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一个呼吸道病原体的纳米孔测序建库的引物组合及其应用

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本发明公开了一个呼吸道病原体的纳米孔测序建库的引物组合及其应用。利用发明的建库的引物组合进行呼吸道病原体的纳米孔测序建库，该方法只需要2步PCR扩增和接头连接，就可以达到建库的目的，其中在第二步PCR扩增时，只需要补充引物而无需添加酶，操作步骤简单；具有快速建库的特点、进而能够实时测序和分析；同时检测样本中的细菌宏基因组和真菌宏基因组。

著录项

公开/公告号CN112176032A

专利类型发明专利
公开/公告日2021-01-05

原文格式PDF
申请/专利权人广州市达瑞生物技术股份有限公司;
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申请/专利号CN202011110625.5
发明设计人吴英松;陆才瑞;杨学习;李明;李贻林;欧阳国军;韩博炜;
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申请日2020-10-16
分类号C12Q1/6806(20180101);C12Q1/6869(20180101);C40B50/06(20060101);C12Q1/689(20180101);C12Q1/6895(20180101);C12Q1/04(20060101);C12N15/11(20060101);
代理机构44102 广州粤高专利商标代理有限公司;
代理人段卉
地址 510160 广东省广州市黄埔区高新技术产业开发区荔枝山路6号自编2号404
入库时间 2023-06-19 09:27:35

说明书

技术领域

本发明涉及呼吸道病原体检测技术领域，更具体地，涉及一个基于纳米孔测序建库的引物组合及其应用。

背景技术

呼吸道感染是临床常见疾病，也是目前危害大众健康最为严重的疾病之一。呼吸道感染可由细菌、真菌等多种病原体引起，病原体检测是呼吸道感染精准治疗的基础，也是疾病得以有效防控的前提。

传统的病原检测方法包括涂片镜检，免疫学检测，微生物培养，分子检测。然而这些方法每次只能检测到一种或有限的病原体，其操作过程繁琐、检测时间较长，此外培养还存在阳性率低的缺点。

现有的二代测序技术可以用于不明原因病原微生物的鉴定，如中国专利CN111394486A“基于宏基因组测序的儿童感染性疾病病原检测及鉴定方法”，但由于二代测序读长短，增加了判定病原的难度；测序仪投入大，测序完成后只能在高性能计算设备上进行数据分析；操作步骤多，从样本到结果的流转周期长，不利于病原的快速和准确鉴定。

中国专利CN111041130A检测病原体的组合物、试剂盒及方法，利用单通道多重实时荧光PCR技术检测多种病原体，但仅能针对特定的15种病原体，而无法对未知病原体进行检测。

可见，本领域仍亟需一种快速、准确、全面的病原体检测方法。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一个基于纳米孔测序建库的引物组合及其应用，通过PCR扩增技术提高病原体核酸在文库中的占比，达到快速鉴定的效果，结合纳米孔测序平台的长读长特性增加病原识别的准确性，从而实现快速、准确、实时的病原体鉴定。

本发明的第一个目的是提供一个基于纳米孔测序建库的引物组合。

本发明的第二个目的是提供一种所述的引物组合在纳米孔测序建库中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种所述的引物组合在制备纳米孔测序建库试剂盒中的应用。

本发明的第四个目的是提供一个基于纳米孔测序建库的试剂盒。

本发明的第五个目的是提供一个基于纳米孔测序建库的方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

本发明要求保护一个呼吸道病原体的纳米孔测序建库的引物组合，包括序列(1)到序列(5)，每条序列从5’端到3’端均由a段序列、b段序列和c段序列组成；

其中序列(1)到序列(5)的b段序列的一致，其序列的核苷酸如SEQ ID NO：1～108任一所示；

序列(1)到序列(5)的c段序列的核苷酸分别依次如SEQ ID NO：109～113所示；

序列(1)、序列(3)和序列(4)的a段序列为所选用的PCR条码试剂盒中条码引物中的正向引物的3’端的24个碱基的反向互补序列；

序列(2)和序列(5)的a段序列为所选用的PCR条码试剂盒中条码引物中的反向引物的3’端的24个碱基的反向互补序列。

优选地，所述PCR条码试剂盒为Oxford nanopore technology公司的SQK-PBK004试剂盒，序列(1)、序列(3)和序列(4)的a段序列核苷酸如SEQ ID NO：114所示，序列(2)和序列(5)的a段序列核苷酸如SEQ ID NO：115所示。

