Hsp90作为制备预防与治疗类固醇糖尿病药物的用途

摘要

本发明涉及一种Hsp90作为制备预防与治疗类固醇糖尿病药物的用途。本发明发现Hsp90抑制剂17‑DMAG、广谱HDAC抑制剂TSA和HDAC6抑制剂Tubacin能抵消地塞米松对GSIS的抑制和对NYP和SSRT3基因表达的促进作用，证实了Hsp90是预防与治疗类固醇糖尿病的潜在靶点。

说明书

技术领域

本发明属于预防与治疗类固醇糖尿病药物领域，特别涉及一种Hsp90作为制备预防与治疗类固醇糖尿病的药物的用途。

背景技术

长期暴露于过量的外源性或内源性糖皮质激素(GCs)通常会导致葡萄糖代谢受损，最终可能发展为糖尿病。内源性的过量糖皮质激素暴露通常由一些罕见的疾病导致，包括促肾上腺皮质激素(ACTH)依赖性的垂体腺瘤(称为库欣病)、异位产生ACTH的肿瘤以及ACTH依赖性的肾上腺腺瘤、癌或异常增生所导致。而另一方面，外源性的糖皮质激素是临床常见药物，全球将近1％的人群由于炎症、自身免疫性疾病、休克、肾病综合征等疾病需要使用外源性糖皮质激素治疗；比如皮质类固醇是一种激素(如强的松和地塞米松)，皮质激素具有明显的抗炎、抗过敏和免疫抑制作用，在免疫相关疾病的治疗中有着广泛的应用。过量的GC对葡萄糖稳态的有害影响包括促进肝糖异生、胰岛素抵抗和β细胞功能障碍。其中，胰岛β细胞在葡萄糖稳态的维持中起关键作用，在过去的几十年中，β细胞功能障碍已被认为是2型糖尿病发生与发展的关键因素。在过量糖皮质激素暴露的早期，β细胞可以通过改变胰岛素分泌来适应胰岛素敏感性的变化，从而维持正常血糖水平。随着时间推移，当胰岛β细胞功能不再能够代偿肝脏、脂肪组织和骨骼肌中胰岛素抵抗的发展时，就会发生糖尿病。同样，对于接受糖皮质激素治疗或患有库欣综合征的患者，葡萄糖耐量受损与β细胞胰岛素分泌代偿不足有关，因此，GC诱导的糖尿病主要归因于慢性胰岛功能破坏。

糖皮质激素受体(GR)是核受体超家族的成员之一，作为受配体调节的转录因子存在于所有的细胞类型中。无配体结合状态的GR与其伴侣分子形成复合物，主要定位于细胞质；而结合其特异性配体GCs后，GR与热休克蛋白(Hsp)90、Hsp70及其他伴侣分子共同形成的复合物解离并转位至细胞核中，进而被募集到GC靶基因的反应元件处，从而激活或抑制特定基因的转录。随着人们对GC的靶基因及其生物学效应之间关系的研究日益深入，可总结出糖皮质激素基因组效应的大致规律：GC的抗炎和免疫抑制作用很大程度上是由于GR对某些基因的抑制作用引起的，而许多副作用则主要由GR对基因的反式激活作用所介导。目前，已有研究证明糖皮质激素主要通过GR反式激活糖异生基因的表达来促进糖异生。

基于上述糖皮质激素发挥效应的分子机制，为了既充分利用糖皮质激素的治疗有益作用又最小化其代谢损害作用，目前大致有三种可能的解决方案。一是开发选择性的糖皮质激素受体激动剂，二是在全身给予GR激动剂的同时针对某些重要脏器(如肝脏)靶向给予GR拮抗剂。然而，选择性糖皮质激素受体激动剂的开发尚处于早期探索阶段，全身给药的副作用尚不明确；对某一脏器靶向给药亦存在难以精准定位的困难，因此这两种方案尚不成熟。解决该问题的第三种策略可以是将GC药物与另一种可以减轻GC不良代谢作用的治疗药物联合使用。最近，在接受GC治疗的患者中针对代谢并发症的二甲双胍随机对照试验确定了二甲双胍对这类患者血糖控制的有益作用，研究发现，二甲双胍可通过改善外周组织胰岛素抵抗并抑制肝脏的葡萄糖生成来拮抗GCs的代谢副作用，这为预防GC治疗导致的代谢不良反应提供了新的思路。

