番茄抗晚疫病长链非编码RNA-lncRNA40787及其克隆方法与应用方法

摘要

本发明提供了一种通过沉默miR394来提高番茄晚疫病抗性的长链非编码RNA‑lncRNA40787，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；提供了该长链非编码RNA的克隆方法：以野生型感晚疫病番茄早粉2号的cDNA为模板进行PCR扩增，将得到的PCR产物与pMD‑18T克隆载体连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落进行测序：还提供了该长链非编码RNA的应用方法，用于番茄抵御病原菌侵染，即在番茄中瞬时过表达所述番茄抗晚疫病的长链非编码RNA‑lncRNA40787。本发明得到的长链非编码RNA在番茄瞬时过表达后，番茄miR394的表达量显著降低，其抗晚疫病效果更优：其用于沉默miR394使番茄对晚疫病的抗性增强，对培育抗晚疫病番茄品种，从而提高番茄产量具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及番茄抗晚疫病长链非编码RNA-lncRNA40787及其克隆方法与应用方法。

背景技术

番茄是番茄属的草本植物，是世界范围内广泛种植的重要经济园艺作物。含丰富的番茄红素、维生素等，具有极高的营养价值。但在其生长过程中经常遭受着多种病原物的侵害，给番茄生产造成巨大的经济损失。其中，由致病疫霉导致的晚疫病，是一种毁灭性的病害，在番茄的各个阶段均产生了恶劣影响，发病严重时导致番茄茎部腐烂，植株萎蔫，最终导致番茄严重减产。目前防治方法存在环境污染、农药残留、效率低、病菌遗传结构改变的问题。通过分子生物学手段发现抗病基因来抵御病原菌侵染，是增强番茄对晚疫病抗性的一种经济有效的方法。

非编码RNA是一类在转录组中不编码蛋白的RNA，包括管家型RNA及调控型RNA两类，其中调控型RNA被认为是关键调控RNA分子。长链非编码RNA(LncRNAs)作为一种长度大于200nt的调控型RNA存在，通过染色质重塑，转录及转录后调控参与植物生命进程。LncRNAs在小麦白粉病、拟南芥尖刀镰胞杆菌，番茄黄化曲叶病毒等多种抗病过程中均有参与。近年来的研究发现lncRNAs在调控植物抗病过程中，与microRNA (miRNA)间存在着相互作用的关系。LncRNAs可作为miRNA的竞争性内源RNA (competing endogenous,ceRNA)也可以被miRNA靶向并剪切，lncRNAs也可以作为 miRNA的前体产生miRNA。在玉米中通过共表达网络发现了86个可以与miRNA共同作用的lncRNA。拟南芥中的LncRNA-IPS1可作为ceRNA沉默miR399，进而调控生物过程。

MiRNA作为一类长约20-24nt内源单链小分子RNA,是另一种发挥重要生物学功能的调控型RNA。MiR394作为一种高度保守的miRNA，广泛存在于水稻、番茄、玉米等多种植物中，在植株对生物胁迫的响应中扮演关键角色。在番茄感染灰霉病后，植株体内 miR394呈现上调趋势，其靶基因LEAF CURLING RESPONSIVENESS(LCR)表达量下降；在尖孢镰刀菌侵染的大蒜中也得到了相似的结果，miR394表达量上调，靶向LCR，参与了茉莉酸信号通路；miR394在棉花抗曲叶病中也可影响相关致病基因的存在。miR394 与三个包含其前体序列的lncRNAs呈现差异表达，响应了油菜核盘菌的感染。说明miR394 在介导真菌病原体的应答过程中，lncRNA也参与其中，但二者间具体关系及调控方式还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于开发一种番茄抗晚疫病长链非编码RNA-lncRNA40787及其克隆的方法；并提供该基因在沉默miR394及增强番茄对晚疫病抗性中的应用方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一种番茄抗晚疫病长链非编码RNA-lncRNA40787，其序列如SEQ ID NO.1所示。

本发本发明还提供了上述番茄抗晚疫病长链非编码RNA-lncRNA40787的克隆方法，以野生型感晚疫病番茄早粉2号的cDNA为模板，以lncRNA40787-FP、lncRNA40787-RP为特异性引物，进行PCR扩增；所述的特异性引物lncRNA40787-FP、lncRNA40787-RP序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示；

