KGF蛋白外泌体的制备方法、KGF蛋白外泌体干粉、应用及一种毛发护理剂

摘要

本发明公开了KGF蛋白外泌体的制备方法、KGF蛋白外泌体干粉、应用及一种毛发护理剂。本发明公开的一种KGF蛋白外泌体的制备方法运用了CRIPSRa技术，高效激活了干细胞KGF基因的表达水平，而后对高表达KGF的干细胞进行外泌体的富集，在不改变内源基因组的前提下选择性地高表达KGF基因。本发明还提供一种毛发护理剂，该毛发护理剂包括上述KGF蛋白外泌体的制备方法制备得到的KGF蛋白外泌体干粉和调配后的滋养液，该毛发护理剂作用于脱发部位，能够修复受损毛囊以及激活毛囊干细胞，从根本上促进毛发的生长，适用于雄性激素性脱发、精神压力引起的脱发、遗传性脱发以及烫染损伤等多种脱发疾病。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及KGF蛋白外泌体的制备方法、KGF蛋白外泌体干粉、应用及一种毛发护理剂。

背景技术

干细胞在再生领域具有广泛的运用，随着对干细胞的研究逐步深入，越来越多的研究表明干细胞对于毛发的再生具有重要的作用，毛发的生长受到毛囊干细胞以及毛囊组织微环境的调控。人类毛发的生长是一个动态的周期循环，可分为三个阶段，包括生长期、退化期以及休止期。健康人群的毛囊有85％左右处于生长期，而脱发患者有30％甚至以上的毛囊处于休止期。处于休止期时候毛发会自动脱落，在休止期过后，毛囊重新回到生长期，新的毛发重新生长出来，这样周而复始直到毛囊发生萎缩。当大量的毛发陷入休止期时候，毛发则无法生长，最终造成脱发。毛囊能够如此周而复始，其原因是在毛囊底部存在毛囊干细胞。在大多数的脱发疾病中，由于调控毛囊生长的细胞因子含量降低，大量的毛囊停滞在休止期，不能进入生长期，最终导致毛发停止生长。目前已知脱发类型较多，如遗传性脱发、化学物质脱发及营养性脱发等等，其中遗传性脱发也就是雄性激素性脱发是比较常见的类型，对于雄性激素性脱发的治疗常使用米诺地尔酊外擦，口服非那雄胺或度他雄胺，但是会带来不可避免的副作用。

外泌体是细胞在特定刺激条件下分泌产生的40-100nm的细胞外盘状囊泡，是细胞间相互沟通与影响的重要工具，外泌体作为细胞的信号分子，可直接进入细胞，影响细胞功能。干细胞分泌的外泌体中含有多种生长因子，如干细胞因子(SCF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)以及角质细胞生长因子(KGF)等，外泌体进入靶细胞后，能够与细胞相互作用，介导细胞间的信号转导，这些因子不仅能够修复受损的毛囊，激活毛囊干细胞的生长，对于调控生物体内组织器官的正常生理代谢具有十分重要的作用。基于外泌体的安全性以及有效性，越来越多的研究发现外泌体对于多种疾病的治疗具有很好的效果，被用于作为治疗疾病的新型手段。近年来，外泌体在生发领域的研究也逐渐出现，将外泌体运用于脱发的治疗也有相关的报道。

诱导多能干细胞(iPSC)最初由日本科学家山中伸弥实现，将人的成体细胞通过病毒载体将四个转录因子组合导入到体细胞中，从而获得类似胚胎状态的多功能细胞。iPSC具有较多的优点，可以无限更新增殖和分化成为特定组织的细胞，还避免了由于个体差异产生的免疫排斥，与胚胎干细胞相比，iPSC也避免了伦理方面的争论，因此iPSC在生物医学领域具有广阔的应用前景。角质细胞生长因子(KGF)属于成纤维母细胞生长因子家族，又称为FGF-7，其主要由间质细胞产生，KGF与受体KGFR特异结合从而发挥多种生物学功能，促进细胞的生长增殖、促进创伤的愈合以及参与组织器官的发育，如，刺激毛母质细胞和毛囊干细胞的增殖及分化，促进毛囊的发育。KGF在临床应用上具有重要意义，但是仍存在一些问题。在制备重组rhKGF蛋白方面，存在蛋白表达量低以及稳定性较差等问题，导致价格昂贵。研究人员也尝试在真核细胞中过表达KGF，从而提高细胞中KGF的含量，但是，运用传统的过表达手段获得稳定高表达KGF细胞株难免会造成外源DNA整合到基因组中，造成不可预测的影响。此外，传统的过表达手段存在效率低耗时长等问题。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种KGF蛋白外泌体的制备方法，该方法能够高效激活干细胞KGF基因的表达水平，对高表达KGF的干细胞进行外泌体的富集，同时又需要避免由于外源基因在基因组的随机插入造成的不可预测的影响。

