它6种冠状病毒表面棘突蛋白S分别具有30％到76％的同一性和46％到86％的相似性，故而利用S蛋白或其亚单位例如受体结合区(RBD)作为捕获抗原进行血清学抗体检测存在交叉免疫反应可能而影响其特异性。例如，在同源性最相近的SARS-CoV2与SARS-CoV之间，S蛋白或RBD所诱导产生抗体的交叉免疫反应已被证实。而且对于B细胞抗原决定簇或T细胞抗原决定簇的预测分析也表明，绝大多数抗原决定簇在SARS-CoV2与SARS-CoV之间重叠或相似。因此，确定SARS-CoV2独有的特异性B细胞抗原决定簇并建立相应的抗体检测方法及试剂盒以排除其它冠状病毒感染诱导产生抗体的干扰，具有重要的现实意义，即将新冠肺炎病毒抗体和其他冠状病毒抗体区分开来。这种多肽-ELISA方法及试剂盒可用于恢复期(包括隐性感染病例)及常规人群血清学筛查以确认新型冠状病毒独特性抗体存在与否及相应水平，将为SARS-CoV2血清抗体流行病学调查提供有效手段，有助于当前正在广泛蔓延的新冠疫情的调查及防控。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种检测新型冠状病毒表面棘突蛋白S独有特异性抗体的多肽-酶联免疫吸附试剂盒。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种检测新型冠状病毒表面棘突蛋白S独有特异性抗体的多肽-酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒，包含包被SARS-CoV2表面棘突蛋白S独有特异性优势线性B细胞抗原多肽的酶标板、样品稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、辣根过氧化物酶标记的抗体、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液。其主要技术方案如下：人工合成SARS-CoV2表面棘突蛋白S中包含优势线性B细胞抗原决定簇位点的四段独有特异性多肽序列SQCVNLTTRTQLPPAYTNSFT、HVSGTNGTKRFD、LGVYYHKNNKSWMESEFRVYSS、ALHRSYLTPGDSSSGWTAG，用包被缓冲液将多肽稀释至10微克/毫升；每种多肽溶液各取1毫升，混匀后以100微升/孔的量包被于96孔酶标板中，4℃反应过夜后洗板3次；每孔加入200微升含有质量浓度1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液进行封闭，37℃孵育1小时后洗板3次，晾干后备用。

该板与待测血清样品37℃孵育1小时，可以结合血清样品中的特异性抗体。同时设立阴性对照孔、阳性对照孔和空白孔。洗涤3次后，加入稀释5000倍的HRP酶标抗体，每孔100微升，37℃孵育30分钟后洗板3次，加入酶底物邻苯二胺(OPD)显色，轻拍混匀后37℃孵育10分钟。每孔加入终止液50微升，震荡10秒混匀，用酶标仪测定450纳米的吸光度值。以P/N比值法判定结果，样品吸光度值/阴性对照吸光度值≥2.1为阳性，否则为阴性。

本发明提供的检测新型冠状病毒表面棘突蛋白S独有特异性抗体的多肽-ELISA试剂盒，可用于检测新型冠状病毒特异性抗体。

本发明提供的检测新型冠状病毒表面棘突蛋白S独有特异性抗体的多肽-ELISA试剂盒，可用于评估新型冠状病毒感染情况，应用于血清学和流行病学研究等。

本发明的有益效果是，本发明可用于检测新型冠状病毒特异性抗体，评估新型冠状病毒感染情况。本发明使用人工合成方法制备包含SARS-CoV2表面棘突蛋白S独有特异性优势线性B细胞抗原决定簇位点的多肽，纯度高，特异性好，直接瞄准相应抗体，避免其他物质引起的非特异性反应，减少假阳性，提高检测准确性；具有灵敏度高，成本低，操作简便，速度快、特异性强等优点，能被基层单位广泛使用。