Hsp90与其辅助因子形成分子伴侣复合物，完整的复合物结构对于各种细胞生理过程如蛋白质折叠、蛋白质运输、信号转导级联和基因表达的表观遗传调控都是必不可少的。未与配体结合状态的GR通常与分子伴侣复合物结合并广泛存在于细胞质中，大量文献已经证实了Hsp90在GR入核过程中扮演着不可或缺的角色。据文献报道，Hsp90抑制剂可改善饮食诱导的肥胖小鼠和糖尿病db/db小鼠的胰岛素敏感性和高血糖症。并且，Hsp90作为伴侣分子的活性受到乙酰化的调节也早已被证实。因此，通过探究抑制Hsp90活性来逆转GC副作用的不同或共同机制，试图找到减轻糖皮质激素导致的胰岛功能受损的潜在治疗靶点具有极为重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种Hsp90作为制备预防与治疗类固醇糖尿病药物的用途，发现Hsp90的抑制剂、广谱去乙酰化酶抑制剂TSA与HDAC6特异性抑制剂干扰地塞米松对胰岛功能的损害作用，证实了Hsp90是预防与治疗类固醇糖尿病的潜在靶点。

本发明提供了一种Hsp90作为制备预防与治疗类固醇糖尿病药物的用途。

所述类固醇为地塞米松。

所述药物以Hsp90为靶点，配以药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成制剂使用。

所述制剂选自片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、缓释剂中的一种。

本发明发现地塞米松对大鼠胰岛中葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)具有显著的抑制作用，并且增加了胰岛分泌负性调控基因NYP与SSRT3的表达。而Hsp90抑制剂17-DMAG、广谱HDAC抑制剂TSA和HDAC6抑制剂Tubacin能抵消地塞米松对GSIS的抑制和对NYP和SSRT3基因表达的促进作用。这些发现表明，Hsp90是预防与治疗类固醇糖尿病的潜在靶点。

附图说明

图1中A、B、C为本发明地塞米松损伤大鼠胰岛的葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验结果。

图2为本发明地塞米松调节胰岛功能基因的表达水平，其中，分别用地塞米松处理INS-1细胞(A)、大鼠胰岛(B)后，检测β细胞功能相关的基因表达。

图3为本发明大鼠胰岛以地塞米松和17-DMAG预孵育，然后用葡萄糖刺激1h后的胰岛素测定。

图4中A、B、C为本发明17-DAMG抑制Hsp90与GR的结合并阻止GR易位实验结果。

图5为本发明检测用地塞米松(DEX)和17-DMAG处理的INS-1细胞中与β细胞功能相关的基因表达。

图6为本发明大鼠胰岛以地塞米松和TSA预孵育，然后用葡萄糖刺激1h后的胰岛素测定。

图7为本发明通过细胞免疫荧光观察INS-1细胞经地塞米松与TSA处理后的GR分布情况。

图8为本发明INS-1细胞经地塞米松(DEX)和TSA处理后GR的总蛋白水平(A)以及细胞核和细胞质提取物中的GR蛋白水平(B)。

图9为本发明用地塞米松(DEX)和TSA分别处理INS-1细胞(A)和大鼠胰岛(B)24h后，检测与β细胞功能相关的基因表达。

图10为本发明大鼠胰岛以地塞米松和Tubacin预孵育，然后用葡萄糖刺激1h后的胰岛素测定。

图11为本发明INS-1细胞经地塞米松(DEX)和Tubacin(Tub)处理后检测INS-1细胞中与β细胞功能相关的基因表达(A)和INS-1细胞核和细胞质提取物中的GR蛋白水平(B)。

