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本申请要求于2018年5月23日提交的美国临时申请号62/675,511的优先权，其内容通过引用整体并入本文。
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发明领域
本文所述的发明总体上涉及嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)的临床有效群体，所述嵌合抗原受体T细胞包含细胞内结合CD2的蛋白质表达阻断融合蛋白，并且另外涉及这种CAR-T细胞在治疗T细胞恶性肿瘤中的用途。本发明还涉及其他免疫细胞的临床有效群体，其包含在细胞内结合CD2的蛋白质表达阻断融合蛋白。
背景技术
基因工程化免疫细胞是癌症和自身免疫疾病的强有力的新疗法。用表达嵌合抗原受体(CAR)的T淋巴细胞进行的最近临床试验的结果已经令人信服地证明了此方法的效力。嵌合抗原受体(CAR)可以使免疫细胞重定向，以特异性识别并杀死肿瘤细胞。CAR是由经由跨膜结构域连接到信号传导分子的抗体单链可变区(scFv)构成的人工多分子蛋白质。当scFv接合其同源抗原时，会触发信号转导，导致肿瘤细胞被表达CAR的细胞毒性T淋巴细胞杀死(Eshhar等人,《美国科学院院刊(PNAS USA)》,90(2):720-724,1993；Geiger等人,《免疫学杂志(J Immunol.)》162(10):5931-5939,1999；Brentjens等人,《自然医学(NatMed.)》9(3):279-286,2003；Cooper等人,《血液(Blood)》101(4):1637-1644,2003；Imai C等人,《白血病(Leukemia)》18:676-684,2004)。用表达CAR的自体T淋巴细胞进行的临床试验在患有B细胞难治性白血病和淋巴瘤的患者中显示出正面反应(参见，例如，Till等人《血液》119(17):3940-3950,2012；Maude等人《新英格兰医学杂志(N Engl J Med.)》371(16):1507-1517,2014)。
已经显示，对表面分子CD19具有特异性的CAR-T细胞在患有治疗难治性CD19阳性恶性肿瘤(如急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病和非霍奇金淋巴瘤)的患者中诱导形态和分子缓解。其它恶性肿瘤可以受到针对不同抗原重定向的T细胞的攻击。因此，基因工程化细胞疗法在肿瘤学中的可能的应用是广泛的。
CAR-T细胞输注的最初临床经验也已经识别了可能会严重降低治疗效果并且阻碍发展的潜在的局限性。主要问题是从患有癌症的患者中收集的免疫细胞的、导致体内扩增和施加抗肿瘤作用的能力无法预测的可变适应性。这种可变性使最有效的细胞剂量的识别变得复杂，可能导致输注短寿命的且无效的细胞产品，并且最终可能阻止一致性“活性药物”的开发。使用来自健康供体的T淋巴细胞应提高有效性和一致性，但会带来移植物抗宿主病(GvHD)的风险，所述GvHD是供体淋巴细胞输注的严重且潜在致命的后果。在这样的同种异体环境中，需要对注入的T细胞进行额外的改性以抑制其识别由不可缺少的细胞表达的组织抗原的能力。
总而言之，对于患有癌症和自身免疫性疾病的患者，迫切需要新的治疗选择。
发明内容
本文提供了用于阻断免疫细胞中的表面受体表达的简单且有效的方法。命名为蛋白表达阻断剂(PEBL)的特定构建体防止靶蛋白向细胞膜转运。PEBL构建体可以容易地与其它基因改性结合，并且并入到用于离体细胞处理以优化免疫细胞的功能的现有大规模cGMP级方案中。
一方面，本文提供一种工程化免疫细胞，其包括：
(i)包含单链可变片段(scFv)的CD2阻断多肽，所述单链可变片段结合连接至细胞定位结构域的N-末端的CD2，其中所述细胞定位结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：内质网(ER)保留序列、高尔基保留序列和蛋白体定位序列，并且其中，所述CD2阻断多肽保留在所述工程化细胞内并结合所述工程化细胞内的内源CD2；和
(ii)包含CD2靶向结构域、跨膜结构域和信号传导结构域的嵌合抗原受体(CAR)，
在一些实施方式中，scFv包含具有与SEQ ID NO：18的至少90％的序列同一性的可变重链(VH)序列和具有与SEQ ID NO：19的至少90％的序列同一性的可变轻链(VL)序列。
在一些实施方式中，scFv包含具有与SEQ ID NO：20的至少90％序列同一性的可变重链(VH)序列和具有与SEQ ID NO：21的至少90％的序列同一性的可变轻链(VL)序列。
在一些实施方式中，ER保留序列包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：KDEL、KKXX、KKMP和KKTN，其中X可以是任何氨基酸；或者高尔基保留序列选自由以下组成的组：YGRL、YQRL、YKGL和YXXL，其中X可以是任何氨基酸。
在一些实施方式中，CD2阻断性多肽还包含连接在scFv和包含KKMP或KKTN的ER保留序列结构域或包含YGRL、YQRL、YKGL的高尔基保留序列结构域之间的跨膜结构域，其中所述跨膜结构域是选自由以下组成的组中的任何一个的跨膜结构域：CD8α、CD8β、4-1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS和FGFR2B。
在一些实施方式中，跨膜结构域包含CD8α的铰链-跨膜结构域。
在一些实施方式中，CD2阻断多肽包含具有与选自由SEQ ID NO：1-4组成的组的任何一个的至少90％的序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，CAR是抗CD2-4-1BB-CD3ζCAR。在一些实施方式中，抗CD2-4-1BB-CD3ζCAR包含具有与SEQ ID NO：5的至少90％的序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，工程化免疫细胞诱导CD2+细胞的细胞毒性。在一些实施方式中，工程化细胞的CD2表面表达被CD2阻断多肽阻断或显著降低。在一些实施方式中，工程化细胞对所述CD2表面表达的阻断持续至少6个月。在一些实施方式中，工程化细胞对CD2表面表达的阻断持续至少12个月。在一些实施方式中，工程化免疫细胞以与相当的免疫细胞基本相等的速率增殖。
在一些实施方式中，工程化免疫细胞是同种异体细胞。在一些实施方式中，工程化免疫细胞是自体细胞。
在一些实施方式中，工程化免疫细胞是工程化T细胞。在一些实施方式中，工程化免疫细胞是工程化NK细胞。
在另一方面，本发明提供了一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向该受试者给药治疗量的包含本文概述的工程化免疫细胞的组合物，从而在有需要的受试者中治疗癌症。
在一些实施方式中，所述组合物还包含药学上可接受的载体。
在一些实施方式中，所述癌症是T细胞恶性肿瘤或CD2相关癌症。在一些实施方式中，T细胞恶性肿瘤或所述CD2相关癌症选自由以下组成的组：T细胞白血病T细胞淋巴瘤，T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)，早期T细胞祖细胞急性淋巴细胞白血病(ETP-ALL)，T细胞幼淋巴细胞性白血病，T细胞大颗粒性淋巴细胞白血病，肠病相关性T细胞淋巴瘤，肝脾性T细胞淋巴瘤，皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤，皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)，任何亚型CTCL，蕈样肉芽肿，Sézary综合征，原发性皮肤γ-δT细胞淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤(NHL)的T谱系亚群的恶性肿瘤，未做其他规定的外周T细胞淋巴瘤(PTCL)(PTCL-NOS)和血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤，以及间变性大细胞淋巴瘤。
在一些实施方式中，给药步骤是通过静脉内输注、动脉内输注、腹膜内输注、手术后直接注射到肿瘤中和/或灌注肿瘤床、在肿瘤部位植入人工支架、或鞘内给药。
本文还提供了编码所描述的任何CD2阻断多肽的多核苷酸。本文还提供了编码任何所述CAR的多核苷酸。
在一些实施方式中，表达载体包含编码CD2阻断多肽的任何多核苷酸。在一些实施方式中，表达载体包含编码CAR的任何一种多核苷酸。在一些实施方式中，表达载体包含编码CD2阻断多肽的任何一种多核苷酸和编码本文所述的CAR的任何一种多核苷酸。
本文还提供了包含表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含编码CD2阻断多肽的任何一种多核苷酸，并且表达载体包含编码CAR的任何一种多核苷酸。
