一种细胞核和细胞器计数及其面积计算方法与系统

摘要

本发明涉及一种细胞核和细胞器计数及其面积计算方法与系统，包括以下步骤：S1对采集的细胞图像进行图像RGB色彩分离,获取单一色彩通道图像；S2将单一色彩通道图像进行图像比例缩放；S3将经过比例缩放的图像进行形态处理；S4对经过形态处理图像进行自动细胞计数，对于粘连或大部分重叠的细胞进行人工计数；S5计算细胞面积和细胞器个数。其简化了细胞个数和面积计算的程序，提高了细胞计数效率和准确率。

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞核和细胞器计数及其面积计算方法与系统，属于细胞生物学技术领域。

背景技术

图像数字信息获取在生物学和临床医学研究中具有重要的作用，一方面生物图像信息获取在临床检验医学中应用非常广泛；另一方面，获取实验过程中的细胞核及细胞器个数与面积能为生物学科研究提供重要的数据支撑。

目前在生物学图像信息的获取方面，针对于细胞核计数的方法很少，针对于细胞器计数例如溶酶体等的计数处于完全空白的状态，细胞器面积的获取方法也无从查起。传统的生物学计数方法在显微镜下凭肉眼识别，计数效率低下且容易出错。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种细胞核和细胞器计数及其面积计算方法与系统，其简化了细胞个数和面积计算的程序，提高了细胞计数效率和准确率。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种细胞核和细胞器计数及其面积计算方法，包括以下步骤：S1对采集的细胞图像进行图像RGB色彩分离,获取单一色彩通道图像；S2将单一色彩通道图像进行图像比例缩放；S3将经过比例缩放的图像进行形态处理；S4对经过形态处理图像进行自动细胞计数，对于粘连或大部分重叠的细胞进行人工计数；S5计算细胞面积和细胞器个数。

进一步，步骤S1对图像进行RGB色彩分离，单一色彩通道图像，细胞核及细胞器用红绿蓝三种不同试剂染色，并通过以下公式将色彩分离：

D(z,m)＝[(z

其中，D表示z和m之间的距离，z，m分别表示RGB颜色空间中的任一点，z

进一步，步骤S2中通过如下公式计算细胞图像放缩比例：

其中，坐标(x

进一步，形态处理包括：S3.1对经过比例缩放的图像进行明暗度调节，边界清除；S3.2对经过步骤S3.1处理的图像计算全局最佳阈值，并对图像进行二值化处理；S3.3对经过二值化处理的图像设置像素面积阈值，去除杂质干扰S3.4对经过步骤S3.3处理的图像进行孔洞填充。

进一步，步骤S3.1中的明暗度调节公式为：

g(x,y)＝T[f(x,y)]

s＝T(r)

其中，f(x,y)为输入图像，g(x,y)为输出图像，T是对图像f的算子，作用于点(x,y)定义的领域，r表示输入图像f(x,y)中的灰度，s表示输出图像g(x,y)中的灰度。

进一步，步骤S3.2中采用以下公式计算全局最佳阈值：

其中，

m

进一步，步骤S4中自动细胞器计数通过matlab软件中的bwlabel函数实现，bwlabel函数在对二值图像矩阵标记时，具有连接分量的像素会被分配给唯一的整数，整数的范围是从1到连接分量的总数，故所有连接分量的总和就是细胞数，确定细胞数后，对每个连通域进行编号，编号显示在每个细胞的几何中心，几何中心通过细胞的周长获得。

进一步，细胞的周长的计算公式为：

矢量大小：

数量大小：

g

g

其中，α(x,y)是在f(x,y)处的最大变化率发生的角度，z

进一步，步骤S5中计算细胞面积的方法为：将经过形态处理的图像返回到二值图像矩阵中，有细胞存在的地方像素Z值为1，没有细胞存在的地方像素点为0，遍历整个二值图像矩阵，统计像素点个数；采用RGB采样时，在二值图像矩阵中，总像素点数为细胞器的像素面积，通过比例换算关系可计算出细胞器面积；细胞器个数的计算方法为：统计出经过形态处理图像的像素点总数，在所述图像中放大观察单个规则的细胞器，数出单个规则细胞器所占像素点，用所述像素点总数除以单个规则细胞器所占的像素点，得出细胞器总数。

本发明还公开了一种细胞核和细胞器计数及其面积计算系统，包括：RGB色彩分离模块，用于对采集的细胞图像进行图像RGB色彩分离,获取单一色彩通道图像；缩放模块，用于将单一色彩通道图像进行图像比例缩放；形态处理模块，用于将经过比例缩放的图像进行形态处理；细胞计数模块，用于对经过形态处理图像进行自动细胞计数，对于粘连或大部分重叠的细胞进行人工计数；细胞器计数模块，用于计算细胞面积和细胞器个数。