本发明的另一个目的在于提供一种毛发护理剂，该毛发护理剂应当包括KGF蛋白外泌体，能够作用于脱发部位，并从根本上促进毛发的生长。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种KGF蛋白外泌体的制备方法，所述制备方法包括，构建具有KGF过表达能力的细胞株，再培养所述细胞株，从培养液中分离得到KGF蛋白外泌体，所述具有KGF过表达能力的细胞株中包含至少两个具有不同插入序列的重组质粒，所述插入序列包括dCas9-转录激活子序列或引导序列。所述转录激活子序列包括序列SEQ ID No.13，所述引导序列编辑gRNA序列，所述引导序列包括由单链DNA退火得到的双链DNA，所单链DNA序列包括以下六组序列中的一组：

第一组序列包括SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；

第二组序列包括SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；

第三组序列包括SEQ ID No.5和SEQ ID No.6；

第四组序列包括SEQ ID No.7和SEQ ID No.8；

第五组序列包括SEQ ID No.9和SEQ ID No.10；

第六组序列包括SEQ ID No.11和SEQ ID No.12。

传统的过表达手段为通过细胞编程，改变iPSC干细胞的基因组成，从而使得其稳定、高效的表达出目的蛋白，但经过细胞编程的细胞株会造成外源DNA整合到基因组的情况发生，整合结果的安全性很难预测，因此，本申请采用了含有KGF基因的转录激活子序列和引导序列的重组质粒，通过转录激活子促进KGF基因的表达水平的提高，而不改变iPSC干细胞的基因组成，从而避免了潜在的安全性风险。

优选地，所述干细胞包括iPSC干细胞。

iPSC干细胞最早于2006年，由日本科学家山中伸弥团队利用逆转录病毒将4个转录因子转入成体细胞进而实现了“生命时钟”的逆转，将其转变为诱导多能干细胞。近年来，随着iPSC干细胞技术不断改进，iPSC干细胞在多种疾病治疗中均展现出了应用潜力，本发明即利用促进iPSC干细胞过表达KGF蛋白而实现KGF蛋白外泌体的制备。

引导序列编辑表达的gRNA能够与KGF基因转录起始位置区域结合，从而引导转录激活子序列靶向结合于KGF转录起始位置，促进KGF基因过表达。gRNA序列的选择具有多样性，由于染色体的空间结构以及表观遗传调控等多种因素导致不同的gRNA序列与KGF基因转录起始位置不同区域结合的程度存在差异，最终使引导的转录激活子靶向KGF基因存在差异。本发明提供的六组gRNA序列都能引导转录激活子序列靶向到KGF基因上，并且其中第三组gRNA序列在空间结构等因素下能够更好地与KGF基因转录起始位置结合，高效引导转录激活子靶向KGF基因取得比其他组更好的效果。

优选地，所述重组质粒的原始质粒包括含有引导序列质粒和含有dCas9-转录激活子质粒。

进一步优选地，所述重组质粒包括质粒lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNA-A和质粒lenti-EF1a-dCas9-VPR-Puro。

lenti-EF1a-dCas9-VPR-Puro质粒中自带KGF基因的转录激活子序列SEQ IDNo.13(5'-GACGCATTGGACGATTTTGATCTGGATATGCTGGGAAGTGACGCCCTCGATGATTTTGACCTTGACATGCTTGGTTCGGATGCCCTTGATGACTTTGACCTCGACATGCTCGGCAGTGACGCCCTTGATGATTTCGACCTGGACATGCTG-3')，本发明选择该质粒，避免了额外插入KGF基因的转录激活子序列的操作流程，既节约了实施成本，同时，由于减少了外源基因的插入步骤，使得重组质粒的构建成功率得到了显著的提高。