克隆所用特异性引物具体如下：

lncRNA40787-FP：CGCGGATCCGCGATCACAAACAAGAAAATGCTTC；

lncRNA40787-RP：CGAGCTCGCGAAGGGATCTGCTGGTTCTGTG；

将得到的PCR产物与PMD-18T克隆载体连接，得到的克隆载体连接产物转化大肠杆菌 DH5α并涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，挑取单菌落，进行测序，测序结果如SEQ ID NO.1所示。优选挑取单菌落于LB液体培养基后，提取含有番茄抗晚疫病长链非编码RNA-lncRNA40787菌体中的质粒进行测序。

本发明还提供了番茄抗晚疫病长链非编码RNA-lncRNA40787的应用方法，用于沉默番茄miR394。

优选方式下，上述番茄抗晚疫病长链非编码RNA-lncRNA40787提高番茄对晚疫病的抗性。

具体通过以下技术方案实现：

将含有番茄抗晚疫病长链非编码RNA-lncRNA40787的重组表达载体转化农杆菌GV3101并涂布在含有卡那霉素、链霉素及利福平的YEB固体培养基上，挑取单菌落进行菌液PCR验证；选取阳性工程菌瞬时侵染番茄叶片，并检测叶片中miR394的表达量，更进一步地，检测叶片对晚疫病的抗性。

本发明的目的植物为双子叶植物番茄。

优选方式下，所述重组表达载体由番茄抗晚疫病长链非编码RNA-lncRNA40787插入表达载体得到。

进一步优化，所述重组表达载体的具体制备方法为：

①克隆番茄抗晚疫病长链非编码RNA-lncRNA40787：以野生型感晚疫病番茄早粉2号的cDNA为模板、以lncRNA40787-FP和lncRNA40787-RP为特异性引物进行PCR扩增；所述特异性引物的序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；将得到的PCR产物与pMD- 18T克隆载体连接，克隆载体连接产物转化大肠杆菌DH5α并涂布在含有氨苄青霉素的LB 固体培养基上，挑取单菌落于LB液体培养基后，提取含有番茄抗晚疫病长链非编码RNA-lncRNA40787菌体中的质粒进行测序；

②构建含有番茄抗晚疫病长链非编码RNA-lncRNA40787的重组表达载体：用限制性内切酶BamHI及SacI对上述测序正确的质粒进行双酶切，回收得到目的片段，将其与同样经 BamHI及SacI双酶切的pBI121表达载体连接，表达载体连接产物即为重组表达载体。

将上述表达载体连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布在含有卡那霉素的LB固体培养基上，挑取单菌落进行PCR及双酶切验证，结果显示表达载体构建成功。

本发明的技术创新在于：

1、本发明克隆得到了一个番茄抗晚疫病长链非编码RNA-lncRNA40787；构建了含有番茄抗晚疫病长链非编码RNA-lncRNA40787的重组表达载体；证明了长链非编码RNA-lncRNA40787对miR394的沉默作用。

2、本发明明确了长链非编码RNA-lncRNA40787可以通过沉默致病相关的非编码RNA-miR394来增强番茄对晚疫病的抗性。过表达本发明得到的过表达lncRNA40787 (OE-lncRNA40787)后，番茄miR394的表达量显著下降，植株抗晚疫病效果更优，对培育抗晚疫病番茄品种具有重要意义。

附图说明

图1为瞬时过表达lncRNA40787与对照组叶片中lncRNA40787的表达量；

图2为瞬时过表达lncRNA40787与对照组叶片中miR394的表达量；

图3为晚疫病菌处理5天后瞬时过表达lncRNA40787与对照组叶片表型。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。实施例中未注明的实验条件及方法，均为常规方法。

实施例一：番茄抗晚疫病长链非编码RNA-lncRNA40787的克隆

1.番茄总RNA的提取

(1)将样品放入研钵中，加入液氮充分研磨至粉末。

(2)取适量粉末，置于1.5mL RNase/DNase Free离心管中，同时迅速加入1mL预冷的 Trizol，摇匀，室温静置5min。

(3)向离心管中加入200μL氯仿，摇匀，室温静置5min，4℃12000r/min离心15 min。

(4)将上清转移至新离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃静置20min后，4℃12000r/min离心10min。