选用其他不同的PCR条码试剂盒a段序列相应的不同。

本发明进一步要求保护所述的引物组合在纳米孔测序建库中的应用。

本发明进一步要求保护所述的引物组合在制备纳米孔测序建库试剂盒中的应用。

本发明进一步还要求保护一个基于纳米孔测序建库的试剂盒，含有所述的引物组合。

本发明进一步还要求保护一个基于纳米孔测序建库的方法，所述方法利用所述的引物组合。

优选地，包括以下步骤：

S1.利用权利要求1所述的引物组合对样本进行第一次多重PCR；

S2.扩增产物中加入PCR条码试剂盒中的快速条码引物，进行第二次PCR；

S3.对扩增产物进行纯化，定量，连接测序接头，即得文库。

优选地，多重PCR的反应程序为：95℃，2分钟；95℃30秒，50℃30秒，72℃2分钟，30个循环；4℃，Hold。

优选地，第二次PCR的反应程序为：95℃，2分钟；95℃30秒，62℃30秒，72℃2分钟，10个循环；72℃5分钟；4℃，Hold。

优选地，不多于PCR条码试剂盒中的快速条码引物个数的样品共用一个引物组合，不同的引物组合间引物组合中序列(1)到序列(5)的b段序列不同。

优选地，第二次PCR扩增时，使用同一个引物组合的不同样品，分别加入不同的快速条形码引物。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)本发明的呼吸道病原体的纳米孔测序建库的引物组合及其应用具有快速建库的特点、进而能够实时测序和分析，相对于传统的病原体检测方法，如病原体分离培养法和免疫检测法，这些方法的操作过程繁琐、灵敏度低以及检测时间较长，本发明可以满足快速诊断的要求。

2)基于本发明的提供的呼吸道样本的建库方法的病原体检测方法是基于纳米孔测序平台，相对于二代测序平台的短读长、无法有效识别病原体的缺陷，纳米孔测序平台具有读长长的特点，可准确识别与鉴定病原体。

3)相对于传统的病原体分离培养法，只能检测少量病原体，本发明可以同时检测样本中的细菌宏基因组和真菌宏基因组。

4)相对于二代测序平台繁琐的建库步骤，本发明只需要2步PCR扩增和接头连接，就可以达到建库的目的，其中在第二步PCR扩增时，只需要补充引物而无需添加酶，操作步骤简单。

