植物中多溴联苯醚、羟基多溴联苯醚与甲氧基多溴联苯醚同步提取分析方法

摘要

本发明公开了植物中多溴联苯醚、羟基多溴联苯醚与甲氧基多溴联苯醚同步提取分析方法，属于化合物的提取分析领域，包括以下步骤：1)样品处理；2)样品提取；3)样品净化；4)样品分离；5)样品分析；所述步骤5)样品分析中的分析目标为含有39种多溴联苯醚的混标、12种羟基多溴联苯醚和12种甲氧基多溴联苯醚。本发明能够同步提取多溴联苯醚、羟基多溴联苯醚和甲氧基多溴联苯醚，并且减少其挥发，同时建立分析方法，提高分析准确性。

说明书

技术领域

本发明涉及化合物的提取分析领域，尤其涉及植物中多溴联苯醚、羟基多溴联苯醚与甲氧基多溴联苯醚同步提取分析方法。

背景技术

多溴联苯醚(PBDEs)是一种重要的溴代阻燃剂，因其阻燃效率高和热稳定性好、对材料性能影响小等特性，曾广泛应用于塑料、电器、家具、纺织品和化工等领域。但是，PBDEs在室温下具有蒸汽压低和亲脂性强的特点，因此很容易从产品中挥发出来进入大气，并通过大气干湿过程沉降到水体和土壤，成为环境中普遍存在的持久性有机污染物。环境介质中的PBDEs会发生转化，生成低溴代PBDEs(de-PBDEs)、羟基多溴联苯醚(OH-PBDEs)、甲氧基多溴联苯醚(MeO-PBDEs)和溴代苯酚等产物。目前在动物和植物体内有检出de-PBDEs、OH-PBDEs和MeO-PBDEs，且研究表明de-PBDEs、OH-PBDEs和MeO-PBDEs对生物的毒性要比母体PBDEs更大。

申请号为“201811449861.2”的专利“测定植物样品中羟基多溴联苯醚的方法”，公开了“测定植物样品中羟基多溴联苯醚的方法”，包括提取-二次提取-叶绿素去除-提纯-分析的步骤，里面仅公开羟基多溴联苯醚的测定方法，未公开MeO-PBDEs的测定分析方法，所以参考意义不大。植物是食物链的起始和重要组成部分，研究植物体内持久性有机污染物的存在对于评价持久性有机污染物的陆生生态风险、以及污染物对食物链的潜在暴露风险都有着重要的意义。所以，研究植物体内PBDEs及OH-PBDEs和MeO-PBDEs的存在特征是刻不容缓的。因此我们首先要建立植物体内PBDEs及OH-PBDEs和MeO-PBDEs的提取分析方法。然而de-PBDEs、OH-PBDEs和MeO-PBDEs所包含的单体种类众多，且含量低，难以提取，所以急需一种植物体内de-PBDEs、OH-PBDEs和MeO-PBDEs的高效同步提取方法，以及分析方法，以提高分析准确性和高效性。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供植物中多溴联苯醚、羟基多溴联苯醚与甲氧基多溴联苯醚同步提取分析方法，能够简便快速、高效同步提取多溴联苯醚、羟基多溴联苯醚和甲氧基多溴联苯醚，并且减少对于样品的浪费，同时建立灵敏度高、能够很好分离的分析方法，提高分析准确性。

本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：

植物中多溴联苯醚、羟基多溴联苯醚和甲氧基多溴联苯醚同步提取分析，包括以下步骤：1)样品处理；2)样品提取；3)样品净化；4)样品分离；5)样品分析；所述步骤5)样品分析中的分析目标为含有39种多溴联苯醚的混标、12种羟基多溴联苯醚和12种甲氧基多溴联苯醚。

其中，39种多溴联苯醚为：mono-BDEs 1，2，3；di-BDEs 7，8，10，11，12，13，15；tri-BDEs 17，25，28，30，32，33，35，37；tetra-BDEs47，49，66，71，75，77；penta-BDEs 85，99，100，116，118，119，126；hexa-BDEs 138，153，154，155，166；hepta-BDEs 181，183，190；

