嗜热几丁质酶Chi304突变体及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了嗜热几丁质酶Chi304突变体及其制备方法和应用。本发明通过基因共识设计氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的几丁质酶Chi304的系列单点突变体，最终成功筛选得到酶活和热稳定性提高的单点突变体Y166F以及表达量、最适温度、热稳定性和底物结合能力均提高的单点突变体D421E。此外，Y166F和D421E这两个单点突变体对底物的转化能力较野生型也有了明显的提高。本发明为工业上几丁质的高温酶法降解奠定了理论基础，并为几丁质酶的工业化应用创造了条件。

说明书

技术领域

本发明涉及几丁质酶突变体，尤其涉及嗜热几丁质酶Chi304的单点突变体，本发明还涉及嗜热几丁质酶Chi304突变体的制备方法以及该突变体在降解几丁质中的应用，属于几丁质酶突变体及应用领域。

背景技术

几丁质又名甲壳质、甲壳素，是一种由N-乙酰葡糖胺通过β-1,4糖苷键聚合而成的天然高分子多糖，自然条件下为白色或灰白色无定型固体，分子量通常在30-3000kDa，乙酰度在90%以上，广泛分布在海产品虾蟹外壳、真菌和藻类细胞壁中，是海洋微生物生长繁殖中最重要的可再生氮源和碳源，在自然界中的含量仅次于纤维素占第二位。

伴随人工养殖海产品技术的发展，虾蟹壳等餐桌废弃物大量堆积造成全球范围污染加剧，加工过程中所产生废弃物可占其原料的50%，其中近30%为几丁质。仅海洋无脊椎动物每年产生的几丁质就高达1.6亿吨。几丁质的降解产物如几丁寡糖和壳寡糖等，由于其安全无毒的特质，在生物医药、农业、食品、化妆品等行业应用广泛，具有良好的经济效益和开发前景。目前几丁质降解的主要方法为浓酸断裂多糖糖苷键的化学降解法，该方法在处理过程中除了存在环境污染和产物不可控的缺点外，其高生产成本和加工能耗也为企业造成较大负担。而酶法降解作为目前众多几丁质降解方法中最高效、环保的方法，不仅具有使用成本低、绿色安全等优点，其产物的高纯度还简化了后续纯化处理步骤。

几丁质酶作为一类糖苷水解酶，能够有效水解几丁质中β-1,4糖苷键，生成高价值的几丁寡糖。几丁质酶广泛存在于细菌、真菌、病毒和动植物体内。几丁质高致密的晶体结构导致其降解困难，生产加工通常在高温条件下进行，以达到几丁质解构的效果，因此高温几丁质酶在实际生产中具有不可替代的作用。目前已知的几丁质酶大多利用传统的方法从可培养的微生物中分离得到，由于微生物的生长条件限制，所分离到的酶热稳定性差、酶活力和表达量偏低，达不到工业化应用的要求。

因此，高效筛选得到嗜热且高效的几丁质酶并通过理性设计等手段提升它的酶学性能，将具有极高的产业应用价值。

发明内容

本发明的目的之一将是提供一种嗜热几丁质酶Chi304突变体；

本发明的目的之二将是将所述嗜热几丁质酶Chi304突变体及其编码基因等应用于降解几丁质；

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案包括：

作为本发明一种具体的实施方式，本发明提供了一种嗜热几丁质酶Chi304突变体，该突变体通过将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列进行Y71K、L133T、F135I、Y166F、Y172F、W181Y、A220E、G262N、F396Y或D421E中的任何一种氨基酸单位点突变所获得的突变体；优选的，将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列进行L133T、Y166F、Y172F、A220E或D421E中的任何一种氨基酸单位点突变所获得的突变体；更优选的，将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列进行Y166F或D421E氨基酸单位点突变所获得的突变体。

本发明所述氨基酸单位点突变“Y71K”表示将氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的嗜热几丁质酶Chi304的第71位氨基酸由酪氨酸（Y）突变成赖氨酸（K）；其余的单位点突变的表述依此类推。

