DNA-孔隙-聚合酶复合物的酶促富集

摘要

本发明提供一种用于分离测序复合物的方法，所述方法包括在与聚合酶共价连接的纳米孔和与纯化部分缔合的寡核苷酸之间形成复合物，使用能够结合所述纯化部分的固体支撑物从所述复合物分离出任何未结合/未复合的纳米孔和寡核苷酸，以及使用酶组合物从所述固体支撑物裂解结合的复合物。

说明书

技术领域

公开了用于分离聚合酶复合物的方法，该聚合酶复合物随后并入生物芯片的膜中以进行多核苷酸的纳米孔测序。也公开了用于分离活性聚合酶复合物的核酸衔接子、包含该核酸衔接子的聚合酶复合物，以及使用该核酸衔接子分离活性聚合酶复合物的方法。

背景技术

纳米孔是近年来兴起用于探究核酸序列和结构的无标记平台。数据典型地报告为与DNA序列相关联的离子电流变化的时间数列，因为该数据是通过跨受控于电压钳放大器的单个孔隙(pore)施加电场而测定的。可以在高带宽和高空间分辨率下检查数百至数千个分子。

阻碍纳米孔成功作为可靠DNA分析工具的障碍是：获得足够数量的功能性测序复合物以允许使用生物芯片上的大多数孔(well)以及长聚合物诸如千碱基长度或更长(单链基因组DNA或RNA)或小分子(例如，核苷)的测序都需要进行扩增或标记。

因此，对于有允许改善测序产率(例如，改善的生物芯片上功能性测序复合物数量)以及无需扩增或标记模板多核苷酸即可进行测序或鉴定的测序复合物存在需求。

发明内容

本公开提供一种用于分离测序复合物的方法，该方法包括在与聚合酶共价连接的纳米孔和与纯化部分缔合的寡核苷酸之间形成复合物，使用能够与该纯化部分结合的固体支撑物从该复合物中分离出任何未结合/未复合的纳米孔和寡核苷酸，以及使用酶组合物从该固体支撑物裂解所结合的复合物。

在一些实施例中，该方法包括(a)将富集引物与样品DNA退火以形成经退火的模板寡核苷酸；(b)纯化经退火的模板寡核苷酸；(c)将缀合物与经退火的模板寡核苷酸组合以形成杂烩(Eintopf)；(d)将该杂烩与能够与纯化部分结合的固体支撑物组合以产生富集的杂烩；以及(e)以酶组合物裂解接头以释放纯化部分，从而释放测序复合物以提供富集的测序复合物溶液。

在一些实施例中，该方法包括(a)将缀合物与含有纯化部分的经退火的模板寡核苷酸组合以形成杂烩，并且使缀合物与经退火的模板寡核苷酸结合以形成测序复合物；(b)将杂烩与能够与经退火的模板寡核苷酸的纯化部分结合的固体支撑物组合，(c)从结合的测序复合物分离出未结合的复合物组分；(d)以酶组合物裂解接头以释放纯化部分，其中纯化部分保持与固体支撑物缔合，从而释放测序复合物，以及(e)从测序复合物分离出固体支撑物以提供富集的测序复合物溶液。

在所有实施例中，富集引物包含与衔接子的一部分互补的寡核苷酸、可酶促裂解的接头和纯化部分。在所有实施例中，该接头包含无碱基位点或至少一个尿嘧啶残基。

在所有实施例中，该样品DNA是线性的、环状的或自引发的。在一些实施例中，该样品DNA已经与至少一个衔接子连接。在一些实施例中，该衔接子已经与该样品DNA的每一末端连接。在一些实施例中，该衔接子是哑铃状衔接子。在所有实施例中，该衔接子包含能够与富集引物结合的引物识别序列。

在一些实施例中，纯化经退火的模板寡核苷酸包括与固体支撑物结合，该固体支撑物选择性地结合双链DNA。在一些实施例中，经退火的模板寡核苷酸在与缀合物复合之前未经纯化。在一些实施例中，该双链DNA的长度大于100个碱基对、长度大于500bp或长度大于1000bp。在一些实施例中，该双链DNA是多个DNA片段的串联体。在所有实施例中，该样品DNA包含条形码，该条形码包含样品标识和/或患者标识。在一些实施例中，该固体支撑物包含珠粒。在一些实施例中，该珠粒是顺磁珠。在一些实施例中，该珠粒包含羧基部分。

在一些实施例中，该能够与纯化部分结合的固体支撑物是珠粒。在一些实施例中，该珠粒包含链霉亲和素。在一些实施例中，该珠粒是顺磁珠。

在一些实施例中，溶液中测序复合物的浓度大于70％，大于75％，大于80％。

在所有实施例中，该酶组合物包含核酸内切酶VIII、核酸内切酶III、裂解酶、糖酵解酶或其组合。

在一个实施例中，提供一种用于制备生物芯片的方法，该方包括(a)分离测序复合物；(b)使该测序复合物在该生物芯片的脂质双层上流动；以及(c)向该芯片施加足以将测序复合物插入该脂质双层中的电压。在一些实施例中，该生物芯片具有的所述纳米孔测序复合物的密度为1mm

附图说明

图1是本公开所述并且用于本公开方法中的各种组分的示意图。

图2是本文该方法的示意图。

图3示出了纳米孔检测方法中使用的pUC19哑铃状DNA模板的5466bp序列。

图4示出了线性衔接子(上)和HEG衔接子(下)。按出现顺序，图中分别公开了SEQID NO 11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 11和SEQ ID NO 12。

具体实施方式

对于本文和所附权利要求中的描述，单数形式“一个”和“一种”包括复数指代物，除非上下文另外明确指示。因此，例如，提到“一种蛋白质”包括超过一种蛋白质，并且提到“一种化合物”是指超过一种化合物。“包含”和“包括”可互换使用，并且不旨在限制。应进一步理解，如果对多个实施例的描述使用了术语“包含”，本领域技术人员应理解，在一些特定情况下，可使用语言“基本上由...组成”或“由...组成”替代性地描述实施例。

若提供数值的范围，则除非上下文另外明确规定，否则应理解为，介于该范围上限与下限之间的该数值的每个中间整数和该数值的每个中间整数的每十分之一(除非上下文另外明确规定)以及所指定范围内的任何其他指定值或中间值，为本发明所涵盖。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在该较小范围内，并且也为本发明所涵盖，以所指定范围内任何明确排除的限制为准。若所指定范围包括一个或两个限值，则排除那些所包括限制中的(i)任意一个或(ii)两个的范围也包括在本发明中。例如，“1至50”包括“2至25”、“5至20”、“25至50”、“1至10”等。

应理解，前述通用性说明(包括附图)和下述详细说明两者均为示例性的且仅为解释性的，并且不是对本公开的限制。

如本文所用，“核酸”是指一个或多个核酸亚基的分子，该核酸亚基包含核酸碱基即腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)或其变体中的一种。核酸可以指核苷酸(例如，dAMP、dCMP、dGMP、dTMP)的聚合物，该核苷酸的聚合物也称为多核苷酸或寡核苷酸，并且核酸包括单链形式和双链形式的DNA、RNA及其杂合物。