优选地，所述质粒lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNA-A的构建方法包括设计合成gRNA序列，根据gRNA序列合成单链DNA序列，经退火后得到对应的双链DNA序列，该双链DNA序列在连接酶的作用下，连接于酶切后的质粒lentiGuide-Hygro-mTagBFP2上，得到质粒lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNA-A。

优选的，所述重组质粒还经过病毒包装。

优选地，所述病毒包装选用293T细胞。

优选地，所述重组质粒在进行病毒包装前还需要进行重组质粒的扩增和鉴定。

优选地，所述重组质粒的扩增包括将重组质粒转化进DH5α感受态细胞中进行培养。

优选地，所述重组质粒的鉴定包括提取扩增后的重组质粒进行基因测序，并确定测序结果中包括引导序列或转录激活子序列。

优选地，在培养所述细胞株之前还包括细胞株的筛选。

优选地，所述细胞株的筛选包括，采用含有细胞毒素的培养基对含有重组质粒的细胞株进行培养，所述的细胞毒素与重组质粒具有的抗性相对应。

优选地，所述细胞毒素包括嘌呤霉素和/或潮霉素B。

优选地，所述的KGF蛋白外泌体采用超速离心方法进行分离，具体包括，采用离心的方法从细胞株培养液中分离获得KGF蛋白外泌体，包括首先离心去除细胞株，而后增大离心力到48000rpm以上，再次离心得到KGF蛋白外泌体。

优选地，所述离心去除细胞株的步骤包括至少两次离心。

优选地，采用三次离心步骤从细胞株培养液中分离KGF蛋白外泌体，具体包括，第一次离心力1600rpm，离心时间30min，离心后取上清溶液，第二次离心力7000rpm，离心时间30min，离心后取上清溶液，第三次离心力48000rpm，离心时间1.5h，离心后取沉淀。

优选地，所述KGF蛋白外泌体的保存方法包括，经生理盐水重悬后，于-80℃保存。

本发明还提供了一种KGF蛋白外泌体干粉，所述KGF蛋白外泌体干粉的制备方法包括，取60～90份KGF蛋白外泌体与5～20份海藻糖、3～12份甘露醇混合，而后冷冻干燥制得KGF蛋白外泌体干粉。

优选地，所述KGF蛋白外泌体干粉包括85份KGF蛋白外泌体、10份海藻糖和5份甘露醇。

本发明还提供了上述KGF蛋白外泌体干粉在制备防脱生发产品中的应用。

优选地，所述防脱生发产品包括具有防脱生发功能的毛发护理剂。

本发明还提供了一种毛发护理剂，所述毛发护理剂包括质量比为1：(1～4)的滋养液和上述KGF蛋白外泌体冻干粉，所述滋养液包括60-70份的去离子水、5-10份的人参提取物、5-10份的绿茶提取物、10-15份的何首乌提取物、1-3份的促溶剂、1-3份的保湿剂、0.1份的防腐剂、2-3份的促透剂和0.02份的香精。

优选地，所述滋养液包括，62-67份的去离子水、6-8份的人参提取物、6-8份的绿茶提取物、12-14份的何首乌提取物、1.5-3份的促溶剂、1.5-3份的保湿剂、0.1份的防腐剂、2-3份的促透剂和0.02份的香精。

优选地，所述滋养液包括65份的去离子水、7份的人参提取物、7份的绿茶提取物、13份的何首乌提取物、3份的促溶剂、3份的保湿剂、0.1份的防腐剂、2份的促透剂和0.02份的香精。

优选地，所述促溶剂包括环己硅氧烷、二丙二醇、异十六烷或十六酸异丙酯中的一种或两种以上组合，所述的保湿剂包括氨基酸保湿剂、1,3-丁二醇、丙三醇或聚乙二醇中的一种或两种以上组合，包括所述的防腐剂包括氯苯甘醚、尼泊金甲酯、尿囊素和苯氧基乙醇中的一种或两种以上组合，所述的促透剂包括卡必醇、月桂氮芯卓酮、薄荷脑或油酸中的一种或两种以上组合，所述的香精包括杏仁1号、乙基肉桂醛、羟基异己基3-环己基甲醛或丁苯基甲基丙醛中的一种或两种以上组合；

