一种从海参中提取岩藻聚糖硫酸硫酸酯和硫酸软骨素的方法

摘要

本发明提供一种从海参中同步提取岩藻聚糖硫酸硫酸酯和硫酸软骨素的方法，更有效的利用海参组织中岩藻聚糖硫酸酯和硫酸软骨素的结构和水溶性不同，完成海参中两种硫酸多糖的提取和分离。本发明方法具有提取条件温和、过程简便的优势，有效的从海参中将硫酸软骨素和岩藻聚糖硫酸酯进行提取和分离纯化；节省了海参中岩藻聚糖硫酸酯和硫酸软骨素的离子色谱分离、凝胶色谱纯化和脱盐等步骤，大大简化了海参中岩藻聚糖硫酸酯和硫酸软骨素的分离纯化工艺。本发明方法成本低廉、容易扩大、回收率高，是一种绿色环保的大规模制备海参岩藻聚糖硫酸酯和硫酸软骨素两种硫酸多糖纯品的方法。

说明书

技术领域

本发明属于分离纯化技术领域，具体涉及一种从海参中提取和分离岩藻聚糖硫酸硫酸酯和硫酸软骨素的方法。

背景技术

海参是棘皮动物门海参纲海参属生物，是一种富含蛋白、多糖、皂苷等活性物质的海珍品。海参体壁中富含硫酸多糖，主要是岩藻聚糖硫酸酯和岩藻糖基硫酸软骨素两种硫酸多糖组成。海参岩藻聚糖硫酸酯是岩藻糖以α1→3或α1→4键连接形成的直链大分子硫酸多糖，具有少量岩藻糖侧链，分子量一般都大于500-700kDa。海参硫酸软骨素是海参中特有的一种具有岩藻糖支链的硫酸软骨素，由葡萄糖醛酸和乙酰氨基半乳糖重复二糖单元组成，以β-1,4-和β-1,3糖苷键连接而成，乙酰氨基半乳糖和葡萄糖醛酸上有硫酸化的岩藻糖支链，分子量在80-120kDa。海参硫酸软骨素的硫酸根含量大于30％，远远高于岩藻聚糖硫酸酯，因此具有更好的抗凝血和抗血栓活性。

海参中岩藻聚糖硫酸酯和硫酸软骨素是两种结构和生物活性不同的硫酸多糖，因此需要分离纯化。目前采用的蛋白酶酶解、水提取的方法可以从海参中提取的海参硫酸多糖为岩藻聚糖硫酸酯和硫酸软骨素的混合物，因此还需要对两种硫酸多糖进行分离。目前，分离纯化岩藻聚糖硫酸酯和硫酸软骨素主要采用乙醇分级分离、盐分级分离、离子交换色谱法、双水相萃取和凝胶色谱柱层析法。而最常用的方法是阴离子交换柱层析法和双水相萃取法，这两种方法会混合大量的盐，除盐工作量大，而且阴离子柱价格昂贵。乙醇分级分离和盐分级分离海参硫酸多糖，分离效率比较低，产品纯度低。而凝胶色谱法每次处理的样品量太低，无法实现大规模生产。

发明内容

针对现有技术中海参岩藻聚糖硫酸酯和硫酸软骨素提取和分离纯化技术的不足，本发明提供一种从海参中同步提取岩藻聚糖硫酸硫酸酯和硫酸软骨素的方法，更有效的利用海参组织中岩藻聚糖硫酸酯和硫酸软骨素的结构和水溶性不同，完成海参中两种硫酸多糖的提取和分离。

本发明所提供的从海参中提取岩藻聚糖硫酸硫酸酯和硫酸软骨素的方法，包括如下的步骤：

1)海参预处理：

将海参进行组织破碎后加入蒸馏水进行浸提，浸提结束后进行离心，取沉淀待用；

所述的海参与水的质量比为1:5-1:10；

所述的蒸馏水进行浸提，是在30-50℃搅拌浸提30-60min。

2)水溶液提取和分离：

将步骤1)离心获得的沉淀中加入Tris-HCl水溶液进行提取，提取结束后离心，收集提取液和沉淀；

所述Tris-HCl水溶液，其一种实施例的具体记载是浓度为0.1-0.3mol/L，pH8.0，含有4mmol/L EDTA；

所述的提取，是在30-50℃缓慢搅拌提取12-24h；

3)将步骤2)获得的提取液真空浓缩后，加入氯化十六烷基吡啶进行沉淀，离心收集沉淀；沉淀溶解于添加了NaCl的醇溶液中；然后用90％乙醇水溶液进行沉淀、冷冻干燥后得海参岩藻聚糖硫酸酯干品；

