降解氰化物的酿酒酵母在食品生产中的应用

摘要

本发明提供了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CCTCC M 2014463在降解氰化物中的应用。在用谷物原料如高粱、大米、糯米、豌豆、玉米等生产发酵食品时，通过添加该酿酒酵母可降解谷物原料发酵时产生的氰化物。本发明还提供了一种高品质白酒的酿造方法，通过所述酿酒酵母降低白酒生产中产生的氰化物以提高白酒的品质。将所述酿酒酵母以液体菌剂培养方式或固体菌剂培养方式接种于白酒大曲、堆积醅或窖池发酵的酒醅。本发明的酿酒酵母在降解中氰化物的应用，在发酵时通过添加该酿酒酵母可大大降低发酵过程中产生的氰化物，可大大提高发酵食品的品质和安全性；该应用中，所使用的酿酒酵母耐受性好，能适应多种食品生产环境，于pH5‑9，温度20‑40℃的环境中均可以降解氰化物。

说明书

技术领域

本发明涉及食品安全和生物工程领域，具体涉及一种降解氰化物的酿酒酵母在食品生产中的应用。

背景技术

以谷物类为原料的传统发酵食品在发酵过程中会不可避免的产生一种代谢副产物——氰化物。

氰化物是指含有CN

谷物原料生长过程中会合成一种用作自身的防御的多糖——蜀黍氰苷，蜀黍氰苷在酶或加热条件下会释放出氰化物，此途径为以谷物类为原料的发酵食品过程氰化物的主要来源。发酵过程遗留的氰化物可能给发酵食品带来潜在风险。现有的方法多是采用前处理优化控制食品中氰化物含量，但是较多的前处理难免影响发酵食品的风味及营养成分。

发明内容

[技术问题]

本发明的技术问题为：以谷物类为原料的传统发酵食品在发酵过程中会产生氰化物，现有的方法多是采用前处理优化控制食品中氰化物含量，但是这种前处理会影响发酵食品的风味及营养成分。

[技术方案]

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在降解氰化物中的应用，所述酿酒酵母是酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae CCTCC M 2014463，该酿酒酵母保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2014463，该菌株是已授权菌株(专利号：ZL201410605253，公告日：2017年07月14日)。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是通过酿酒酵母降解食品生产中产生的氰化物。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是通过酿酒酵母降解发酵食品生产中产生的降解氰化物。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是通过酿酒酵母降低酒精饮品生产中产生的氰化物应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是通过酿酒酵母降解谷物原料发酵时产生的氰化物，所述谷物原料是高粱、大米、糯米、豌豆、玉米、小麦、大麦、麸皮等。

本发明还提供了一种高品质白酒的酿造方法，通过所述酿酒酵母降低白酒生产中产生的氰化物以提高白酒的品质。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述酿酒酵母和/或所述酿酒酵母的组合物以液体或固体培养物的形式接种于白酒大曲、堆积醅或窖池发酵的酒醅。

在本发明的一种实施方式中，所述组合物是酒曲或酒醅或任何固/液态菌剂。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述酿酒酵母以液体菌剂培养方式或固体菌剂培养方式培养至微生物总活菌数达到10

在本发明的一种实施方式中，所述酿酒酵母菌在接种时的接种量是1×10

[有益效果]

本发明提供了一种酿酒酵母在降解中氰化物的应用，在进行发酵时通过添加该酿酒酵母可大大降低发酵过程中产生的氰化物，提高了发酵食品的品质和安全性；所使用的酿酒酵母耐受性好，能适应多种食品生产环境，于pH5-9，温度20-40℃的环境中均可以降解氰化物。

本发明的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是酿酒酵母Saccharomycescerevisiae CCTCC M 2014463，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M2014463，该菌株是已授权菌株(专利号：ZL201410605253，公告日：2017年07月14日)。

附图说明

图1基于宏转录组中获得的氰化物降解基因设计引物在基因组进行PCR结果，泳道分别表示不同的S.cerevisiae，每个菌两个泳道，共7个S.cerevisiae，编号分别为MT-1，Y2，Y3，Y4，Y5，Y6，Y7；