附图说明

图1为本发明试剂盒制备工艺流程图；

图2为新型冠状病毒SARS-CoV2表面棘突蛋白S1A区线性抗原表位的预测结果图(箭头所指处为4个独特位点)；

图3为本发明试剂盒检测血清中新型冠状病毒SARS-CoV2表面棘突蛋白S特异性抗体的多肽-ELISA结果图。

具体实施方式

如附图1所示，本发明检测新型冠状病毒表面棘突蛋白S独有特异性抗体的多肽-ELISA试剂盒通过以下方法制备得到：

(1)根据线性B细胞抗原决定簇抗原性强、表面性好、亲水性强的特点，使用生物信息学软件分析新型冠状病毒表面棘突蛋白S的氨基酸序列，预测并确定其中的优势线性B细胞抗原决定簇位点(见附图2)；然后将新型冠状病毒SARS-CoV2与其它6种已知可感染人并引发相关疾病的冠状病毒尤其是与其同源性最相近的SARS-CoV的表面棘突蛋白S氨基酸序列进行比对，明确其优势线性B细胞抗原表位的独有特异性。

(2)人工合成新型冠状病毒表面棘突蛋白S中的四段包含优势线性B细胞抗原决定簇位点的独有特异性多肽序列(SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4)SQCVNLTTRTQLPPAYTNSFT、HVSGTNGTKRFD、LGVYYHKNNKSWMESEFRVYSS、ALHRSYLTPGDSSSGWTAG，并鉴定纯度。将各多肽分别稀释到10微克/毫升，以100微升/孔的量作为捕获抗原包被于96孔酶标板中，与临床感染SARS-CoV2患者的恢复期血清反应，并以正常人血清为对照，验证并确定各多肽片段的抗原性/免疫原性和特异性。

(3)将以上合成多肽作为捕获抗原，用包被缓冲液分别稀释到10微克/毫升，各取1毫升多肽溶液进行混合，混匀后以100微升/孔的量包被于96孔酶标板中，4℃过夜后洗板3次。每孔加入200微升含有质量浓度1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液进行封闭，37℃孵育1小时后洗板3次，晾干，用密封袋封装酶标板，4℃保存，即为预先包被好抗原的酶标板。

