田纳西曲霉及其应用

摘要

本申请公开了田纳西曲霉(Aspergillus tennesseensis)用于制备喜树碱的应用，以及用于制备10‑羟基喜树碱的应用，本申请还提供了从喜树中分离出的喜树内生真菌田纳西曲霉(Aspergillus tennesseensis)CUIZT1。利用田纳西曲霉获得10‑羟基喜树碱的方法和利用田纳西曲霉CUIZT1获得喜树碱的方法简单易控制，适用于产业化生产。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及田纳西曲霉及其应用。

背景技术

喜树碱(CPT)是一种著名的吲哚生物碱(TIA)，通过抑制真核拓扑异构酶I的活性而表现出抗癌活性，其两个衍生物topothecan和irinothecan于1994年被美国食品药品监督管理局(FDA)批准。10-羟基喜树碱的抗癌活性由于喜树碱，对多种动物肿瘤有抑制作用，与常用抗肿瘤药物无交叉耐药、动物实验显示其抗瘤谱广。对核酸特别是DNA的合成有明显抑制作用，其作用机制与喜树碱相似，但毒性较小。喜树碱及其衍生物是当今世界市场上的第三大抗癌药物。CPT最早在喜树中发现，在商业生产中主要从喜树(Camptothecaacuminate)和青脆枝(Nothapodytes nimmoniana)中分离得到。过度砍伐喜树和青脆枝使得这些植物数量大幅下降，由于天然植物资源的有限性和化学合成的复杂性，迫切需要开发CPT及其衍生物的可持续生产资源。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何提供CPT及其衍生物的可持续生产资源。

为实现上述目的，本发明提供了田纳西曲霉(Aspergillus tennesseensis)用于制备喜树碱的应用。

在某些实施方式中，所述田纳西曲霉获取自喜树组织。

在某些实施方式中，所述喜树组织包括喜树果实。

在某些实施方式中，所述田纳西曲霉的RPB2基因包含如SEQ ID NO.1所示序列。

在某些实施方式中，所述应用包括：

a)培养所述田纳西曲霉，收取培养液Ⅰ；

b)使用a)中所述培养液Ⅰ提取喜树碱。

在某些实施方式中，所述培养为使用PDB液体培养基培养，所述提取包括使用二氯甲烷萃取。

在某些实施方式中，所述田纳西曲霉的保藏号为：CGMCC20729。

另一方面，本申请还提供了田纳西曲霉(Aspergillus tennesseensis)用于制备10-羟基喜树碱的应用。

在某些实施方式中，所述田纳西曲霉获取自喜树组织。

在某些实施方式中，所述喜树组织包括喜树果实。

在某些实施方式中，所述田纳西曲霉的RPB2基因包含如SEQ ID NO.1所示序列。

在某些实施方式中，所述应用包括：

a)将所述田纳西曲霉与喜树组织共培养，收取培养液Ⅱ；

b)使用a)中所述培养液Ⅱ提取10-羟基喜树碱。

在某些实施方式中，所述喜树组织包括喜树种子、喜树果实、喜树皮和/或喜树根。

在某些实施方式中，所述田纳西曲霉的保藏号为：CGMCC20729。

另一方面，本申请还提供了田纳西曲霉(Aspergillus tennesseensis)用于制备药物的应用，所述药物用于预防/治疗肿瘤。

在某些实施方式中，所述应用包括使用合适的培养基培养所述田纳西曲霉以产生喜树碱和/或10-羟基喜树碱。

在某些实施方式中，所述药物的活性成分包含喜树碱和/或10-羟基喜树碱。

在某些实施方式中，所述肿瘤包括胃癌、肠癌、肝癌、急性和慢性粒细胞性白血病、绒毛膜上皮癌、肺癌和/或膀胱癌。

在某些实施方式中，所述田纳西曲霉的保藏号为：CGMCC20729。

另一方面，本申请还提供了一种田纳西曲霉(Aspergillus tennesseensis)，其保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC20729。

本申请公开了采集自喜树组织组织的田纳西曲霉能够应用于制备喜树碱，并且其与喜树种子发酵共培养制得发酵液提取物，与对照相比将10-羟基喜树碱含量提高224％；本申请还提供了从喜树植物中分离出的喜树内生真菌田纳西曲霉(Aspergillustennesseensis)CUIZT1。田纳西曲霉(Aspergillus tennesseensis)具有生长速度快，易培养等优点，利用田纳西曲霉转化获得10-羟基喜树碱的方法和利用田纳西曲霉获得喜树碱的方法简单易控制，适用于产业化生产，从而实现可持续性生产喜树碱和10-羟基喜树碱。

