由白介素-2突变蛋白和I型干扰素构成的融合蛋白

摘要

本发明描述了基于细胞因子的融合蛋白，称为双细胞因子(BC)，具体地通过IL2激动剂突变蛋白与I型干扰素(IFN)的结合而形成，由突变人IgG1的Fc区和连接肽连接。IL2激动剂突变蛋白和I型IFN在双细胞因子结构中的组合为这些分子提供了令人惊讶的免疫调节特性，并且提供了比亲代细胞因子或它们的组合优越的治疗效果，这使它们成为用于治疗癌症的有吸引力的新颖分子。还描述了包含本专利的融合蛋白标的作为活性成分的药物组合物。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和免疫肿瘤学领域，尤其涉及基于细胞因子的融合蛋白的开发。特别地，本发明描述了由I型干扰素(IFN)与白介素2 (IL2)激动剂突变蛋白结合而构成的融合蛋白。

背景技术

尽管在癌症免疫疗法领域中已进行了数十年与细胞因子使用有关的艰苦工作，但迄今为止所获得的结果仍是微不足道的。这些分子的高毒性和降低的半衰期以及受益患者的低百分比，使得有必要制定创新策略来增强其抗肿瘤特性，从而转化为癌症患者的更高生活质量和更长寿命。破坏细胞因子的治疗功效的机制中包括调节性T细胞的诱导，其抑制肿瘤微环境中细胞毒性CD8+ T细胞的应答(Ovens和Naugler (2012) TheoreticalBiology and Medical Modeling, 9: 44)。

传统上，通过可溶分子的共同施用或融合蛋白(通常称为融合因子(fusokine))的产生，组合一直是旨在优化细胞因子在癌症治疗中的治疗用途的策略之一。与融合蛋白的使用相关的优点不仅包括其生产的可行性，而且还包括在具有不同药理特性的分子之间建立化学计量关系的可能性。另外，已经表明，与独立施用亲代细胞因子相比，甚至当与它们的组合相比时，一些融合因子具有优越的治疗效果(Stagg J.等(2004) Cancer Research,64: 8795-8799；Acres B. (2005) Cancer Research, 65: 9536-9546)；US 2011/0150828。最近在融合因子的研究中描述的一种治疗策略是肿瘤内施用编码基于1型IFN和TGFβ受体胞外域的融合蛋白的mRNA，其显示抗肿瘤作用。mRNA的肿瘤内转移技术是一种非常适合临床情况的高度灵活、可重现、简单且适应性强的治疗工具(Van der Jeught等(2015), OncoImmunology, 4: 5)。

与抗肿瘤治疗相关的两种细胞因子是1型干扰素IFNα和IL2，它们是癌症治疗中所需的T辅助1应答模式的有效诱导剂。先前已描述了IFNα对恶性细胞的直接抗肿瘤作用。它与细胞生长抑制、抗增殖作用以及细胞外基质蛋白酶水平的降低相关，所述细胞外基质蛋白酶参与侵袭和转移过程并与疾病的预后较差有关。另一方面，该细胞因子促进抗原呈递细胞的成熟和迁移、αCD8树突状细胞中交叉呈递的诱导和淋巴细胞活化(Chikkala等(1990) Cancer Research, 50: 1176-1182)。已描述，由于抗原介导的活化，IFNα保护T细胞免受线粒体依赖性细胞凋亡的影响，从而以受调控的方式促进克隆扩增过程(Dondi等(2004)The Journal of Immunology, 173 (6): 3740-3747)。

另一方面，细胞因子IL2是一种自分泌因子，其促进抗原活化的T淋巴细胞的增殖。然而，其与调节性T淋巴细胞结合的亲和力高于与效应细胞结合的亲和力，从而诱导其增殖，因而在抗肿瘤作用中产生负面影响(Chaput等(2007).J Immunol, 179: 4969-4978)。改善该分子的治疗功效的策略之一是基于合理设计开发突变蛋白。在分子免疫学中心(Center of Molecular Immunology)产生的IL2激动剂突变蛋白就是这种情况，它不能与调节性T细胞中表达的高亲和力受体结合。IL2激动剂突变蛋白在下文中将被称为no alphaIL2 (US 9,206,243的SEQ ID NO 6)。由于其相对于野生型IL2的修饰，与调节性T淋巴细胞相比，no alpha IL2优先扩增NK和记忆CD8 T细胞的效应子群体。还已描述了该分子与野生型Il2相比对健康组织的较低毒性(Carmenate等(2013). of Immunology, 190: 6230-6238)。

IL2的另一种激动剂变体由体外进化(基因工程)产生。这种称为IL2的超级因子的变体(H9)对IL2受体的β链表现出增加的结合亲和力并刺激T淋巴细胞的强大增殖，而与IL2受体的CD25α链的表达无关。事实上，已证明，相对于IL2，所述变体能够诱导细胞毒性T淋巴细胞的扩增增加，体内抗肿瘤反应增强，调节性T细胞的有限扩增以及毒性降低(Levin等(2012) Nature, 48: 529-535)。下文将该变体称为H9。

若干研究表明，IL2和IFNα的组合施用在癌症治疗中具有协同作用。与独立使用的细胞因子相比，通过使用IFNα和IL2的组合，可显著提高BR55-2 MAb针对HT29结直肠癌细胞系诱导的刺激抗体依赖性细胞毒性的能力(Flieger等(2000) Cytokine, 12: 756-761)。在2010年，Konjevic等证实，从临床IV期转移性黑素瘤患者获取的外周血样本中，IL2和IFNα都可提高NK细胞的体外活性。IL2和IFNα这两种细胞因子都能够刺激NK细胞中NKG2D激活受体的表达，甚至在具有CD16高表达的NK细胞亚群中也是如此；两种细胞因子的NKG2D诱导都与NK细胞活性的诱导相关(Konjevic等(2010) Melanoma Research, 20: 459-67)。

在文献中，有一篇报道描述了融合蛋白的产生，该融合蛋白结合了两种细胞因子，即野生型IL2和人IFNα2b。在该分子中，IL2直接与IFNα2b连接，并且其抗肿瘤作用未与亲代细胞因子和它们的组合进行比较(He等(1999) J Leukoc Biol, 125: 77-82)，因此没有证据表明所述融合蛋白优于这些细胞因子。

考虑到上述先决条件，本申请的发明人生成了用于癌症治疗的几种称为双细胞因子(BC)的双功能融合蛋白。获得了两种将I型IFN与IL2激动剂结合的双功能分子，用于治疗癌症。为了获得它们，起点是两个突变蛋白的融合：no alpha IL-2或H9，和IFNα。所提出的这些BC (下文分别称为BC2和BC3)的设计由两种细胞因子通过免疫球蛋白的Fc区连接组成，所述Fc区与Fcγ受体的结合有限。能够结合新生儿Fc受体的这种Fc区的存在可延长半衰期。这些组合和设计构成了这类蛋白质的开发中的新要素。所得分子具有免疫调节作用以及令人惊讶的体内抗肿瘤特性，其优于以等摩尔量施用每个亲代细胞因子(与相同的Fc区融合)以及甚至这些亲代细胞因子的组合后所观测到的体内抗肿瘤特性。

发明内容

在一个实施方案中，本发明的主题是包含通过接头与I型IFN连接的IL2突变蛋白的融合蛋白。特别地，作为本发明的融合蛋白的一部分的IL2突变蛋白的序列描述于SEQ IDNO 1和2。作为所述融合蛋白的结构的一部分的IFN是IFNα (SEQ ID NO 3)。

在一个特定的实施方案中，本发明的融合蛋白的特征在于所述接头由突变人IgG1的Fc区和连接肽组成，并且其序列以SEQ ID NO 5示出。

另外，本发明中描述的融合蛋白的序列以SEQ ID NO 6和7示出，并且编码它们的核酸序列分别以SEQ ID NO 10和11示出。

在另一个实施方案中，本发明涉及药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的以SEQ ID NO 6和7描述的融合蛋白以及药学上可接受的载体。

在另一个实施方案中，本发明的主题是本文描述的融合蛋白在癌症治疗中的用途；包括编码所述融合蛋白的核酸分子的肿瘤内注射方法。

附图说明

图1. 序列：(A)人IFNα2b，(B)接头片段。

图2. H9的序列。

图3. 通过ELISA评估BC2m和单一对照在HEK293T细胞中的瞬时表达。

图4. 通过蛋白质印迹法利用以下对BC2m和单一对照进行免疫识别：(A)对IFNα具特异性的抗体，(B)对IL2具特异性的抗体。

图5. (A) BC2m和IFNα-Fc对照的IFNα样活性，如通过在用转染的HEK293T细胞的上清液处理的MB16F10肿瘤细胞中由MHCI表达的诱导测试所测量，(B) BC2m和单一对照Fc-no alpha IL2的IL2样活性，如通过用转染的HEK293T细胞的上清液处理的原生小鼠脾细胞的培养物中T CD8+淋巴细胞的扩增测试所测量。

图6. 通过ELISA检测转导的4T1肿瘤细胞上清液中的BC2m和单一对照：(A)对Fc区具特异性，(B)对Fc和IL2区具特异性，(C)对Fc和IFNα区具特异性。

图7. 在实验的第25天和第27天，通过使用转导的4T1肿瘤细胞来评估BC2m的抗肿瘤作用。

图8. 在实验的第17天，在肿瘤内注射BC2m的4T1模型中评估治疗效果。

通过以下实施例和附图进一步阐述本发明。然而，这些实施例不应解释为限制本发明的范围。

具体实施方式

BC的设计

设计本发明的融合蛋白时要考虑到它们预期的病理情况。BC2是通过no alpha IL-2突变蛋白与人IFNα的融合形成，no alpha IL-2突变蛋白的序列以SEQ ID NO. 1示出(先前公开于US 9,206,243 B2的SEQ ID No. 6)，并且人IFNα的序列示于图1A以及本发明的SEQID. NO 3。具有L234A L235A突变的突变人IgG1的Fc区(与参与免疫应答的受体的活化能力有限相关) (Hezareh等(2001) J Virol., 75 (24): 12161-12168)与连接肽(Gly

BC3是通过人IFNα与前述H9突变蛋白的融合而形成，人IFNα的序列示于图1A以及SEQ ID. NO 3，并且前述H9突变蛋白的序列示于SEQ ID NO. 2以及图2。接头元件由具有突变L234A L235A并且参与免疫应答的受体的激活能力有限的人IgG1的Fc区和接头肽(Gly

药物组合物

可发现本发明的BC标的为活性成分，因此构成适合的不同药物组合物的一部分，以及药学上可接受的载体。所述药物组合物中活性成分的浓度在1 μg/ml至20 μg/ml的范围内，优选在5 μg/ml至10 μg/ml的范围内。

药学上可接受的载体包括但不限于：盐溶液、pH中性的磷酸盐缓冲盐水和类似制剂。适于施用于患者的其它缓冲剂、分散剂和无毒惰性物质可包括在本发明的组合物中。所述组合物可以是适于施用的溶液，并且通常是无菌的并且不含不希望的颗粒。

治疗用途和治疗方法

BC的新颖格式部分是由于在构成它们的细胞因子的接头元件中存在Fc区。该Fc区使其可通过蛋白A亲和色谱法纯化，从而可通过不同途径(皮下、静脉内、皮内、肌内、腹膜内)以可溶性蛋白的形式施用，并且还可增加这些药剂在循环中的半衰期，并因此提高它们的治疗效用。这允许使用较低的剂量，从而降低毒性。替代的施用途径是肿瘤内，与其它途径相比，肿瘤内施用的毒性较低。同样，与目前临床情况中使用的野生型IL2分子相比，存在noalpha IL2或H9与毒性降低相关。

另外，本发明中用于这些BC的施用策略可包括通过基于基因的治疗方法进行产品的肿瘤内注射，例如肿瘤内注射mRNA和编码它们的转导颗粒。对于表达BC2或BC3的肿瘤或浸润性肿瘤细胞的遗传修饰保证了它们在肿瘤微环境中的存在，这使其免疫调节作用以及对肿瘤本身的直接作用成为可能。肿瘤内注射编码治疗剂的核酸的多功能性和高再现性是治疗不同类型肿瘤的合适平台。

鉴于这些分子的免疫调节特性，除了以非特异性方式原位增强抗肿瘤反应外，在各种类型的癌症患者中，可考虑与靶向疗法的可能组合支持的特异性抗原免疫反应刺激作为未来的治疗方法。

以这种方式，前述BC旨在构成新的治疗前沿，其增强了目前用于癌症治疗的I型IFN和IL2个别细胞因子的药理作用。该作用与细胞毒性T细胞优于调节性T细胞的优先扩增相关，这导致更有效的抗肿瘤免疫应答，因此导致所治疗个体的肿瘤生长延迟和更大存活率。除此之外，与使用野生型细胞因子的疗法相比，所使用的IL2突变蛋白的较低毒性水平增加了成功的可能性。所有这些反应都可以转化为所治疗患者的更高预期寿命和生活质量。

实施例

实施例1. 设计和获得BC和细胞因子的单一对照。

为了在小鼠中模拟基于I型IFN和IL2激动剂的BC的免疫调节和抗肿瘤作用，产生了以SEQ ID NO 8描述的BC2m。这由通过以SEQ ID NO 12示出的接头片段与no alpha IL2突变蛋白(IL2激动剂的实施例，以SEQ ID NO 1描述)融合的I型IFN (鼠类IFNα4 (SEQ. IDNO 4))组成，所述接头片段由结合到肽连接子(Gly

将单一对照设计为包含与突变鼠类IgG1 (D265A)的Fc区融合的每个亲代细胞因子并保持每个细胞因子在BC2m结构中的相对位置的分子。因此，在单个IFNα对照中，该细胞因子结合至上述Fc区的Nt，而在no alpha IL2的单一对照中，该细胞因子位于上述Fc区的Ct处。因此，IFNα和no alpha IL2的单一对照是二聚且二价的分子。

将BC2m和单一对照IFNα-Fc和Fc-no alpha IL2基因克隆到pLV-CMV-IRES-Neo载体中，以便在高级细胞中进行瞬时表达测定。所得的遗传构建也用作转移载体，以获得用于肿瘤细胞系的遗传修饰的转导颗粒。通过使用脂质转染胺(lipofectamine)的瞬时转染检查所述基因在HEK293T细胞中的表达。通过对鼠类Fc区具特异性的ELISA对上清液中的不同重组分子进行定量。

BC2和BC3的生成

为了构建BC2和BC3的人BC，使用人IFNα (SEQ ID NO 3和图1A)以及激动剂突变蛋白noalpha IL2和H9 (分别描述于SEQ ID NO. 1和2)。具有L234A L235A突变和参与免疫应答的受体的激活能力有限的突变人IgG1的Fc区和接头肽(Gly

双功能蛋白BC2和BC3的最终设计分别示于SEQ ID NO. 6和7。将BC2和BC3的基因克隆到转移载体pLV-CMV-IRES-Neo中，以在高级细胞中稳定表达。这些基因的功能性通过在HEK293T细胞中用脂质转染胺进行瞬时表达测定来检查，为此，通过对人Fc区具特异性的ELISA来定量重组分子。

实施例2. BC2m被表达为完整的功能蛋白。

一旦获得了BC2m构建体和单一对照IFNα-Fc和Fc-no alpha IL2，就对HEK293T细胞进行瞬时转染测定，以评估设计这些分子的可行性。培养72小时后，除去上清液并进行对鼠类Fc区具特异性的ELISA。为此，用对鼠类IgG分子具特异性的抗体包被聚苯乙烯板，并与用含有BC2m基因的每种构建体和单一对照转染的细胞的上清液一起温育。最后，使用缀合至酶过氧化物酶的对鼠类IgG的Fc区具特异性的抗体进行检测。通过用鼠类IgG在标准曲线中内插在492nm处的吸光度值，计算重组蛋白的浓度。通过此测试，可检测三种目标蛋白的表达，并检查所设计格式的功能性(图3)。

类似地，通过进行对细胞因子IFNα和IL2具特异性的蛋白质印迹测定，检查了其在BC2m结构中的存在(图4A和图4B)。同样，已证实在非还原和还原条件下，BC2m表达为一种蛋白质，其电泳迁移分别对应于二聚体的理论大小120 kDa和单体的理论大小60 kDa。还在相应的单一对照IFNα-Fc和Fc-no alpha IL2中检查了这些细胞因子的鉴定，并且根据设计，检测到的电泳迁移与预期大小相对应(图4A和图4B)。

实施例3. BC2m保留了与细胞因子IFNα和IL2相对应的生物活性。

为了确定IFNα4和no alpha IL2突变蛋白的部分在BC2m和单一对照的结构中是否具有活性，对用相应基因构建体转染的HEK293T细胞上清液并使用等摩尔量的分子进行体外实验。未转染的HEK293T细胞的上清液用作阴性对照。在IFNα样活性的情况下，通过流式细胞术评估在24小时内用所述上清液处理的MB16F10黑素瘤细胞表面上的MHCI表达的增加。与使用阴性对照获得的结果相反，含有BC2m或IFNα-Fc对照的上清液能够刺激MHCI在治疗的肿瘤细胞中的表达，这表明IFNα的活性功能被保留在BC2的结构中(图5A)。

为了确定在BC2m和Fc-no alpha IL2对照中存在的no alpha IL2是否表现出生物活性，用来自原生小鼠的脾细胞培养物进行CD8+淋巴细胞增殖刺激测定。用CFSE试剂标记来自C57BL/6小鼠的脾细胞，并在含有BC2m或Fc-no alpha IL2对照的转染HEK293T细胞上清液存在下培养72小时。实验结束时，分析CD8+ T淋巴细胞增殖的百分比。作为阴性对照，使用与未转染HEK293T细胞的上清液一起温育的脾细胞，并通过分别将用BC2m或Fc-noalpha IL2处理的脾细胞的增殖CD8+ T细胞的百分比除以对应于阴性对照的值来计算CD8+T淋巴细胞的增殖比率(Pr)。

在图5B中，含有BC2和Fc-no alpha IL2的上清液能够诱导脾细胞增殖，分别是阴性对照的4倍和5倍。这些结果证实所述融合蛋白的结构中所含的no alpha IL2部分保留了其生物学特性。

实施例4. BC2m由通过慢病毒转导进行基因修饰的4T1肿瘤细胞分泌。

为了评估BC2m在体内的抗肿瘤活性，使用4T1乳腺癌作为模型，选择了转导的肿瘤细胞的方法。用编码BC2m和单一对照的慢病毒颗粒转导细胞。作为阴性对照，使用用空pLV-CMV-IRES-Neo载体转导的肿瘤细胞(模拟对照)。将转导的细胞在选择性培养基(含G-418抗生素)中保持10天，并通过ELISA测量上清液中重组分子的浓度，以检测鼠类免疫球蛋白的Fc部分。通过该技术在转导的肿瘤细胞的上清液中检测到BC2m和单一对照(图6A)。

另外，通过夹心ELISA确认了BC2m和单一对照中no alpha IL2部分和IFNα的存在。在其中之一中，将转导细胞的上清液在涂有抗Fc抗体的板上温育，并依次添加对IL2具特异性的兔抗体和与酶过氧化物酶结合的抗兔免疫球蛋白抗体来检测IL2部分。因此，在BC2m和单个Fc-no alpha IL2对照的结构中检测到Fc-IL2部分(图6B)。在另一测定中，将转导细胞的上清液在涂有抗IFNα抗体的板上温育，并用对小鼠IgG的Fc区具特异性的抗体(与酶过氧化物酶缀合)检测Fc部分。在BC2m和单个IFNα-Fc对照中检测到IFNα-Fc部分(图6C)。

实施例5. BC2m的抗肿瘤作用优于单个细胞因子IFNα-Fc和Fc- no alpha IL2或其组合的对照的抗肿瘤作用

为了比较BC2m相对于对照的抗肿瘤作用，评估了来自分泌不同分子的4T1细胞的植入肿瘤的生长。设想了五组待治疗的动物：其中三组接受4T1-模拟、4T1-IFNα-Fc或4T1-Fc-noalpha IL2细胞，并且其余两组接种no alpha 4T1-IFNα-Fc+4T1-FcIL2或4T1-BC2m细胞的组合。皮下施用了总数为100 000个的细胞。考虑到转导的品系表达不同水平的重组蛋白，在某些情况下将它们与模拟细胞混合以确保分泌的蛋白/总细胞比率在所有组中均相等。

为了分析结果，在实验的第25天和第27天，通过Fisher精确检验，对不同组中肿瘤体积小于或等于4T1-模拟组中存在的最小体积的动物的频率进行配对比较。

如图7中所观察到，在第25天和第27天，与单一对照及其组合相比，在接受4T1-BC2m细胞的组中，肿瘤尺寸小于或等于模拟对照组中观察到的最低值的动物的频率明显更高(Fisher精确检验，p<0.05)。在接受4T1-IFNα-Fc+4T1-Fc no alpha IL2细胞的组合的组中未观察到这种现象，其中所评估的频率与用每种单一疗法治疗的组相比没有差异(结果未示出，Fisher精确检验，p>0.05)。

这些结果指出了BC2m的治疗优势，因为它们表明IFNα与no alpha IL2的结合导致了定性或定量不同分子和细胞机制的激活，从而发挥了增强的抗肿瘤反应，高于采用细胞因子IFNα-Fc和Fc-no alpha IL2的单一对照的共同施用或这些细胞因子的单独施用所获得的抗肿瘤反应。

实施例6. 在4T1模型中肿瘤内注射BC2m具有比单一对照IFNα-Fc和Fc-no alphaIL2更大的抗肿瘤作用。

将4T1细胞接种在BALB/c免疫活性小鼠中。10天后，经肿瘤内注射等摩尔量的先前转染的HEK293T细胞的上清液中包含的IFNα-Fc、Fc-no alpha IL2和BC2m。另一组接受了含有IFNα-Fc和Fc-no alpha IL2的上清液的混合物的注射，从而相对于单一对照和BC2m确保了每种细胞因子的等摩尔性。作为阴性对照，使用未转染的HEK293T细胞的上清液。以每天一次的频率注入上清液，持续四天。如图8所示，在实验的第17天，用BC2m治疗的小鼠中100%小鼠的肿瘤体积低于阴性对照组的平均值，这一结果在任何其它治疗组中均未观察到。在接受BC2m治疗的组中，带有肿瘤尺寸低于阴性对照组平均值的动物的频率高于任何接受个别疗法IFNα-Fc或Fc-no alpha IL2的组(Fisher精确检验；p<0.05)。然而，与单一对照IFNα-Fc相比，在用IFNα-Fc和Fc-no alpha IL2对照的组合治疗的组中，肿瘤体积小于阴性对照组的平均肿瘤体积的动物的频率更高。相反，相对于Fc-no alpha IL2对照，该频率没有更高，这表明需要在同一分子中结合IFNα和no alpha IL2细胞因子以获得更有效的保护作用。这可能是由于与同时刺激两个分子的受体相关的分子和细胞机制的可能激活。总体而言，这些证据支持，相对于亲代细胞因子，在肿瘤中局部施用BC2m具有优越的治疗价值。

序列表

<110> 免疫分子中心(Centro de Inmunologia Molecular)

<120> 由白介素-2突变蛋白和I型干扰素构成的融合蛋白

<130> 592018CU00

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 利用DNA重组技术

<400> 1

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Ala Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 2

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 利用DNA重组技术

<400> 2

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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65 70 75 80

Asp Pro Arg Asp Val Val Ser Asn Ile Asn Val Phe Val Leu Glu Leu

85 90 95

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100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 3

<211> 165

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 利用DNA重组技术

<400> 3

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met

1 5 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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<211> 162

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 利用DNA重组技术

<400> 4

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1 5 10 15

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<210> 5

<211> 246

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 利用DNA重组技术

<400> 5

Ala Ala Ala Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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245

<210> 6

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 利用DNA重组技术

<400> 6

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 利用DNA重组技术

<400> 7

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 利用DNA重组技术

<400> 8

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<210> 10

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 利用DNA重组技术

<400> 10

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aaggataaag tcagtctgac ctgcatgata acagacttct tccctgaaga cattactgtg 960

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acc 1563

<210> 11

<211> 1632

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 利用DNA重组技术

<400> 11

tgcgatctgc cgcagaccca tagcctgggc agccgccgca ccctgatgct gctggcgcag 60

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gaagaatttg gcaaccagtt tcagaaagcg gaaaccattc cggtgctgca tgaaatgatt 180

cagcagattt ttaacctgtt tagcaccaaa gatagcagcg cggcgtggga tgaaaccctg 240

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aaatattttc agcgcattac cctgtatctg aaagaaaaaa aatatagccc gtgcgcgtgg 420

gaagtggtgc gcgcggaaat tatgcgcagc tttagcctga gcaccaacct gcaggaaagc 480

ctgcgcagca aagaagcggc cgctagcgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 540

cctgaagccg cggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 600

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gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 720

cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 780

gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 840

atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 900

cccccatccc gggaggaggt gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 960

ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1020

aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctatag caagctcacc 1080

gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1140

ctgcacaacc actacacgca gaagtcgctc agcctgtccc cgggtaaagg tggaggcggt 1200

tcaggcggag gtggttctgg cggtggcgga tcggcgccga ccagcagcag caccaaaaaa 1260

acccagctgc agctggaaca tctgctgctg gatctgcaga tgattctgaa cggcattaac 1320

aactataaaa acccgaaact gacccgcatg ctgaccttta aattttatat gccgaaaaaa 1380

gcgaccgaac tgaaacatct gcagtgcctg gaagaagaac tgaaaccgct ggaagaagtg 1440

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aacgtgtttg tgctggaact gaaaggcagc gaaaccacct ttatgtgcga atatgcggat 1560

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agcaccctga cc 1632

<210> 12

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 利用DNA重组技术

<400> 12

Ala Ala Ala Ser Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val

1 5 10 15

Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile

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130 135 140

Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp

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165 170 175

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180 185 190

Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His

195 200 205

Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro

210 215 220

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225 230 235 240

Ser