所述的嗜热几丁质酶Chi304突变体的编码基因也属于本发明的保护范畴之内。

本发明还公开了含有所述嗜热几丁质酶Chi304突变体的编码基因的重组表达载体或重组宿主细胞；其中，所述重组表达载体可以为重组原核表达载体或重组真核载体。

本发明进一步提供了制备任何一项所述的嗜热几丁质酶Chi304突变体的方法，包括：

（1）将所述嗜热几丁质酶Chi304突变体的编码基因可操作的与表达调控元件连接构建得到重组表达载体；

（2）将重组表达载体转化宿主细胞，培养宿主细胞，诱导表达重组蛋白，纯化，即得。

本发明还公开了所述的嗜热几丁质酶Chi304突变体、嗜热几丁质酶Chi304突变体的编码基因以及含有编码基因的重组表达载体在降解几丁质中的用途。

一 Chi304单点突变体的设计、单点突变体的构建与诱导表达

（一）Chi304单点突变体的设计

Chi304为发明人本实验室前期从海洋宏基因组中筛选得到的嗜热几丁质酶，为了进一步提升它的综合性质，通过基因共识的方法对其中的关键氨基酸位点进行突变，首先利用Chi304氨基酸序列在美国国家生物技术信息中心(NCBI)上进行Blast比对，下载e值小于10

（二）Chi304单点突变体的构建与诱导表达

利用两步PCR法对相应位置氨基酸进行突变，测序正确后转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3) 进行诱导表达，将表达后的蛋白用Ni柱进行纯化并使用SDS-PAGE检测蛋白表达情况。根据表达结果可见，这10个单点突变体蛋白的表达较好，目的条带单一，且与野生型Chi304蛋白的大小一致，为70.95KDa。其中，Y71K、G262N和D421E的蛋白表达量较野生型Chi304有所提高。

二Chi304单点突变体的酶学性能测定试验

（一）Chi304单点突变体的酶活力检测

Chi304突变体蛋白经过Ni柱纯化和蛋白定量后，采用DNS法测定其酶活力。结果显示：L133T、Y166F、Y172F、A220E四个突变体相比Chi304酶活分别提高6.59%、12.14%、4.59%和7.39%。突变体Y71K、F396Y和G262N酶活力没有明显变化。F135I、W181Y和D421E三个突变体酶活力有所降低，其中W181Y的酶活力最低，降为Chi304的85.56%。

（二）Chi304及突变体最适温度和温度稳定性检测

将Chi304和突变体（Y166F和D421E）在不同温度（70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃）条件下进行酶活力测定，结果发现Chi304和突变体Y166F的最适温度为85℃，而突变体D421E最适温度相较Chi304有了明显的变化，由85℃提高至90℃。随后分别将Chi304和突变体分别在90℃条件下保温处理然后检测其酶活力。结果表明在保温处理30 min内，Y166F和D421E相对酶活力均比Chi304高，且剩余酶活高于50%，表现出良好的热稳定性。

（三）Chi304及突变体最适pH与pH值稳定性检测

对突变体（Y166F和D421E）与Chi304的最适pH值进行检测，发现两个突变体与Chi304的最适pH值一致，均在pH 9.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液中发挥最大酶活力。

对pH稳定性进行检测时发现，在不同pH值缓冲溶液冰上处理1h后，Y166F和D421E的pH值稳定性变化不大，在pH 7.5-10.0之间仍可保持良好酶活力。

（四）Chi304及突变体酶促反应动力学参数检测

通过检测Chi304和突变体（Y166F和D421E）的酶促反应动力学参数发现，Chi304的

综上，本发明通过基因共识设计几丁质酶Chi304的单点突变体，成功筛选得到酶活和热稳定性提高的单点突变体Y166F以及表达量、最适温度、热稳定性和底物结合能力均提高的单点突变体D421E。此外，Y166F和D421E对底物的转化能力较野生型也有了明显的提高。本发明为工业上几丁质的高温酶法降解奠定了理论基础，并为几丁质酶的工业化应用创造了条件。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA（肽核酸）、在反义技术中所用的DNA类似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等）。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体（包括（但不限于）简并密码子取代）和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选（或所有）密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代（Batzer等人，

术语“突变”和“突变体”在此具有它们的常用含义，指的是在核酸或多肽序列中的遗传的、天然存在的或引入的变化，它们的意义与本领域人员通常所知的意义相同。

术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。

术语“转化”指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。

附图说明

图1 Chi304及其突变体SDS-PAGE分析。

图2 Chi304及其突变体酶活检测。

图3 Chi304及其突变体最适温度和温度稳定性检测注：A：最适温度检测；B：温度稳定性检测。

图4 Chi304及其突变体最适pH和pH稳定性检测结果；A：最适pH检测；B：pH稳定性检测。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1 Chi304单点突变体的设计、单点突变体的构建与诱导表达

