一种用于纳米正电子显像剂的68Ga标记化合物及其制备与应用

摘要

本发明的化合物A为小分子化合物且具有弗林酶靶向性，对细胞渗透性较好，能被高表达弗林酶的肿瘤细胞摄取，在肿瘤部位发生缩合反应形成纳米粒子，提高了生物组织局部的浓度，具有较高的肿瘤靶向性，成像灵敏度高、成像效果好，避免了直接采用大分子造成的摄取率低、靶向性差的问题。本发明的所述化合物A，采用68Ga作为显像的标记部分。68Ga无需由昂贵的回旋加速器生成，无需合成仪进行合成，仅需合适的淋洗液从商用68Ge‑68Ga发生器上淋洗出68Ga，与标记前体混匀，通过络合反应与标记前体结合，合成简便，反应时间短，标记率高达95％以上，从而可以通过所需核素量来确定生产量，使用成本较低，无需大型设备和场地。

说明书

技术领域

本发明属于纳米显像剂领域，具体涉及一种用于纳米PET显像剂的

背景技术

肿瘤的早期诊断是治疗肿瘤、提高生存率的一个关键因素。在肿瘤的临床诊断方法中，正电子断层显像(positron emission tomography，PET)是最先进的医学影像诊断方法之一。PET利用人体天然元素发射正电子的同位素等标记的生物活性物质作为显像剂的核医学成像技术，PET可进行三维全身扫描，快速获得多层面断层影像、三维定量结果，更早期、更灵敏、更准确地诊断肿瘤、指导治疗和监测疗效。

随着PET检查数的增加，对PET药物的需求也不断增加，各种新型探针也不断涌现，其中以纳米粒子作为PET探针是目前的研究热点之一。纳米粒子可以作为一个载体来装载大量的探针分子以提高生物组织局部浓度，从而提高显像的灵敏性。目前最常用的纳米成像技术通常都是选择一种纳米颗粒作为基础，对其进行包被或表面修饰，在纳米颗粒表面连接PET显像核素，在体外完成纳米制备，然后注入体内进行PET显像。这种体外合成的纳米探针他们面临的困难是体外合成较复杂、收率较低，在注入体内后又会遇到由于较大的粒子尺寸和较低的细胞渗透性所造成的低摄取等问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是现有技术中的纳米PET显像剂需体外制备、在生物体内摄取率低、靶向性低的问题，进而提供一种制备简单、成像效果良好的肿瘤细胞靶向性的纳米PET显像剂的化合物、及其制备方法、及化合的应用。

一种化合物，所述化合物为A或B；

A为

B为Ga络合的化合物，如式(Ⅱ)所示；

所述的化合物A在制备纳米PET显像剂中的应用。

所述的化合物B在制备纳米PET显像剂的纳米促发剂中的应用。

一种纳米PET显像剂，包括所述化合物A。

可选的，所述纳米PET显像剂，还包括所述的化合物B。

一种制备化合物A的方法，包括以下步骤：将乙酰基-精氨酸-缬氨酸-精氨酸-精氨酸-半胱氨酸-赖氨酸(1,4,7-三氮杂环壬烷-1，4-二乙酸-7-羧基乙基乙酰胺)-2-氰基-6-氨基苯并噻唑用溶剂溶解，加入

可选的，所述用于溶解乙酰基-精氨酸-缬氨酸-精氨酸-精氨酸-半胱氨酸-赖氨酸(1,4,7-三氮杂环壬烷-1，4-二乙酸-7-羧基乙基乙酰胺)-2-氰基-6-氨基苯并噻唑的溶剂为水或者水与甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、二甲基甲酰胺或四氢呋喃形成的溶液。

可选的，调节pH的溶液为醋酸钠溶液。

可选的，所述

可选的，在所述反应液中，所述乙酰基-精氨酸-缬氨酸-精氨酸-精氨酸-半胱氨酸-赖氨酸(1,4,7-三氮杂环壬烷-1，4-二乙酸-7-羧基乙基乙酰胺)-2-氰基-6-氨基苯并噻唑的浓度为2-100μg/mL(1.37*10

一种制备化合物B的方法，包括以下步骤：将乙酰基-精氨酸-缬氨酸-精氨酸-精氨酸-半胱氨酸-赖氨酸(1,4,7-三氮杂环壬烷-1，4-二乙酸-7-羧基乙基乙酰胺)-2-氰基-6-氨基苯并噻唑和GaCl