所述的添加了NaCl的醇溶液，其一种是添加了3mol/L氯化钠的86％乙醇溶液；

所述的用于沉淀的乙醇水溶液，其一种是90％乙醇水溶液；

4)将步骤2)中获得的沉淀加入复合蛋白酶，在45-60℃水浴中酶解3-5h；

所述的复合蛋白酶为碱性蛋白酶和胰蛋白酶混合物；

5)将步骤4)的酶解液离心，收集上清液；上清液真空浓缩后，采用超滤膜超滤脱蛋白脱盐，收集截留液；截留液经真空浓缩、干燥后，得到岩藻糖基硫酸软骨素干品；

所述超滤膜是截留分子量为5kDa-20kDa的超滤膜。

本发明方法具有提取条件温和、过程简便的优势，有效的从海参中将硫酸软骨素和岩藻聚糖硫酸酯进行提取和分离纯化；节省了海参中岩藻聚糖硫酸酯和硫酸软骨素的离子色谱分离、凝胶色谱纯化和脱盐等步骤，大大简化了海参中岩藻聚糖硫酸酯和硫酸软骨素的分离纯化工艺。本发明方法成本低廉、容易扩大、回收率高，是一种绿色环保的大规模制备海参岩藻聚糖硫酸酯和硫酸软骨素两种硫酸多糖纯品的方法。

附图说明

图1、新鲜仿刺参的岩藻聚糖硫酸酯的高效凝胶排阻色谱分析图；

图2、新鲜仿刺参硫酸软骨素的高效凝胶排阻色谱分析图；

图3、仿刺参岩藻聚糖硫酸酯的单糖组成分析的高效液相色谱图；

图4、仿刺参硫酸软骨素的单糖组成分析的高效液相色谱图。

具体实施方式

申请人在研究中发现海参体壁中硫酸软骨素缠绕在胶原蛋白纤维上，形成胶原原纤维超分子结构，不能溶于水。而岩藻聚糖硫酸酯分布在海参体壁中，富含硫酸根，没有与蛋白质结合，易溶于水。而本发明采用水溶液提法，从海参中提取、分离出水溶性的岩藻聚糖硫酸酯和胶原原纤维沉淀。胶原原纤维经过酶解和超滤脱蛋白后获得硫酸软骨素纯品，从而实现海参岩藻聚糖硫酸酯和硫酸软骨素的提取和分离一步完成。

下面结合实施例和附图对本发明的方法进行详细的描述。

实施例1

1)将新鲜仿刺参的体壁切成1cm小块，称取约300g海参体壁，加入1.0L水，在30℃下搅拌30min。然后用100目绢纱过滤，弃去滤液，将滤渣反复水洗两次，合并滤渣。

2)滤渣中加入0.1mol/L Tris-HCl溶液(pH 8.0，4mmol/L EDTA)1.0L，在30℃下缓慢搅拌24h进行提取。然后离心7000×g，30min，4℃。再加200mL蒸馏水洗涤沉淀，收集上清液和沉淀。

3)步骤2)获得的上清液经真空浓缩后至200mL，加入氯化十六烷基吡啶质量浓度达到10％，4℃静置20h，离心4000×g，15min，20℃，弃上清，得沉淀。

将所得的沉淀溶解于250mL NaCl的乙醇溶液(3mol/L NaCl，86％乙醇)中溶解。然后再加入500mL 95％乙醇，4℃下放置12h。离心4000×g，15min，20℃，弃上清液，取沉淀。将沉淀用100mL 95％乙醇洗涤2次。收集沉淀冷冻干燥后得海参岩藻聚糖硫酸酯干品。

4)步骤2)的胶原原纤维沉淀，加入500mL水中，用1mol/LNaOH溶液调整pH至8.0，加300mg中性蛋白酶和300mg碱性蛋白酶，50℃水解6h。酶解产物在沸水浴中5min灭酶活，冷却至室温。离心5000×g，20min，50℃，收集上清液。

5)取步骤4)的上清液，真空浓缩后，采用截留分子量为10kDa的超滤膜进行超滤，收集分子量大于10kDa的截留液。截留液经真空浓缩、冷冻干燥后，得到岩藻糖基硫酸软骨素干品。