优选地，所述促溶剂为二丙二醇，所述保湿剂为氨基酸保湿剂，所述防腐剂为氯苯甘醚，所述促透剂为卡必醇，所述香精为杏仁1号。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种KGF蛋白外泌体的制备方法，该方法构建了具有KGF过表达能力的细胞株，所述具有KGF过表达能力的细胞株中包含至少两个具有不同插入序列的重组质粒，所述插入序列包括转录激活子序列或引导序列，所述转录激活子序列包括序列SEQ IDNo.13，所述引导序列编辑gRNA序列，gRNA序列能够靶向KGF转录起始区域，dCas9与转录激活子以融合蛋白形式存在，在gRNA的指导下dCas9能够精确地靶向结合DNA，从而使转录激活子结合到KGF转录起始区域，从而实现KGF基因的高效表达，提高细胞株分泌外泌体的活性。与传统的过表达手段相比，本发明提供的KGF蛋白外泌体的制备方法避免了由于外源基因在基因组的随机插入造成的不可预测的影响，在不改变内源基因组的前提下选择性地高表达KGF基因。

本发明还提供了一种KGF蛋白外泌体干粉，该KGF蛋白外泌体干粉由上述制备的KGF蛋白外泌体与海藻糖、甘露醇混合后冷冻干燥制得，制得的冻干粉保证外泌体活性，在室温下性能稳定，能够长期保存。得到的KGF蛋白外泌体干粉能够用于制备防脱生发产品。

本发明还提供了一种毛发护理剂，该毛发护理剂包括上述KGF蛋白外泌体的制备方法制备得到的KGF蛋白外泌体干粉和调配后的滋养液，该毛发护理剂作用于脱发部位，能够修复受损毛囊以及激活毛囊干细胞，从根本上促进毛发的生长，防脱生发的效果显著，适用于雄性激素性脱发、精神压力引起的脱发、遗传性脱发以及烫染损伤等多种脱发疾病。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明中干细胞内源基因KGF的转录被激活示意图；

图2为实施例1-6及对比例KGF mRNA表达水平对比。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种KGF蛋白外泌体的制备方法，通过运用CRIPSRa技术高效激活干细胞KGF基因的表达水平，提高干细胞分泌的外泌体活性，干细胞内源基因KGF被激活高效表达水平的过程如图1所示。

本实施例具体步骤如下：

1.gRNA引物设计

本实施例设计了gRNA序列，并根据分别gRNA的正向序列和gRNA反向序列合成相应单链DNA，即单链OligoDNA，所述的单链OligoDNA序列如下：

gRNA正向序列相应单链DNA序列(正链OligoDNA序列)：5'-CACCGTACTACGAACTGTTTTTATG-3'(SEQ ID No.5)；

gRNA反向序列相应单链DNA序列(负链OligoDNA序列)：5'-AAACCATAAAAACAGTTCGTAGTAC-3'(SEQ ID No.6)。

2.重组质粒的构建

2.1质粒lentiGuide-Hygro-mTagBFP2的酶切

将质粒lentiGuide-Hygro-mTagBFP2于37℃下酶切30min，所用酶切体系如下：

2.2Oligos的退火连接

步骤1中合成的相应单链OligoDNA，经过退火形成双链DNA，退火反应体系如下：

将上述体系瞬时离心后，于PCR仪中95℃孵育5min，孵育后自然冷却20min，取1μl杂交后的双链DNA按1:200稀释，取稀释后的双链DNA与步骤2.1中得到的酶切后的lentiGuide-Hygro-mTagBFP2载体，4℃连接过夜，得到重组质粒lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNA-A，连接体系如下:

2.3重组质粒lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNA-A的转化

2.3.1将感受态细胞DH5α从-80℃中取出，冰上缓慢解冻。

2.3.2加入重组质粒lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNA-A至感受态细胞DH5α中，轻轻吹吸混匀，冰上静置30min。

2.3.3取出步骤2.3.2中的混合物，迅速置于42℃水浴锅中热激90s，热激结束后冰上静置5min。

2.3.4取LB培养基经预热后，取900μl加入步骤2.3.3得到的热激后的转化有重组质粒lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNA-A的感受态细胞DH5α溶液，摇床的旋转加速度调至180rpm，于37℃下培养1h，而后在室温、4000rpm条件下离心3min，取沉淀重悬于100μl LB培养基中。

2.3.5将重悬的菌液均匀涂到含有抗性的LB平板上，37℃培养箱中培养过夜。

2.4.重组质粒lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNA-A的提取

使用质粒小提试剂盒(去内毒素)对重组质粒lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNA-A进行提取，具体操作步骤如下：

2.4.1挑选步骤2.3中得到的单克隆，接种到含有抗性的LB培养基中，摇床过夜培养。

2.4.2在5000rpm转速下离心菌液10min，吸弃上清，收集沉淀即菌体。

2.4.3向收集的菌体中加入500μl已添加RNase A的Solution I，充分混匀，重悬菌体。

2.4.4再加入500μl Solution II至步骤2.4.3中得到的菌体悬液，并轻轻地上下颠倒数次，直到溶液变的透明，室温下静置3min。

2.4.5然后加入250μl预冷的N3 Buffer至步骤2.4.4得到的透明液体，并轻轻地上下颠倒数次，于室温、13000rpm条件下离心10min。

2.4.6吸取步骤2.4.5中离心后的上清液至另第二离心管中，加入0.1个体积的ETRSolution，上下颠倒数次直至混匀，冰上静置10min。

2.4.7将步骤2.4.6中得到的第二离心管置于42℃水浴锅中孵育5min，然后于室温、12000rpm条件下离心3min。

2.4.8将步骤2.4.7中离心后得到的上清液转移至第三离心管中，加入0.5个体积的无水乙醇，轻轻地颠倒混匀，室温下静置2min。

2.4.9在吸附柱中加入步骤2.4.8中获得的混合液，于室温、13000rpm条件下离心1min，弃掉离心液。

2.4.10向吸附柱中加入500μl HBC Buffer，于室温、13000rpm条件下离心1min，弃掉离心液。

2.4.11向吸附柱中加入700μl DNA Wash Buffer，于室温、13000rpm条件下离心1min，弃掉离心液。

2.4.12于室温、13000rpm条件下将步骤2.4.11中的空吸附柱离心1min，并将上层空吸附柱转移到第四离心管中，而后向其中加入100μl ddH

2.4.13室温下离心步骤2.4.12，13000rpm离心1min。

2.4.14步骤2.4.13离心下来的液体即为含有重组质粒lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNA-A的液体，使用NanoDrop仪器对重组质粒lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNA-A进行浓度的测定，结果为1022ng/μl，放于-20℃保存。

3.病毒包装

3.1从培养箱中取出293T细胞，显微镜下确定细胞生长情况良好。

3.2细胞转染前，准备以下试剂：

质粒混合液(用15ml离心管准备)：将上述构建得到的质粒lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNA-A和市购的质粒lenti-EF1a-dCas9-VPR-Puro加入到Opti-MEM培养基中，轻轻吹吸2-3下混匀，室温下静置5min。

PEI混合液(用15ml离心管准备)：将浓度为1mg/ml的PEI加入到Opti-MEM培养基中，轻轻吹吸2-3下混匀，室温下静置5min。

详细添加计量及计算见表1：

表1实施例1中10cm培养皿包装质粒用量

3.3静置后，将PEI混合液加入到质粒混合液中，缓慢逐滴加入，边加边混合晃动离心管，避免沉淀出现，室温下静置15min。

注：PEI混合液与质粒混合液的添加顺序不能颠倒，一定要将PEI混合液加入到质粒混合液中。

3.4静置结束后，将步骤3.3得到的质粒-PEI混合液逐滴均匀加入到培养基中，置于培养箱中培养，6h后更换培养基。

注：实验过程中均使用不含抗生素的培养基。

3.5在转染48h时收集第一次病毒上清液，转染72h时收集第二次病毒上清液，将两次收集到的病毒上清液混合，0.45μm滤膜过滤所有的病毒上清液。

3.6利用离心的方法步骤5)中过滤后的病毒上清液进行浓缩，4℃下19400rpm离心2h。

3.7离心结束后，弃上清，用DMEM基础培养基重悬沉淀，将重悬液分装到1.5ml EP管，每管500ul，-80℃保存。

4.细胞感染与筛选

4.1细胞感染：

1)病毒感染前一天，将生长状态良好的干细胞接种在24孔板中，按照每孔50K的细胞密度接种。

2)准备病毒混合液，分别往离心管中加入lenti-EF1a-dCas9-VPR-Puro病毒上清液以及Polybrene，使得Polybrene终浓度为5μg/ml。

3)吸弃24孔板中的培养基，加入步骤2)中制备好的病毒混合液。

4)离心24孔板，离心条件为：25℃、2250rpm、30min。

5)离心结束后，取下24孔板，放回培养箱培养，24h后更换新鲜培养基继续培养。

4.2细胞筛选：

1)病毒感染细胞72h后，取出孔板，吸弃培养基，加入含有嘌呤霉素的培养基进行药物筛选。

2)每隔两天将原有培养基吸弃，更换含有嘌呤霉素的新鲜培养基。

3)使用含有嘌呤霉素的培养基培养细胞7天后，更换为含有减半药物浓度的培养基维持培养，此时获得稳定表达lenti-EF1a-dCas9-VPR-Puro的细胞株。

4)在稳定表达lenti-EF1a-dCas9-VPR-Puro的细胞株上进行lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNA-A病毒的感染，步骤按照上述细胞感染所描述进行。

5)病毒感染细胞72h后，取出孔板，吸弃培养基，加入含有潮霉素B的培养基再次进行药物筛选。

6)每隔两天将原有培养基吸弃，更换含有潮霉素B的新鲜培养基。

7)使用含有潮霉素B的培养基培养细胞7天后，更换为含有减半药物浓度的培养基维持培养，此时获得稳定过表达KGF基因的细胞株，对此细胞株进行检测。

5.KGF基因表达水平检测

5.1细胞总RNA的提取

1)吸弃培养皿中的培养基，加入2ml DPBS漂洗细胞，漂洗结束后弃掉DPBS，加入1ml TRIZOL溶液，冰上孵育10min。

2)转移步骤1)中的溶液至离心管中，加入200μl氯仿，涡旋震荡以混匀溶液，置于冰上孵育5min。

3)离心，4℃13000rpm条件下离心15min，离心结束后小心将上层水相转移到新的离心管中。

4)加入等量体积的异丙醇，混匀后将离心管放于-80℃中沉淀30min。

5)再次离心，4℃13000rpm条件下离心15min，小心地吸弃上清，离心管底可见白色沉淀。

6)加入1ml预冷的75％乙醇溶液，颠倒混匀并在4℃13000rpm条件下离心5min，吸弃上清。

7)重复步骤6)一次。

8)打开离心管盖，室温下静置3～5min，让多余的乙醇挥发干净，此时离心管管底白色沉淀呈现无色透明，沉淀即为细胞总RNA。

9)往离心管中加入含有RNase抑制剂的DEPC水溶解RNA，并进行浓度和纯度的测定。

5.2cDNA第一链的合成

1)基因组DNA的去除，在冰上配制以下反应体系：

2)在PCR仪中设定以下程序进行反应：37℃30min→75℃10min→4℃短暂保存。

3)从上一步骤中取出10μl RNA溶液到离心管中，配制以下反应体系：

4)将离心管放于65℃水浴中反应5min，反应结束迅速放于冰上冷却。

5)将离心管瞬时离心后，加入以下组分，操作均在冰上完成：

6)将离心管放于37℃水浴中反应2min。

7)水浴结束后，加入1μl M-MLV逆转录酶。

8)设定以下PCR程序进行反应：25℃10min→37℃50min→70℃15min→4℃短暂保存。

9)-20℃中保存得到的产物。

5.3qRT-PCR检测KGF mRNA的表达水平

1)将制备好的cDNA用ddH

2)在冰上配制以下反应体系：

3)将上一步的混合液转移到qRT-PCR板中并进行封板。

4)将qRT-PCR板放进qRT-PCR仪中，采用软件中的标准两步法和溶解曲线程序开始运行。

6.干细胞外泌体防脱生发制剂的制备

生发制剂主要由两部分组成，包括外泌体冻干粉以及滋养液，使用时需要将滋养液与冻干粉进行1:1比例混合使用，制备过程如下：

6.1外泌体冻干粉的制备

1)从-80℃中取出干细胞外泌体，在4℃缓慢下解冻。

2)外泌体解冻完全后，按比例加入海藻糖、甘露醇，作为冻干保护剂。

3)搅拌均匀，调pH至7.2-7.4。

4)分装至西林瓶，每瓶2ml，半挂瓶塞，-80℃预冻。

5)预冷冻干机至-50℃，从-80℃迅速取出样品放入冻干机进行冻干。

6.2滋养液的制备

1)按照以下组分比例称取各组分：去离子水60-70份，人参根提取物5-10份，绿茶提取物5-10份，何首乌提取物10-15份，二丙二醇3份，氨基酸保湿剂3份，氯苯甘醚0.1份，卡必醇2-3份，杏仁1号0.02份。

2)将上述各组分混合，搅拌均匀，完全溶解后分装至西林瓶，压盖保存。

实施例2

本实施例除了单链DNA序列如下，之外其余与实施例1相同：

正链Oligo DNA序列：5'-CACCGAGGAATCCTGTGTTGTTATC-3'(SEQ ID No.1)；

负链Oligo DNA序列：5'-AAACGATAACAACACAGGATTCCTC-3'(SEQ ID No.2)。

实施例3

本实施例除了单链DNA序列如下，之外其余与实施例1相同：

正链Oligo DNA序列：5'-CACCGTTGAGTTGATTGTTACTCCT-3'(SEQ ID No.3)；

负链Oligo DNA序列：5'-AAACAGGAGTAACAATCAACTCAAC-3'(SEQ ID No.4)。