在所述反应液中，所述乙酰基-精氨酸-缬氨酸-精氨酸-精氨酸-半胱氨酸-赖氨酸(1,4,7-三氮杂环壬烷-1，4-二乙酸-7-羧基乙基乙酰胺)-2-氰基-6-氨基苯并噻唑的浓度为5-50mmol/L；所述GaCl

可选的，乙酰基-精氨酸-缬氨酸-精氨酸-精氨酸-半胱氨酸-赖氨酸(1,4,7-三氮杂环壬烷-1，4-二乙酸-7-羧基乙基乙酰胺)-2-氰基-6-氨基苯并噻唑与GaCl

如下任一所述制备纳米PET显像剂的方法:

(I)包括以下步骤：将化合物A与水或生理盐水混合，无菌过滤即得。

(II)包括以下步骤：将化合物A、化合物B溶解于水或生理盐水中，无菌过滤即得。

进一步地，所述的显像剂作为报告furin酶高表达肿瘤的正电子断层显像剂。

一种报告荷瘤裸鼠的肿瘤细胞中弗林蛋白酶或检测肿瘤细胞或肿瘤成像的方法，将上述化合物或上述纳米PET显像剂溶解于水或生理盐水，通过尾静脉注射给药；

将上述方法制备得到的PET显像剂通过尾静脉注射给药。

所述方法为非疾病诊断治疗方法。

进一步地，以20g裸鼠体重为计，化合物A的用量为50-300μCi；化合物B的用量为40-400μg；优选的，给药体积为0.1-0.2mL。

所述化合物A是用于纳米PET显像剂的

弗林蛋白酶(furin)，是真核生物细胞中一种重要的内切蛋白酶，在非小细胞肺癌、结肠癌、乳腺癌、鳞状上皮细胞癌等多种肿瘤细胞中高度表达，这种异常升高的furin酶对底物的加工会导致肿瘤的发展、侵袭、转移和血管生成，增加肿瘤侵袭性、生长速度和恶性程度，因此设计靶标为furin酶的化合物可以在肿瘤发展早期进行诊断和治疗。所述化合物A和B结构中含有RVRR(精氨酸-缬氨酸-精氨酸--精氨酸)肽段，该肽段为furin酶特异性识别基团，实现furin靶向性。

所述化合物A含有furin酶切底物,被高表达furin酶的肿瘤细胞识别摄取，在肿瘤细胞内的glutathion和furin酶共同作用下，这些小分子被剪切掉RVRR和双硫键，产生自由的Cystein片断从而和另一分子的CBT发生分子间缩合反应形成二聚体，然后通过相互间的π-π堆积自组装成放射性纳米粒子，具体如下所示：

所述化合物A与化合物B的制备过程如下所示：

本发明的上述技术方案，相比现有技术具有以下优点：

(1)本发明的化合物A为小分子化合物且具有弗林酶靶向性，对细胞渗透性较好，能被高表达弗林酶的肿瘤细胞摄取，在肿瘤部位发生缩合反应形成纳米粒子，提高了生物组织局部的浓度，具有较高的肿瘤靶向性，成像灵敏度高、成像效果好，避免了直接采用大分子造成的摄取率低、靶向性差的问题。

(2)本发明的所述化合物A，采用

(3)本发明所述的纳米PET显像剂还包括不含标记元素Ga-68的所述化合物B，作为PET显像剂Ac-RVRRCK(

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1中合成的Ac-RVRRCK(NODAGA)-CBT的质谱图；

图2为实施例1中合成的放射性Ac-RVRRCK(

图3为实施例3中合成的Ac-RVRRCK(Ga-NODAGA)-CBT的HPLC图谱；；纵坐标为紫外吸收响应强度，单位AU，横坐标为时间(min)；

图4为实施例3中合成的Ac-RVRRCK(Ga-NODAGA)-CBT的质谱图；

图5为实施例4中化合物Ac-RVRRCK(Ga-NODAGA)-CBT体外缩合形成纳米粒子的透射电子显微镜表征；

图6为实施例10中注入A后1h的microPET扫描图谱；

图7为实施例10中注入B后1h的microPET扫描图谱；

图8为实施例10中注入C后1h的microPET扫描图谱；

图9为实施例10中注入D后1h的microPET扫描图谱。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明下述实施例中使用的反应物中间体：乙酰基-精氨酸-缬氨酸-精氨酸-精氨酸-半胱氨酸-赖氨酸-2-氰基-6-氨基苯并噻唑(Ac-RVRRCKCBT)按照现有技术中方法合成即可(Ya-Ling Liu,Qing-Qing Miao,Pei Zou,Long-Fei Liu,Xiao-Jing Wang,Lin-NaAn,Xiao-Liu Zhang,Xiang-Ping Qian,Shi-Neng Luo*,and Gao-Lin Liang*.Enzyme-controlled intracellular self-assembly of 18F nanoparticles for enhancedmicroPET imaging of tumor.Theranostics,2015,5(10):1058-1067：Scheme S1,即该文中Acetyl-Arg-Val-Arg-Arg-Cys(StBu)-Lys-CBT)。