附图说明

图1a-b显示的是本申请中田纳西曲霉CUIZT1的PDA固体培养形态图。

图1c-d显示的是本申请中田纳西曲霉CUIZT1的菌丝和孢子形态图。

图2显示的是本申请中田纳西曲霉CUIZT1的系统发育树。

图3显示的是本申请中喜树碱标准品与田纳西曲霉CUIZT1发酵液喜树碱粗提物的HPLC图。

图4a-b显示的是本申请中喜树碱标准品(a)与田纳西曲霉CUIZT1发酵产喜树碱(b)的质谱图。

图5显示的是本申请中10-羟基喜树碱标准品与田纳西曲霉CUIZT1发酵液提取物的HPLC图。

图6显示的是本申请中共培养后10-羟基喜树碱的含量。

在本申请中：

菌株CUIZT1分类命名：田纳西曲霉(Aspergillus tennesseensis)

保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所

保藏编号：CGMCC20729

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明作进一步地说明，应理解这些实施例仅作为例证的目的，本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

实施例1田纳西曲霉(Aspergillus tennesseensis)的分离和分类鉴定

(1)准备植物材料。采集正常健康生长的喜树果实(采集自中国上海市徐汇区)，采集的植物材料按照常规操作切段、清洗、消毒。具体为：用自来水彻底冲洗除去尘土等杂物，先后用浓度为75％乙醇浸泡5min，10％次氯酸钠溶液浸泡5min，再用无菌水冲洗3次，每次1min，最后用无菌滤纸吸除喜树各组织部位的表面水分，用无菌手术刀将植物材料切成2mm×2mm小块，待用。

(2)将准备好的植物材料按常规无菌操作方法接种培养。将准备好的喜树植物材料接种到PDA固体培养基(购自上海源叶生物科技有限公司)上，25℃±2℃恒温培养7d；待植物材料新切面长出菌丝后，挑取菌丝移至新的PDA培养基上继续培养，条件25℃±2℃恒温培养,经纯化三代后得到内生真菌菌株，命名为CUIZT1。

(3)固体培养基培养条件形态学特征。将接种到PDA培养基的内生菌株CUIZT1，25±2℃培养，观察菌落形态。菌株CUIZT1在PDA培养基上生长缓慢，7d后的菌落大小为12-15mm，颜色为绿色，菌落反面为淡柠檬黄色；表面平坦，无可溶性色素或渗出液，其形态如图1所示，其中，图a-b为固体培养基上的菌落形态图，图c-d为100倍镜下的菌丝和真菌孢子。

(4)分子生物学鉴定。发酵培养。将菌株CUIZT1依照常规方法制备得到种子液，将10mL种子液接种到100mL PDA液体培养基中，25±2℃，摇床160±20rpm，培养7d，得到发酵混合物。将发酵混合物经滤纸过滤，收集菌丝体；用无菌去离子水冲洗菌丝体3次，离心去上清液；按照植物基因组DNA抽提试剂盒(Plant Genomic DNAKit)的操作说明进行菌株CUIZT1的基因组DNA提取。

以获得的菌株CUIZT1基因组DNA为模板，正向引物(rPB2-5F)：GAYGAYMGWGATCAYTTYGG-3’(其中，Y为C或T，M为A或C，W为A或T。SEQ ID NO.2所示)，反向引物(rpb2-7R)：CCCATRGCYTGYTTMCCCATDGC-3’(R为A或G，Y为C或T，M为A或C，D为G、A或T。SEQID NO.3所示)；PCR反应体系及反应条件：2.5μL2×PrimeSTARMax，ddH

将扩增产物送上海派森诺生物科技有限公司进行测序，碱基序列结果如SEQ IDNO.1所示。将测序结果在NCBI进行BLAST比对，选择每个物种代表性的序列进行序列比对，将邻联和BioNJ算法应用于最大复合似然法估计的两两距离矩阵，自动获得启发式搜索的初始树，然后选择对数似然值较高的拓扑。采用离散伽马分布来模拟位点间的演化率差异，速率变化模型允许某些位点在进化上不变。所有包含间隙和缺失数据的位置被消除，进化分析在MEGA7中进行，最后得到发育树，结果如图2所示。