图12中A、B、C为本发明Hsp90的过度乙酰化破坏了Hsp90和GR的相互作用实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例中各个对照组CON的具体实验条件如下：INS-1细胞培养在含11.1mM葡萄糖和10％FBS的RPMI 1640培液中，细胞贴壁后更换为含5.6mM葡萄糖与0.25％BSA的RPMI1640培液预孵育2-8小时，然后实验组加药处理，对照组继续培养与实验组相同的时间。胰岛在含5.6mM葡萄糖和0.25％BSA的RPMI1640的培养液中孵育24小时后收集RNA或蛋白样本。胰岛促泌实验时，在上述条件孵育24小时后，转移至3.3mM KRB溶液中预孵育30分钟，然后在不同糖浓度的KRB溶液中孵育并测量1小时内的胰岛素分泌量。

实施例1

1.主要试剂与材料

(1)实验动物及细胞株

6～8周龄的雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠，体重200～250g，购自上海中科院斯莱克实验动物公司。给予大鼠充足的食物和水，并在21±1℃的室温下以12h/12h的明暗周期饲养，饲养环境达到SPF(Specific Pathogen Free)级标准。

INS-1细胞(约31～45代)在含有11.1mmol/L葡萄糖、10％胎牛血清(FBS)、1mmol/L丙酮酸钠、10mmol/L HEPES、50μmol/Lβ-巯基乙醇与青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基中，于37℃、5％CO2的培养箱中培养。

(2)实验试剂与耗材

大鼠胰岛素ELISA检测试剂盒购自美国Mercodia公司，胰岛RNA抽提试剂盒LS1040购于美国Promega公司。逆转录试剂盒GoScript购于美国Promega公司；TB Green PremixEx Taq实时荧光定量PCR试剂盒购自日本Takara公司。二奎琳甲酸(BCA)法蛋白浓度测定试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司。核质分离试剂盒购买于美国ThermoFisher Scientific公司。TSA获自美国Cell Signaling Technology公司；17-DMAG从美国Calbiochem公司购买；Tubacin购自美国Selleckchem公司。地塞米松购于美国Sigma-aldrich公司。Hsp90的亚型是Hsp90alpha，抗体的种属来源是兔，兔抗Hsp90α抗体购于美国Millipore公司。

2.实验方法

(1)地塞米松对胰岛功能的影响

为了研究地塞米松对胰岛功能的影响，将新鲜分离的大鼠胰岛分别用0、10、50和100nmol/L地塞米松(DEX)预处理24h，然后用16.7mmol/L葡萄糖刺激1h，测定胰岛素分泌，如图1中A所示，可知地塞米松剂量依赖性地抑制葡萄糖刺激的胰岛素分泌，在浓度为10nmol/L时已显示出明显的作用。为了进一步筛选出研究地塞米松长期作用的最佳时间点，用100nmol/L地塞米松分别预处理新鲜分离的大鼠胰岛12、24和48h，然后用16.7mmol/L葡萄糖刺激1h，测定胰岛素分泌，并且设置对照组CON，如图1中B所示，可知预处理12、24和48h后，大鼠胰岛葡萄糖刺激的胰岛素分泌分别下降了67％、83％和33％。意料之外的是，48h的地塞米松预处理组没有表现出最明显的胰岛素分泌抑制作用。对数据的进一步分析显示，在体外培养48h后，处理组和对照组对葡萄糖刺激的反应性均降低，并且胰岛细胞内的胰岛素含量也显著减少。故推测，由于体外培养时间过长，胰岛的活性和功能下降。因此，选择24h作为接下来的胰岛分泌试验中统一的药物预处理时间。实验组以100nmol/L地塞米松预处理24h后，实验组与对照组胰岛在如图1中C所示的葡萄糖浓度或35mmol/L氯化钾刺激下测定胰岛素分泌1h；数据均表示为三个独立实验的平均值±标准误(mean±SEM)。与对照组(CON)相比，