(4)本试剂盒中所含阴性对照血清为正常血清样本，阳性对照血清为明确感染该病毒的患者血清样本，并已通过实验验证。

(5)本试剂盒涉及的其他试剂配制方法如下：

包被缓冲液(0.05摩尔/升碳酸盐缓冲液，pH 9.6)：1000毫升蒸馏水中加入1.59克碳酸钠(Na

磷酸盐缓冲液(0.01摩尔/升PBS，pH 7.4)：1000毫升蒸馏水中加入8.0克氯化钠(NaCl)，0.2克磷酸二氢钾(KH

封闭液：100毫升PBS洗液中加入1克牛血清白蛋白，溶解混匀。

样品稀释液：PBS中加入牛血清白蛋白和吐温-20，至牛血清白蛋白的质量浓度为1％，吐温-20的体积浓度为0.1％，pH7.4。

辣根过氧化物酶标记的抗体：HRP标记的抗体，市售，用样品稀释液稀释5000倍使用。

浓缩洗涤液：含有体积浓度1％吐温-20，pH7.4的PBS，洗涤时用PBS稀释10倍使用。

酶底物A溶液：5.1克柠檬酸(C

酶底物B溶液：30％(体积浓度)双氧水(H

酶底物C溶液：邻苯二胺(OPD)粉末1克。

终止液：2摩尔/升的硫酸溶液，取108.7毫升体积浓度为98％浓硫酸加入891.3毫升中，混匀冷却。

(6)使用本发明试剂盒检测样本的具体方法如下：

取出试剂盒中已经包被了新型冠状病毒表面棘突蛋白S独有特异性优势线性B细胞抗原多肽的酶标板。用样品稀释液将各血清样品稀释100倍，加入预先制备好的酶标板孔中，每孔100微升，同时设立阴性对照孔、阳性对照孔和空白孔，37℃孵育1小时，洗涤液洗板3次。将酶标抗体用样品稀释液稀释5000倍，加入孔中，每孔100微升，37℃孵育30分钟后洗板3次。配置OPD显色液，称取酶底物C 20毫克，溶于50毫升酶底物A中，加入20微升酶底物B，混匀后以每孔100微升加入酶标板各孔中，避光放置10分钟后以每孔50微升加入2摩尔/升硫酸终止反应，空白孔调零，用酶标仪测定450纳米处的吸光度值。使用P/N比值法判定结果，样品血清吸光度值/阴性对照吸光度值≥2.1为阳性，否则为阴性。鉴定结果举例如下：样品1为阴性，样品2为阳性(见附图3)。

以下实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

实施例1：新型冠状病毒表面棘突蛋白S中独特优势线性B细胞抗原表位的预测与确定

根据线性B细胞抗原决定簇抗原性强、表面性好、亲水性强的特点，使用生物信息学软件分析新型冠状病毒表面棘突蛋白S的氨基酸序列，预测并确定其中的优势线性B细胞抗原决定簇位点(图2)。使用生物信息学软件比对新型冠状病毒SARS-CoV2与其它6种已知可感染人并引发相关疾病的冠状病毒尤其是与其同源性最相近的SARS-CoV的表面棘突蛋白S的氨基酸序列，明确以上优势线性B细胞抗原表位的独有特异性。人工合成各多肽，然后将它们分别稀释到10微克/毫升，以100微升/孔的量作为捕获抗原包被于96孔酶标板中，与临床感染SARS-CoV2患者的恢复期血清反应，并以正常人血清为对照，验证并确定各多肽片段的抗原性/免疫原性和特异性。

实施例2：新型冠状病毒表面棘突蛋白S独特优势线性B胞抗原多肽的制备

人工合成包含新型冠状病毒表面棘突蛋白S中独特优势线性B细胞抗原决定簇位点的四段多肽(SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4)：SQCVNLTTRTQLPPAYTNSFT、HVSGTNGTKRFD、LGVYYHKNNKSWMESEFRVYSS、ALHRSYLTPGDSSSGWTAG，纯化后纯度为95％以上。

实施例3：使用该试剂盒检测样品中新型冠状病毒表面棘突蛋白S的特异性抗体

样品孵育：取出试剂盒中已经包被了SARS-CoV2表面棘突蛋白S独有特异性优势线性B细胞抗原多肽的酶标板。用样品稀释液将各样品稀释100倍，加入预先制备好的酶标板孔中，每孔100微升，同时设立阴性对照孔、阳性对照孔和空白孔，37℃孵育1小时，洗涤液洗板3次。

二抗孵育：将酶标抗体用样品稀释液稀释5000倍，加入孔中，每孔100微升，37℃孵育30分钟后洗板3次。

显色读数：配置OPD显色液，称取酶底物C 20毫克，溶于50毫升酶底物A中，加入20微升酶底物B，混匀后以每孔100微升加入酶标板各孔中，避光放置10分钟后以每孔50微升加入2摩尔/升硫酸终止反应，空白孔调零，用酶标仪测定450纳米处的吸光度值。

结果判定：P/N比值法，样品血清吸光度值/阴性对照吸光度值≥2.1为阳性，否则为阴性。例如附图3中ELISA结果：样品1为阴性，样品2为阳性。

序列表

<110> 杭州医学院

<120> 检测新型冠状病毒S蛋白独特性抗体的多肽-ELISA试剂盒

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Gln Cys Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr

1 5 10 15

Thr Asn Ser Phe Thr

20

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp

1 5 10

<210> 3

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Leu Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu

1 5 10 15

Phe Arg Val Tyr Ser Ser

20

<210> 4

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp

1 5 10 15

Thr Ala Gly