如本文所用，“核苷酸”是指核苷-5′-寡磷酸酯化合物，或核苷-5′-寡磷酸酯的结构类似物，其能够用作核酸聚合酶的底物或抑制剂。示例性的核苷酸包括但不限于，核苷-5′-三磷酸酯(例如，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和dUTP)；具有长度为4个或更多个磷酸酯的5′-寡磷酸酯链(例如，5′-四磷酸酯、5′-五磷酸酯、5′-六磷酸酯、5′-七磷酸酯、5′-八磷酸酯)的核苷(例如，dA、dC、dG、dT和dU)；以及核苷-5′-三磷酸酯的结构类似物，其可具有修饰的核酸碱基部分(例如，取代的嘌呤或嘧啶核酸碱基)、修饰的糖部分(例如，O-烷基化的糖)和/或修饰的寡磷酸酯部分(例如，包含硫代磷酸酯、亚甲基和/或其他磷酸酯间桥的寡磷酸酯)。

如本文所用，“核酸”是指包含附接至糖部分(例如，核糖或脱氧核糖)的天然出现或非天然出现的核酸碱基的分子部分。

如本文所用，“聚合酶”是指能够催化聚合反应诸如核苷酸单体的聚合以形成核酸聚合物的任何天然或非天然出现的酶或其他催化剂。可用于本公开组合物和方法中的示例性聚合酶包括核酸聚合酶，诸如DNA聚合酶(例如，EC 2.7.7.7类的酶)、RNA聚合酶(例如，EC2.7.7.6类或EC 2.7.7.48类的酶)、逆转录酶(例如，EC 2.7.7.49类的酶)和DNA连接酶(例如，EC 6.5.1.1类的酶)。

如本文所用，“部分”是指分子的一部分。

如本文所用，“接头”是指在两个或更多个分子、分子基团和/或分子部分之间提供具有一定空间的键合附接的任何分子部分。

如本文所用，“标签”是指部分或分子的一部分，其使得具有增强或直接或间接地检测和/或鉴定与该标签偶联的分子或分子复合物的能力。例如，标签可提供可检测的性质或特征，诸如空间体量或体积、静电电荷、电化学电势和/或光谱标志。

如本文所用，“纳米孔”是指形成在或以其他方式提供在膜或其他屏障材料中的孔隙、隧道或通道，其具有约1埃至约10,000埃的特征宽度或直径。纳米孔可由以下项作成：天然出现的成孔蛋白诸如来自金黄色葡萄球菌(S.aureus)的α-溶血素、或野生型成孔蛋白的非天然出现(即，工程化)的突变体或变体诸如α-HL-C46或天然出现的突变体或变体。膜可以是有机膜诸如脂质双层，或由非天然出现的聚合性材料制作的合成膜。纳米孔可以设置成邻近或靠近传感器、传感电路或与传感电路(诸如，举例而言，互补金属氧化物半导体(CMOS)或场效应晶体管(FET)电路)偶联的电极。

如本文所用，“纳米孔可检测的标签”是指一种标签，其可以进入纳米孔、变成被定位在纳米孔中、被纳米孔捕获、转运通过纳米孔和/或穿过纳米孔，并因此造成穿过该纳米孔的电流的可检测的变化。示例性的纳米孔可检测的标签包括但不限于，天然聚合物或合成聚合物，诸如聚乙二醇、寡核苷酸、多肽、碳水化合物、肽核酸聚合物、锁核酸聚合物，其任一者都可以可选地以化学基团修饰或与化学基团链接，该化学基团可导致可检测的纳米孔电流变化，诸如染料部分或荧光团。

如本文所用，“离子流动”是由于电动势诸如阳极与阴极间的电势造成的离子运动(典型是在溶液中)。典型地，离子流动可测量为电流或静电势的衰减。

如本文所用，在纳米孔检测的语境中，“离子流动改变”是指导致穿过纳米孔的离子流动相对于穿过处于其“开放隧道”(O.C.)状态的该纳米孔的离子流动减少或增加的特征。

如本文所用，“开放隧道电流”、“O.C.电流”或“背景电流”是指，当施加电势并且纳米孔开放(例如，纳米孔中没有标签存在)时，跨该纳米孔测量的电流水平。

如本文所用，“标签电流”是指当施加电势并且标签存在于纳米孔中时，跨该纳米孔测量的电流水平。例如，取决于标签的特定特征(例如，整体电荷、结构等)，标签在纳米孔中的存在可减少穿过该纳米孔的离子流动，并因此导致所测量的标签电流水平降低。

如本文所用，“复合物组分”是指形成测序复合物所需的未结合组分”。该组分包括与纯化部分缔合的多核苷酸，以及聚合酶-纳米孔复合物。当多核苷酸模板或衔接子不是自引发的时，可将该多核苷酸模板退火成寡核苷酸引物，其中该寡核苷酸引物包含纯化部分。该寡核苷酸引物、或自引发的模板或自引发的衔接子还包含纯化部分。

如本文所用，“杂烩”是指包含测序复合物的元件(即经退火的模板(例如，模板-引物杂合物))和缀合物或由该元件和缀合物组成的复合物。一旦经退火的模板和缀合物在溶液中缔合，则可自其分离测序复合物以提供富集的测序复合物。

如本文所用，“聚合酶复合物”是指通过聚合酶和多核苷酸模板底物的缔合形成的复合物。并非自引发的多核苷酸模板需要寡核苷酸引物来启动扩链。据此，在不存在自引发的多核苷酸的情况下，聚合酶复合物还可包括寡核苷酸引物，该寡核苷酸引物可包含纯化部分。

如本文所用，“富集的测序复合物”是指包含测序复合物的溶液，该测序复合物已经从包含杂烩的溶液中富集，使得尚未变成缔合以形成测序复合物的复合物组分已经被移除，从而得到含有按重量计至少70％、75％、80％或85％测序复合物的溶液。

如本文所用，“缀合物”是指与聚合酶共价连接的纳米孔。

如本文所用，“捕获复合物”是指通过聚合酶、多核苷酸模板底物和捕获寡核苷酸的缔合形成的复合物。

“捕获寡核苷酸”或“富集引物”可互换使用，并且如本文中所用，是指包含用以固定化测序复合物的纯化部分的寡核苷酸，通过该纯化部分，测序复合物与固体支撑物缔合。优选地，该纯化部分可以是生物素或修饰的生物素，其与固体支撑物上的纯化部分结合配偶体(例如，链霉亲和素或修饰的链霉亲和素)结合。如果模板寡核苷酸是自引发的，则纯化部分被并入自引发的模板中(如下文所提供)，因此，当与缀合物缔合时是捕获寡核苷酸。

如本文所用，“多核苷酸模板”和“多核苷酸底物模板”是指一种多核苷酸分子，通过多核苷酸聚合酶例如DNA聚合酶由该多核苷酸分子合成互补核酸链。多核苷酸模板可以是线性的、发夹形的或连续的。连续模板可以是环状的或哑铃状的。发夹形模板可以是自引发的模板或包含通用引物序列。