为了探索地塞米松损伤胰岛分泌功能的潜在机制，以100nmol/L地塞米松处理INS-1细胞24h后，提取细胞RNA，并通过qRT-PCR技术检测了一系列胰岛功能相关基因的表达水平，并设置对照组CON，如图2A所示，可见地塞米松可抑制转录因子MAFA、胰腺和十二指肠同源盒1(PDX1)、胰岛素原1(INS1)、葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)、葡萄糖激酶(GCK)、转录因子NKX6.1和ATP敏感的内向整流钾通道11(Kcnj11)的mRNA表达，同时增加神经肽Y(NPY)和生长抑素受体3(SSTR3)基因在INS-1细胞中的表达。在分离的大鼠胰岛中，以100nmol/L地塞米松处理24h，检测β细胞功能相关的基因表达，并设置对照组CON，如图2B所示，可见NPY和SSTR3表现出相似的表达增加。但是，地塞米松仅抑制了大鼠胰岛中PDX1和INS1的表达。

(2)Hsp90抑制剂逆转地塞米松导致的胰岛分泌功能抑制

为了探讨Hsp90抑制剂17-DMAG是否能拮抗地塞米松对胰岛素分泌的抑制作用。将分离的大鼠胰岛分别在含有100nmol/L地塞米松和1μmol/L 17-DMAG的培养液、含有100nmol/L地塞米松的培养液、含有1μmol/L 17-DMAG的培养液中预孵育24h，然后用3.3或16.7mmol/L葡萄糖刺激1h，取培养基用于胰岛素测定，并设置对照组(CON)，如图3所示。数据以三个独立实验的平均值±标准误(mean±SEM)表示。与对照组(CON)相比，

为了探索17-DMAG对Hsp90的抑制作用是否会影响Hsp90与GR的结合。收集1μmol/L17-DMAG(17-DM)处理1h的INS-1细胞的裂解物，用GR抗体进行免疫共沉淀，然后用GR和Hsp90α抗体进行免疫印迹检测，用IgG免疫沉淀的裂解物作为阴性对照，如图4中A所示，可见在用1μmol/L 17-DMAG处理1h的INS-1细胞中，Hsp90和GR的相互作用显著降低。通过蛋白质印迹检测在分别用100nmol/L地塞米松(DEX)和1μmol/L 17-DMAG、100nmol/L地塞米松(DEX)、1μmol/L 17-DMAG处理1h的INS-1细胞中GR的总蛋白水平，并设置对照组(CON)，如图4中B所示。检测100nmol/L地塞米松和1μmol/L 17-DMAG、100nmol/L地塞米松、1μmol/L 17-DMAG分别处理1h后的INS-1细胞核与细胞质提取物中的GR蛋白水平，并设置对照组(CON)，如图4中C所示。选择Lamin B1作为核蛋白内参，并选择α-Tubulin作为胞质蛋白内参。由图4中B可知INS-1细胞与地塞米松和17-DMAG共孵育1h后，虽然Hsp90和GR的总蛋白含量没有明显变化，但是由图4中C可知地塞米松触发的GR易位入核却被17-DMAG显著抑制。故发明人合理推测，17-DMAG阻止了Hsp90与GR蛋白的有效结合，从而抑制了GR易位入核。

为了进一步检测17-DMAG对GR转录活性的影响，将INS-1细胞与1μmol/L 17-DMAG和100nmol/L地塞米松共孵育24h，然后通过qRT-PCR检测处理后的INS-1细胞中与β细胞功能相关的基因表达，并且设置DEX单独处理组(INS-1细胞与100nmol/L地塞米松共孵育24h，其余均与上述相同)、17-DMAG单独处理组(INS-1细胞与1μmol/L 17-DMAG共孵育24h，其余均与上述相同)和对照组(CON)(INS-1细胞没有经过孵育处理，其余均与上述相同)，如图5所示，可知17-DMAG逆转了地塞米松引起的NPY和SSTR3的表达降低，但PDX1和INS1基因的下调并没有被17-DMAG改变。因此，可以合理地推测，抑制Hsp90通过阻止GR入核以及之后GR的基因组效应——NPY和SSTR3表达增加，从而改善了地塞米松损伤的胰岛功能。

(3)TSA通过抑制GR的易位和转录活性拮抗地塞米松诱发的分泌功能损伤

将新鲜分离的大鼠胰岛与100nmol/L地塞米松(DEX)和200nmol/L TSA预孵育24h后，然后以3.3mmol/L或16.7mmol/L葡萄糖刺激分泌1h，然后检测上清中的胰岛素浓度，并且设置DEX单独处理组(大鼠胰岛与100nmol/L地塞米松共孵育24h，其余均与上述相同)、TSA单独处理组(大鼠胰岛与200nmol/L TSA共孵育24h，其余均与上述相同)和对照组(CON)(大鼠胰岛没有经过孵育处理，其余均与上述相同)，如图6所示，图中数据表示为三个独立实验的平均值±标准误(mean±SEM)。与对照组(CON)相比

为了研究TSA是否能阻断GR的转运，对INS-1细胞贴附的玻片分别以200nmol/LTSA、100nmol/L地塞米松、200nmol/LTSA和100nmol/L地塞米松处理1h。固定样本后，通过细胞免疫荧光技术在显微镜下观察GR在细胞内的分布情况，并且设置对照组CON，如图7所示，在基础状态下，GR主要定位在INS-1细胞的细胞质中，而TSA显著阻断了地塞米松诱导的细胞GR入核转运。

通过核质分离技术与蛋白免疫印迹实验检测了TSA和地塞米松孵育1h后INS-1细胞中GR的分布，具体为：以100nmol/L地塞米松(DEX)和200nmol/L TSA处理INS-1细胞1h后，通过蛋白质印迹检测GR的总蛋白水平以及细胞核和细胞质提取物中的GR蛋白水平，并且设置DEX单独处理组(以100nmol/L地塞米松处理INS-1细胞1h)、TSA单独处理组(以200nmol/LTSA处理INS-1细胞1h)和对照组(CON)(INS-1细胞没有经过处理)。TSA或地塞米松对INS-1细胞中GR的整体蛋白水平没有影响(图8A)。然而，TSA显著降低了地塞米松诱导的细胞核内GR蛋白水平的升高(图8B)。这证实了TSA可以抑制地塞米松诱导的GR转位入核。

用100nmol/L地塞米松(DEX)和200nmol/L TSA分别处理INS-1细胞和大鼠胰岛24h后，检测与β细胞功能相关的基因表达，并且设置DEX单独处理组(以100nmol/L地塞米松分别处理INS-1细胞和大鼠胰岛24h)、TSA单独处理组(以200nmol/L TSA分别处理INS-1细胞和大鼠胰岛24h)和对照组(CON)(INS-1细胞或大鼠胰岛没有经过处理)，如图9所示。图中数据表示为三个独立实验的平均值±标准误(mean±SEM)。与对照组(CON)相比，

(4)HDAC6的抑制可改善胰岛素分泌并阻止地塞米松诱导的GR易位

将分离的大鼠胰岛以100nmol/L地塞米松(DEX)和10μmol/L Tubacin(Tub)预孵育24h，然后用3.3或16.7mmol/L葡萄糖刺激1h，取培养基用于胰岛素测定，并且设置DEX单独处理组(大鼠胰岛与100nmol/L地塞米松预孵育24h，其余均与上述相同)、Tub单独处理组(大鼠胰岛与10μmol/L Tubacin预孵育24h，其余均与上述相同)和对照组(CON)(大鼠胰岛没有经过孵育处理，其余均与上述相同)。如图10所示，图中数据来自于3次独立试验，均以平均值±标准误(mean±SEM)表示，与对照组(CON)相比，