（一）Chi304单点突变体的设计

Chi304为发明人本实验室前期从海洋宏基因组中筛选得到的嗜热几丁质酶（其氨基酸序列为SEQ ID No.1所示），为了进一步提升它的综合性质，通过基因共识的方法对其中的关键氨基酸位点进行突变，具体方法如下：

首先利用Chi304氨基酸序列在美国国家生物技术信息中心(NCBI)上进行Blast比对，下载e值小于10

（二）Chi304单点突变体的构建与诱导表达

利用两步PCR法对相应位置氨基酸进行突变，测序正确后转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3) 进行诱导表达，将表达后的蛋白用Ni柱进行纯化并使用SDS-PAGE检测蛋白表达情况。

根据表达结果可见，这10个单点突变体蛋白的表达较好，目的条带单一，且与野生型Chi304蛋白的大小一致，为70.95KDa。其中，Y71K、G262N和D421E的蛋白表达量较野生型Chi304有所提高（图1）。

试验例1 Chi304单点突变体的酶学性能测定试验

（一）Chi304单点突变体的酶活力检测

Chi304突变体蛋白经过Ni柱纯化和蛋白定量后，采用DNS法测定其酶活力。结果显示：L133T、Y166F、Y172F、A220E四个突变体相比Chi304酶活分别提高6.59%、12.14%、4.59%和7.39%。突变体Y71K、F396Y和G262N酶活力没有明显变化。F135I、W181Y和D421E三个突变体酶活力有所降低，其中W181Y的酶活力最低，降为Chi304的85.56%（图2）。综合以上蛋白表达和酶活力结果确定突变体Y166F和D421E为主要研究对象。

（二）Chi304及突变体最适温度和温度稳定性检测

将Chi304和突变体（Y166F和D421E）在不同温度（70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃）条件下进行酶活力测定，结果发现Chi304和突变体Y166F的最适温度为85℃，而突变体D421E最适温度相较Chi304有了明显的变化，由85℃提高至90℃ （图3A）。随后分别将Chi304和突变体分别在90℃条件下保温处理15 min、30 min、45 min、60 min、75 min和90 min，然后检测其酶活力。结果表明在保温处理30 min内，Y166F和D421E相对酶活力均比Chi304高，且剩余酶活高于50%，表现出良好的热稳定性（图3B）。

（三）Chi304及突变体最适pH与pH值稳定性检测

对突变体（Y166F和D421E）与Chi304的最适pH值进行检测，发现两个突变体与Chi304的最适pH值一致，均在pH9.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液中发挥最大酶活力（图4A）。

对pH稳定性进行检测时发现，在不同pH值缓冲溶液冰上处理1h后，Y166F和D421E的pH值稳定性变化不大，在pH 7.5-10.0之间仍可保持良好酶活力（图4B）。

（四）Chi304及突变体酶促反应动力学参数检测

通过检测Chi304和突变体（Y166F和D421E）的酶促反应动力学参数发现，Chi304的

综上，本发明通过基因共识设计几丁质酶Chi304的单点突变体，成功筛选得到酶活和热稳定性提高的单点突变体Y166F以及表达量、最适温度、热稳定性和底物结合能力均提高的单点突变体D421E。此外，Y166F和D421E对底物的转化能力较野生型也有了明显的提高。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 嗜热几丁质酶Chi304突变体及其制备方法和应用

<130> BJ-2002-201104A-L

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 644

<212> PRT

<213> 海洋宏基因组(Artifial sequence)

<400> 1

Met Lys Arg Ser Phe Leu Cys Val Leu Leu Ala Gly Gly Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ile Gly Gly Cys Leu Val Pro Leu Gly Pro Ser Glu Arg Glu Gly Gly