如所用，“引物化模板”和“经退火的模板”是指与纯化部分缔合的寡核苷酸模板。因此，如果模板寡核苷酸是自引发的，则纯化部分被并入该自引发的模板中。此外，如果衔接子已经与模板寡核苷酸连接并且该衔接子是自引发的，则该纯化部分被并入该自引发的衔接子中。最后，如果模板寡核苷酸已经退火成引物，则该引物包含纯化部分。

如本文所用，“纯化部分”是指辅助纯化测序复合物的部分。

如本文所用，“测序复合物”是指与DNA聚合酶共价连接的孔隙，该DNA聚合酶与引物化的模板DNA例如经退火的模板结合。

如本文所用，“富集的”是指分子按重量计以至少75％的浓度存在于样品中，或按重量计以至少80％的浓度存在于包含该分子的样品中。

如本文所用，“生物素化的”是指修饰的分子，例如，核酸分子(包括单链或双链DNA、RNA、DNA/RNA嵌合分子、核酸类似物、以及含有或并入有核苷酸序列的任何分子，例如，肽核酸(PNA)或其任意修饰)、蛋白质(包括糖蛋白、酶、肽文库或显示产品和抗体或其衍生物)、肽、碳水化合物或多糖、脂质等，其中该分子与生物素或生物素类似物共价连接。很多生物素化的配体是可商购的或可通过标准方法制备。将生物分子例如核酸分子或蛋白质分子与生物素偶联的过程是本领域中已知的(Bayer和Wilchek，“Avidin-BiotinTechnology：Preparation of Biotinylated Probes”，Methods in Molec.Biology 10，137-148.1992)。

如本文所用，“结合配偶体”是指能够与另一个生物分子特异性或非特异性结合或相互作用的任何生物分子或其他有机分子，所述结合或相互作用可称为“配体”结合或相互作用并且例示为但不限于：抗体/抗原、抗体/半抗原、酶/底物、酶/抑制剂、酶/辅因子、结合蛋白/底物、载体蛋白/底物、凝集素/碳水化合物、受体/激素、受体/效应子或阻遏物/诱导物结合或相互作用。本文中，术语“结合配偶体”是指在本文所述分离方法中使用的亲和性复合物的配偶体，例如，生物素-生物素结合配偶体。

如本文所用，“生物素结合”化合物旨在涵盖能够与生物素或任何生物素化合物紧密但非共价地结合的任何化合物。优选的生物素结合化合物包括修饰的链霉亲和素和亲和素及其衍生物和类似物，例如，硝基链霉亲和素。

如本文所用，“亲和素”是指天然蛋清糖蛋白亲和素及其衍生物或等效物，诸如去糖基化形式或重组形式的亲和素，例如，N-酰基亲和素，例如，N-乙酰基亲和素、N-邻苯二甲酰基亲和素和N-琥珀酰基亲和素，以及商业产品ExtrAvidin、Neutralite Avidin和CaptAvidin。

如本文所用，“链霉亲和素”是指由所选择的链霉菌菌株例如亲和素链霉菌(Streptomyces avidinii)产生的细菌链霉亲和素及其衍生物或等效物，诸如重组链霉亲和素和截短的链霉亲和素，例如，“核心”链霉亲和素。

本文提供的方法和组合物适用于各种不同种类的核酸模板、新生链和双链产物，包括单链DNA；双链DNA；单链RNA；双链RNA；DNA-RNA杂合物；包含修饰的、缺失的、非天然的、合成的和/或罕见的核苷的核酸；及其衍生物、模拟物和/或组合。

本发明的模板核酸可包含任何合适的多核苷酸，包括双链DNA、单链DNA、单链DNA发夹结构、DNA/RNA杂合物、具有结合聚合剂的识别位点的RNA、和RNA发夹结构。再者，靶标多核苷酸可以是细胞基因组的特定部分，诸如内含子、调节区、等位基因、变体或突变；全基因组；或其任意部分。在其他实施例中，靶标多核苷酸可以是或衍生自mRNA、tRNA、rRNA、核糖酶、反义RNA或RNAi。

模板核酸(例如，多核苷酸)可包括非天然核酸诸如PNA、修饰的寡核苷酸(例如，包含对于生物RNA或DNA并非典型的核苷酸的寡核苷酸，诸如240-O-甲基化寡核苷酸修饰的磷酸酯骨架等。核酸可以是，例如，单链的或双链的。

用于生产本文方法中的模板核酸(即，靶标核酸)的核酸基本上可以是可适用于本文所示方法的任何类型的核酸。在一些情况下，靶标核酸本身包含可直接作为模板核酸使用的片段。典型地，将靶标核酸片段化并进一步处理(例如，与衔接子连接和/或环化)以用作模板。例如，靶标核酸可以是DNA(例如，基因组DNA、mtDNA等)、RNA(例如，mRNA、siRNA等)、cDNA、肽核酸(PNA)、扩增的核酸(例如，经由PCR、LCR或全基因组扩增(WGA))、经历片段化和/或连接修饰的核酸、全基因组DNA或RNA，或其衍生物(例如，化学修饰的、标记的、重新编码的、蛋白质结合的或以其他方式改变的)。

模板核酸可以是线性的、环状的(包括用于环形冗余测序(CRS)的模板)、单链的或双链的、和/或具有单链区的双链的(例如，茎和环结构)。模板核酸可以从以下项纯化或分离：环境样品(例如，海水、冰芯、土壤样品等)、培养样品(例如，原代细胞培养物或细胞系)、被病原体(例如，病毒或细菌)感染的样品、组织或生物活检样品、法医样品、血液样品或来自有机体(例如，动物、植物、细菌、真菌、病毒等)的另一样品。此类样品可含有各种其他组分，诸如蛋白质、脂质和非靶标核酸。在某些实施例中，模板核酸是来自有机体的全基因组样品。在其他实施例中，模板核酸是从生物样品中提取的总RNA或cDNA文库。在一些实施例中，模板DNA是从血液或血浆样品获得的不含细胞的DNA(cfDNA)样品。在一些实施例中，血液样品包含胎儿DNA。

在一些实施例中，模板DNA与衔接子连接。该衔接子可以是线性衔接子、哑铃状衔接子、六甘醇(HEG)衔接子等。在一些实施例中，该衔接子包含能够用捕获寡核苷酸退火的序列。该HEG衔接子包括18个原子的间隔，该间隔阻断聚合酶活性。因此，聚合酶不能像它对传统哑铃状衔接子所做的那样同时读取两条链。哑铃状衔接子是本领域中周知的并且在别处有所描述；参见，例如，US8153375(太平洋生物科学公司(Pacific Biosciences))。

测序复合物的聚合酶可以是野生型的或在所使用的测序条件下保持聚合酶活性的变体聚合酶。用于本文所述组合物和方法中的聚合酶的示例包括phi29、pol6及其变体诸如外切核酸酶缺陷的聚合酶和/或动力性特征有所改变的变体聚合酶。在一些实施例中，该聚合酶是Pol6聚合酶，其具有与SEQ ID NO：3至少70％一致的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3(野生型Pol6(DNA聚合酶[梭状芽胞杆菌属噬菌体phiCPV4]；GenBank：AFH27113.1)