本文提供了一种宿主细胞，其包含表达载体，该表达载体包含编码CD2阻断多肽的任何一种多核苷酸和编码本文所述的CAR的任何一种多核苷酸。
在一些方面，本发明提供了一种产生实施方式中任一项的工程化免疫细胞的方法。该方法包括：将示例性多核苷酸引入免疫细胞。
在其他方面，本发明提供了一种产生实施方式中任一项的工程化免疫细胞的方法。该方法包括：将一种或多种示例性表达载体引入免疫细胞。
可以在2018年5月24日提交的美国临时申请号62/675,525中找到本发明的其他描述，其内容通过引用整体并入本文，包括序列、附图和附图说明。
附图说明
图1描绘了本文所述的示例性抗CD2嵌合抗原受体(CAR)构建体的示意图。
图2说明抗CD2CAR在白血病细胞中的表达。抗CD2CAR包含基于抗CD2单克隆抗体9.6的抗CD2scFv。9.6的详细描述可以在例如Kamoun等人《实验医学杂志(J Exp Med)》,1981,153:207-212中找到。用包含CAR构建体和GFP或仅GFP(“模拟”)的载体转导细胞。流式细胞仪点图说明了抗CD2 CAR表达。使用了抗山羊抗小鼠抗体APC(GAM-APC)。
抗CD2单克隆抗体9.6和9-1的详细描述可以分别在例如Kamoun等人《实验医学杂志》,1981,153:207-212和Bernard等人《白细胞分型II(Leukocyte Typing II)》1986年编辑Reinherz,E.L.,Haynes,B.F.,Nadler,L.M.,&Bernstein,I.D.(Springer，纽约)，第53-66页中找到。
图3显示在存在CD2+靶细胞的情况下抗CD2CAR的表达诱导了活化标志物的表达。条形图显示当存在表达9.6抗CD2 CAR的细胞时，CCRF-CEM细胞系的CD25+细胞和CD69+细胞数量增加。
图4显示了9.6抗CD2CAR构建体在T细胞上的表达。用包含CAR构建体和GFP或仅GFP(“模拟”)的载体转导T细胞。流式细胞仪点图说明了抗CD2 CAR表达。使用了抗山羊抗小鼠抗体APC(GAM-APC)。
图5显示了9.6抗CD2CAR表达T细胞对靶细胞(CD2+靶细胞)的细胞毒性活性。在共培养实验中显示了用抗CD2 scFv-41BB-CD3ζCAR mRNA或仅GFP mRNA电穿孔的CAR或模拟转导的T细胞的细胞毒性。将CAR T细胞和靶标以1:1的效应子与靶标比率(E:T)铺板。共培养几天后，确定了活靶细胞的数量。条形图显示9.6抗CD2 CAR T细胞对CD2+靶细胞产生了细胞毒性。CD107a代表刺激和NK细胞功能活性后CD8+T细胞脱粒的标记。条形图显示，与仅使用GFP相比，表达9.6抗CD2 CAR的CD107a+细胞百分比更高。
图6提供了本文所述的抗CD2蛋白表达阻断剂(PEBL)构建体的示例性实施方式。9.6PEBL I构建体包括：CD8α信号肽；9.6抗CD2 scFv，其包含通过接头与VH结构域连接的VL结构域；和ER保留结构域。9.6PEBL II构建体包括：CD8α信号肽；9.6抗CD2 scFv，其包含通过接头与VH结构域连接的VL结构域；CD8α铰链跨膜结构域；和ER保留结构域。9-1PEBL I构建体包括：CD8α信号肽；9-1抗CD2 scFv，其包含通过接头与VH结构域连接的VL结构域；和ER保留结构域。9-1PEBL II构建体包括：CD8α信号肽；9-1抗CD2 scFv，其包含通过接头与VH结构域连接的VL结构域；CD8α铰链跨膜结构域；和ER保留结构域。
9.6抗CD2单克隆抗体和9-1抗CD2单克隆抗体的详细描述可以分别在例如Kamoun等人《实验医学杂志》,1981,153:207-212和Bernard等人《白细胞分型II》1986年编辑Reinherz,E.L.,Haynes,B.F.,Nadler,L.M.,&Bernstein,I.D.(Springer，纽约)，第53-66页中找到。9.6scFv识别并结合静止和活化T细胞上的CD2。它还抑制(阻断)CD58与CD2的结合。9-1scFv识别并结合活化T细胞上的CD2。它不会阻止CD58与CD2结合。
图7显示了用9.6抗CD2 PEBL I、9.6抗CD2 PEBL II、9-1抗CD2 PEBL I、9-1抗-CD2PEBL II或仅GFP(“模拟”)转导的白血病细胞中CD2的表面和细胞内表达的流式细胞仪直方图。9.6抗CD2 PEBL II构建体在白血病细胞中的表达下调了CD2的表达。
图8显示了用9.6抗CD2 PEBL II构建体电穿孔的T细胞中CD2的表面表达的流式细胞仪点图。数据显示电穿孔的T细胞对CD2表达的下调(部分下调)。
具体实施方式
以下是对本发明的示例实施方式的描述。
I.简介
在本发明提供了允许快速且有效下调包含CAR-T细胞的T细胞中的表面分子的方法。在本发明的一个实施方式中，提供了一种抗CD2 PEBL(也称为CD2 PEBL)，其中抗CD2PEBL的转导引起了CD2的细胞内保留。本文概述的PEBL构建体可以具有最小的细胞外泄漏或无细胞外泄漏，并且在阻断CD2表达和信号传导时非常有效。PEBL表达和CD2阻断是持久的，并且不会影响其它表面分子的表达。表达PEBL的免疫细胞(例如T细胞)可以存活和增殖，也可以与类似的免疫细胞(例如T细胞)存活和增殖。重要的是，表达PEBL的T细胞对CAR信号传导作出正常反应，并且可以在体外有效杀死CAR靶向细胞，例如癌细胞。对CD2表达和信号传导的PEBL阻断是支持输注如CAR-T细胞等同种异体T细胞的简单且有效的工具。
II.定义
除非另有说明，否则本发明的实施将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，它们处于本领域的技术范围内。文献中对这样的技术进行了充分的解释。参见，例如，《分子生物学的当前方案》(FrederickM.AUSUBEL，2000，Wiley and son Inc，美国国会图书馆)；《分子克隆：实验室手册》，第三版，(Sambrook等人，2001，Cold Spring Harbor，纽约：Cold Spring Harbor LaboratoryPress)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑，1984)；Mullis等人，美国专利号4,683,195；《核酸杂交》(B.D.Harries&S.J.Higgins编辑，1984)；《转录和翻译》(B.D.Hames&S.J.Higgins编辑，1984)；《动物细胞培养》(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987)；《固定化的细胞和酶》(IRL Press,1986)；B.Perbal，《分子克隆实用指南》(1984)；系列；《酶学方法》系列(J.Abelson和M.Simon，主编，Academic Press，Inc，纽约)，特别是第154和155卷(Wu等人编辑)和第185卷，“基因表达技术”(D.Goeddel编辑)；《哺乳动物细胞的基因转移载体》(J.H.Miller和M.P.Calos编辑，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；《细胞和分子生物学中的免疫化学方法》(Mayer和Walker编辑，Academic Press，伦敦，1987)；《实验免疫学手册》，第I至IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑，1986)；以及《操纵小鼠胚胎》(oldSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，纽约，1986)。
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如在本申请中使用的，除非本文另有明确规定，否则以下每个术语应具有以下阐述的含义。在整个申请中阐述了附加的定义。
除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术术语和科学术语的含义与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。例如，《生物医学和分子生物学简明词典》，Juo，Pei-Show，第2版，2002，CRC Press；《细胞和分子生物学词典》，第3版，1999年，学术出版社；和《牛津生物化学和分子生物学词典》，2000年修订，牛津大学出版社，提供了本公开中使用的许多术语的通用词典中的一项技能。
应该理解的是，无论在何处用语言“包括”来描述方面，都还提供了以“由...组成”和/或“基本上由...组成”描述的类似方面。
如本文所用，“工程化免疫细胞”是指与天然存在的免疫细胞相比已经被基因改性的免疫细胞。