(5)弃去上清，加入1mL预冷的75％乙醇，清洗沉淀，4℃12000r/min离心5min。

(6)小心弃去上清，在室温下开盖放置，待乙醇完全挥发后，加入20μL RNase FreeddH

(7)取5μLRNA，1％琼脂糖凝胶电泳检测。

2.番茄cDNA的合成

以总RNA作为模板进行反转录，应用Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)(购自Takara)参照说明书完成操作。

3.长链非编码RNA-lncRNA40787的PCR扩增

以番茄早粉2号的cDNA为模板，应用特异性引物,进行PCR扩增。

克隆所用特异性引物如下：

lncRNA40787-FP:CGCGG GATCACAAACAAGAAAATGCTTC

lncRNA40787-RP:CGAGCTCGCGAAGGGATCTGCTGGTTCTGTG

反应条件如下：

4.PCR产物的回收纯化

1％琼脂糖凝胶电泳检测上述PCR产物后，用切胶回收试剂盒(购自Takara)回收符合目标的片段。

5.目标片段与克隆载体连接

将上述回收得到的片段与克隆载体pMD-18T(购自Takara)连接，反应体系如下：

16℃连接8h得到克隆载体连接产物pMD-18T-lncRNA40787。

6.克隆载体连接产物转化大肠杆菌

(1)将10μL的克隆载体连接产物加入至100μL的大肠杆菌感受态细胞中，吹打混匀后，冰水浴30min；

(2)将上述冰浴后的混合液立即转移至42℃水浴锅中，90s后再次冰水浴2min；

(3)向混合液中加入1mL新鲜的LB培养基，于37℃恒温振荡培养(180rpm)1.5h；

(4)4000r/min离心10min上述菌液，吸去1mL上清，留下100μL菌液，将其充分吹打悬浮后，均匀涂布于LB平板上(含100mg/L氨苄青霉素、24mg/L IPTG以及20mg/L X-Gal)，于37℃恒温培养箱中过夜；

(5)挑取白色单菌落，接至LB液体培养基(含100mg/L氨苄青霉素)中，37℃恒温振荡培养(180rpm)过夜。

7.pMD-18T-lncRNA40787质粒的提取

依据质粒小提试剂盒(购自Vazyme)的说明，提取上述菌液中所含有的pMD-18T-lncRNA40787质粒。取5μL的样品，用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

8.测序

将得到的质粒送至华大基因(北京)公司测序，分析测序结果。

实施例二：番茄抗晚疫病长链非编码RNA-lncRNA40787重组表达载体的构建

1.pMD-18T-lncRNA40787质粒的酶切

将pMD-18T-lncRNA40787质粒用BamHI和SacI(购自Takara)进行双酶切，回收目标片段即小片段。酶切反应体系及方法如下：

37℃酶切6h，1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。

2.pBI121质粒双酶切

用BamHI和SacI对pBI121质粒进行双酶切，回收pBI121片段即大片段。反应体系如下:

37℃酶切6h，l％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。

3.目标片段与pBI121载体连接

利用T4DNA连接酶(购自Takara)，将上述切胶回收得到的目标片段和双酶切后的pBI121载体连接。反应体系如下：

16℃连接14h得到重组表达载体pBI121-lncRNA40787，将上述表达载体连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布在含有卡那霉素的LB固体培养基上，挑取单菌落进行PCR及双酶切验证，结果显示表达载体构建成功。

实施例三：番茄抗晚疫病长链非编码RNA-lncRNA40787的应用

l.pBI121-lncRNA40787农杆菌工程菌的制备

⑴将2.0μL的pBI121-lncRNA40787质粒加入至100μL的农杆菌感受态细胞中，充分混匀后，冰水浴10min，迅速移至液氮中冷冻5min；

(2)将冷冻后的混合液于37℃水浴5min，加入1mL新鲜的YEB培养基，置于28℃恒温摇床中振荡(180rpm)培养3h；

(3)将上述菌液离心后，吸去1mL上清，充分吹打混匀余下的100μL菌液，均匀涂布于 YEB固体培养基(含100mg/L链霉素、100mg/L利福平和50mg/L卡那霉素)上，28℃培养36h；