本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：

1、本发明中方法简化了细胞个数和面积计算的程序，使其操作更加简单，计数效率高，整个计算过程基本可以自动完成，人工参与较少，准确率高。

2、现有技术中，通常只能从图像中进行细胞计数和细胞面积计算，但很少有细胞核和细胞器的计数，本发明是针对细胞核和细胞器进行计数，分辨率相较现有技术有明显的提高。

附图说明

图1是本发明一实施例中细胞核和细胞器计数及其面积计算方法的流程图；

图2是本发明一实施例中细胞核和细胞器计数及其面积计算方法的操作界面图；

图3是本发明一实施例中电子显微镜下拍摄的细胞图像；

图4是本发明一实施例中对细胞图像进行蓝色色彩分离后得到的图像；

图5是本发明一实施例中对细胞图像进行形态处理后得到的图像；

图6是本发明一实施例中对细胞图像进行细胞计数编号后得到的图像；

图7是本发明一实施例中操作界面图显示的细胞计数图；

图8是本发明一实施例中操作界面图显示的像素面积阈值为0的细胞面积图；

图9是本发明一实施例中电子显微镜下拍摄溶酶体的细胞图像；

图10是本发明一实施例中对溶酶体的细胞图像进行红色色彩分离后得到的图像；

图11是本发明一实施例中对溶酶体的细胞图像进行形态处理后得到的图像；

图12是本发明一实施例中软件界面显示的个体值为20溶酶体计数图；

图13是本发明一实施例中软件界面显示的个体值为50溶酶体计数图。

具体实施方式

为了使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方向，通过具体实施例对本发明进行详细的描绘。然而应当理解，具体实施方式的提供仅为了更好地理解本发明，它们不应该理解成对本发明的限制。在本发明的描述中，需要理解的是，所用到的术语仅仅是用于描述的目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

实施例一

本实施例公开了一种细胞核和细胞器计数及其面积计算方法，如图1所示，为方便用户或没有计算机背景的科研人员使用，需要本实施例基于本发明中方法进行了程序界面设计与开发，使得界面呈现简单，易于操作，操作界面如图2所示。包括以下步骤：首先，对细胞图像进行图像采集，其采集的图像如图3所示。在操作界面中点击图片获取按钮，选择需要处理的图片，读取细胞图片。细胞图片的读取，指的是对图片的取样与量化。即当计算机对一幅图像f(x,y)采样时，得到一幅M行和N列的矩阵，M×N表示像素，数值越大表示清晰度越好。该矩阵中坐标(x,y)表示图像在该像素点的灰度值，坐标(x,y)的值是离散量。计算机默认对图像采样是8精度的，这里的灰度值是一个0-255之间的整数。图像的原点定义为(x,y)＝(0,0)处，这里的(0,0)指的是计算机的采样点。沿着第一列的下一个坐标是(1,0)，表示计算机在列方向的第二个采样点。对该细胞图像进行如图1所示的操作。

S1对采集的细胞图像进行图像RGB色彩分离,获取单一色彩通道图像，去除杂质干扰。

如图4所示，细胞核及细胞器图片为彩色图像，细胞核及细胞器通常采用荧光染料染色，生物学图片一般有红绿蓝三种颜色组成，本实施例对图像RGB色彩分离，这样有利于后续图像颜色分离，提高细胞核和细胞器计数及面积的获取精度。RGB图像是由红绿蓝三个采样通道组成，计算机在储存、处理图像时会生成3个二维矩阵来表示图像，矩阵的大小表示图片的像素。矩阵上的数值代表图片在该像素点的灰度值。

分割是把一幅图像根据某种规律分成不同的区域来处理。针对本实施例需要把细胞核和细胞器图片分割成只有特定范围的物体。假定现有一组感兴趣的彩色(或者彩色范围)的样本点，获得一个‘平均’的颜色估计，它是希望分割的某种颜色。用RGB图像的列向量来定义这种平均色。这样做的主要目的是对图像中的每一个RGB像素进行分类，使其在指定的范围内有一种颜色或者没有颜色。