如本文所用，术语“核酸”是指包括多个核苷酸单体(例如，核糖核苷酸单体或脱氧核糖核苷酸单体)的聚合物。“核酸”包含例如基因组DNA、cDNA、RNA和DNA-RNA杂交分子。核酸分子可以是天然存在的、重组的或合成的。另外，核酸分子可以是单链的、双链的或三链的。在一些实施方式中，核酸分子可以被改性。在双链聚合物的情况下，“核酸”可以指代分子的任一条或两条链。
关于核酸的术语“核苷酸序列”是指通过共价连接，如磷连接(例如，磷酸二酯、烷基和芳基膦酸酯、硫代磷酸酯、磷酸三酯键)和/或非磷连接(例如，肽和/或氨基磺酸酯键)连接的连续核苷酸系列。在某些实施方式中，编码例如连接到定位结构域的靶结合分子的核苷酸序列是异源序列(例如，具有不同物种或细胞类型起源的基因)。
术语“核苷酸”和“核苷酸单体”是指天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单体，以及其非天然存在的衍生物和类似物。因此，核苷酸可以包含例如包括天然存在的碱基的核苷酸(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、肌苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷或脱氧胞苷)和包括本领域已知的经过改性的碱基的核苷酸。
如本领域的技术人员应了解的，在一些方面，核酸进一步包括质粒序列。质粒序列可以包含例如，选自由以下组成的组的一种或多种序列：启动子序列、选择标记序列和基因座靶向序列。
如本文所用，有时将编码与定位结构域连接的靶结合分子的基因称为“编码PEBL的基因”、“编码PEBL的多核苷酸”、“编码PEBL的核酸”等。
在某些实施方式中，靶结合分子是抗体或其抗原结合片段。如本文所用，“抗体”意指完整抗体或抗体的抗原结合片段，其包含已经被改性或工程化的完整的抗体或抗原结合片段，或者是人抗体。已经被改性或工程化的抗体的实例是嵌合抗体、人源化抗体、多互补位抗体(例如，双互补位抗体)和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。抗原结合片段的实例包含Fab、Fab'、F(ab')
“双抗体”是具有两个抗原结合位点的小抗体片段。所述片段包括连接到同一多肽链(V
在某些实施方式中，抗体是三抗体或四抗体。设计和产生三抗体和四抗体的方法是本领域已知的。参见例如，Todorovska等人,《免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)》,248(l-2):47-66,2001。
“结构域抗体片段”是仅含有重链的可变区或轻链的可变区的免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些情况下，两个或更多个VH区与肽接头共价连接以产生二价结构域抗体片段。二价结构域抗体片段的两个VH区可以靶向相同或不同的抗原。
在一些实施方式中，抗体是经过改性的或工程化的。经过改性的或工程化的抗体的实例包含嵌合抗体、多互补位抗体(例如，双互补位抗体)和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。
如本文所用，“多互补位抗体”意指包括至少两种单结构域抗体的抗体，其中至少一种单结构域抗体针对抗原上的第一抗原决定簇，并且至少一种其它单结构域抗体针对同一抗原上的第二抗原决定簇。因此，例如，“双互补位”抗体包括针对抗原上的第一抗原决定簇的至少一种单结构域抗体和针对同一抗原上的第二抗原决定簇的至少一种另外的单结构域抗体。
如本文所用，“多特异性抗体”意指包括至少两种单结构域抗体的抗体，其中至少一种单结构域抗体针对第一抗原，并且至少一种其它单结构域抗体针对第二抗原(不同于第一抗原)。因此，例如，“双特异性”抗体是包括针对第一抗原的至少一种单结构域抗体和针对第二抗原(例如，不同于第一抗原)的至少一种另外的单结构域抗体的抗体。
在一些实施方式中，本文所公开的抗体是单克隆抗体，例如，鼠单克隆抗体。产生单克隆抗体的方法是本领域已知的。参见例如，Pluckthun(1994),《单克隆抗体药理学》,第113卷,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,纽约,第269-315页。
“Fab片段”包括一条轻链以及一条重链的CH1和可变区。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。
“Fc”区含有两个重链片段，所述重链片段包括抗体的CH2结构域和CH3结构域。两个重链片段由两个或更多个二硫键并且通过CH3结构域的疏水相互作用保持在一起。
“Fab'片段”含有一条轻链和一条重链的一部分，使得可以在两个Fab'片段的两条重链之间形成链间二硫键，以形成F(ab')
“F(ab')
“Fv区”包括来自重链和轻链两者的可变区，但是缺乏恒定区。
在特定实施方式中，靶结合分子是单链Fv抗体(“scFv抗体”)。scFv是指包括抗体的VH结构域和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单多肽链中。通常，Fv多肽进一步包括位于VH结构域与VL结构域之间的多肽接头，所述多肽接头使scFv能够形成用于抗原结合的所需的结构。对于scFv的综述，参见Pluckthun(1994),《单克隆抗体药理学(ThePharmacology of Monoclonal Antibodies)》,第113卷,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,纽约,第269-315页。还参见PCT公开第WO 88/01649号以及美国专利第4,946,778号和第5,260,203号。
术语“序列同一性”意指两个核苷酸或氨基酸序列在如通过使用默认间隙权重的程序GAP或BESTFIT最佳对准时共享至少例如70％的序列同一性、或至少80％的序列同一性、或至少85％的序列同一性、或至少90％的序列同一性、或至少90％的序列同一性或更高。为了进行序列比较，通常一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列(例如，亲本序列)。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到计算机，指定子序列坐标(如有必要)，并且指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于所指定的程序参数，计算一个或多个测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。
用于比较的序列的最佳对准可以通过以下来进行：例如，Smith&Waterman的局部同源算法,《应用数学进展(Adv.Appl.Math.)》2:482(1981)；Needleman和Wunsch的同源对准算法,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》48:443(1970)；Pearson&Lipman的相似性搜索法,《美国国家科学院院刊(Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA)》,85:2444(1988)；这些算法的计算机化实施方式(威斯康星州麦迪逊科学大道575号遗传学计算机组(Genetics ComputerGroup)的威斯康星遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或视觉检查(通常参见Ausubel等人,《当代分子生物学实验指南(Current Protocols in MolecularBiology)》)。适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法，所述BLAST算法描述于Altschul等人,《分子生物学杂志》,215:403(1990)。用于执行BLAST分析的软件可以通过国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)公开获得(通过NCBI国立卫生研究院(National Institutes of HealthNCBI)的互联网服务器公开获得)。通常，可以使用默认程序参数来执行序列比较，但是也可以使用自定义参数。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用作为默认的字长(W)3、期望值(E)10和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff,《美国国家科学院院刊》89:10915(1989))。
如本文所用，在PEBL基因的环境中“可操作地连接”是指在与编码一个或多个定位结构域的一个或多个基因相邻的框中(例如，没有接头)直接编码靶结合分子的基因。可替代地，可以通过如本文所描述的接头序列将编码靶结合分子的基因连接到编码一个或多个定位结构域的一个或多个基因。