三叔丁氧基-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二乙酸-7-羧基乙基乙酸酯(NODAGA(OtBu)

英文简称HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸；TCEP：三(2-羧乙基)膦盐酸盐。

实施例1：Ac-RVRRCK(

本实施例中，首先合成Ac-RVRRCK(NODAGA)-CBT，合成方法具体为：

将Ac-RVRRCKCBT(66mg,0.06mmol)、三叔丁氧基-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二乙酸-7-羧基乙基乙酸酯(NODAGA(OtBu)

Ac-RVRRCK(

实施例2：Ac-RVRRCK(

本实施例中，Ac-RVRRCK(

实施例3：Ac-RVRRCK(Ga-NODAGA)-CBT的合成

将Ac-RVRRCK(NODAGA)-CBT 29mg(0.02mmoL)和34mg GaCl

[M+H]

实施例4：Ac-RVRRCK(Ga-NODAGA)-CBT和furin酶体外共孵育进行纳米粒子制备

为验证包含Ac-RVRRCK(

将Ac-RVRRCK(Ga-NODAGA)-CBT溶解到DMSO中配制浓度为25mM的母液，使用含有100mM的HEPES，1mM的CaCl

实施例5：Ac-RVRRCK(

将实施例1制备的放射性化合物和注射用水混合均匀，0.22μm无菌滤膜过滤，制为含放射性化合物1.5mCi/mL的注射剂即可。

实施例6：Ac-RVRRCK(

将实施例2制备的放射性化合物和生理盐水混合均匀，0.22μm无菌滤膜过滤，制为含放射性化合物2mCi/mL的注射剂即可。

实施例7：Ac-RVRRCK(

本实施例中Ac-RVRRCK(

将实施例3中制备的Ac-RVRRCK(Ga-NODAGA)-CBT配制成浓度为4mg/mL的水溶液，取该水溶液10μL加入0.1mL实施例6中制备的Ac-RVRRCK(

实施例8：Ac-RVRRCK(

本实施例中，Ac-RVRRCK(

将实施例3中制备的Ac-RVRRCK(Ga-NODAGA)-CBT配制成浓度为10mg/mL的水溶液，取该水溶液10μL加入0.1mL实施例6中制备的Ac-RVRRCK(

实施例9：Ac-RVRRCK(

本实施例中，Ac-RVRRCK(

将实施例3中制备的Ac-RVRRCK(Ga-NODAGA)-CBT配制成浓度为40mg/mL的水溶液，取该水溶液10μL加入0.1mL实施例6中制备的Ac-RVRRCK(

实施例10：Ac-RVRRCK(

进行以下几组试验：

A：实施例5中制备的Ac-RVRRCK(

B：实施例7中制备的Ac-RVRRCK(

C：将实施例8中制备的Ac-RVRRCK(

D：将实施例9中制备的Ac-RVRRCK(

为验证本发明的纳米PET显像剂的成像效果，采用以下方法进行Ac-RVRRCK(

取高表达弗林蛋白酶的MDA-MB-468肿瘤细胞接种于裸鼠腋下，6-7周后成瘤。将带瘤裸鼠麻醉后转移至microPET扫描床，分别将A、B、C和D通过尾静脉注射入裸鼠，采集1h的扫描数据。

注入A的microPET扫描图谱见图6，结果显示，注射后肿瘤MDA-MB-468较好的显像效果，1小时的每克组织放射性占注射量的百分比为0.99％ID/g。

注入B的microPET扫描图谱见图7，结果显示，注射后肿瘤MDA-MB-468较好的显像效果，1小时的每克组织放射性占注射量的百分比为1.37％ID/g。

注入C的microPET扫描图谱见图8，结果显示，注射后肿瘤MDA-MB-468较好的显像效果，1小时的每克组织放射性占注射量的百分比为1.80％ID/g。

注入D的microPET扫描图谱见图9，结果显示，注射后肿瘤MDA-MB-468较好的显像效果，1小时的每克组织放射性占注射量的百分比为3.78％ID/g。

由上述结果可知，Ac-RVRRCK(Ga-NODAGA)-CBT的加入可以提高PET显像的灵敏度，增加肿瘤区域的％ID/g。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。