附图说明

图1为基于纳米孔测序平台的呼吸道病原体检测流程示意图。

图2为纳米孔测序reads的片段分布。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

1、仪器包括

GridION、PCR仪、Qubit 3.0、涡旋仪、移液器、磁力架、冰箱等。

2、试剂包括

ONT建库试剂盒SQK-PBK004、AMPure XP纯化磁珠、QubitTM检测试剂盒、ONT测序芯片等。

实施例1一个基于纳米孔测序建库的引物组合

包括序列(1)到序列(5)，每条序列从5’端到3’端均由a段序列、b段序列和c段序列组成；

其中序列(1)到序列(5)的b段序列的一致，其序列的核苷酸如SEQ ID NO：1～108任一所示；

序列(1)到序列(5)的c段序列的核苷酸分别依次如SEQ ID NO：109～113所示；

序列(1)、序列(3)和序列(4)的a段序列核苷酸如SEQ ID NO：114所示，序列(2)和序列(5)的a段序列核苷酸如SEQ ID NO：115所示。

序列详见表1：

表1

根据以上规则，一共会有108个不同的引物组合，在此给出四个引物组合的作为举例：

引物组合1：

16S-27F-N1：

TTTCTGTTGGTGCTGATATTGCAGAACGACTTCCATACTCGTGTGAAGRGTTTGATYHTGGCTCAG，

16S-1492R-N1：

ACTTGCCTGTCGCTCTATCTTCAGAACGACTTCCATACTCGTGTGACGGYTACCTTGTTAYGACTT，

ITS1ngs-N1：

TTTCTGTTGGTGCTGATATTGCAGAACGACTTCCATACTCGTGTGATCCGTAGGTGAACCTGC，

ITS1Fngs-N1

TTTCTGTTGGTGCTGATATTGCAGAACGACTTCCATACTCGTGTGAGGTCATTTAGAGGAAGTAA，

ITS4ngsUni-N1：

ACTTGCCTGTCGCTCTATCTTCAGAACGACTTCCATACTCGTGTGACCTSCSCTTANTDATATGC。

引物组合2：

16S-27F-N2：

TTTCTGTTGGTGCTGATATTGCAACGAGTCTCTTGGGACCCATAGAAGRGTTTGATYHTGGCTCAG，

16S-1492R-N2：

ACTTGCCTGTCGCTCTATCTTCAACGAGTCTCTTGGGACCCATAGACGGYTACCTTGTTAYGACTT，

ITS1ngs-N2：

TTTCTGTTGGTGCTGATATTGCAACGAGTCTCTTGGGACCCATAGATCCGTAGGTGAACCTGC，

ITS1Fngs-N2：

TTTCTGTTGGTGCTGATATTGCAACGAGTCTCTTGGGACCCATAGAGGTCATTTAGAGGAAGTAA，

ITS4ngsUni-N2：

ACTTGCCTGTCGCTCTATCTTCAACGAGTCTCTTGGGACCCATAGACCTSCSCTTANTDATATGC。

引物组合3：

16S-27F-N3：

TTTCTGTTGGTGCTGATATTGCAGGTCTACCTCGCTAACACCACTGAGRGTTTGATYHTGGCTCAG，

16S-1492R-N3：

ACTTGCCTGTCGCTCTATCTTCAGGTCTACCTCGCTAACACCACTGCGGYTACCTTGTTAYGACTT，

ITS1ngs-N3：

TTTCTGTTGGTGCTGATATTGCAGGTCTACCTCGCTAACACCACTGTCCGTAGGTGAACCTGC，

ITS1Fngs-N3：

TTTCTGTTGGTGCTGATATTGCAGGTCTACCTCGCTAACACCACTGGGTCATTTAGAGGAAGTAA，

ITS4ngsUni-N3：

ACTTGCCTGTCGCTCTATCTTCAGGTCTACCTCGCTAACACCACTGCCTSCSCTTANTDATATGC。

引物组合4：

16S-27F-N4：

TTTCTGTTGGTGCTGATATTGCCGTCAACTGACAGTGGTTCGTACTAGRGTTTGATYHTGGCTCAG，

16S-1492R-N4：

ACTTGCCTGTCGCTCTATCTTCCGTCAACTGACAGTGGTTCGTACTCGGYTACCTTGTTAYGACTT，

ITS1ngs-N4：

TTTCTGTTGGTGCTGATATTGCCGTCAACTGACAGTGGTTCGTACTTCCGTAGGTGAACCTGC，

ITS1Fngs-N4：

TTTCTGTTGGTGCTGATATTGCCGTCAACTGACAGTGGTTCGTACTGGTCATTTAGAGGAAGTAA，

ITS4ngsUni-N4：

ACTTGCCTGTCGCTCTATCTTCCGTCAACTGACAGTGGTTCGTACTCCTSCSCTTANTDATATGC。

实施例2一种基于纳米孔测序的建库方法

操作流程如图1所示，经过提取纯化后的核酸，经过2步PCR扩增、产物纯化、连接测序接头后，即为文库，可以直接上机，数据实时分析，具体实验步骤如下：

1、DNA提取纯化

采用天根生化科技有限公司的核酸提取试剂盒(DP710-T6B)提取纯化。

(1)肺泡灌洗液样本的裂解消化

样本取500μl样本置于2ml EP管中，分别加入500μl裂解液GHH-A和50μlProteinase K，涡旋振荡混匀，65℃水浴20min。

(2)玻璃珠珠磨

1)取裂解消化后1000μl的样本置于珠磨仪上以20～25×100r转速研磨10min。

2)珠磨后于高速离心机13000g离心2分钟，结束后转移1000ul上清液至新的2mlEP管中(注意不要吸到玻璃珠)。

(3)核酸吸附

加入600uL异丙醇和25μl磁珠悬浮液GHE，涡旋振荡混匀，室温放置10min，期间每5min涡旋混匀30sec。

(4)核酸纯化

1)将离心管置于磁力架上2min，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体。

2)加入1ml缓冲液GDF(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，涡旋混匀2min使磁珠充分悬浮，瞬时离心去除管盖内壁的液滴。