(4)农杆菌工程菌的PCR检测

挑取上述平板中经抗生素筛选得到的菌落，置于5mL YEB中，28℃，180rpm振荡培养16-17h。

吸取上述菌液2μL，加入18μL的ddH

以上述DNA为模板，利用lncRNA40787特异性引物进行PCR，反应条件及反应体系同“实施例一中的3”。

2.农杆菌介导瞬时转化番茄早粉2号

(1)番茄种子的萌发

用水浸泡番茄种子12h，均匀摆放于湿润的滤纸上，表面再覆盖一层湿润的滤纸，保持90％以上的湿度，于28℃下暗培养至萌发。

(2)番茄植株的培养

播种刚萌发的种子至土壤中，在25-28℃，16h光照的条件下培养至5叶期。

(3)农杆菌菌液的制备

挑取含有空载体pBI121的农杆菌GV3101和经菌液PCR验证的阳性克隆，分别接种到含 50mg/L卡那霉素和100mg/L利福平的5mL YEB液体培养基中，于28℃,180rpm振荡培养18h；

按1:50的比例吸取上述菌液，加到含有l00 mg/L利福平、50mg/L卡那霉素、10mmol/L MES、20μmol/L AS和2mmol/L MgSO

4℃、4000r/min离心l0 min，收集农杆菌菌体，重悬菌体于含10mmol/L MES、10mmol/L MgCl

(4)瞬时侵染番茄叶片

转化前将5叶期番茄植株置于弱光下l-2h，并浇足水；

使用去除针头的1mL无菌注射器，在实验组和对照组的番茄叶背分别注射200μL上述活化的含有空载和pBI121-lncRNA40787的菌液；

注射完毕后，将番茄植株于25℃、16/8h的光/暗周期下培养。

3.瞬时转化番茄的表达特性及抗病性分析

(1)瞬时表达番茄的表达特性分析

取瞬时侵染3天的番茄叶片，提取总RNA，应用Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)(购自Takara)和Trans

实时定量所用特异性引物如下：

qlncRNA40787-FP:AAAATCAAGCACCACGCAGG

qlncRNA40787-RP:CAGGTCCACCAAAGGTCGAG

qmiR394:TTGGCATTCTGTCCACCTCC

(2)瞬时表达番茄的抗病性分析

选取瞬时表达3天的完好番茄植株叶片，于叶片注射处接种10μl浓度为1×10

将上述处理的叶片置于18℃光照培养箱，16/8h光周期，保持90％以上相对湿度，培养5 天后拍照记录发病情况。如图3所示，实验组叶片的病情程度明显弱于对照组，说明过表达 lncRNA40787(OE-lncRNA40787)可以降低番茄中miR394的表达量从而提高番茄对晚疫病的抗性。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 大连理工大学

<120> 番茄抗晚疫病长链非编码RNA-lncRNA40787及其克隆方法与应用方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 455

<212> DNA

<213> 番茄(Lycopersicon esculentum)

<400> 1

atcacaaaca agaaaatgct tcttctaaaa taaattcaca actatcacaa tctcaaatca 60

tcatcactcg tcggagaacc gaatatttaa aaaaacaagt atcatttttt tctctgataa 120

atgaaaaaat caagcaccac gcaggaatgc acatacagta acgaactcgt gttgatttta 180

tggagaagtt gaagttgcat ttagtcgatg aacgaatgcc tttgttccaa atcttcatgt 240

atctcctctg cgtttacctg gtatagcaag gctacggtac aacttattac tttgtgataa 300

gacaggctag ttgacaactc cattcacata tttctcagca ttagaggtgt ttgtggaggt 360

aatctcgacc tttggtggac ctgaatgccg tcttgtaatg gctggtgaag gtgagtaaga 420

gagtcgcttc ttcacagaac cagcagatcc cttcg 455

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgcgggatca caaacaagaa aatgcttc 28

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgagctcgcg aagggatctg ctggttctgt g 31

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaaatcaagc accacgcagg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caggtccacc aaaggtcgag 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttggcattct gtccacctcc 20