经过以上分离鉴定，得到的内生真菌菌株CUIZT1为田纳西曲霉(Aspergillustennesseensis)。

(5)保藏。将菌株CUIZT1的孢子溶液(1×10

实施例2利用喜树内生真菌菌株CUIZT1提取喜树碱

(1)发酵培养。将实施例1中保藏的菌株CUIZT1依照常规方法制备得到种子液，将10mL种子液接种到100mL PDB液体培养基中，25±2℃，摇床160±20rpm，培养7d，得到发酵混合物，将发酵混合物经无菌滤纸过滤，分别收集滤液和菌丝体。

(2)制备发酵提取物。收集上一步所得滤液200mL用等体积二氯甲烷溶剂萃取，有机相于40℃减压浓缩得到发酵液提取物(此时发酵液提取物呈粉末状附在旋转蒸发瓶上)，之后加入2mL甲醇溶剂溶解，滤膜过滤后所得滤液即为喜树碱粗提物。

所得菌丝体烘干研磨破碎，10mL甲醇浸泡过夜，4000rpm离心15min得上清，所得上清液用等体积二氯甲烷溶剂萃取三次，有机相于40℃减压浓缩得到菌丝体提取物；加入甲醇溶剂溶解，滤膜过滤后所得滤液即为喜树碱粗提物。

(3)菌株CUIZT1发酵物中喜树碱的HPLC检测。采用HPLC分别检测上一步得到的发酵液喜树碱粗提物与菌丝体喜树碱粗提物，HPLC分析检测条件为：Eclipse XDB-C18柱(4.6mm×250mm,5μm)，流动相A：甲醇，流动相B：水+0.1％甲酸，柱温：30℃，流速：1mL/min；进样量：10μL；检测波长：254nm；洗脱程序为:0-15min,45％A；15-25分钟，45-60％A；25-27分钟，60-99％A；27-35分钟，99％A；35-36分钟，99-45％A；36-46min,45％A，检测波长为254。

在上述条件下，喜树碱标准品的保留时间为：19.71min，内生菌株CUIZT1发酵液提取物中喜树碱的保留时间为：19.71min，浓度为15.3μg/L(滤液)。图3所示为喜树碱标准品(CPT)与菌株CUIZT1发酵液提取物(CUIZT1)的HPLC图；此外，菌丝体提取物结果显示，其HPLC图中19.71min不出峰，质谱检测出浓度为39.7ng/g，表明菌丝体提取物中仅含痕量喜树碱，菌株CUIZT1产生的喜树碱主要存在于发酵液中，有利于生产提取。

(4)产喜树碱内生菌菌株CUIZT1的HPLC-MS确证。将经本实施例步骤(3)验证的含有与喜树碱标准品保留时间相同的发酵液提取物进行液质联用分析，图4a-b为喜树碱标准品(图4a)与内生菌株CUIZT1所产喜树碱(图4b)的HPLC-MS图,确证该产物为喜树碱。

实施例3利用喜树内生真菌菌株CUIZT转化获得10-羟基喜树碱

(1)发酵培养。将实施例1中保藏的菌株CUIZT1依照常规方法制备得到种子液。将10mL种子液接种到50ml PDB液体培养基中，25±2℃，摇床120±20rpm，培养3d，然后加入灭菌的0.5g喜树种子粉末共培养2-4d，得发酵混合物，同时设置空白对照，即0.5g喜树种子粉加入没有接入种子液的50mL PDB液体培养基中。

(2)制备发酵提取物。收集上一步所得发酵混合物50mL用等体积二氯甲烷溶剂萃取三次，有机相于40℃减压浓缩得到发酵液提取物(此时提取物呈粉末附在旋转蒸发瓶上)，加入2mL甲醇溶剂溶解，滤膜过滤后所得滤液即为10-羟基喜树碱粗提物。