如本文所用，在蛋白的环境中“连接”是指将第一结构域(例如，靶结合分子)连接到第二结构域(例如，定位结构域)。接头可以是氨基酸序列。本领域已知的各种适合的接头可以用于将靶结合分子拴系到定位结构域。例如，可以根据本发明使用非天然存在的肽，如由不同长度的亲水残基组成的多肽或(GGGGS)
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指以根据临床上可接受的标准改进医疗病症的程度使医疗病症(例如，与T细胞恶性肿瘤有关的病症)产生反作用。
如本文所用，“受试者”是指哺乳动物(例如，人、非人的灵长类动物、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、豚鼠、大鼠、小鼠)。在某些实施方式中，所述受试者是人。“其有需要的受试者”是指患有或处于发展中的疾病或风险中的可通过诱导T细胞对恶性T细胞的细胞毒性发挥特异性作用而被治疗(例如，改善、改进、预防)的受试者(例如患者)。
如本文所定义，“治疗量”是指当给药于受试者时，足以在给药条件下在受试者中获得期望的治疗效果(治疗与T细胞恶性肿瘤有关的病症)的量。待给药的药剂的有效量可以由本领域的普通临床医师使用本文提供的指导和本领域已知的其它方法来确定，并且取决于若干个因素，所述因素包含，例如，所选择的特定药剂、受试者的年龄、敏感性、对药物的耐受性和总体健康状况。
如本文所用，“增强的治疗功效”是指以下中的一种或多种：宿主中减少的移植物抗宿主疾病(GvHD)；减少或消除宿主的排斥；延长宿主的存活率；降低宿主对肿瘤的抑制作用；降低宿主的自我杀伤力；降低宿主的炎症级联反应；或者在宿主中持续进行了CAR介导的信号转导。
III.蛋白质表达阻断剂(PEBL)
本文所述的方法能够在免疫细胞中快速去除或灭活特定靶蛋白如CD2。所述方法部分地依赖于多肽构建体，所述多肽构建体含有结合待去除或中和的靶标(例如，蛋白质)的靶结合分子。根据应用，靶结合分子与将多肽引导至特定细胞区室的结构域(例如，定位结构域或细胞内保留结构域)相连，所述细胞区室例如高尔基、内质网、蛋白酶体或细胞膜。为了简单起见，有时将与定位结构域连接的靶结合分子称为“蛋白质表达阻断剂”或“PEBL”。在一些实施方式中，PEBL还包括信号肽结构域。在其他实施方式中，PEBL包含跨膜结构域或细胞定位结构域包括跨膜结构域。
PEBL的示例性实施方式在图6中示出，并且示例性氨基酸和核酸序列在表1中提供。
表1.PEBL、CAR及其组分的序列。
研究表明，活化的免疫细胞分泌细胞因子会触发细胞因子释放综合征和巨噬细胞活化综合征，对免疫细胞疗法产生严重的不良影响(Lee等人,《血液(Blood)》，2014,124(2):188-195》。
在一些实施方式中，PEBL的靶结合分子是与CD蛋白例如人CD2特异性结合的分子。在某些情况下，靶结合分子是抗CD2抗体或结合CD2的抗原结合片段。
通过与T细胞上表达的配体(例如肽或抗原)结合而能够激活或失活免疫应答的所有这些合适的结合分子被统称为“靶结合分子”。如本领域技术人员将理解的，靶结合分子不需要包含抗体或抗原结合片段(例如，scFv)；相反，靶结合分子与靶分子结合的部分可以衍生自例如受体-配体对中的受体或受体-配体对中的配体。
本文所述的PEBL的靶结合分子可以衍生自结合CD2的抗体。在一些实施方式中，结合CD2的抗体是抗CD2单克隆抗体9.6或其变体。在一些实施方式中，结合CD2的抗体是抗CD2单克隆抗体9.6的人源化变体。在其他实施方式中，结合CD2的抗体是抗CD2单克隆抗体9-1。在一些实施方式中，结合CD2的抗体是抗CD2单克隆抗体9-1的人源化变体。
9.6和9-1的详细说明可以在例如Kamoun等人《实验医学杂志》，1981，153：207-212；以及Bernard等人《白细胞分型II》，1986年编辑Reinherz,E.L.,Haynes,B.F.,Nadler,L.M.,&Bernstein,I.D.(Springer，纽约)，第53-66页中找到。
人源化抗体是指能够与靶抗原(例如人CD2)结合的免疫球蛋白氨基酸序列变体或其片段，其包含基本上具有人免疫球蛋白氨基酸序列的构架(FR)区和基本上具有非人免疫球蛋白氨基酸序列的CDR。这样，人源化抗体9-1可以结合CD2，并包含基本上具有人免疫球蛋白氨基酸序列的FR区和基本上具有鼠抗体9-1氨基酸序列的CDR。同样地，人源化抗体9.6可以结合CD2，并且其包含基本上具有人免疫球蛋白氨基酸序列的FR区和基本上具有鼠类抗体9.6氨基酸序列的CDR。
通常，人源化抗体包含至少一个且通常是两个可变结构域(Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc、Fv)的基本上全部，其中所有或基本上所有CDR区都对应于非人免疫球蛋白的那些区，并且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些区。人源化抗体最佳地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区。通常，抗体将包含轻链以及至少重链的可变结构域。该抗体还可以包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区域。
人源化抗体可以选自免疫球蛋白的任何种类，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。通常，恒定结构域是补体固定恒定结构域，其中期望人源化抗体表现出细胞毒活性，并且类别通常是IgG1。在不需要这种细胞毒性活性的情况下，恒定结构域可以是IgG2类的。人源化抗体可包含来自一种以上类型或同种型的序列，并且选择特定的恒定结构域以优化所需的效应子功能在本领域普通技术人员范围内。
人源化抗体的FR和CDR区不必精确地对应于亲本序列，例如，可以通过取代、插入或缺失至少一个残基来诱变输入CDR或共有FR，从而使该位点处的CDR或FR残基既不与共有抗体对应也不与输入抗体对应。但是，此类突变不会广泛存在。通常，至少75％的人源化抗体残基将对应于亲本FR和CDR序列的残基，更通常为90％，最优选大于95％。
通常，通过使用亲本和人源化序列的三维模型对亲本序列和各种概念性人源化产物进行分析的过程来产生人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是普遍可获得的并且为本领域技术人员所熟悉。可获得计算机程序，其说明并显示了所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。这些显示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。
影响抗原结合(例如，CD2结合)的残基定义为以阳性或阴性意义上主要负责候选免疫球蛋白的抗原亲和力或抗原特异性的残基。在某些情况下，从共有序列和导入序列中选择和结合FR残基以获得所需的免疫球蛋白特征。这种期望的特征包括对靶抗原的亲和力的增加和更高的特异性，尽管可以想到在某些情况下可能需要相反的作用。通常，CDR残基直接且最实质地参与影响抗原结合(尽管并非所有CDR残基都如此参与，因此不需要被替换为共有序列)。但是，FR残基也具有显著作用，并且可以至少三种方式发挥作用：它们可以非共价地直接结合抗原，它们可以与CDR残基相互作用，以及它们可以影响重链和轻链之间的接口。
通常，有必要从相邻CDR的空间位置以及靶标抗原的尺寸和结构推断抗原的位置。通常，仅那些能够形成盐桥、氢键或疏水相互作用的人源化抗体残基可能参与非共价抗原结合，但是具有与抗原在空间上的间隔为3.2埃或更小的原子的残基也可以与抗原非共价相互作用。这样的残基通常是具有最大体积的侧链的相对较大的氨基酸，例如酪氨酸、精氨酸和赖氨酸。结合抗原的FR残基通常还将具有侧链，该侧链被定向成围绕CDR的溶剂定向面的包膜，其从CDR结构域向溶剂延伸约7埃，并且在CDR结构域的任一侧延伸约7埃，又如通过三维建模可视化的。
与CDR相互作用的残基通常是影响CDR多肽主链构象或与CDR残基侧链形成非共价键的残基。影响构象的残基通常是那些将任何CDR骨架原子的空间位置改变超过约0.2埃的残基。CDR序列的骨干原子被残基置换，这些残基会打断或改性组织结构，例如β折叠、螺旋或环。可以对邻近序列的构象产生深远影响的残基包括脯氨酸和甘氨酸，两者均能够将弯曲引入骨架。可以取代骨架原子的其他残基是那些能够参与盐桥和氢键的残基。
与CDR侧链相互作用的残基是可以合理预期与CDR侧链形成非共价键的残基，通常为盐桥键或氢键。这些残基通过其侧链的三维定位来识别。可以预期，在彼此相反的约2.5-3.2埃内的两个侧链之间会形成盐或离子桥，这些侧链带有相反的电荷，例如赖氨酰和谷氨酰对。可以预期在残基对的侧链之间形成氢键，所述残基对例如丝氨酸或苏糖基与天冬氨酰或谷氨酰基(或其他氢接受残基)。这样的配对在蛋白质化学领域中是众所周知的，并且在候选抗体的三维建模中对于本领域技术人员将是显而易见的。