图2发酵过程中实验组与对照组的氰化物含量变化对比。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1

1.1固态样品预处理

精准称取5.0g待测的固态发酵样品于50mL离心管中，添加20.0mL ddH

1.2顶空固相微萃取结合气相色谱质谱检测氰化物

1.2.1试剂的配制

氯胺T溶液(10g/L)：称取0.1g氯胺T，用水定容至10mL(现配现用)。

0.1％氢氧化钠溶液：称取0.1g氢氧化钠，用水定容至100mL。

磷酸溶液(1:5，V:V)：量取10mL浓磷酸，加入到50mL水中，混合均匀。

1.2.2标准溶液的配制

移取适量的氰离子(以CN-计)标准中间溶液(1mg/L)，用水进行2倍梯度稀释，共8个梯度。

标准曲线的制备：分别移取5mL氰离子标准工作溶液至20mL顶空瓶中，加入0.1mL磷酸溶液(1:5，V:V)，然后加入0.1mL氯胺T溶液(10g/L)，立即加盖密封，涡旋，待测。

1.2.3样品前处理

准确移取0.1mL试样(酒样、酒醅浸提液或实施例4中降解液)于顶空瓶中，加入0.15mL 0.1％氢氧化钠溶液，静置5min，加入蒸馏水4.75mL，加入0.1mL磷酸溶液(1:5，V:V)，然后加入0.1mL氯胺T溶液(10g/L)，立即加盖密封，涡旋，待测。

1.2.4仪器条件

(1)顶空条件:顶空平衡温度：60℃；取样针温度:65℃；顶空加热时间:10-20min；进样体积：0.5mL。

(2)色谱条件：DB-FFAP(60m×0.25mm，0.25μm，Agilent，CA，USA)毛细管柱。以恒定流速1mL/min的高纯度氦气(≥99.999％)作为载气。色谱柱温度：40.0℃；温度程序：40℃保持2-5min，后升到60℃，保持1-4min；后升到200℃，保持2-5min；进样模式：分流(10:1)；进样口温度：200℃；载气：He；吹扫流量：3.0mL/min。

(3)质谱条件：离子源温度：230℃；接口温度:220℃；溶剂延迟时间：3min；扫描离子m/z：61、63、35、26；定量离子m/z：61。

实施例1：酿酒酵母(S.cerevisiae CCTCC M 2014463)的筛选、验证

1.筛选

通过白酒发酵过程酒醅宏转录组结果发现酿酒酵母具有腈水解酶基因，说明白酒体系中存在具有氰化物降解能力的酶。

通过上述基因的相关序列设计引物，并收集酵母单菌基因组查找具有腈水解酶的酵母菌，其结果如图1所示。

2.验证

通过引物筛选获得S.cerevisiae CCTCC M 2014463为具有氰化物降解基因的菌株，为了进一步验证含有腈水解酶的酵母降解氰化物的能力，对S.cerevisiae CCTCC M2014463进行了如下转化实验及部分细节的优化：

(1)将菌株培养20h后离心去上清，用pH＝8的tris缓冲液洗涤离心取上清3次后再用缓冲液重悬(排除培养基对氰化物显色反应检测的干扰)。

(2)将细胞重悬液一式两份，一份直接添加一定量的氰化物标准液使氰化物终浓度为10mg/L(全细胞转化)，转化实验在两毫升的离心管中进行(尽量减少溶液与空气的接触，避免氰化物的挥发和降解)；一份超声破碎后加入一定浓度的氰化物标准液使氰化物终浓度为10mg/L(粗酶转化)；以pH＝8的缓冲液配制的相同浓度的溶液作为空白对照。每份样品一式三份。将离心管架置于摇床，28℃，200rpm，反应10h，结果如下：

表1不同处理方式转化8h时氰化物降解率(％)

结果表明细胞破碎后转化效果更佳，相对于空白对照，转化10h后细胞破碎后CCTCC M 2014463中的氰化物含量降低了更多，表明S.cerevisiae CCTCC M 2014463的氰化物降解活性更佳。