将上述岩藻聚糖硫酸酯和硫酸软骨素的干品称重，计算岩藻聚糖硫酸酯的产率为1.56％，岩藻糖基硫酸软骨素低聚糖的产率2.83％。

图1和2为高效凝胶排阻色谱法检测本实施例制备的岩藻聚糖硫酸酯和岩藻糖基硫酸软骨素的分子量。岩藻聚糖硫酸酯的重均分子量658.16kDa，数均分子量351.95kDa，分散系数为2.32(图1)。岩藻糖基硫酸软骨素的重均分子量111.07kDa，数均分子量47.85kDa，分散系数1.87。

采用离子色谱法检测制备的岩藻聚糖硫酸酯和硫酸软骨素的硫酸根含量分别是26.72％和32.28％，

图3、图4和表1为采用PMP单糖衍生-高效液相色谱法制备的岩藻聚糖硫酸酯和硫酸软骨素的单糖组成。制备的岩藻聚糖硫酸酯含62.84％岩藻糖、8.89％氨基半乳糖、6.37％半乳糖，含有少量的胺基葡萄糖、葡萄糖醛酸和葡萄糖；制备的岩藻糖基硫酸软骨的单糖主要含有40.28％岩藻糖、16.58％氨基半乳糖和8.57％氨基葡萄糖、16.58％葡萄糖醛酸和10.76％甘露糖，符合海参岩藻糖基硫酸软骨素的单糖组成的要求。

表1：新鲜仿刺参的岩藻聚糖硫酸酯和硫酸软骨素的单糖组成的比较表

总单糖含量为100％。Man：甘露糖；GlcN：氨基葡萄糖；GlcA：葡萄糖醛酸；GalN：氨基半乳糖；Glc：葡萄糖；Gal：半乳糖；Fuc：岩藻糖

实施例2：

1)取干制的小有刺参(含水质量为10％以下)，用组织粉碎机粉碎，然后过80目筛子。称取样品100g，加入500mL蒸馏水，在50℃下搅拌浸提60min，弃去上清液。重复浸提2次，收集合并沉淀。

2)将沉淀中加入0.1mol/L的Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0，5mmol/L EDTA，0.5mol/LNaCl)1L，50℃缓慢搅拌24h。提取液离心5000×g，20min，20℃。再加500mL Tris-HCl缓冲溶液重复提取1次，收集合并上清液和沉淀。

3)步骤2)获得的上清液，参照实例1中的真空浓缩、十六烷基吡啶沉淀、乙醇沉淀、冻干后，得海参岩藻聚糖硫酸酯干品。

4)步骤2)中获得的沉淀，参照实例1中的复合蛋白酶水解、超滤脱盐脱蛋白、干燥后，得到海参硫酸软骨素干品。

5)将上述岩藻聚糖硫酸酯和岩藻糖基硫酸软骨素的干品称重，计算岩藻聚糖硫酸酯的产率为1.04％，岩藻糖基硫酸软骨素的产率2.26％。采用离子色谱法检测制备的岩藻聚糖硫酸酯和硫酸软骨素的硫酸根含量分别是23.75％和30.84％，复合海参硫酸多糖的硫酸根含量要求。

采用高效凝胶排阻色谱检测本实施例制备的岩藻聚糖硫酸酯和岩藻糖基硫酸软骨素的分子量。岩藻聚糖硫酸酯的重均分子量602.13kDa，数均分子量266.43kDa，分散系数为2.26。岩藻糖基硫酸软骨素的重均分子量98.76kDa，数均分子量58.79kDa，分散系数1.68。

图3、图4和表2为干制小有刺参中提取的岩藻聚糖硫酸酯和硫酸软骨素的单糖组成。制备的岩藻聚糖硫酸酯含岩藻糖61.50％、氨基半乳糖10.28％、半乳糖5.76％、甘露糖8.24％，含有少量的胺基葡萄糖、葡萄糖醛酸和葡萄糖。

表2、干制小有刺参的岩藻聚糖硫酸酯和硫酸软骨素的单糖组成比较表

制备的岩藻糖基硫酸软骨的单糖主要含有岩藻糖38.28％、氨基半乳糖19.18％和氨基葡萄糖3.75％、葡萄糖醛酸16.72％和甘露糖10.76％，符合海参岩藻糖基硫酸软骨素的单糖组成的要求。