12种羟基多溴联苯醚为：2'-OH-BDE3、3'-OH-BDE7、4'-OH-BDE17、3'-OH-BDE28、3-OH-BDE47、5-OH-BDE47、4'-OH-BDE49、6-OH-BDE47、2'-OH-BDE68、6-OH-BDE85、5'-OH-BDE99、6'-OH-BDE99；

12种甲氧基多溴联苯醚为：2'-MeO-BDE3、3'-MeO-BDE7、4'-MeO-BDE17、3'-MeO-BDE28、3-MeO-BDE47、5-MeO-BDE47、4'-MeO-BDE49、6-MeO-BDE47、2'-MeO-BDE68、6-MeO-BDE85、5'-MeO-BDE99和6'-MeO-BDE99。

进一步，具体操作步骤如下：

1)样品处理：

将冷干的植物根和地上部分样品破碎后加入乙醇-正己烷-水溶液中浸泡，然后蒸馏，再采用精馏等方式收集精馏样品；

2)样品提取：

称取精馏样品5-10mg，加入1ml异丙醇，2mL正己烷和MTBE的混合溶液，其中正己烷和MTBE的体积比为1:1，涡旋30s后超声萃取1h，于3000rpm转速下离心10min后，取出上清液于KD瓶中，重复三次该过程后合并上清液，氮吹至干，随后溶于20mL二氯甲烷；

3)样品净化：

将步骤2)提取得到的样品用酸性硅胶柱进行净化，酸性硅胶柱内径为10mm，从下到上分别填充高度为12cm、质量比为44％的硫酸酸性硅胶和4cm的无水硫酸钠，用50mL二氯甲烷进行洗脱，将洗脱得到的溶液经旋蒸、氮吹吹干后重新用正己烷定容至1mL；

4)样品分离：

中性硅胶层析柱从下到上依次填充10cm的5％水去活化的硅胶和2cm无水硫酸钠，用正己烷预淋中性硅胶层析柱后，将步骤3)净化得到的样品加入，上样后洗脱，第一步用洗脱剂洗脱得到含有多溴联苯醚和甲氧基多溴联苯醚的第一组分；第二步用洗脱剂洗脱得到含有羟基多溴联苯醚的第二组分；

5)样品分析：

将步骤4)得到的第一组分经旋蒸、氮吹吹干后，正己烷定容至100μL，通过GC-MS进行分析；

第二组分经旋蒸、氮吹吹干后，用乙腈定容至100μL，通过UPLC-MS/MS进行分析。

进一步，步骤1)样品处理的具体操作如下：

将冷干的植物根和地上部分样品破碎至0.1-0.2cm后加到乙醇-正己烷-水溶液中，其中乙醇为73wt％，正己烷为14wt％，搅拌均匀后密封浸泡1-2h，进行梯度蒸馏，先加热至60℃保温10min后，继续加热至70℃保温15min，再加热至80℃保温5min后，取出蒸馏液进行精馏，加热至30℃保温30-50min后得到精馏样品。

进一步，所述步骤4)样品分离的洗脱操作具体如下：

首先采用60ml二氯甲烷/正己烷洗脱液洗脱后得到第一组分，二氯甲烷/正己烷体积比为1:4，然后再采用70ml二氯甲烷洗脱液洗脱后得到第二组分。

进一步，所述步骤5)第一组分的样品分析中，GC-MS分析条件如下：

(1)多溴联苯醚的测定：选用DB-5MS毛细管柱，30m×0.25mm×0.25μm，采用不分流进样的方法进行样品的分离与测试，GC进样口温度为250℃，检测器温度为280℃；

柱温箱升温过程：初始温度110℃，保持1min；然后以30℃/min升到200℃，保持1min；再以3℃/min升到260℃，保持12.5min，20℃/min升到295℃，保持20min；气相色谱与质谱间的连接温度为280℃，载气为高纯氦气，流速为1.5mL/min，质谱采用EI源电子电离方式，电子能量为70eV，选择离子检测SIM模式，1μl进样量；