对图像进行RGB色彩分离，单一色彩通道图像，细胞核及细胞器用红绿蓝三种不同试剂染色，并通过以下公式将色彩分离：

D(z,m)＝[(z

其中，D表示z和m之间的距离，z，m分别表示RGB颜色空间中的任一点，z

S2将单一色彩通道图像进行图像比例缩放，以提高自动计数的精确度。

步骤S2中通过如下公式计算细胞图像放缩比例：

其中，坐标(x

S3将经过比例缩放的图像进行形态处理。

如图5所示，形态处理包括：

S3.1对经过比例缩放的图像进行明暗度调节，边界清除；

用户可以通过调节界面设计中的滑动条来改变图像的亮度。对图像所作亮度调节时，可以使那些过暗的细胞变得明亮，这样不会在后续二值转化过程中缺陷或者丢失，图像处理本质上是对图像的像素作处理。步骤S3.1中的明暗度调节公式为：

g(x,y)＝T[f(x,y)]

变换T的最简单形式是领域大小为1×1(单个像素)的情况。在此情况下，g(x,y)的值仅由f(x,y)在这一点处的灰度决定，。当处理彩色图像时，亮度用来表示在特定色彩空间里的彩色图像成分，由于输出值仅取决于点的灰度值，而不是取决于点的领域，T可以简化为以下形式：

s＝T(r)

其中，f(x,y)为输入图像，g(x,y)为输出图像，T是对图像f的算子，作用于点(x,y)定义的领域，r表示输入图像f(x,y)中的灰度，s表示输出图像g(x,y)中的灰度。为了定义点(x,y)的空间领域，主要方法是利用一块中心位于(x,y)的正方形或者矩形区域。此区域的中心由起始点开始逐个像素移动。在移动中包括不同的领域。算子T作用于每个位置(x,y)，从而得到相应位置的输出图像g。只有位于中心点(x,y)领域内的像素点才可以被用来计算(x,y)处g的值。这种方法不光可以用来对图形亮度调节，还可以用来滤波。本实施例中，算子T使用一次函数y＝ax+b来实现，a＝±1，x是矩阵中的灰度值，b是滑动条的范围，滑动条设置的范围是0到125的整数。

本步骤中进行明暗度调节是因为细胞图像通常会有少量的杂质游离于细胞像素面积外，在计算细胞面积时会导致实际细胞面积偏大。这里采用形态学重建的过程，所谓的形态学重建是一种形态学的变换，包括两幅图像和一个结构元。一幅图像是标记，是变换的开始点；另一幅图像是模板，用于约束变换的过程。结构元用来定义连通性。在计算机程序上采用imclearborder函数，这个函数能够利用8连通方式去除比周围物体更亮或者更暗的相连接结构。

S3.2对经过步骤S3.1处理的图像计算全局最佳阈值，并对图像进行二值化处理；

步骤S3.2中采用以下公式计算全局最佳阈值：

令一幅图像的直方图成分由下式所示：

其中，n是图像中像素的总数，n

阈值k由Otsu’s公式选定，其公式为：

其中，

m

如果设置k＝0，那么拥有为k赋值的任何像素C

Otsu’s算法优点是：方差

S3.3对经过二值化处理的图像设置像素面积阈值，去除杂质干扰；

对经过二值化处理的图像利用bwareaopen函数，通过设置像素面积阈值，去除图像中一些微小杂质。bwareaopen函数会将对经过二值化处理的图像中像素面积小于设置像素面积阈值部分的连通域变为0。用户可在图2所示的界面窗口进行像素面积阈值设定，当用户没有输入时，默认像素面积阈值为0即不进行去除。

S3.4对经过步骤S3.3处理的图像进行孔洞填充。

对经过步骤S3.3处理的图像的孔洞填充是一种形态重建的过程，孔洞填充的具体方法如下式所示：

其中，I(x,y)表示经过步骤S3.3处理的图像，假设选择标记图像F(x,y)，除了图像边缘外，其余部分都为0，边缘部分设值为1-I。

S4对经过形态处理图像进行自动细胞计数并编号，对于粘连或大部分重叠的细胞进行人工计数。

在对细胞核计数之前，需要了解连接分量。在之前的处理过程中都是对单个像素点进行处理，而细胞往往是多个像素的集合。连接分量就是用来识别这些集合对象的。一个坐标(x,y)的像素p具有两个水平和两个垂直的相邻像素，它们的坐标分别为(x+1，y)，(x-1，y)，(x，y+1)和(x，y-1)。这个p的相邻像素集合记为N