20 25 30

Glu Ser Ala Arg Ala Ala Ala Gly Gly Leu Pro Tyr His Ile Val Val

35 40 45

Tyr Phe Pro Glu Trp Gly Ile Tyr Ala Gly His Asn Tyr Tyr Tyr Pro

50 55 60

Glu His Val Pro Phe Glu Tyr Ile Thr His Leu Asn Tyr Ala Phe Leu

65 70 75 80

Glu Ile Lys Lys Val Gly Thr Asn Gln Phe Gln Leu Gly Ile Ile Asp

85 90 95

Ser Trp Ala Ser Leu Gln Lys Ala Tyr Gly Thr Trp Asp Gln Thr Glu

100 105 110

Arg Met Gly Asn Ile Arg Glu Leu Lys Tyr Gln Arg Asp Leu Arg Asn

115 120 125

Pro Asn Val Lys Leu Leu Phe Ser Val Gly Gly Trp Ser Arg Ser Gly

130 135 140

Tyr Phe Ser Glu Met Ala Tyr Thr Pro Glu Gly Arg Ala Ser Phe Ile

145 150 155 160

Gln Ser Cys Ile Glu Tyr Leu Arg Thr Tyr Gly Tyr Asp Gly Ile Asp

165 170 175

Ile Asp Trp Glu Trp Pro Gly Val Tyr Arg Ala Pro Ser Asn Ser Pro

180 185 190

Pro Gly Asp Gln Gly Asn Pro Val Tyr Gly Thr Pro Glu Glu Asp Lys

195 200 205

Arg Asn Phe Thr Leu Leu Leu Lys Glu Leu Arg Ala Ala Leu Asp Gln

210 215 220

Ala Gly Gln Gln Asp Gly Lys His Tyr Leu Leu Thr Val Ala Val Gly

225 230 235 240

Ala Gly Lys Asp Lys Ile Asp Met Thr Glu Pro Asn Val Tyr His Gln

245 250 255

Tyr Val Asp Tyr Ile Gly Leu Met Thr Tyr Asp Phe His Gly Gly Trp

260 265 270

Glu Asn Val Thr Asn His Gln Ser Pro Leu Tyr Pro Asn Pro Asn Asp

275 280 285

Pro Ser Glu Tyr Arg Asp Thr Tyr Asn Ile Asp Trp Val Val Lys Tyr

290 295 300

Phe Ser Gly Gln Tyr Ser Val Pro Lys Glu Lys Leu Val Val Gly Leu

305 310 315 320

Pro Tyr Tyr Ser Arg Gly Trp Lys Gly Val Asp Pro Asn Thr Gly Ile

325 330 335

Asn Gly Leu Phe Ala Gln Ala Gln Gly Ala Ala Asp Thr Gly Ala Trp

340 345 350

Asp Gly His Thr Ala Pro Tyr Tyr Gln Thr Arg Ala Trp Gly Gln Gly

355 360 365

Ala Asp Gly Phe Ile Arg Tyr Trp Asp Asp Thr Ala Lys Val Pro Trp

370 375 380

Leu Tyr Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Met Trp Thr Phe Glu Asp Leu Glu

385 390 395 400

Ser Ile Thr Ile Lys Ala Asn Tyr Leu Lys Gln Asn Gly Tyr Gly Gly

405 410 415

Phe Leu Ile Trp Asp Ile Thr Gly Asp Tyr Pro Asn Val Ala Asn Gly

420 425 430

Glu Lys Gly Ala Glu Leu Thr Lys Ala Ile Tyr Glu Leu Phe Gly Gly

435 440 445

Asp Ser Val Pro Ser Pro Thr Pro Thr Pro Ser Thr Thr Pro Thr Pro

450 455 460

Ser Pro Thr Pro Thr Ala Thr Pro Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro

465 470 475 480

Thr Ser Thr Pro Thr Ser Thr Pro Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Val

485 490 495

Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Thr Ala Tyr Pro Val Trp Asp Pro

500 505 510

Ser Gln Val Tyr Val Gly Gly Asp Arg Val Tyr Trp Asn Gly His Asn

515 520 525

Trp Glu Ala Arg Trp Trp Thr Lys Gly Glu Glu Pro Gly Thr Thr Gly

530 535 540

Glu Trp Gly Val Trp Lys Asp Leu Gly Pro Ala Glu Gly Ala Thr Pro

545 550 555 560

Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ala Thr Pro

565 570 575

Thr Pro Thr Ser Thr Met Thr Pro Thr Pro Thr Ala Ser Pro Thr Pro

580 585 590

Thr Pro Ser Gly Gly Pro Ala Glu Trp Gln Ala Tyr Thr Ala Tyr Ala

595 600 605

Val Gly Asp Arg Val Ser Tyr Gly Gly Val Val Tyr Arg Cys Leu Gln

610 615 620

Ala His Thr Ser Leu Pro Gly Trp Glu Pro Pro Asn Ala Pro Ala Leu

625 630 635 640

Trp Gln Ala Glu

<210> 2

<211> 1932

<212> DNA

<213> 海洋宏基因组(Artifial sequence)