(2)甲氧基多溴联苯醚的测定：选用DB-5MS毛细管柱，30m×0.25mm，0.25μm膜厚，采用不分流进样的方法进行样品的分离与测试，GC进样口温度为250℃，检测器温度为280℃；

柱温箱升温程序：初始温度110℃，保持1min；然后以15℃/min升至215℃，保持1min；再以2℃/min升至270℃，保持16min；气相色谱与质谱间的连接温度为280℃，高纯氦气为载气，质谱采用EI源电子电离方式，电子能量为70eV，选择离子检测SIM模式，1μl进样量。

进一步，所述步骤5)第二组分样品分析中，UPLC-MS/MS分析条件如下：

选用Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱，2.1mm×100mm，1.7μm膜厚；流动相采用溶剂A乙腈和溶剂B水，采用梯度洗脱；柱温设定为40℃，进样量为10μL；样品室温度：10℃；其中梯度洗脱程序为：

质谱检测使用负离子扫描的电喷雾离子源，采集模式选择反应监测MRM模式，其中碰撞气体为氦气，毛细管电压为2.5KV，离子源温度为150℃，去溶剂温度为500℃，去溶剂气流量为700L/h，锥孔气流量为50L/h；其中质谱检测条件为：

本发明的有益效果如下：

1、大多数对于植物中的多溴联苯醚、羟基多溴联苯醚和甲氧基多溴联苯醚的提取方法都是分别提取各这三类目标化合物，本发明可以将植物中的多溴联苯醚、羟基多溴联苯醚和甲氧基多溴联苯醚同步提取，减少了样品量的需求，节省了提取时间，并建立了简便快速、灵敏度高、能够很好的分离的同步提取分析检测方法。

2、选用乙醇-正己烷-水溶液三元体系作为溶剂对植物样品进行蒸馏、精馏，能将多溴联苯醚、羟基多溴联苯醚和甲氧基多溴联苯醚尽量多的收集浓缩，去除杂质，防止植物样品中的其他物质对分析的干扰，造成分析误差。

3、将植物样品经过蒸馏和精馏处理，防止多溴联苯醚、羟基多溴联苯醚和甲氧基多溴联苯醚挥发，同时不会对目标物质进行破坏，在一定程度上减少处理过程对检测结果的影响，提高分析检测结果的准确度。

附图说明

图1为多溴联苯醚的色谱图，其中1:BDE-1，2:BDE-2，3:BDE-3，4:BDE-10，5:BDE-7，6:BDE-11，7:BDE-8，8:BDE-13，9:BDE-12，10:BDE-15，11:BDE-30，12:BDE-32，13:BDE-17，14:BDE-25，15:BDE-28，16:BDE-33，17:BDE-35，18:BDE-37，19:BDE-75，49，20:BDE-71，21:BDE-47，22:BDE-66，23:BDE-77，24:BDE-100，25:BDE-119，26:BDE-99，27:BDE-118，28:BDE-116，29:BDE-85，30:BDE-126，155，31:BDE-154，32:BDE-153，33:BDE-138，34:BDE-166，35:BDE-183，36:BDE-181，37:BDE-190；

图2为羟基多溴联苯醚的色谱图，其中1:2'-OH-BDE3，2:3'-OH-BDE7，3:4'-OH-BDE17，4:3'-OH-BDE28，5:3-OH-BDE47，6:5-OH-BDE47/4-OH-BDE49，7:6-OH-BDE47，8:2'-OH-BDE68，9:6-OH-BDE85，10:5'-OH-BDE99，11:6'-OH-BDE99；