实施例2：制备酿酒酵母(S.cerevisiae CCTCC M 2014463)发酵剂

功能酵母菌剂的制作方式：

液体菌剂培养基的制作方法：麸皮经粉碎后，与水w/v(Kg/L)按1︰1～4的比例混合后，蒸煮1-5h，冷却后加入糖化酶10～50单位/g原料，于40～80℃保持2～10h，过滤，离心所得滤液，调节糖度为10～15°Bx，调节pH为4～6。

液体菌剂培养方式，接一环菌体于液态培养基中，30℃培养24h。

固体菌剂培养基的制作方法：高梁样品经粉碎后，与水w/v(Kg/L)按1︰0.5～2的比例混合后，80～100℃蒸煮30min。

固体菌剂培养方式：接一环菌体于液态培养基中，30℃培养24h后，以10％接种比例接种于固体培养基中，30℃培养24－36h。

实施例3：酿酒酵母(S.cerevisiae CCTCC M 2014463)白酒生产中的应用

以液体菌剂培养方式或固体菌剂培养方式，将酿酒酵母(S.cerevisiae CCTCC M2014463)培养至微生物总活菌数达到10

将高粱冲洗后加去离子水过夜浸泡(1kg高粱加1.5L去离子水)，用灭菌锅105℃蒸煮45min，之后降温至60℃以下打开灭菌锅取出，冷却后进行接种。

实验组：向蒸熟冷却的高粱(熟粮醅)中接种50g的生产用曲，并额外添加10mg/kg的KCN，另接种S.cerevisiae CCTCC M 2014463，接种量为1×10

对照组：接种50g的生产用曲，并额外添加10mg/kg的KCN，并添加与实验组酿酒酵母菌液等体积的无菌水，将曲粉与熟粮醅混合均匀以使微生物能够均匀生长。取100g所得混合物装入100mL锥形瓶中，使用保鲜膜对瓶口进行密封。于30℃下，培养5天，取样时间为0、1、2、3、4、5(天)。

发酵结束，对酒醅进行浸提，并检测浸提液中的氰化物含量。结果如图2所示，相比于对照组，实验组中氰化物含量在发酵1天后均显著低于对照组。

实施例4：温度、pH对酿酒酵母(S.cerevisiae CCTCC M 2014463)降解氰化物的影响

YPD液体培养基：酵母浸膏10g/L、胰蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L

不同pH的缓冲液：分别配置1/15mol/L的磷酸氢二钠和磷酸二氢钾溶液，将二者按不同比例混合后获得pH＝5、6、7、8、9的1/15mol/L的缓冲液。

1.温度对酿酒酵母(S.cerevisiae CCTCC M 2014463)降解氰化物的影响

将S.cerevisiae CCTCC M 2014463培养20h后用pH＝8的缓冲液洗脱细胞重悬后加入氰化物溶液使初始氰化物浓度为10mg/L，在不同温度条件下(20，25，30，35，40℃)转化4h测定不同温度条件对氰化物降解的影响，结果表明在设定的温度条件下(20，25，30，35，40℃)酿酒酵母(S.cerevisiae CCTCC M 2014463)均可以降解氰化物，其降解率范围为13.21-25.9％。

2.pH对酿酒酵母(S.cerevisiae CCTCC M 2014463)降解氰化物的影响

将S.cerevisiae CCTCC M 2014463培养20h后用不同pH的缓冲液洗(pH＝5、6、7、8、9)脱细胞重悬后加入氰化物溶液使初始氰化物浓度为10mg/L，在30℃转化4h测定不同pH条件对氰化物降解的影响，结果表明在设定的pH条件下(pH＝5、6、7、8、9)酿酒酵母(S.cerevisiae CCTCC M 2014463)均可以降解氰化物，其降解率范围为14.75-25.9％。

本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡是在本发明构思的精神和原则之内，本领域的专业人员能够做出的任何修改、等同替换和改进等均应包含在本发明的保护范围之内。