3)将离心管置于磁力架上1min，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体。

4)加入500μl缓冲液GDF，涡旋混匀2min使磁珠充分悬浮，瞬时离心去除管盖内壁的液滴。

5)将离心管置于磁力架上1min，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体。

6)加入1ml漂洗液PWG(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，涡旋混匀2min使磁珠充分悬浮，瞬时离心去除管盖内壁的液滴。

7)将离心管置于磁力架上1min，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体。

8)加入500μl漂洗液PWG，涡旋混匀2min使磁珠充分悬浮，瞬时离心去除管盖内壁的液滴。

9)将离心管置于磁力架上1min，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体。

10)离心10秒，让管壁液体甩到管底。将管子放回磁架管孔里，待磁珠吸附全后，用10ul枪吸去管底液体，注意不要吸到磁珠，将离心管置于磁力架上，室温晾干5-10min。

11)加入30μl RNase-Free ddH2O，用移液器吹吸使磁珠重新悬浮，56℃孵育5min，期间每2min轻轻晃动使核酸充分洗脱。

12)将离心管放置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附时小心将核酸溶液转移至新的离心管中，并于-20℃保存。

(5)DNA提取浓度检测

提取完成的样本，用Qubit 2.0/Qubit 3.0荧光计进行DNA定量。

2、第一次多重PCR扩增

冰上融化含有引物组合的引物混合液；

(1)取新的PCR反应管，按照下表配制反应体系，不多于PCR条码试剂盒中的快速条码引物个数的样品共用一个引物组合，不同的引物组合间引物组合中序列(1)到序列(5)的b段序列不同。在此选用Oxford nanopore technology公司的SQK-PBK004 PCR条码试剂盒中，其中有12个不同的快速条码引物，所以每12个样本使用同一个引物组合的引物混合液，冰上操作，配制以下体系：

其中，引物组合中，序列(1)、序列(1)、序列(1)和序列(5)的摩尔量的比为：1：1：2：2：2。

(2)手指轻弹管壁混匀，短暂离心，将PCR管置于PCR仪内，按如下程序进行反应：95℃，2分钟；(95℃30秒，50℃30秒，72℃2分钟)30个循环；4℃，Hold。

3、第二次PCR扩增

(1)从PCR仪中取出第一次多重PCR管，添加1.5μL标签接头：

(2)将PCR管置于PCR仪内，按如下程序进行反应：95℃，2分钟；(95℃30秒，62℃30秒，72℃2分钟)10个循环；72℃5分钟；4℃，Hold。

4、产物纯化

(1)PCR产物加水23.5μL补至50μL，加入30μL磁珠，轻弹混匀，使DNA纯化磁珠均匀分散在溶液中，室温放置5min。

(2)将离心管短暂离心，插入磁力架的管孔里，放置5分钟至溶液澄清后，用200μL吸头吸去液体(注意不要吸到DNA纯化磁珠，离心管留在磁力架上)。

(3)吸取200μL 80％的乙醇加入离心管，期间轻轻旋动离心管两次，每次半圈，使DNA纯化磁珠在管壁上移动。用200μL吸头吸去液体，注意不要吸到DNA纯化磁珠。

(4)重复步骤4(3)一次。

(5)取下离心管，短暂离心甩下管壁和盖子上的液滴。将离心管放回磁力架的管孔里，待DNA纯化磁珠吸附完全后，用10μL吸头吸去管底液体(注意不要吸到DNA纯化磁珠)。

(6)将离心管盖打开，室温晾干，让残留乙醇挥发。

(7)取下离心管，从有DNA纯化磁珠的离心管壁一侧加入11μL洗脱液，把DNA纯化磁珠洗脱到管底，轻弹管壁混匀，短暂离心甩下管壁和盖子上的液滴，室温放置2分钟。

(8)将离心管插入磁力架的管孔里，直至DNA纯化磁珠吸附完全，溶液变澄清之后，转移溶液至新的1.5mL离心管中。

(9)纯化好的PCR产物用Qubit荧光计进行DNA定量。

5、连接测序接头

(1)文库总投入量为100ng，平均分配到24个测序样本上，每个样本4.17ng。根据每个样本的浓度，计算体积并混合成一管，总体积为10μL，不足的部分用洗脱液补齐。