图3为甲氧基多溴联苯醚的色谱图，其中1:2'-MeO-BDE-3，2:3'-MeO-BDE-7，3:4'-MeO-BDE-17，4:3'-MeO-BDE-28，5:2'-MeO-BDE-68，6:6-MeO-BDE-47，7:3-MeO-BDE-47，8:5-MeO-BDE-47，9:4-MeO-BDE-49，10:6'-MeO-BDE-99，11:5'-MeO-BDE-99，12:6-MeO-BDE-85。

具体实施方式

以下将结合具体实施例对本发明进行详细说明：

实施例1：

选用玉米作为植物样品，按照以下步骤进行多溴联苯醚、羟基多溴联苯醚和甲氧基多溴联苯醚的提取与分析，具体操作步骤如下：

1)样品处理：

将冷干的玉米根和地上部分样品破碎至0.15±0.05cm后，加到乙醇-正己烷-水溶液中，其中乙醇浓度为73wt％，正己烷浓度为14wt％，搅拌均匀后密封浸泡2h，进行梯度蒸馏，梯度蒸馏过程中先加热至60℃，保温10min后，继续加热至70℃，保温15min，再加热至80℃，保温5min后，取出蒸馏液进行精馏，加热至30℃保温30min后得到精馏样品；

2)样品提取：

称取精馏样品5mg，加入1ml异丙醇和2mL正己烷与MTBE的混合溶液，其中正己烷与MTBE的体积比为1:1，涡旋30s后超声萃取1h，于3000rpm转速下离心10min后，取出上清液于KD瓶中，重复三次该过程后合并上清液，氮吹至干，随后溶于20mL二氯甲烷中；

3)样品净化：

将步骤2)提取得到的样品用酸性硅胶柱进行净化，酸性硅胶柱内径为10mm，从下到上分别填充高度为12cm、质量比为44％硫酸酸性硅胶和4cm的无水硫酸钠，用50mL二氯甲烷进行洗脱，将洗脱得到的溶液经旋蒸、氮吹吹干后重新用正己烷定容至1mL；

4)样品分离：

中性硅胶层析柱从下到上依次填充10cm的5％水去活化的硅胶和2cm无水硫酸钠，用正己烷预淋中性硅胶层析柱后，将步骤3)净化得到的样品加入，上样后洗脱，第一步洗脱剂为60ml二氯甲烷/正己烷，其中，二氯甲烷和正己烷体积比为1:4，得到含有多溴联苯醚和甲氧基多溴联苯醚的第一组分；第二部洗脱剂为70ml二氯甲烷，得到含有羟基多溴联苯醚的第二组分；

5)样品分析：

将步骤4)得到的第一组分经旋蒸、氮吹吹干后，正己烷定容至100μL，通过GC-MS分析第一组分；

第二组分经旋蒸、氮吹吹干后，用乙腈定容至100μL，通过UPLC-MS/MS进行分析。

其中GC-MS分析的条件如下：

选用GC-MS(GC 7890A，MS 5975MSD，Agilent)，自动进样器(7683B，Agilent)

(1)多溴联苯醚的测定：选用DB-5MS毛细管柱，30m×0.25mm×0.25μm，采用不分流进样的方法进行样品的分离与测试，GC进样口温度为250℃，检测器温度为280℃；

柱温箱升温过程：初始温度110℃，保持1min；然后以30℃/min升到200℃，保持1min；再以3℃/min升到260℃，保持12.5min，20℃/min升到295℃，保持20min；气相色谱与质谱间的连接温度为280℃，载气为高纯氦气，流速为1.5mL/min，质谱采用EI源电子电离方式，电子能量为70eV，选择离子检测SIM模式，1μl进样量；

(2)甲氧基多溴联苯醚的测定：选用DB-5MS毛细管柱，30m×0.25mm，0.25μm膜厚，采用不分流进样的方法进行样品的分离与测试，GC进样口温度为250℃，检测器温度为280℃；

柱温箱升温程序：初始温度110℃，保持1min；然后以15℃/min升至215℃，保持1min；再以2℃/min升至270℃，保持16min；气相色谱与质谱间的连接温度为280℃，高纯氦气为载气，质谱采用EI源电子电离方式，电子能量为70eV，选择离子检测SIM模式，1μl进样量。

其中UPLC-MS/MS分析条件如下：

选用Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱，2.1mm×100mm，1.7μm膜厚；流动相采用溶剂A乙腈和溶剂B水，采用梯度洗脱；柱温设定为40℃，进样量为10μL；样品室温度：10℃；其中梯度洗脱程序为：

质谱检测使用负离子扫描的电喷雾离子源，采集模式选择反应监测MRM模式，其中碰撞气体为氦气，毛细管电压为2.5KV，离子源温度为150℃，去溶剂温度为500℃，去溶剂气流量为700L/h，锥孔气流量为50L/h；

其中质谱检测条件为：

结果与数据分析：

按照上述方法进行加标回收率实验，分别对不同浓度的39种多溴联苯醚、12种羟基多溴联苯醚、12种甲氧基多溴联苯醚进行测定，得到的多溴联苯醚、羟基多溴联苯醚和甲氧基多溴联苯醚的定量检测限如表1-3所示，色谱图如图1-3所示。

其中，39种多溴联苯醚为：mono-BDEs 1，2，3；di-BDEs 7，8，10，11，12，13，15；tri-BDEs 17，25，28，30，32，33，35，37；tetra-BDEs47，49，66，71，75，77；penta-BDEs 85，99，100，116，118，119，126；hexa-BDEs 138，153，154，155，166；hepta-BDEs 181，183，190；

12种羟基多溴联苯醚为：2'-OH-BDE3、3'-OH-BDE7、4'-OH-BDE17、3'-OH-BDE28、3-OH-BDE47、5-OH-BDE47、4'-OH-BDE49、6-OH-BDE47、2'-OH-BDE68、6-OH-BDE85、5'-OH-BDE99、6'-OH-BDE99；

12种甲氧基多溴联苯醚为：2'-MeO-BDE3、3'-MeO-BDE7、4'-MeO-BDE17、3'-MeO-BDE28、3-MeO-BDE47、5-MeO-BDE47、4'-MeO-BDE49、6-MeO-BDE47、2'-MeO-BDE68、6-MeO-BDE85、5'-MeO-BDE99和6'-MeO-BDE99。

表1多溴联苯醚的定量检测限(n＝6)

表2羟基多溴联苯醚的定量检测限(n＝6)

表3甲氧基多溴联苯醚的定量检测限(n＝6)

由以上数据可知，39种多溴联苯醚，12种羟基多溴联苯醚，12种甲氧基多溴联苯醚在3个加标浓度水平上的加标回收率分别在76–103％，75–95％，76–98％的范围内，表明该样品前处理方法和检测方法有很好的回收率，同时实现了多溴联苯醚、羟基多溴联苯醚和甲氧基多溴联苯醚同步提取，减少了样品量的需求，节省了提取时间，并建立了简便快速、灵敏度高、能够很好的分离的同步提取分析检测方法。

实施例2：

对采集生长于某电子垃圾拆解地污染土壤的8个植物样品采用实施例1的方法进行分析，在植物中分别检测到24种多溴联苯醚(PBDEs)，12种羟基多溴联苯醚(OH-PBDEs)以及11种甲氧基多溴联苯醚(MeO-PBDEs)。其中植物中的PBDEs以mono-BDEs和di-BDEs为主，24种PBDEs总浓度范围为6-42ng/g；植物体中12种OH-PBDEs总浓度范围为0.8-3.9ng/g，其中6-OH-BDE47在植物中含量较高(0.3-0.9ng/g)；此外，植物体中11种MeO-PBDEs总浓度范围为9-350ng/g，以6-MeO-BDE85(8.5-150ng/g)为主。说明本发明可以实际运用于植物检测分析，可以对植物中的多溴联苯醚、羟基多溴联苯醚和甲氧基多溴联苯醚进行同步提取，节省了提取时间，并建立了简便快速、灵敏度高、能够很好的分离的同步提取分析检测方法，并且分析检测结果准确度较高。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。