<400> 2

atgaagcgta gcttcctgtg cgttctgctg gcgggtggcc tgctgctgat cggtggctgc 60

ctggttccgc tgggtccgag cgagcgtgaa ggtggcgaga gcgcgcgtgc ggcggcgggt 120

ggcctgccgt accacatcgt ggtttatttc ccggaatggg gcatttacgc gggtcacaac 180

tactattacc cggagcacgt tccgttcgaa tacatcaccc acctgaacta tgcgtttctg 240

gagattaaga aagtgggcac caaccagttt caactgggta tcattgacag ctgggcgagc 300

ctgcagaaag cgtacggcac ctgggatcaa accgagcgta tgggtaacat tcgtgaactg 360

aagtatcagc gtgacctgcg taacccgaac gtgaaactgc tgttcagcgt tggtggctgg 420

agccgtagcg gctactttag cgagatggcg tataccccgg aaggtcgtgc gagcttcatc 480

caaagctgca ttgagtacct gcgtacctat ggttacgatg gcatcgacat tgattgggaa 540

tggccgggcg tttatcgtgc gccgagcaac agcccgccgg gtgaccaggg taacccggtg 600

tatggtaccc cggaggaaga taagcgtaac tttaccctgc tgctgaaaga actgcgtgcg 660

gcgctggacc aagcgggtca gcaagatggc aagcactacc tgctgaccgt ggcggttggt 720

gcgggcaagg acaaaatcga tatgaccgaa ccgaacgtgt atcaccagta cgttgactat 780

attggtctga tgacctacga tttccacggt ggctgggaga acgttaccaa ccaccaaagc 840

ccgctgtatc cgaacccgaa cgacccgagc gaataccgtg acacctataa catcgattgg 900

gtggttaagt actttagcgg ccagtatagc gttccgaagg agaaactggt ggttggtctg 960

ccgtattaca gccgtggttg gaaaggcgtg gatccgaaca ccggtatcaa cggtctgttt 1020

gcgcaggcgc agggtgcggc ggacaccggc gcgtgggatg gtcacaccgc gccgtattac 1080

caaacccgtg cgtggggtca gggtgcggac ggctttattc gttactggga cgataccgcg 1140

aaagtgccgt ggctgtacaa cccgagcacc ggttatatgt ggaccttcga ggatctggaa 1200

agcatcacca ttaaggcgaa ctacctgaaa cagaacggct atggtggctt tctgatctgg 1260

gacattaccg gtgattaccc gaacgttgcg aacggcgaga agggcgcgga actgaccaaa 1320

gcgatctatg aactgtttgg tggcgacagc gtgccgagcc cgaccccgac cccgagcacc 1380

accccgaccc cgtctcctac cccgaccgcg accccgtctc ccaccccgac cccgaccccg 1440

accagcaccc cgaccagcac cccgtctcca accccgaccc cgactgtgac cccgaccccg 1500

accccgacgg gtaccgcgta cccggtttgg gacccgagcc aggtgtacgt tggtggcgat 1560

cgtgtgtatt ggaacggcca caactgggag gcgcgttggt ggaccaaggg cgaggaaccg 1620

ggtaccaccg gcgagtgggg tgtttggaaa gacctgggcc cggcggaagg tgcgaccccg 1680

tctccgaccc cgaccccgac cccgaccccg accccgactg ctaccccgac cccgaccagc 1740

acgatgaccc cgaccccgac cgcttctcct accccgaccc cgagcggtgg cccggcggaa 1800

tggcaagcgt acaccgcgta tgcggtgggc gatcgtgtta gctacggtgg cgtggtttat 1860

cgttgcctgc aggcgcacac cagcctgccg ggttgggagc cgccgaacgc gccggcgctg 1920

tggcaagcgg aa 1932