由于不可能完全预先预测给定取代的确切影响，因此可能有必要进行取代并测定候选抗体的所需特性。然而，这些步骤本身是常规的并且完全在本领域普通技术范围内。
CDR和FR残基是根据标准序列定义确定的(Kabat等人，《免疫学感兴趣的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》，美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州，(1987)，和《结构定义(a structural definition)》(如Chothia和Lesk，《分子生物学杂志(J.Mol Biol.)》196：901-917(1987)。如果这两种方法导致对CDR的识别稍有不同，则优选结构定义，但是通过序列定义方法识别的残基被认为是重要的FR残基，用于确定哪些构架残基要导入共有序列。
通常，人源化导入抗体(例如9-1抗体或9.6抗体)的第一步是获得一个要掺入导入序列的共有氨基酸序列。接下来，使用上述方法为这些序列生成模型。在某些实施方式中，共有人序列衍生自Kabat等人的序列编辑中最丰富的亚类。(Kabat,E.A.等人，《免疫学感兴趣的蛋白质序列》(美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达，1987))。尽管可以以不同顺序采取这些步骤，但是通常在去除了全部相应的人CDR后，通过将至少一个CDR从非人输入序列转移到共有人结构中来创建候选人源化抗体的结构。如序列变异性所定义(Kabat,E.A.等人，《免疫学感兴趣的蛋白质序列》(美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达，1987年))或由结构变异性定义(Chothia，C.&Lesk,A.M.,《分子生物学杂志》196:901-917(1987))，人源化抗体可在CDR内的位置上包含非人输入残基的人替代物。分别研究非人类输入残基和人类共有框架残基之间的差异，以确定它们对CDR构象和/或与抗原结合的可能影响。希望通过建模，检查特定位置的氨基酸特性或通过评估特定氨基酸的取代或诱变效果通过实验确定这种可能影响的研究。
在一些实施方式中，利用以下步骤制备包含输入的非人抗体和人抗体的氨基酸序列的人源化抗体：(a)获得输入抗体可变结构域和共有人可变结构域的至少一部分的氨基酸序列；(b)在输入和人可变结构域序列中标识互补决定区(CDR)氨基酸序列；(c)用输入的CDR氨基酸序列代替相应的人CDR氨基酸序列；(d)将输入抗体的构架区(FR)的氨基酸序列与共有抗体的相应FR进行比对；(e)在比对的FR序列中标识与相应的共有抗体残基不同源的输入抗体FR残基；(f)确定是否合理预期非同源输入氨基酸残基具有以下作用中的至少一种：(1.)非共价直接结合抗原，(2.)与CDR相互作用；或(3.)参与VL-VH接口；或(g)合理地预期具有这些作用中至少一种的任何非同源输入抗体氨基酸残基，用该残基代替共有抗体FR序列中的相应氨基酸残基。
任选地，可以确定在步骤(e)中识别出的任何非同源残基是否暴露在结构域的表面上或埋在其中，并且如果该残基暴露在外但没有步骤(f)中识别的效果，则可以保留共有残基。
产生人源化抗体的方法的其他描述可见于，例如，US6,054,297；US6,407,213；和US6,719,971，其内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，PEBL的靶结合分子包含抗CD2单链可变片段，其包含具有与SEQ ID NO:18的至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的VH结构域以及具有与SEQ ID NO：19的至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的VL结构域。在某些情况下，接头连接scFv的VH域和VL域。VH-VL接头可以是(GGGGS)
在一些实施方式中，PEBL的靶结合分子包含抗CD2单链可变片段，其包含具有与SEQ ID NO：20的至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的VH结构域以及具有与SEQ ID NO：21的至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的VL结构域。在某些情况下，接头连接scFv的VH域和VL域。VH-VL接头可以是(GGGGS)
在某些情况下，抗CD2 scFv包含一个或多个氨基酸取代，可与人免疫细胞中的CD2结合。在一些实施方式中，VH结构域在SEQ ID NO：18所示的序列中包含至少一个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)氨基酸取代，并且VL结构域在SEQ ID NO：19所示的序列中包含至少一个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)氨基酸取代，使得CD2的表达在人类免疫细胞中被阻断、减少或降低。在其他实施方式中，VH结构域在SEQ ID NO：20所示的序列中包含至少一个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)氨基酸取代，并且VL结构域在SEQ IDNO：21所示的序列中包含至少一个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)氨基酸取代，使得CD2的表达在人类免疫细胞中被阻断、减少或降低。
在各种实施方式中，本文所述的PEBL的靶结合分子包含抗CD2scFv，其包含与SEQID NO：22的至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性。在一些实施方式中，靶结合分子包含抗CD2 scFv，其包含与SEQ IDNO：23的至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100)％)的序列同一性。在一些实施方式中，抗CD2 scFv是SEQ ID NO：22的变体，并且具有与SEQ ID NO：22的抗CD2 scFv相同的结合活性。在其他实施方式中，抗CD2 scFv是SEQ IDNO：23的变体，并且具有与SEQ ID NO：23的抗CD2 scFv相同的结合活性。
在一些实施方式中，PEBL的scFv包含可变重链序列，其具有与CD2抗体的可变重链序列的至少90％的序列同一性、至少91％的序列同一性、至少92％的序列同一性、至少93％的序列同一性、至少94％的序列同一性、至少95％的序列同一性、至少95％的序列同一性、至少96％的序列同一性、至少97％的序列同一性、至少98％的序列同一性、至少99％的序列同一性或100％的序列同一性。在一些实施方式中，本发明的scFv包含可变轻链序列，其具有与抗CD2抗体的可变轻链序列的至少90％序列同一性、至少91％序列同一性、至少92％序列同一性、至少93％序列同一性、至少94％序列的可变轻链序列、同一性、至少95％序列同一性、至少95％序列同一性、至少96％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性、至少99％序列同一性或100％序列同一性。例如，抗CD2抗体可以是本领域技术人员公认的任何这样的抗体。在一些实施方式中，本发明的抗CD2抗体或抗CD2scFv是其人源化变体。
在一些实施方式中，PEBL的抗CD2scFv结合静止的T细胞和活化的T细胞中的细胞内CD2。在其他实施方式中，抗CD2 scFv结合活化的T细胞中的细胞内CD2。在某些实施方式中，抗CD2scFv结合活化的T细胞而非静止T细胞中的细胞内CD2。在某些实施方式中，抗CD2scFv结合免疫细胞中的细胞内CD2。
在一些实施方式中，PEBL的抗CD2scFv抑制、阻断或预防CD58的CD2结合。在其他实施方式中，抗CD2 scFv不抑制、阻断或预防CD58与CD2的结合。
细胞定位结构域包括保留信号传导结构域。在一些实施方式中，细胞定位结构域包含保留信号传导结构域和跨膜结构域。在一些情况下，细胞定位结构域包含内质网(ER)保留序列、高尔基保留序列或蛋白酶体定位序列。细胞定位结构域可包括防止或阻止蛋白质被细胞分泌的氨基酸序列。细胞定位结构域可以包括在细胞内区室中保留蛋白质的氨基酸序列。在一些情况下，细胞定位结构域可包括在细胞膜例如ER或高尔基的膜中保留蛋白质锚的氨基酸序列。例如，保留信号传导结构域可以包含KDEL序列(SEQ ID NO：24)、KKD/E序列(SEQ ID NO：25)、KKXX序列(SEQ ID NO：26)、KKMP序列(SEQ ID NO：27)、或YQRL序列(SEQ ID NO：28)，其中X代表任何氨基酸序列。在一些实施方式中，如果保留信号传导结构域包含KKXX或KKMP，则细胞定位结构域进一步包含CD8α铰链和跨膜结构域，例如但不限于SEQ ID NO：15的序列。在一些情况下，CD8α铰链和跨膜结构域连接至SEQ ID NO：14的ER保留结构域的N-末端。