通过qRT-PCR检测用100nmol/L地塞米松(DEX)和10μmol/L Tubacin(Tub)处理24h的INS-1细胞中与β细胞功能相关的基因表达，并设置DEX单独处理组(以100nmol/L地塞米松处理INS-1细胞24h)、Tub单独处理组(以10μmol/L Tubacin处理INS-1细胞24h)和对照组(CON)(INS-1细胞没有经过处理)，如图11A所示。用蛋白免疫印迹法检测100nmol/L地塞米松和10μmol/L Tubacin处理1h的INS-1细胞核和细胞质提取物中的GR蛋白水平，并设置DEX单独处理组(以100nmol/L地塞米松处理INS-1细胞1h)、Tub单独处理组(以10μmol/LTubacin处理INS-1细胞1h)和对照组(CON)(INS-1细胞没有经过处理)，如图11B所示。图11中，数据以三个独立实验的平均值±标准误(mean±SEM)表示。与对照组(CON)相比，

(5)TSA和Tubacin通过增加Hsp90乙酰化作用促进GR和Hsp90的解离

用200nmol/L TSA或10μmol/L Tubacin(Tub)处理INS-1细胞1h，然后用Hsp90α抗体免疫沉淀细胞裂解液，并用抗乙酰赖氨酸(Ac)抗体进行免疫印迹试验，并设置对照组(CON)，如图12中A所示，可知与TSA的作用相似，Tubacin处理导致Hsp90的高度乙酰化。用GR抗体免疫共沉淀200nmol/L TSA处理1h的INS-1细胞裂解物，然后用GR和Hsp90α抗体免疫印迹法检测蛋白量，如图12中B所示。用GR抗体免疫共沉淀10μmol/L Tubacin处理1h的INS-1细胞的裂解液，然后用GR和Hsp90α抗体行免疫印迹检测，如图12中C所示。结果，与Hsp90抑制剂17-DMAG相同，TSA显著抑制了Hsp90与GR的结合能力(图12中B)。而Tubacin处理也显示了相似的结果(图12中C)。

3.结果

本实施例发现，地塞米松长期处理显著抑制离体大鼠胰岛的胰岛素分泌；Hsp90抑制剂17-DMAG可逆转地塞米松诱导的胰岛素分泌抑制以及胰岛分泌功能相关的基因表达；17-DMAG抑制Hsp90与糖皮质激素受体GR的正常结合，阻止了地塞米松诱导的GR入核。

本实施例发现，广谱去乙酰化酶抑制剂TSA亦可逆转地塞米松造成的胰岛功能损伤，并对抗其介导的相关基因表达；TSA不影响细胞内GR的总蛋白水平，但可抑制地塞米松刺激下的GR转位入核。HDAC6特异性抑制剂Tubacin逆转了地塞米松介导的胰岛素分泌抑制及相关基因的表达和GR转位入核；TSA、Tubacin均使热休克蛋白Hsp90过度乙酰化，从而影响Hsp90与GR的正常结合，进而影响GR的入核以及生物学功能的发挥。

综上，本实施例的实验结果显示，慢性地塞米松暴露可通过改变胰岛功能相关基因的表达水平来抑制离体大鼠胰岛的GSIS。类似于对Hsp90的抑制，由TSA、HDAC6抑制剂引起的Hsp90高乙酰化可阻止Hsp90与GR结合，从而导致GR无法进入细胞核发挥基因组作用，从而改善地塞米松导致的胰岛功能受损。这些结果表明，Hsp90是预防与治疗类固醇糖尿病的潜在靶点。