p的4个对角线相邻像素坐标分别为(x+1，y+1),(x+1,y-1),(x-1,y+1),(x-1,y-1)这样p的4个对角像素记为N

现有另一像素q，若q∈N

步骤S4中自动细胞器计数通过matlab软件中的bwlabel函数实现，该函数通常默认使用8连接，bwlabel函数在对二值图像矩阵标记时，具有8连接分量的像素会被分配给唯一的整数，整数的范围是从1到连接分量的总数，换一种说法，标记值为1的像素属于第一个连接分量；标记值为2的像素属于第二个连接分量的总数；以此类推，故所有连接分量的总和就是细胞数，确定细胞数后，但是图像中的细胞往往有一部分存在粘连，处于分裂期的问题。如果仅仅得到连通分量总数，不知道细胞在计数过程中是否计数完全，如果采用分水岭分割，则会损失一部分细胞面积。通常仅有少量的粘连细胞，对此，采用连通域对细胞计数时，不光要获得连接分量总量，对于获得的每个连通域都会利用计算机对其编号。对每个连通域进行编号，编号显示在每个细胞的几何中心。故需要提取细胞轮廓，得到细胞周长。细胞周长的公式为：

矢量大小：

数量大小：

g

g

其中，α(x,y)是在f(x,y)处的最大变化率发生的角度，z

其中，人工计数可以采用在处理界面中，点击图像中粘连或大部分重叠的细胞，每点击一次细胞数加一，同时在点击处显示总数加一后的编号。采取人工修正的方法是因为一方面对细胞核进行分割会使细胞核在面积计算时缺失一部分，另一方面现有的分割算法对细胞核进行分割存在分割不完全和过度分割问题。

S5计算细胞面积和细胞器个数，并通过处理界面对计算结果进行显示。

步骤S5中计算细胞面积的方法包括：如图5所示，经过形态处理的图像返回到二值图像矩阵中，有细胞存在的地方像素Z值为1，没有细胞存在的地方像素点为0，遍历整个二值图像矩阵，统计像素点个数。采用RGB采样时，利用unit8(无符号8比特整数)读入，在二维图像矩阵中，一个字节表示一个像素。总像素点数即为细胞器的像素面积，通过比例换算关系可计算出细胞器面积，如图8所示。

在一幅图片中细胞器是一些离散的点，或者许多聚集在一个部分的团状。采用连通域分量总量算法对细胞器是没有用的，故细胞器个数的计算方法为：统计出经过形态处理图像的像素点总数，在图像中放大观察单个规则的细胞器，数出单个规则细胞器所占像素点，用像素点总数除以单个规则细胞器所占的像素点，得出细胞器总数。用户在使用过程中可在细胞器计数滑动条下方通过细胞器个体值输入单个细胞器像素面积。

实施例二

本实施例以溶酶体为了对本发明中方案进行进一步阐述。

获取溶酶体细胞图像，如图9所示，图9为电子显微镜下拍摄溶酶体的细胞图像。为在操作界面中点击图片获取按钮，选择需要处理的图片，读取细胞图片。

S1对采集的细胞图像进行图像RGB色彩分离,获取单一色彩通道图像，去除杂质干扰。如图10所示，本实施例对溶酶体的细胞图像进行红色色彩分离。

S2将单一色彩通道图像进行图像比例缩放，以提高自动计数的精确度。

S3将经过比例缩放的图像进行形态处理。

S3.1对经过比例缩放的图像进行明暗度调节，边界清除；

S3.2对经过步骤S3.1处理的图像计算全局最佳阈值，并对图像进行二值化处理；

S3.3对经过二值化处理的图像设置像素面积阈值，去除杂质干扰；

S3.4对经过步骤S3.3处理的图像进行孔洞填充。

S4对经过形态处理图像进行自动细胞计数并编号，对于粘连或大部分重叠的细胞进行人工计数。

S5计算细胞面积和细胞器个数，并通过处理界面对计算结果进行显示。

经过形态处理后得到的溶酶体的细胞图像如图11所示。

图12和图13是中软件界面显示的个体值为20和50时的溶酶体计数图；不进行输入时，计算的结果为细胞器总面积。经过实验验证本思路可行，精确度非常高，可以达到96％以上。

通过界面设计，将处理过后的最终图片和结果与显示器进行通讯，这样用户仅需要点击界面上的按钮就可以得到处理后的图片和结果。

实施例三

基于相同发明构思，本实施例公开了一种细胞核和细胞器计数及其面积计算系统，包括：RGB色彩分离模块，用于对采集的细胞图像进行图像RGB色彩分离,获取单一色彩通道图像；缩放模块，用于将单一色彩通道图像进行图像比例缩放；形态处理模块，用于将经过比例缩放的图像进行形态处理；细胞计数模块，用于对经过形态处理图像进行自动细胞计数，对于粘连或大部分重叠的细胞进行人工计数；细胞器计数模块，用于计算细胞面积和细胞器个数。

最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，而未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，其均应涵盖在本发明的权利要求保护范围之内。上述内容仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以权利要求的保护范围为准。