通过天然出现和非天然出现(例如，工程化或重组)的成孔蛋白两者生成的纳米孔可用于本文中。本领域中已知可用于生成纳米孔的多种成孔蛋白，该纳米孔可用来进行本公开的对改变离子流动的标签的纳米孔检测。生物纳米孔包括来自大肠杆菌(E.coli，sp.)、沙门氏菌属(Salmonella sp.)、志贺氏菌属(Shigella sp.)和假单胞菌属(Pseudomonas sp.)的OmpG，以及来自金黄色葡萄球菌(S.aureus sp.)的α溶血素和来自耻垢分枝杆菌(M.smegmatis sp.)的MspA。代表性的成孔蛋白包括但不限于，α-溶血素、β-溶血素、γ-溶血素、气单胞菌溶素、细胞溶素、杀白细胞素、蜂毒肽、MspA孔蛋白和孔蛋白A。纳米孔可以是野生型纳米孔、变体纳米孔和修饰的变体纳米孔。

变体纳米孔可经工程化以具备相对于亲本酶改变的特征。参见，例如，2015年10月28日提交的题为“alpha-Hemolysin Variants with Altered Characteristics”的美国专利申请No.14/924,861和2017年4月20日提交的题为“alpha-Hemolysin variants andUses Thereof”的美国专利申请No.15/492,214，这些美国专利申请通过引用而以其整体并入本文。

其他变体纳米孔也描述在例如2017年6月29日提交的题为“Long LifetimeAlpha-Hemolysin Nanopores”的美国专利申请No.15/638,273中，该美国专利申请通过引用而以其整体并入本文。在其他示例实施例中，可如2017年3月29日提交的题为“NanoporeProtein Conjugates and Uses Thereof”的国际专利申请No.PCT/EP2017/057433中所述来修饰α-溶血素纳米孔的α-溶血素，该国际专利申请通过引用而以其整体并入本文。

来自金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)的α-溶血素(本文中也称为“α-HL”)，是成孔蛋白类中被研究最多的成员之一，并且已经广泛用来创建纳米孔装置。(参见，例如，美国专利申请No.2015/0119259、No.2014/0134616、No.2013/0264207和No.2013/0244340。)也已经使用大量技术，包括定点突变和化学标记，对d-HL进行测序、克隆、广泛的结构表征和功能表征(参见，例如，Valeva等人(2001)，及其中引用的参考文献)。

天然出现的(即，野生型)α-HL成孔蛋白亚基的氨基酸序列显示如下。

上述野生型α-HL氨基酸序列是适用于确定替换位置的成熟序列，因此不包括初始甲硫氨酸残基。在一些实施例中，α-HL亚基在氨基酸G294处被截短，并且可选地包括如下文公开的C末端SpyTag肽融合。

已经制备了各种非天然出现的α-HL成孔蛋白，包括而不限于，包含以下替换中的一个或多个的变体α-HL亚基：H35G、H144A、E111N、M113A、D127G、D128G、T129G、K131G、K147N和V149K。这些各种工程化的α-HL孔多肽的性质在例如美国专利申请No.2017/0088588、No.2017/0088890、No.2017/0306397和2018/0002750中有所描述，这些美国专利申请各自通过引用并入本文。

众所周知，α-HL单体的七聚复合物自发地形成包埋在脂质双层膜内并创建穿过该脂质双层膜的孔隙的纳米孔。已经发现，包含比率为6∶1的天然α-HL和突变α-HL的α-HL七聚体可形成纳米孔(参见，例如，Valeva等人(2001)“Membrane insertion of theheptameric staphylococcal alpha-toxin pore-A domino-like structuraltransition that is allosterically modulated by the target cell membrane”，J.Biol.Chem.276(18)：14835-14841，及该论文中引用的参考文献)。该七聚孔隙的一个α-HL单体单元可使用如WO 2015/148402中所述的SpyCatcher/SpyTag缀合方法与DNA-聚合酶共价缀合，该专利通过引用并入本文(也参见，Zakeri and Howarth(2010)，J.Am.Chem.Soc.132：4526-7)。简而言之，SpyTag肽作为重组融合体附接到α-HL的1x亚基的C末端，而SpyCatcher蛋白片段作为重组融合体附接到扩链酶例如Pol6 DNA聚合酶的N末端。SpyTag肽和SpyCatcher蛋白片段经历SpyCatcher蛋白的赖氨酸残基与SpyTag肽的天冬氨酸残基之间的反应，造成两个α-HL亚基与酶缀合的共价链接。

通常，使用与本领域中已知的用于野生型或其他工程化α-HL蛋白者的相同方法，使用该α-HL亚基来制备七聚α-HL纳米孔。据此，在一些实施例中，本公开的化合物可与纳米孔装置合用。该七聚α-HL纳米孔具有六个各自均没有用于附接聚合酶的接头的亚基，以及一个具有包括SpyTag肽AHIVMVDAYK(SEQ ID NO：5)的C末端融合体(始于截短的野生型序列的位置294处)的亚基。SpyTag肽允许纳米孔与SpyCatcher修饰的扩链酶诸如Pol6 DNA聚合酶的缀合。

在一些实施例中，突变体的C末端SpyTag肽融合体包含接头肽(例如，GSSGGSSGG(SEQ ID NO：6))、SpyTag肽(例如，AHIVMVDAYKPTK (SEQ ID NO：7))和末端His标签(例如，KGHHHHHH(SEQ ID NO：8))。因此，C末端SpyTag肽融合体包含以下氨基酸序列：GSSGGSSGGAHIVMVDAYKPTKKGHHHHHH (SEQ ID NO：9)。在一些实施例中，该C末端SpyTag肽融合体附接在一个亚基的位置294处，该亚基是相对于野生型α-HL亚基序列截短的。(参见，例如，如WO2017125565A1中所述的SEQ ID NO：2的C末端SpyTag肽融合体，该专利通过引用并入本文)。

用于将聚合酶与纳米孔附接的示例性方法包括将接头分子与纳米孔附接或将纳米孔突变以具有附接位点，然后将聚合酶附接到该附接位点或附接接头。在将纳米孔插入膜内之前，将聚合酶附接到附接位点或附接接头。在一些情况下，将缀合物插入设置在孔和/或生物芯片电极上的脂质膜内。

在一些例子中，将聚合酶表达为包含SpyCatcher多肽的融合蛋白，该融合蛋白可与包含SpyTag肽的纳米孔共价结合(Zakeri等人PNAS109：E690-E697[2012])。

可以任何合适的方式形成该缀合物，例如，聚合酶-纳米孔复合物。可使用SpyTag/SpyCatcher肽系统(Zakeri等人PNAS109：E690-E697[2012])、天然化学连接(Thapa等人，Molecules 19：14461-14483[2014])、分选酶系统(Wu and Guo，J Carbohydr Chem 31：48-66[2012]；Heck等人，Appl Microbiol Biotechnol 97：461-475[2013])、转谷氨酰胺酶系统(Dennler等人，Bioconjug Chem 25：569-578[2014])、甲酰甘氨酸链接(