(2)在10μL混合样本中加入1μL连接反应混合液，轻弹混匀，瞬时离心，室温放置10min，然后置于冰上。

6、上机

(1)芯片预处理

1)在室温下融化冲洗缓冲液FLB、冲洗引发剂FLT，涡旋振荡混匀、瞬时离心，冰上备用。

2)将30μL冲洗引发剂FLT加到冲洗缓冲液FLB(1mL/管)中，涡旋振荡混匀，配制成引发混合液。

3)打开芯片的清洗口盖子，按照如下操作除去气泡：

A.将1000μL的移液器调至200μL；

B.枪尖轻轻插入清洗口，垂直于芯片的平面保持住；

C.转动移液器转轮直至刻度显示为220～230μL，或看到小容量缓冲液进入移液器吸头。

4)在芯片清洗口中加入800μL的引发混合液(步骤6.1.2)，加入过程中避免产生气泡；

5)室温静置5分钟，打开芯片进样孔盖子。

6)在芯片清洗口再加入200μL引发混合液(步骤6.1.2)，加入过程中避免引入气泡。

(2)上样

1)在室温下融化测序缓冲液SQB、磁珠LB，用移液器吹打混匀、瞬时离心，冰上备用，取新的1.5mL离心管，按照下表配制：

2)利用移液器，通过芯片进样口以逐滴方式将75μL上样混合液加到芯片中。

3)关闭芯片进样口和芯片清洗口。

(3)测序与生信分析

1)将芯片载入至GridION/MinION进行测序。

2)对测序下机数据进行生信分析。

实施例3肺泡灌洗液样本的纳米孔测序

一、实验方法

使用实施例2中方法，对24例肺泡灌洗液样本的纳米孔测序，样本分别编号为1～24，其中编号1～12号样本使用实施例1中的引物组合1进行第一次多重PCR扩增，编号13～24号样本使用实施例1中的引物组合2第一次多重PCR扩增。

第二次PCR扩增时，编号1～12号的样本依次分别加入BP1-BP12，编号13～24号的样本依次分别加入BP1-BP12。

二、实验结果

各样本检测到的致病病原体见表2。

表2：

纳米孔测序reads的片段分布如图2所示，600bp和1500bp处的峰分别对应真菌ITS和细菌16S的扩增条带。24个样本均能检测到数量不等的致病病原，说明本发明提供的建库方法可以检测到与致病性相关的病原体。

对比例1

一、实验方法

使用二代测序方法对实施例3的24例肺泡灌洗液样本进行测序，并进行生信分析。

二、实验结果

各样本检测到的致病病原体见表3。

表3：

通过比较发现，与实施例3的纳米孔测序样本1无法检测出金黄色葡萄球菌，样本3无法检测出表皮葡萄球菌，样本10无法检测出路氏肠杆菌，样本14无法检测鲍曼不动杆菌，样本19无法检测出副流感嗜血杆菌，说明本发明提供的建库方法可以检测出更多的病原体。

实施例4肺泡灌洗液样本的纳米孔测序

一、实验方法

使用实施例2中方法，对实施例2的24例肺泡灌洗液样本进行纳米孔测序检测，在不同时间对(10min、20min、30min、40min、50min、60min)病原体reads数目进行了分析。

二、实验结果

结果如表4所示，由于纳米孔测序具有的实时分析的特点，随着测序时间的增加，检测到的病原体数目也随之增加。。病原体载量较高的样本，都可以在10分钟内检测到病原体reads，即便是载量低的样本，也可以在40分钟内检测到目标病原。纳米孔测序与二代测序技术不同，二代测序需要把所有样本混合后上机，测序期间是不能分析的，需要等到测序结束后统一分析，比较耽误时间；纳米孔测序可以随时测序，随时分析，Nanopore测序平台提供的是动态、实时的测序，支持用户在测序极早期就获得病原体鉴定等时间关键型应用的检测结果。这种高效快速的病原体检测，通过早期预警，辅助临床做出更精准的治疗决策，对于“时间就是生命”的重症感染患者的救治具有极其重要的作用。

表4：纳米孔测序检测到病原体reads数目随着时间的分布

序列表

<110> 广州市达瑞生物技术股份有限公司

<120> 一个呼吸道病原体的纳米孔测序建库的引物组合及其应用

<160> 115

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA