危重病死亡率诊断性生物标志物tenascin-c及其应用

摘要

本发明属于诊断试剂和系统技术领域，涉及一种诊断性生物标志物及用于危重病病情严重程度的判断以及死亡率预测制品中的用途。具体涉及腱生蛋白tenascin‑c(TNC)作为危重病死亡率的检测标志物及在制备危重病死亡率检测系统及其试剂盒中的用途。经实验，结果显示，危重病患者相对于正常人群有更高的肌酐水平、SOFA评分以及血清TNC水平，血清TNC水平越高对应更高的死亡率；TNC的检验效能与SOFA评分类似，TNC水平与SOFA评分有良好的线性相关性，所述TNC作为诊断性生物标志物具有临床推广价值。

说明书

技术领域

本发明属于诊断系统领域，涉及一种诊断性生物标志物及其在危重病病情严重程度的判断以及死亡率预测方面的应用。尤其涉及腱生蛋白Tenascin-c(TNC)作为诊断性生物标志物用于制备危重病病情严重程度的判断以及死亡率预测的检测试剂盒和检测系统中的用途。

背景技术

危重病见于生命体征不稳定、病情发展迅速，常常危及生命的一类患者。许多人口、经济方面的研究表明，在发达国家危重病带来的社会负担和经济负担已经远超预期，并且还在随着人口老龄化而增加。早期发现、诊断、治疗危重病患者，不仅可以提高患者的生存率，对于减轻全球危重病的经济负担也可以起着积极作用。目前对于重症监护病人疾病严重程度的评估主要依赖一些综合性评分模型，比如SAPS、APACHE、SOFA等。SOFA评分，全称为顺序器官衰竭评估评分，是第一个脓毒血症相关的器官衰竭评估评分，于1994年引入。SOFA评分评估了患者全身主要脏器的功能，可以及时的量化患者疾病的严重程度。SOFA评分由6个系统的评分组成，总共12个变量，根据器官功能障碍的程度每个变量评分从0到4分。虽然总的来说SOFA评分足够可靠，但需要经过计算或者严格遵守数据定义的变量在进行评分时就会变得不那么准确。并且至今为止SOFA评分仍然依靠医师手动填写表格进行计算，没有相应的自动提取数据并进行评分的程序，这使得人为差错的可能性大大增加。即使我们通过反复核对或者两人比对来降低这种人为误差，SOFA评分需要的即时检查结果项目也非常多，很难立即得到当日的准确得分。基于这些不足，我们亟需要更简单直观且可靠的方式来进行实时评估危重病患者病情，新的生物标志物或许能满足我们的需求。

生物标志物是近年来非常热门的一个研究方向，高敏感性、高特异性的生物标志物有助于早期对临床疾病的诊断、治疗以及预后的判断。理想的生物标志物应该具有精确的诊断灵敏度和特异性，同时拥有较高的可用性和可操作性，甚至需要考虑到合适的医学成本。

发明内容

本发明的目的是提供腱生蛋白Tenascin-c(TNC)新用途，尤其是腱生蛋白Tenascin-c(TNC)作为诊断性生物标志物用于制备危重病病情严重程度的判断以及死亡率预测的检测试剂盒和检测系统中的用途。

本发明中经实验，结果显示，危重病患者相对于正常人群有着更高的肌酐水平、SOFA评分以及血清TNC水平，血清TNC水平越高对应更高的死亡率。多因素回归分析显示TNC水平、血小板水平以及GCS评分是危重病例死亡率的独立危险因素。这提示本身wing所述的血清TNC可作为一种诊断预测性生物标志物，而在危重病学领域，国内外无相关报道。本发明在上述发明构思基础上完成。

本发明提供了腱生蛋白tenascin-c的应用，即腱生蛋白tenascin-c是危重病死亡率的检测标志物。

Tenascin-c(TNC)作为腱生蛋白家族最早被发现的成员，本质上是一种细胞外基质糖蛋白，它作为一种六聚体，拥有四个不同功能的结构域，使得它可以与致病成分、基质成分、可溶性因子以及细胞表面蛋白等相互作用，拥有多种多样的功能。TNC的表达在时间以及空间上都受到严格调控，在胚胎发育阶段广泛分布，在成人组织中限制性表达。同时，TNC又可在伤口愈合期间重新表达上调。

本发明还提供了腱生蛋白tenascin-c在制备危重病死亡率的检测制剂方面的应用。

较好的，所述的检测药剂基于腱生蛋白tenascin-c的大分子变体。

本发明中，所述的危重病是心功能不全、肺部感染、呼吸衰竭呼吸机辅助通气、急/亚急性肝衰竭、血液透析、AKI(急性肾损伤)、脑出血、意识障碍、脓毒血症、MODS(官功能障碍综合征)中的一种或者几种。

换言之，所述的危重病的患者是出现心功能不全、肺部感染、呼吸衰竭呼吸机辅助通气、急/亚急性肝衰竭、血液透析、AKI、脑出血、意识障碍、脓毒血症、MODS中的一种或者几种情况的患者。

本发明进一步提供了一种危重病死亡率检测系统，所述的系统包括生化指标检测部分和计算分析部分；

所述的生化指标包括腱生蛋白tenascin-c表达量；

所述的分析包括生活指标的定量、分类、统计或者概率计算。

所述的危重病死亡率检测系统中，生化指标的检测包括以下步骤：

收集待测样品；

分离血清；

检测生化指标。

其中，待测样品通常是离体的血液样品，例如静脉全血、指尖取血。

分离血清，可以采用离心血液样品，然后收集上层血清的方法。

检测TNC的表达量，通常分为核酸和蛋白两种表示方法。核酸定量，例如采用Q-PCR，获得TNC的RNA含量。蛋白定量，例如使用western方法检测，或者使用ELISA杂交、蛋白芯片等方法更精确的定量。

对于进入各ICU的患者，可在入院时以及入院后的任何阶段抽取血清进行检测。

危重病的生化指标通常包括患者血液、体液或者细胞组织的实验室检测结果。本发明所述的检测系统中，生化指标还可以包括肌酐水平、血小板水平或者GCS评分。

本发明所述的检测系统中所采用的计算分析使用SAPS、APACHE或者SOFA评分中的一种或者几种。

本发明的危重患者死亡率检测系统，将危重病患者来源的血清TNC水平定量，并且分类进行比较：

1.TNC 0～133.0ng/ml：28天生存率达92.57％；

2.TNC 133.0～491.8ng/ml：28天生存率达82.23％；

3.TNC 491.8～850ng/ml：28天生存率为66.94％；

4.TNC 850ng/ml～：28天生存率仅为26.45％；

血清TNC水平随着疾病的进展而改变，当TNC水平＞850ng/ml，28天死亡率大大提升。

本发明还提供了一种危重病死亡率检测试剂盒，其含有检测腱生蛋白tenascin-c表达量的试剂。所述的试剂包括检测核酸或者蛋白的常用试剂，例如在本发明的优选例中，使用检测tenascin-c的Elisa试剂。

通常，该试剂盒还含有阳性对照、阴性对照和说明书等。

较好的，上述试剂盒还含有腱生蛋白tenascin-c的标准品。

本发明提供了一种诊断性生物标志物TNC及其检测试剂盒和检测系统，可以用于危重病病情严重程度的判断以及死亡率预测。实验结果显示危重病患者相对于正常人群有着更高的肌酐水平、SOFA评分以及血清TNC水平，血清TNC水平越高对应更高的死亡率。多因素回归分析显示TNC水平、血小板水平以及GCS评分是危重病例死亡率的独立危险因素。TNC的检验效能与SOFA评分类似，TNC水平与SOFA评分有着良好的线性相关性，TNC作为诊断性生物标志物具有临床推广价值。

附图说明

图1入选患者年龄分布图。

图2危重病组与正常对照患者TNC水平比较图。

图3 TNC与生存率关系图。

图4 TNC的SOFA评分图。

图5 TNC与SOFA评分比较图。

具体实施方式

收集2014年4月至2017年2月就诊于复旦大学附属华山医院的ICU患者资料，入院当天知情同意书签字，留血清进行TNC检测，同时记录各基线指标。其中男性88名(占65.67％)，女性46名(34.33％)，患者年龄分布情况如图1所示。

对于入选患者的主要病种统计如表1所示。

表1入选患者的主要病种统计

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实施例1危重病组与正常对照患者基线水平比较

以来院体检的46名患者作为正常对照，同样留取其血清以及各基线指标，比较入选患者与正常对照组之间的年龄、性别、体重、肌酐、血小板、SOFA评分、血清TNC水平等基线水平是否有差异。结果显示，对照组平均年龄54.67±5.83岁，平均体重66.32±3.07Kg，54.35％为男性。研究队列的年龄、体重不符合正态分布，年龄中位数为56岁(38岁，67岁)，体重中位数为63.0Kg(55.0Kg，72.5Kg)，65.67％为男性。正常对照组血小板水平中位数为220.0×10

表2危重病组与正常对照患者基线水平比较

。

实施例2危重病患者血清TNC水平与死亡率检测

纳入研究的134名患者中，截止随访时28天全因死亡人数27人，28天全因死亡率为20.15％。将患者按照TNC水平0～133.0ng/ml、133.0～491.8ng/ml、491.8～850ng/ml以及大于850ng/ml分为四组，绘制生存曲线。比较四组年龄、性别、体重，两两之间无统计学差异。而四组28天生存率分别为92.57％、82.23％、66.94％、26.45％，有显著的统计学差异。TNC水平越高对应更高的死亡率。

实施例3血清TNC水平与SOFA评分呈中度相关性

对危重病患者抽血当天的SOFA评分以及血清TNC水平进行spearman相关性分析，结果显示相关系数为0.4486，P＜0.0001，在统计学意义上呈中度相关性。可得到线性拟合方程：Y＝53.03*X+168.3。

实施例4 TNC的诊断水平与SOFA评分

为了比较在危重病患者中TNC与SOFA评分这两种方法的诊断价值，我们绘制了受试者工作曲线(ROC曲线)，并计算两者的曲线下面积，SOFA为0.8079，TNC为0.7632。两个曲线下面积均大于0.7，提示两者作为诊断试验均有合格的准确度和精确度。而两者曲线下面积无统计学差异，提示两者作为诊断试验检验效能类似。对于TNC的ROC曲线，经计算得最大约登指数为0.4837，此时对应的cut-off值为491.8ng/ml。

实施例5影响危重病28天死亡率危险因素分析

为分析影响危重病患者死亡率的危险因素，将入选危重病患者按照28天内死亡以及生存分为两组，比较两组年龄、性别、体重、SOFA评分、TNC水平、肌酐、血小板、GCS评分等是否存在差异。如表3所示，两组性别、SOFA评分、TNC水平、血小板、GCS评分、是否需要药物维持血压以及呼吸机辅助通气有明显的统计学差异。将上述可能的危险因素进行回归分析，结果提示TNC、血小板水平、GCS评分是影响危重病患者28天死亡率的独立危险因素。

表3影响危重病28天死亡率危险因素分析

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表4危重病危险因素进行回归分析

危重病患者相对于正常人群有着更高的肌酐水平、SOFA评分以及血清TNC水平，血清TNC水平越高对应更高的死亡率。多因素回归分析显示TNC水平、血小板水平以及GCS评分是危重病例死亡率的独立危险因素。TNC的检验效能与SOFA评分类似，TNC水平与SOFA评分有着良好的线性相关性，TNC作为诊断性生物标志物具有临床推广价值。

实施例6TNC与28天生存率测试

1.对于临床判断病情危重的患者，可留取第一天、第三天血清以助于预后判断。在患者病情变化时，也可随时留取、检测；

2.Tenascin的检测

1)采用黄帽管收集入选对象静脉全血，4℃3000rpm离心15分钟，收集上层血清保存于-80℃待测。

2)由于FN III可被可变剪切，TNC可产生许多大小不同的变体。研究发现小分子量变体常表达于正常组织，而大分子量变体则存在于病理状态以及癌症中。因而，本研究采用IBL公司货号NO.27767检测TNC大分子量变体的ELISA试剂盒。样品稀释倍数50倍，检测结果以ng/ml为单位。

3.结果分析：

1)TNC 0～133.0ng/ml：28天生存率达92.57％；

2)TNC 133.0～491.8ng/ml：28天生存率达82.23％；

3)TNC 491.8～850ng/ml：28天生存率为66.94％；

4)TNC 850ng/ml～：28天生存率仅为26.45％；

血清TNC水平随着疾病的进展而改变，当TNC水平＞850ng/ml，28天死亡率大大提升。

TNC用于危重病诊断、预后的判断，包括用于急诊、各ICU、疾病进展状态的患者，其危险分层，以及对不同灵敏度、特异性下TNC截点的选择如表5所示。

表5危重病TNC的截点

n＝(μα/δ)*(μα/δ)*(1-P)P

参数：

(1)μα：α＝0.05，μα＝Zα/2＝1.960

(2)δ：判断界值。由研究者根据预试验或查文献来估计。可综合取预试验之灵敏度或特异度的1/5～1/10。一般定在0.05～0.10之间。本例取δ＝0.08

(3)P的确定：一般，计算试验组的样本量时用P灵敏度，而计算对照组样本量时用P特异度)。