在一些例子中，使用Solulink

在一些情况下，将锌指突变引入纳米孔分子中，然后使用分子(例如，DNA中间体分子)将Pol6聚合酶与该纳米孔(例如，α-溶血素)上的锌指位点链接。

此外，可通过在附接位点与纳米孔附接的接头分子的手段将聚合酶附接到纳米孔(例如，aHL、OmpG)。在一些情况下，使用分子钉将聚合酶附接到纳米孔。在一些例子中，分子钉包含三个氨基酸序列(表示为接头A、B和C)。接头A可从纳米孔单体延伸，接头B可从聚合酶延伸，然后接头C通过缠绕(例如，缠绕着接头A和B两者)将接头A和接头B结合，从而将聚合酶与纳米孔链接。也可将接头C构造成接头A或接头B的一部分，从而减少接头分子的数量。

可用于将聚合酶附接到纳米孔的其他接头是直接基因连锁(例如，(GGGGS)

替代地，可使用在大量允许通过马来酰亚胺链接化学进行蛋白质共价修饰的位置处插入的半胱氨酸残基替换将α-HL单体工程化(参见，如Valeva等人(2001))。例如，可使用K46C突变修饰单个α-HL亚基，然后用接头简单地修饰，从而允许使用四嗪-反式-环辛烯点击化学将DNA聚合酶的Bst2.0变体附接到该七聚6∶1纳米孔。此实施例在2017年2月22日提交的题为“Pore-forming Protein Conjugate Compositions and Methods”的美国专利申请No.15/439,173中描述，该美国专利申请通过引用并入本文。

用于将扩链酶附接到纳米孔的其他方法包括天然化学连接(Thapa等人，Molecules 19：14461-14483[2014])、分选酶系统(Wu and Guo，J Carbohydr Chem 31：48-66[2012]；Heck等人，Appl Microbiol Biotechnol 97：461-475[2013])、转谷氨酰胺酶系统(Dennler等人，Bioconjug Chem 25：569-578[2014])、甲酰甘氨酸链接(Rashidian等人，Bioconjug Chem 24：1277-1294[2013])，或本领域中已知的化学连接技术。也可使用以下项中所述的方法将聚合酶附接到纳米孔：例如，PCT/EP2017/057002(公布为WO2017/162828；吉尼亚技术公司(Genia Technologies，Inc.)和罗氏公司(F.Hoffmann-La RocheAG))、PCT/US2013/068967(公布为WO2014/074727；吉尼亚技术公司(Genia Technologies，Inc.))、PCT/US2005/009702(公布为WO2006/028508；哈佛大学(President and Fellowsof Harvard College))和PCT/US2011/065640(公布为WO2012/083249；哥伦比亚大学(Columbia University))。

通过测序复合物实施聚合酶辅助纳米孔测序，该测序复合物通过将引物化模板(例如与纯化部分缔合的靶标多核苷酸)与缀合物(即，聚合酶-纳米孔复合物)缔合形成。在一些实施例中，接着将聚合酶-孔隙复合物与模板链接以形成测序复合物，接着将该测序复合物插入脂质双层内。

跨已经被插入(例如，通过电穿孔)脂质膜内的纳米孔测量流经纳米孔的离子电流。可通过刺激信号诸如电刺激、压力刺激、液体流动刺激、气体鼓泡刺激、超声、声音、振动或其组合插入纳米孔。在一些情况下，在鼓泡的辅助下形成该膜，并且在电刺激的辅助下将纳米孔插入该膜。在其他实施例中，纳米孔将其自身插入该膜内。用于组装脂质双侧的方法和对核酸分子测序的方法可在PCT专利申请No.WO2011/097028和No.WO2015/061510中找到，这些PCT专利申请通过引用而以其整体并入本文。

在一些示例实施例中，该纳米孔的特征相对于野生型纳米孔有所改变。在一些实施例中，将纳米孔测序复合物的变体纳米孔工程化以降低衍生该变体纳米孔的亲本纳米孔的离子电流噪声。具有改变特征的变体纳米孔的示例是，在约束位点具有一个或多个突变的OmpG纳米孔(2016年9月20日提交的题为“OmpG Variants”的国际专利申请No.PCT/EP2016/072224，该国际专利申请通过引用而以其整体并入本文)，其相对于亲本OmpG降低了离子噪声水平。降低的离子电流噪声为这些OmpG纳米孔变体在多核苷酸和蛋白质的单分子传感中的使用提供了条件。在其它实施例中，可将变体OmpG多肽进一步突变以结合分子衔接子，当它停留在孔隙内时，减慢被分析物(例如，核苷酸碱基)穿过该孔隙的运动，并因此提高对被分析物的鉴定准确性(Astier等人，J Am Chem Soc 10.1021/ja057123+，2005年12月30日在网上发表)。

典型地，修饰的变体纳米孔是多聚纳米孔，其亚基已经被工程化以影响亚基间相互作用(2016年9月23日提交的题为“Alpha-Hemolysin Variants”的美国专利申请No.15/274,770，该美国专利申请通过引用而以其整体并入本文)。改变的亚基相互作用可用来具化单体借以在脂质双层中形成多聚纳米孔的顺序和次序。这一技术提供对形成纳米孔的亚基的化学计量学的控制。其亚基已经被修饰以确定寡聚过程中亚基相互作用顺序的多聚纳米孔的示例是aHL纳米孔。

在一些示例实施例中，将单个聚合酶附接到每个纳米孔。在其他实施例中，将两个或更多个聚合酶附接到单体纳米孔或附接到寡聚纳米孔的亚基。

纳米孔装置和制备并在纳米孔检测应用(诸如使用改变离子流动的标签化核苷酸进行纳米孔测序)中使用其方法是本领域中已知的(参见，例如，美国专利No.7,005,264B2、No.7,846,738、No.6,617,113、No.6,746,594、No.6,673,615、No.6,627,067、No.6,464,842、No.6,362,002、No.6,267,872、No.6,015,714、No.5,795,782以及美国专利申请No.2015/0119259、No.2014/0134616、No.2013/0264207、No.2013/0244340、No.2004/0121525和No.2003/0104428，这些美国专利和美国专利申请通过引用而以其整体并入本文)。通常，纳米孔装置包含包埋在脂质双层膜中的成孔蛋白，其中该膜被固定在或附接到包含孔或储器的固体基底上。该纳米孔的孔隙延伸穿过膜，在该膜的顺式侧和反式侧之间创建流体联接。典型地，固体基底包含选自由聚合物、硅及其组合所组成组的材料。此外，固体基底包含邻近该纳米孔的传感器、传感电路或与传感电路(任选地，互补金属氧化物半导体(CMOS)或场效应晶体管(FET)电路)偶联的电极。典型地，在膜的顺式侧和反式侧上存在电极，该电极允许跨该膜设定DC或AC电压电势，从而生成流经该纳米孔的孔隙的基线电流(或O.C.电流水平)。标签(诸如2018年2月28日提交的题为“Tagged Nucleoside CompoundsUseful For Nanopore Detection”的美国专利临时申请62/636,807、2016年8月26日提交的题为“Polypeptide Tagged Nucleotides and Uses Thereof”的国际专利申请PCT/EP2016/070198、2013年9月19日公布的题为“Nanopore Based Molecular Detection andSequencing”的美国专利申请公布US 2013/0244340 A1、2013年10月10日公布的题为“DNASequencing By Synthesis Using Modified Nucleotides And Nanopore Detection”的美国专利申请公布US 2013/0264207 A1和2014年5月14日公布的题为“Nucleic AcidSequencing Using Tags”的美国专利申请公布US 2014/0134616 A1中所述)的存在导致经过纳米孔的正离子流动发生变化，从而生成了跨电极的电流水平相对于纳米孔O.C.电流的可测量的变化。