(3)菌株CUIZT1与喜树种子共培养发酵物中10-羟基喜树碱的HPLC检测。采用HPLC检测实上一步得到的发酵液混合物提取物，HPLC分析检测条件：Eclipse XDB-C18柱(4.6mm×250mm,5μm)，流动相A：甲醇，流动相B：水+0.1％甲酸，柱温：30℃，流速：1mL/min；进样量：10μL；检测波长：254nm；洗脱程序为：0-15min,45％A；15-25分钟，45-60％A；25-27分钟，60-99％A；27-35分钟，99％A；35-36分钟，99-45％A；36-46min,45％A。

在上述条件下，10-羟基喜树碱标准品的保留时间为：12.15min；内生菌株CUIZT1发酵混合物提取物中10-羟基喜树碱的保留时间为：12.15min。图5所示为共培养4天后的发酵混合物10-羟基喜树碱粗提物和10-羟基喜树碱标准品的HPLC图；图6显示的是共培养2天、3天、4天的培养物与对照组的每单位重量(克)的喜树种子粉末所得10-羟基喜树碱的定量结果图，图中显示，共培养4天时内生真菌CUIZT1可以使等量喜树种子粉末的10-羟基喜树碱含量提高224％，即利用菌株CUIZT1的转化能够获得更多的10-羟基喜树碱。另外请见如下表1。

表1

表1中为单位体积(升)的发酵混合物中10-羟基喜树碱的含量。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

序列表

<110> 上海师范大学

<120> 田纳西曲霉及其应用

<130> CN015-20010CN

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1026

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> RPB2

<400> 1

cgttacgtac aaaggtgtgt ggaaaccaac cgtgagattt acctcaacat tggtatcaag 60

gccagcacct tgagcggtgg tttgaagtat gctctcgcta ctggtaactg gggagaacag 120

aagaaggcag ccagcgccaa ggctggtgtg tcgcaagtgc tcagtcgcta cacatatgca 180

tctacattgt cacatcttcg gcgaacaaac acgcccattg gtcgtgatgg aaagattgcc 240

aaaccccgac agctgcacaa cactcactgg ggtctggtgt gtccggcaga gactcctgaa 300

ggtcaagcat gtggtttggt caagaacttg gcgctcatgt gctacatcac agtcggtaca 360

cccagcgagc ctatcatcga tttcatgatc cagcggaaca tggaagttct tgaggagttt 420

gaacctcaag taacgccgaa cgccaccaag gtctttgtga acggtgtttg ggttggtgtt 480

catcgggatc ctgctcacct tgtcaacacc atgctttcgc tacgtcggcg gaacatgatc 540

tcccacgaag tcagtcttat tcgagacatt cgtgagcgag agttcaagat ctttaccgac 600

gccggtcgtg tctgtcggcc actctacgtc atcgacaacg atcccaagag tgaaaactgc 660

ggtagtctag tcttgaacaa ggagcacatt cgcaagctgg agcaagacaa ggaactccca 720

ccagacatgg acccagaaga tcgccgggaa caatacttcg gatgggacgg tttagtcaag 780

tcaggtgttg ttgagtatgt ggatgccgaa gaagaagaaa caatcatgat tgttatgaca 840

ccagaggatc tggaaatttc gaagcaactc caggcagggt acgccttacc cgaagaggag 900

cacgatatta ataaacgcgt gcggtcggtt ctcagccaaa gagcacatac ctggacacac 960

tgcgaaattc accccagtat gattcttggt gtctgcgcca gtatcattcc ttccccgatc 1020

acaacc 1026

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> RPB2正向引物

<220>

<221> n

<222> (3)..(3)

<223> n可以是c或t

<220>

<221> n

<222> (6)..(6)

<223> n可以是c或t

<220>

<221> n

<222> (7)..(7)

<223> n可以是a或c

<220>

<221> n

<222> (9)..(9)

<223> n可以是a或t

<220>

<221> n

<222> (15)..(15)

<223> n可以是c或t

<220>

<221> n

<222> (18)..(18)

<223> n可以是c或t

<400> 2

ganganngng atcanttngg 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> RPB2反向引物

<220>

<221> n

<222> (6)..(6)

<223> n可以是a或g

<220>

<221> n

<222> (9)..(9)

<223> n可以是c或t

<220>

<221> n

<222> (12)..(12)

<223> n可以是c或t

<220>

<221> n

<222> (15)..(15)

<223> n可以是a或c

<220>

<221> n

<222> (21)..(21)

<223> n可以是g, a或t

<400> 3

cccatngcnt gnttncccat ngc 23