在一些实施方式中，细胞定位结构域包含KDEL序列(SEQ ID NO：24)。在某些实施方式中，细胞定位结构域包含AEKDEL的序列(SEQ ID NO：29)。在各个实施方式中，细胞定位结构域包含GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL序列(SEQ ID NO：30)。在特定实施方式中，细胞定位结构域包含KKMP序列(SEQ ID NO：27)。在一些实施方式中，细胞定位结构域包含LYKYKSRRSFIEEKKMP的序列(SEQ ID NO：31)和KKMP序列(SEQ ID NO：27)。
在某些实施方式中，细胞定位结构域包括与SEQ ID NO：30的至少90％的序列同一性、至少91％的序列同一性、至少92％的序列同一性、至少93％的序列同一性、至少94％的序列同一性、至少95％的序列同一性、至少95％的序列同一性、至少96％的序列同一性、至少97％的序列同一性、至少98％的序列同一性、至少99％的序列同一性或100％的序列同一性，只要其具有所需的功能。在一些实施方式中，细胞定位结构域包括与SEQ ID NO：31的至少90％的序列同一性、至少91％的序列同一性、至少92％的序列同一性、至少93％的序列同一性、至少94％的序列同一性、至少95％的序列同一性、至少95％的序列同一性、至少96％的序列同一性、至少97％的序列同一性、至少98％的序列同一性、至少99％的序列同一性或100％的序列同一性，只要其具有所需的功能。
在一些实施方式中，ER保留序列包含选自KDEL、KKXX、KKMP和KKTN的氨基酸序列，其中X可以是任何氨基酸。在一些实施方式中，高尔基保留序列选自YGRL(SEQ ID NO：40)、YQRL(SEQ ID NO：41)、YKGL(SEQ ID NO：42)和YXXL(SEQ ID NO：43)，其中X可以是任何氨基酸。
在一些实施方式中，通过将scFv序列连接至包含21个(TRIM21)靶向结构域序列的三重基序并共表达编码人TRIM21 E3泛素连接酶蛋白的序列来实现蛋白酶体定位。TRIM21以高亲和力与抗体的Fc结构域结合，并可以募集泛素-蛋白体复合物以降解与抗体结合的分子(例如，蛋白质和肽)。TRIM21靶向结构域序列编码选自人免疫球蛋白G(IgG)恒定区(Fc)基因的组(例如IgG1、IgG2或IgG4)的氨基酸序列，并用于形成包含scFv和Fc结构域的融合蛋白。在该实施方式中，外源表达的TRIM21蛋白结合与靶蛋白(例如，CD2)结合的scFv-Fc融合蛋白，并将复合物引导至蛋白酶体进行降解。
人TRIM21 E3连接酶蛋白的氨基酸序列的细节可以在例如NCBI参考序列号NP_003132.2下的NCBI蛋白质数据库中找到。编码人TRIM21 E3连接酶蛋白的核酸序列的细节可以在例如NCBI参考序列号NM_003141.3下的NCBI蛋白质数据库中找到。
跨膜结构域可以包括衍生自以下的跨膜结构域或铰链与跨膜结构域的组合：CD8α、CD8β、4-1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、ICOS、VEGFR2、FAS或FGFR2B。在某些实施方式中，跨膜结构域衍生自CD8α。在某些实施方式中，跨膜结构域衍生自CD8α。衍生自CD8α的铰链和跨膜结构域与ER或高尔基保留信号结构域连接。
在一些实施方式中，跨膜结构域或铰链和跨膜结构域包括与SEQ ID NO：15的至少90％序列同一性、至少91％序列同一性、至少92％序列同一性、至少93％序列同一性、至少94％序列同一性、至少95％的序列同一性、至少95％的序列同一性、至少96％的序列同一性、至少97％的序列同一性、至少98％的序列同一性、至少99％的序列同一性或100％的序列同一性，只要其具有所需的功能。
在一些实施方式中，跨膜结构域通过接头连接到保留信号传导结构域。在一些实施方式中，scFv的VL结构域和VH结构域通过接头连接。跨膜结构域和保留信号结构域之间的接头与scFv的接头的序列相同。在一些情况下，跨膜结构域和保留信号传导结构域之间的接头具有与scFv的接头不同的序列。接头的非限制性实例包括(GS)
在特定实施方式中，接头包括，例如，GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:38)。在一些实施方式中，接头包括，例如，GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:39)。在各个实施方式中，长度为约5个到约100个氨基酸(含)的肽接头可以用于本发明。在某些实施方式中，长度为约20个到约40个氨基酸(含)的肽接头可以用于本发明。在一些实施方式中，长度为至少5个氨基酸、至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少25个氨基酸、至少30个氨基酸、至少35个氨基酸或至少40个氨基酸的肽接头可以用于本发明。如本领域的技术人员将了解的，此类接头序列以及此类接头序列的变体是本领域已知的。设计并入接头序列的构建体的方法以及评估功能性的方法对于本领域的技术人员而言是容易获得的。
在特定的实施方式中，PEBL的信号肽衍生自CD8α信号肽。在一些实施方式中，信号肽包含与SEQ ID NO：11的至少90％的序列同一性、至少91％的序列同一性、至少92％的序列同一性、至少93％的序列同一性、至少94％的序列同一性、至少95％的序列同一性、至少96％的序列同一性、至少97％的序列同一性、至少98％的序列同一性、至少99％的序列同一性或100％的序列同一性。信号肽可以位于靶结合分子的N-末端。
如本领域技术人员将理解的，在某些实施方式中，本文公开的各种组分(例如，信号肽、scFv、细胞内信号传导结构域、跨膜结构域、接头、定位结构域及其组合)的任何序列可以具有与本文公开的特定对应序列的至少90％序列同一性、至少91％序列同一性、至少92％序列同一性、至少93％序列同一性、至少94％序列同一性、至少95％序列同一性、至少96％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性、至少99％序列同一性或100％序列同一性。
表1提供了本文所述的PEBL的示例性实施方式。
在一些实施方式中，编码抗CD2 PEBL的核酸序列包含表1中列出的一个或多个核酸序列。在某些实施方式中，抗CD2 PEBL包含具有与SEQ ID NO：6或其密码子优化的变体的至少90％的序列同一性(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性)的核苷酸序列。在某些实施方式中，抗CD2 PEBL包含具有与SEQ ID NO：7或其密码子优化的变体的至少90％的序列同一性(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性)的核苷酸序列。在一些实施方式中，抗CD2 PEBL包含具有与SEQ ID NO：8或其密码子优化的变体的至少90％的序列同一性(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性)的核苷酸序列。在其他实施方式中，抗CD2 PEBL包含具有与SEQ ID NO：9或其密码子优化的变体的至少90％的序列同一性(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性)的核苷酸序列。例如，可以改性编码抗CD2PEBL的核酸序列，以在人细胞例如人免疫细胞中获得所需的表达或活性。
产生针对任何靶蛋白的抗体和其抗体片段的方法在本领域是众所周知且常规的。此外，如本文所例示，可将针对各种靶标例如CD2的市售抗体用于产生PEBL分子，如本文所例示。如本文所例示的，本领域已知的抗体以及由此衍生的抗体片段(例如，scFv)可以用于本发明。
如本领域的技术人员将了解的，嵌合抗原受体和/或PEBL分子可以被设计成结合到本文所公开的靶以及本文所公开的靶的变体。举例来说，可以将嵌合抗原受体和/或PEBL分子设计成与CD2或其天然存在的变体分子结合。此类天然存在的变体可以具有与分子的野生型形式相同的功能。在其它实施方式中，变体可以具有相对于分子的野生型形式而改变的功能(例如，赋予患病状态)。
如本领域的技术人员将了解的，PEBL分子构建体的各个组分可以以不同的组合被取代(例如，以含有不同的接头、不同的定位序列、不同的scFv等)，只要组合产生功能性PEBL。如本文所公开的，评估特定构建体的功能性的方法在本领域的技术人员的范围内。
IV.嵌合抗原受体(CAR)