预期，改变离子流动的标签化合物(即，标签化的核苷酸)可与多种纳米孔装置合用，该纳米孔装置包含通过天然出现和非天然出现(例如，工程化或重组)的成孔蛋白生成的纳米孔。本领域中已知可用于生成纳米孔的多种成孔蛋白，该纳米孔可用来进行本公开的对改变离子流动的标签的纳米孔检测。代表性的成孔蛋白包括但不限于，α-溶血素、β-溶血素、γ-溶血素、气单胞菌溶素、细胞溶素、杀白细胞素、蜂毒肽、MspA孔蛋白和孔蛋白A。

天然出现的(即，野生型)α-HL成孔蛋白亚基的氨基酸序列显示如下。

野生型α-HL氨基酸序列(SEQ ID NO：4)

上述野生型α-HL氨基酸序列是本文所述的适用于确定替换位置的成熟序列，因此不包括初始甲硫氨酸残基。在一些实施例中，α-HL的突变亚基除了包括本文所公开的突变之外，还在氨基酸G294处被截短，并且可选地包括如下文公开的C末端SpyTag肽融合。

已经制备了各种非天然出现的α-HL成孔蛋白，包括而不限于，包含以下替换中的一个或多个的变体α-HL亚基：H35G、H144A、E111N、M113A、D127G、D128G、T129G、K131G、K147N和V149K。这些各种工程化的α-HL孔多肽的性质在例如美国专利申请No.2017/0088588、No.2017/0088890、No.2017/0306397和2018/0002750中有所描述，这些美国专利申请各自通过引用并入本文。

如本文中别处所述，以使用本文所述Pol6纳米孔测序复合物的变体Pol6聚合酶为特征的分子可以是各种类型的，包括带电分子或极性分子诸如带电聚合物分子或极性聚合物分子。特定示例包括核糖核酸(RNA)分子和脱氧核糖核酸(DNA)分子。DNA可以是单链DNA(ssDNA)分子或双链DNA(dsDNA)分子。可以将核糖核酸逆转录，然后测序。

在某些示例实施例中，提供了使用根据本文所提供方法制备的聚合酶-模板复合物在高盐浓度下进行核酸测序的方法，即，在高盐浓度且不存在核苷酸的情况下进行核酸测序的方法。接着，将聚合酶-模板复合物附接到纳米孔以形成纳米孔测序复合物，该纳米孔测序复合物检测多核苷酸序列。在其他示例实施例中，提供了使用根据本文所提供方法制备的聚合酶-模板复合物进行核酸测序的方法，诸如使用低核苷酸浓度、在高温下、以及在不存在过量聚合酶的情况下形成聚合酶-模板复合物。接着，将聚合酶-模板复合物附接到纳米孔以形成纳米孔测序复合物，该纳米孔测序复合物检测多核苷酸序列。

包含根据本文所提供组合物和方法制备的聚合酶-模板复合物的纳米孔测序复合物，可用于使用本领域中已知的采用酶进行多核苷酸测序的其他纳米孔测序平台在高盐浓度下测定核酸的序列。同样，包含根据所提供组合物和方法制备的聚合酶-模板复合物的纳米孔测序复合物，可用于使用本领域中已知的采用酶进行多核苷酸测序的其他纳米孔测序平台在例如高温下测定核酸的序列。例如，包含根据本文所述方法制备的聚合酶-模板复合物的纳米孔测序复合物，可用于根据Oxford Nanopore(Oxford，UK)、Illumina(San Diego，CA)和Stratos Genomics(Seattle，WA)的纳米孔扩张测序(nanopore sequencing-by-expansion)的基于螺旋酶和核酸外切酶的方法进行核酸测序。

在一些示例实施例中，核酸测序包含制备包含根据本文所述方法制备的聚合酶-模板复合物的纳米孔测序复合物，并且如PCT/US2013/068967(2013年11月7日提交，题为“Nucleic Acid Sequencing Using Tags”，通过引用而以其整体并入本文)中所述，使用标签化核苷酸在高盐浓度下测定多核苷酸序列。例如，处于邻近或在传感层面靠近一个或多个传感电极的膜(例如，脂质双层)内的纳米孔测序复合物，可在高盐浓度下通过聚合酶检测标签化核苷酸的并入，因为该核苷酸碱基被并入与该聚合酶缔合的多核苷酸链的互补链内，并且该核苷酸的标签被纳米孔检测。该聚合酶-模板复合物可与本文所提供的纳米孔缔合。

该标签化核苷酸的标签可包括能够被纳米孔检测的化学基团或分子。用来提供标签化核苷酸的标签的示例至少在PCT/US2013/068967的段落[0414]至[0452]有所描述。核苷酸可从不同核苷酸的混合物并入，该混合物是例如标签化dNTP的混合物，其中N是腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)或尿嘧啶(U)。替代地，核苷酸可从个体标签化dNTP的替代溶液并入，即，标签化dATP，之后是标签化dCTP，之后是标签化dGTP等。对多核苷酸序列的测定可随着纳米孔在标签流经或邻近该纳米孔时、或在标签停留在该纳米孔中时和/或在标签被呈递至该纳米孔时检测该标签而发生。每个标签化核苷酸的标签可在任何位置处与核苷酸碱基偶联，该位置包括但不限于该核苷酸的磷酸酯(例如，γ磷酸酯)、糖或含氮碱基部分。在一些情况下，当标签在核苷酸标签的并入过程中与聚合酶缔合时，标签被检测。标签可继续被检测，直到该标签在核苷酸并入之后转运穿过纳米孔并且随后裂解和/或释放该标签为止。在一些情况下，核苷酸并入事件从标签化核苷酸释放标签，并且标签穿过纳米孔并被检测。标签可由聚合酶释放，或以包括而不限于通过定位在接近聚合酶处的酶裂解的任何合适方式裂解/释放。通过这种方式，可鉴定所并入的碱基(即，A、C、G、T或U)，因为从每种类型的核苷酸(即，腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶)释放了独特的标签。在一些状况下，核苷酸并入事件不释放标签。在这种情况下，在纳米孔的辅助下检测与所并入的核苷酸偶联的标签。在一些实例中，标签可移动穿过或靠近纳米孔并在该纳米孔的辅助下被检测。