实施例4

本实施例除了单链DNA序列如下，之外其余与实施例1相同：

正链Oligo DNA序列：5'-CACCGTTAGTTCCTGATAACAACAC-3'(SEQ ID No.7)；

负链Oligo DNA序列：5'-AAACGTGTTGTTATCAGGAACTAAC-3'(SEQ ID No.8)。

实施例5

本实施例除了单链DNA序列如下，之外其余与实施例1相同：

正链Oligo DNA序列：5'-CACCGTAGGAAGAGGTCAATGACCT-3'(SEQ ID No.9)；

负链Oligo DNA序列：5'-AAACAGGTCATTGACCTCTTCCTAC-3'(SEQ ID No.10)。

实施例6

本实施例除了单链DNA序列如下，之外其余与实施例1相同：

正链Oligo DNA序列：5'-CACCGTCAATCTACAATTCACAGAT-3'(SEQ ID No.11)；

负链Oligo DNA序列：5'-AAACATCTGTGAATTGTAGATTGAC-3'(SEQ ID No.12)。

对比例

以同样的病毒包装步骤进行lenti-EF1a-dCas9-VPR-Puro以及lentiGuide-Hygro-mTagBFP2病毒的包装，并感染细胞进行抗性筛选，获得稳定表达VPR以及不含gRNA序列的细胞株，作为对照组，进行KGFmRNA表达水平检测。

实验例

对上述六组实施例与对比例按照实施例1中步骤5所述方法进行KGF mRNA表达水平检测，检测结果如图2所示，由图中可以看出，在各稳定细胞株中能看到KGF表达水平与对照组相比明显升高，这说明KGF基因被高效激活，但是激活的程度不一样，其中在实施例1所得细胞株中KGF的表达含量最高，可见其激活程度最高。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 珠海乐维再生医学科技有限公司

<120> KGF蛋白外泌体的制备方法、KGF蛋白外泌体干粉、应用及一种毛发护理剂

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caccgaggaa tcctgtgttg ttatc 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaacgataac aacacaggat tcctc 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caccgttgag ttgattgtta ctcct 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aaacaggagt aacaatcaac tcaac 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caccgtacta cgaactgttt ttatg 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaaccataaa aacagttcgt agtac 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

caccgttagt tcctgataac aacac 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aaacgtgttg ttatcaggaa ctaac 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

caccgtagga agaggtcaat gacct 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aaacaggtca ttgacctctt cctac 25

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

caccgtcaat ctacaattca cagat 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

aaacatctgt gaattgtaga ttgac 25

<210> 13

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gacgcattgg acgattttga tctggatatg ctgggaagtg acgccctcga tgattttgac 60

cttgacatgc ttggttcgga tgcccttgat gactttgacc tcgacatgct cggcagtgac 120

gcccttgatg atttcgacct ggacatgctg 150