嵌合抗原受体(CAR)是由与单个融合分子中一个或多个信号传导结构域相关的靶向部分组成的合成受体。通常，CAR的结合部分由单链抗体(scFv)的抗原结合结构域组成，该结构域包含通过柔性接头连接的单克隆抗体的轻链可变片段。第一代CAR的信号结构域已衍生自CD3zeta的细胞质区域或Fc受体γ链。第一代CAR已被证明能够成功地重定向T细胞的细胞毒性，但是，它们无法在体内提供延长的扩增和抗肿瘤活性。已单独添加(第二代)或组合添加(第三代)来自CD28、OX40(CD134)和4-1BB(CD137)等共刺激分子的信号传导结构域，以提高生存率并提高CAR改性T细胞的增殖。
除了单链CAR之外，在一些实施方式中，本文所述的CAR是多链CAR。多链CAR或多特异性CAR包含几个(例如，两个或更多个)细胞外抗原(配体)结合结构域，以同时结合不同的靶标，从而增强免疫细胞的活化和功能。在一些情况下，细胞外抗原结合结构域串联放置在相同的跨膜多肽上，并且任选地可以被接头分开。在其他情况下，可以将不同的细胞外抗原结合结构域放置在组成多链CAR的不同的跨膜多肽上。与单链CAR相似，多链CAR的信号转导结构域可以是Fc受体或T细胞受体和共受体(它们共同作用以在抗原受体参与后启动信号转导)的细胞质序列，以及这些序列和具有相同功能的合成序列的任何派生或变体。
信号转导域包含两类不同的细胞质信号序列，它们启动抗原依赖性的一级激活，以及以抗原非依赖性的方式起作用以提供次级或共刺激信号。初级细胞质信号转导序列可包含信号转导基序，称为免疫受体基于酪氨酸的激活基序(ITAM)。在本发明中使用的ITAM的非限制性实例可包括作为非限制性实例的那些衍生自TCRzeta、FcRgamma、FcRbeta、FcRepsilon、CD3gamma、CD3delta、CD3epsilon、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。信号转导域也可以包括共刺激信号分子。在WO2014/4011988中描述了双特异性或多特异性CAR的另外的描述，其内容通过引用整体并入本文。
因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种工程化免疫细胞，其包括含有编码嵌合抗原受体(例如，CAR)的核苷酸序列的核酸，以及含有编码与结合CD2的定位结构域连接的靶结合分子的核苷酸序列的核酸(例如，PEBL)。在一些实施方式中，本发明涉及工程化的免疫细胞(例如CAR-T细胞)，其包含与CD2结合的嵌合抗原受体(例如CAR)和与结合CD2的定位结构域连接的靶结合分子(例如PEBL)。CAR-T细胞的CD2 CAR结合另一个细胞的细胞表面上的CD2，而CAR-T细胞的CD2 PEBL结合位于CAR-T细胞胞内区室的CD2。这样，CD2 PEBL可以防止其他CD2结合CAR破坏CAR-T细胞。
在本发明的某些方面，嵌合抗原受体(CAR)结合在靶细胞表面上表达的CD2。在其他实施方式中，CAR还结合CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD25、CD28、CD30、CD38、CD45、CD45RA、CD45RO、CD52、CD56、CD57、CD99、CD127或CD137。
CAR的CD2结合结构域可以是抗CD2抗体或结合CD2的抗原结合片段。在一些实施方式中，结合CD2的抗体是抗CD2单克隆抗体9.6。在其他实施方式中，结合CD2的抗体是抗CD2单克隆抗体9-1。在一些实施方式中，结合CD2的抗体是抗CD2单克隆抗体9.6或其变体。在一些实施方式中，结合CD2的抗体是抗CD2单克隆抗体9.6的人源化变体。在其他实施方式中，结合CD2的抗体是抗CD2单克隆抗体9-1。在一些实施方式中，结合CD2的抗体是抗CD2单克隆抗体9-1的人源化变体。
在一些实施方式中，CAR的CD2结合结构域是抗CD2 scFv。在一些实施方式中，scFv包含可变重链序列，其具有与抗CD2抗体的可变重链序列的至少90％的序列同一性、至少91％的序列同一性、至少92％的序列同一性、至少93％的序列同一性、至少94％的序列同一性、至少95％的序列同一性、至少95％序列同一性、至少96％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性、至少99％序列同一性或100％序列同一性。在一些实施方式中，本发明的scFv包含可变轻链序列，其具有与抗CD2抗体的可变轻链序列的至少90％序列同一性、至少91％序列同一性、至少92％序列同一性、至少93％序列同一性、至少94％序列的可变轻链序列、同一性、至少95％序列同一性、至少95％序列同一性、至少96％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性、至少99％序列同一性或100％序列同一性。例如，抗CD2抗体可以是本领域技术人员公认的任何这样的抗体。
在一些实施方式中，抗CD2单链可变片段可包含具有与SEQ ID NO：18的至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的VH结构域和具有与SEQ ID NO：19的至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的VL结构域。在某些情况下，接头连接scFv的VH域和VL域。VH-VL接头可以是(GGGGS)
在某些情况下，VH结构域在SEQ ID NO：18所示的序列中包含至少一个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)氨基酸取代。在某些情况下，VL结构域在SEQ ID NO：19所示的序列中包含至少一个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)氨基酸取代。
在一些实施方式中，抗CD2 scFv包含具有与SEQ ID NO：20的至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的VH结构域和具有与SEQ ID NO：21的至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的VL结构域。在某些情况下，接头连接scFv的VH域和VL域。VH-VL接头可以是(GGGGS)
在某些情况下，抗CD2 scFv包含一个或多个氨基酸取代，可与人免疫细胞中的CD2结合。在一些实施方式中，VH结构域在SEQ ID NO：18所示的序列中包含至少一个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)氨基酸取代，并且VL结构域在SEQ ID NO：19所示的序列中包含至少一个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)氨基酸取代，使得CD2的表达在人类免疫细胞中被阻断、减少或降低。在其他实施方式中，VH结构域在SEQ ID NO：20所示的序列中包含至少一个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)氨基酸取代，并且VL结构域在SEQ IDNO：21所示的序列中包含至少一个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)氨基酸取代，使得CD2的表达在人类免疫细胞中被阻断、减少或降低。
在各种实施方式中，抗CD2 scFv包含与SEQ ID NO：22的至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性。在各种其他实施方式中，抗CD2 scFv包含与SEQ ID NO：23的至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性。在一些实施方式中，抗CD2 scFv是SEQID NO：22的变体，并且具有与SEQ ID NO：22的抗CD2 scFv相同的结合活性。在其他实施方式中，抗CD2 scFv是SEQ ID NO：23的变体，并且具有与SEQ ID NO：23的抗CD2 scFv相同的结合活性。
PEBL的CD2结合结构域可以结合与CAR的抗CD2结合结构域相同的CD2表位。在其他情况下，PEBL的抗CD2结合结构域可以结合与CAR的CD2结合结构域不同的CD2表位。PEBL的CD2结合结构域和CAR的CD2结合结构域的氨基酸序列可以基本相同。或者，PEBL的CD2结合结构域和CAR的CD2结合结构域的氨基酸序列可以不同。在一些实施方式中，PEBL的CD2结合结构域的序列具有与CAR的CD2结合结构域的至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性。
CAR的示例性实施方式在图1中示出，并且示例性氨基酸和核酸序列在表1中提供。
在一些实施方式中，编码抗CD2CAR的核酸序列包含表1中列出的一个或多个核酸序列。在某些实施方式中，抗CD2CAR包含具有与SEQ ID NO：10或其密码子优化的变体的至少90％的序列同一性(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性)的核苷酸序列。例如，可以改性编码抗CD2CAR的核酸序列，以在人细胞例如人免疫细胞中获得所需的表达或活性。