因此，在一方面，提供了用于在纳米孔测序复合物的辅助下，在高盐浓度下对来自样品例如生物样品的多核苷酸进行测序的方法。在包含高浓度的盐且基本上不含核苷酸的溶液中，将样品多核苷酸和聚合酶组合，以提供纳米孔测序复合物的聚合酶-模板复合物部分。在一个实施例中，样品多核苷酸是样品ssDNA链，其与DNA聚合酶组合以提供聚合酶-DNA复合物，例如，Pol6-DNA复合物。

在一些实施例中，通过以下所述实施多核苷酸样品的纳米孔测序：在包含高浓度例如超过100mM的盐并且基本上不含核苷酸的溶液中，提供聚合酶-模板复合物，例如，Pol6-模板或变体Pol6-模板复合物；将该聚合酶-模板复合物附接到纳米孔以形成纳米孔测序复合物；以及提供核苷酸以启动模板依赖性链合成。测序复合物的纳米孔部分定位在邻近或靠近传感电极的膜内，如本文中别处所述。所得纳米孔测序复合物能够在高盐浓度下测定样品DNA中的核苷酸碱基序列，如本文中别处所述。在其他实施例中，纳米孔测序复合物测定双链DNA的序列。在其他实施例中，纳米孔测序复合物测定单链DNA的序列。在其他实施例中，纳米孔测序复合物通过对逆转录产物测序而测定RNA的序列。

在一些实施例中，提供了用于纳米孔测序的方法。该方法包括(a)在包含高浓度例如至少100mM盐且不含核苷酸的溶液中，提供聚合酶-模板复合物；(b)将该聚合酶-模板复合物与纳米孔组合以形成纳米孔测序复合物；(c)向该纳米孔测序复合物提供标签化的核苷酸以启动模板依赖性纳米孔测序；以及(d)在纳米孔的辅助下，检测在并入每个核苷酸的过程中与每个标签化核苷酸缔合的标签，以测定该模板的序列。聚合酶-模板复合物的聚合酶可以是野生型的或在高盐浓度下保持聚合酶活性的变体聚合酶。可用于本文所述组合物和方法中的聚合酶的示例包括本文中别处所述的耐盐聚合酶。在一些实施例中，聚合酶-模板复合物的聚合酶是Pol6聚合酶，其具有与SEQ ID NO：3至少70％一致的氨基酸序列。

在一些实施例中，提供了对核酸样品进行纳米孔测序的方法。该方法包括使用包含本文所提供的变体Pol6聚合酶的纳米孔测序复合物。在一个实施例中，该方法包括，向Pol6纳米孔测序复合物提供标签化核苷酸，进行聚合反应以将该核苷酸以模板依赖性方式并入，以及检测每个所并入核苷酸的标签以测定模板DNA的序列。

在一个实施例中，向包含本文所提供的变体Pol6聚合酶的Pol6纳米孔测序复合物提供标签化核苷酸，在所述纳米孔测序复合物的变体Pol6酶的辅助下实施聚合反应，以将标签化核苷酸并入生长中的与来自核酸样品的单链核酸分子互补的链中；以及在纳米孔的辅助下，检测在个体标签化核苷酸并入过程中与所述个体标签化核苷酸缔合的标签，其中，在该核苷酸与变体Pol6聚合酶缔合的同时，在所述纳米孔的辅助下检测该标签。

在一方面，提供了用于在纳米孔测序复合物的辅助下，在高温和低盐浓度下对来自样品例如生物样品的多核苷酸进行测序的方法。例如，在具有高温且具有低浓度核苷酸的溶液中，将样品多核苷酸与聚合酶组合。在一个实施例中，样品多核苷酸是样品ssDNA链，其与DNA聚合酶组合以提供聚合酶-DNA复合物，例如，Pol6-DNA复合物。温度可以高于室温，诸如在约40℃，如本文所述。例如，核苷酸浓度可以是约1.2μM，如本文所述。再者，该溶液可包括高浓度的聚合酶，诸如聚合酶饱和。聚合酶可以是如本文所述的变体聚合酶。

在某些示例方面，提供了基于纳米孔的多核苷酸模板测序方法。该方法包括，在包括低浓度核苷酸的溶液中形成聚合酶-模板复合物，如本文所述，该溶液具有高温诸如高于室温。例如，该温度可以是约40℃，如本文所述。该方法包括将所形成的聚合酶-模板复合物与纳米孔组合以形成纳米孔测序复合物。然后，向该纳米孔测序复合物提供标签化核苷酸以在高温下启动对模板的模板依赖性纳米孔测序。在纳米孔的辅助下，在每个标签化核苷酸与聚合酶缔合的同时，检测在每个标签化多核苷酸并入过程中与每个标签化核苷酸缔合的标签，从而测定多核苷酸模板的序列。在某些实施例中，形成聚合酶-模板复合物包括用该聚合酶-模板复合物的聚合酶该溶液成为进行饱和。核苷酸浓度可以是0.8μM至2.2μM，诸如约1.2μM。例如，该温度可以是约35℃至45℃，诸如约40℃。

包括使用标签化核苷酸和本公开纳米孔测序复合物进行多核苷酸测序的测序方法的其他实施例提供在WO2014/074727中，该专利通过引用以其整体并入本文。

使用AC波形和标签化核苷酸进行的核酸测序在2013年11月6日提交的题为“Nucleic Acid Sequencing Using Tags”的美国专利公布US2014/0134616中描述，该美国专利公布通过引用而以其整体并入本文。除了US2014/0134616中描述的标签化核苷酸之外，也可使用缺少糖或非环状部分的核苷酸类似物(例如，五种常见碱基：腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶和胸腺嘧啶的(S)-甘油核苷三磷酸酯(gNTP))实施测序(Horhota等人，Organic Letters，8：5345-5347[2006])。

在以下实验公开中，采用以下缩写：eq(当量)；M(摩尔浓度)；μM(微摩尔浓度)；N(正常)；mol(摩尔)；mmol(毫摩尔)；μmol(微摩尔)；nmol(纳摩尔)g(克)；mg(毫克)；kg(千克)；μg(微克)；L(升)；ml(毫升)；μl(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(纳米)；℃(摄氏度)；h(小时)；min(分钟)；sec(秒)；msec(毫秒)。

本实施例涉及制备经退火的模板的方法。

在微量离心管(1.5mL)中，将25.0μL退火缓冲液(500mM NaCl、100mM Tris，pH8.0)、5.0μL富集引物(20μM)和20μL不含核酸酶的水混合，制备引物混合物。该富集引物包含与模板DNA的一部分互补的核苷酸序列、至少一个尿嘧啶残基和与纯化部分链接的核苷酸序列。

在用于每一待测序样品的独立试管内，将10μL的引物混合物加入40μL的样品DNA(25nM)中并混合。

将每个试管放置在热循环仪中，并使用以下方案孵育：在45℃孵育30秒，以-0.1℃/sec的速率冷却到20℃至4℃。将温度保持在4℃，直到将试管从热循环仪中移除并放置在冰上为止。

向每50μL的退火反应中加入75μL的AMPure XP珠粒(Beckman Coulter)(DNA：珠粒比率＝1∶1.5)。将试管涡旋5秒，然后短暂旋转。使反应在室温下孵育10分钟，之后将试管在室温下于磁分离架上放置几分钟，直到上清液澄清为止。尽管本实施例中包括这一清理步骤，但这一步骤是可选的并且可以省略。小心地移除上清液，并加入200μL 80％乙醇。将试管放置回磁分离架，并在几分钟后移除乙醇。将珠粒小心地用乙醇再洗涤一次，并如上所述移除乙醇。将珠粒重新悬浮在10μL缓冲液(75mM KGlu、20mM HEPES pH 7.5、0.01％(w/v)吐温-20、5mM TCEP、8％(w/v)海藻糖和10μM阻断胞嘧啶(例如，dCpCpp(dCMPCPP)2′-脱氧胞苷-5′-[(α，β)-甲桥]三磷酸、钠盐。dpCpCpp是dCTP的不可水解的α，β类似物)中，将试管短暂涡旋并旋转，以将内容物带至试管底部。将试管在室温下孵育5分钟。然后，将试管放置在磁分离架上磁分离1min，直到上清液澄清为止。小心地移除上清液，并转移到新鲜的0.2mLPCR管中。上清液含有经退火的模板。

本实施例涉及制备杂烩组合物的方法。杂烩是经退火的模板和缀合物的溶液，其允许形成测序复合物。

如本文所述，使用SpyTag/SpyCatcher系统制备缀合物。向每个实施例1中制备的经退火的模板中加入十微升的0.4μM缀合物在杂烩缓冲液(75mM KGlu、20mM HEPES pH7.5、0.01％(w/v)吐温-20、5mM TCEP，8％(w/v)海藻糖和10μM阻断胞嘧啶)中的溶液。所得缀合物：模板比率为大约4∶1，在20μL总体积中的最终缀合物浓度为400nM(即，10μL的经退火的模板和10μL的缀合物)。

然后，将试管放置在热循环仪中，并在36℃孵育30分钟，然后骤冷至4℃。这允许在SpyTag部分和SpyCatcher部分之间形成自发异肽键。一旦完成，就将试管从热循环仪中移除，并放置在冰上或保持在4℃。如果测序复合物没有在制备杂烩组合物当天使用，则将它们在-80℃储存，直到准备好进行如下文实施例3中所述的富集为止。

本实施例涉及从如上文实施例2中制备的杂烩富集测序复合物。

富集前-洗珠粒

对每一待测序样品取50μL的KilobaseBINDER富集珠粒(ThermoFisher)等量小样，置于新鲜的1.5mL试管内。将试管放置在磁分离架上，使珠粒分离2至3分钟，直到上清液澄清为止。移除上清液，注意不要扰乱珠床。在试管仍处于磁分离架上时，加入500μL的杂烩缓冲液。缓慢地移除上清液，再次注意不要扰乱珠床。加入另外500μL的杂烩缓冲液并移除，注意不要扰乱珠床或让珠粒干透。然后，将试管从磁分离架上移除，并短暂旋转以将内容物带至试管底部。再次将试管放置在磁分离架上磁化1分钟，直到上清液澄清为止。小心地移除任何残留的上清液，加入20μL的杂烩缓冲液，并且将试管从磁分离架上移除。将试管剧烈涡旋以重新悬浮珠粒，在台上式离心机中短暂旋转以将内容物带至试管底部。现在洗涤珠粒，珠粒准备好用于富集方案中。

富集

将热循环仪预加热至20℃。向已洗涤的珠粒中加入20μL的实施例2中制备的杂烩组合物并彻底混合。将试管放置在可编程热循环仪中，并以1,200rpm在20℃孵育10min。将试管移除并放置在磁分离架上，使珠粒分离2至3分钟，直到上清液澄清为止。缓慢地移除上清液，注意不要扰乱珠床。在试管仍处于磁分离架上时，加入500μL洗涤缓冲液(300mMKGlu、20mM HEPES pH 7.5、0.01％(w/v)吐温-20、5mM TCEP、8％(w/v)海藻糖和10μM阻断C)。缓慢地移除上清液，再次注意不要扰乱珠床。将试管从磁分离架上移除，并将79μL洗涤缓冲液和1μL USER酶加入珠粒中。将试管彻底混合并短暂旋转以将内容物带至试管底部。将试管放置在热循环仪中，并以1,200rpm在20℃孵育10min。将试管移除并放置在磁分离架上，短暂旋转，使珠粒分离2至3分钟，直到上清液澄清为止。缓慢地移除上清液，再次注意不要扰乱珠床，并转移到新鲜的1.5mL试管中。根据制造商的建议方案，使用Qubit高灵敏度(HS)dsDNA检验(ThermoFisher)将2μL的回收DNA用于对与测序复合物缔合的dsDNA定量。使用以下等式将浓度转化为nM：

Qubit浓度(ng/μL)x le6/[平均片段长度(nt)x 660(g/mol)]＝浓度(nM)然后，通过加入适量的洗涤缓冲液，将DNA的浓度调节为6nM。然后，如果样品在12小时内使用，则将该6nM样品在冰上储存或保持在4℃；或在-80℃储存，直到准备好进行测序为止。

此时的组合物称为富集的测序复合物，它是与缀合物结合的引物化模板(例如，经退火的模板、自引发的模板等)。

本实施例描述用于纳米孔测序的富集的测序复合物的制备。

稀释体积和加载浓度的实施例显示在下表中：

表

稀释缓冲液：20mM HEPES、300mM KGlu、0.001％吐温20、8％海藻糖、5mM TCEP、10μM C-BN(阻断的核苷酸)、10mM MgCl

样品在4℃或冰上储存，直到准备好在12小时内进行测序。

本实施例描述该富集的测序复合物在纳米孔测序中的用途。

提供包含多个孔的生物芯片，其中双层已经设置在多个孔上。如2014年10月23日提交的PCT/US14/61853中所述，形成该双层。如WO2013123450中所述，建立用来检测分子(和/或对核酸测序)的纳米孔装置(或传感器)。

如PCT/US2013/026514中所述，调整电极并在芯片上构建磷脂质双层。如2014年10月23日提交的PCT/US14/61853中所述或如PCT/US2013/026514(公布为WO2013/123450)中所述，使上述实施例4中提供的稀释的富集的测序复合物在生物芯片上流过并使测序复合物插入。尽管这些策略描述了孔隙-聚合酶复合物在没有结合经退火的模板的情况下的用途，但相同策略可用于测序复合物。

随着标签化核苷酸被以DNA模板引物化的α-HL-Pol6纳米孔-聚合酶缀合物捕获，观察到了代表每个不同聚合物部分导致的不同的已改变离子流动事件的标签电流水平信号。随时间推移记录这些事件的情节并分析。通常，持续超过10ms的事件指示，富有成效的标签捕获和与模板链互补的正确碱基的聚合酶并入同时发生。

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