如本领域技术人员将理解的，在某些实施方式中，本文公开的各种组分(例如，信号肽、scFv、细胞内信号传导结构域、跨膜结构域、接头及其组合)的任何序列可以具有与本文公开的特定对应序列的至少90％序列同一性、至少91％序列同一性、至少92％序列同一性、至少93％序列同一性、至少94％序列同一性、至少95％序列同一性、至少96％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性、至少99％序列同一性或100％序列同一性。
在一些实施方式中，4-1BB细胞内信号传导结构域可具有与SEQ ID NO：16的至少90％的序列同一性、至少91％的序列同一性、至少92％的序列同一性、至少93％的序列同一性、至少94％的序列同一性、至少95％序列同一性、至少95％序列同一性、至少96％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性、至少99％序列同一性或100％序列同一性，只要其具有所需的功能。
在某些实施方式中，4-1BB细胞内信号传导结构域可以被来自共刺激分子的另一个细胞内信号传导结构域替代，所述共同刺激分子诸如CD28、OX40、ICOS、CD27、GITR、HVEM、TIM1、LFA1或CD2。在一些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域可具有与CD28、OX40、ICOS、CD27、GITR、HVEM、TIM1、LFA1或CD2的细胞内信号传导结构域的至少90％的序列同一性、至少91％的序列同一性、至少92％的序列同一性、至少93％的序列同一性、至少94％的序列同一性、至少95％序列同一性、至少96％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性、至少99％序列同一性或100％序列同一性。任选地，4-1BB细胞内信号传导结构域还可以包括来自共刺激分子例如CD28、OX40、ICOS、CD27、GITR、HVEM、TIM1、LFA1或CD2的另一个细胞内信号传导结构域(或其一部分)。在一些实施方式中，另外的细胞内信号传导结构域可以具有与CD28、OX40、ICOS、CD27、GITR、HVEM、TIM1、LFA1或CD2的细胞内信号传导结构域的至少90％的序列同一性、至少91％的序列同一性、至少92％的序列同一性、至少93％的序列同一性、至少94％的序列同一性、至少95％的序列同一性、至少96％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性、至少99％序列同一性或100％序列同一性。
在一些实施方式中，CD3zeta(CD3ζ)细胞内信号传导结构域可以具有与SEQ IDNO：17的至少90％的序列同一性、至少91％的序列同一性、至少92％的序列同一性、至少93％的序列同一性、至少94％的序列同一性、至少95％的序列同一性、至少95％的序列同一性、至少96％的序列同一性、至少97％的序列同一性、至少98％的序列同一性、至少99％的序列同一性或100％的序列同一性，只要其具有所需的功能。
在一些情况下，细胞内信号传导结构域包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其一部分，只要其具有所需的功能。CAR的细胞内信号传导结构域可以包括具有与ITAM的至少90％的序列同一性、至少91％的序列同一性、至少92％的序列同一性、至少93％的序列同一性、至少94％的序列同一性、至少95％的序列同一性、至少96％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性、至少99％序列同一性或100％序列同一性。在某些实施方式中，细胞内信号传导结构域可以具有与FcεRIγ、CD4、CD7、CD8、CD28、OX40或H2-Kb的至少95％的序列同一性、至少96％的序列同一性、至少97％的序列同一性、至少98％的序列同一性、至少99％的序列同一性或100％的序列同一性，只要其具有所需的功能。
在一些实施方式中，CD8 alpha(CD8α)铰链和跨膜结构域可以具有与SEQ ID NO：11的至少90％的序列同一性、至少91％的序列同一性、至少92％的序列同一性、至少93％的序列同一性、至少94％的序列同一性、至少95％的序列同一性、至少95％的序列同一性、至少96％的序列同一性、至少97％的序列同一性、至少98％的序列同一性、至少99％的序列同一性或100％的序列同一性，只要其具备所需的功能。
适用于本发明的铰链和跨膜序列是本领域已知的，并且提供在例如出版物WO2016/126213中，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，抗CD2CAR的铰链和跨膜结构域可以包括来自CD8α、IgG、CD8β、4-1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS、FGFR2B或其他跨膜蛋白的信号传导结构域(例如跨膜结构域)。跨膜结构域也可以是非天然存在的疏水蛋白区段。
在一些实施方式中，CD8alpha(CD8α)信号肽可具有与SEQ ID NO：11的至少90％的序列同一性、至少91％的序列同一性、至少92％的序列同一性、至少93％的序列同一性、至少94％的序列同一性、至少95％序列同一性、至少95％序列同一性、至少96％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性、至少99％序列同一性或100％序列同一性，只要其具有所需的功能。
V.工程化免疫细胞
因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种表达CD2 CAR和CD2 PEBL的工程化免疫细胞。在某些实施方式中，工程化免疫细胞是工程化T细胞、工程化自然杀伤(NK)细胞、工程化NK/T细胞、工程化单核细胞、工程化巨噬细胞或工程化树突细胞。在一些实施方式中，免疫细胞是外周血单核细胞(PBMC)衍生的T细胞。
在一些实施方式中，本发明描述了表达结合CD2的PEBL的工程化免疫细胞，例如本文概述的那些。在一些实施方式中，工程化免疫细胞表达PEBL，其包含具有与选自SEQ IDNO：1-4的任何一种的至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，工程化细胞表达PEBL，其包含具有与SEQ ID NO：1的至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，工程化细胞表达PEBL，其包含具有与SEQ ID NO：2的至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，工程化细胞表达PEBL，其包含具有与SEQ ID NO：3的至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，工程化细胞表达PEBL，其包含具有与SEQ ID NO：4的至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，工程化细胞表达包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的PEBL。在一些实施方式中，工程化细胞表达包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的PEBL。在一些实施方式中，工程化细胞表达包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的PEBL。在一些实施方式中，工程化细胞表达包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的PEBL。在某些实施方式中，工程化免疫细胞是工程化T细胞、工程γδT细胞、PBMC衍生的T细胞、工程化自然杀伤(NK)细胞、工程化NK/T细胞、工程化单核细胞、工程化巨噬细胞或工程化树突状细胞。
在一些实施方式中，本发明涉及表达结合CD2的CAR的工程化免疫细胞，包括本文概述的那些。在一些实施方式中，工程化细胞表达包含CAR，其包含具有与SEQ ID NO：5的至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，工程化细胞表达包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CAR。在某些实施方式中，工程化免疫细胞是工程化T细胞、工程γδT细胞、PBMC衍生的T细胞、工程化自然杀伤(NK)细胞、工程化NK/T细胞、工程化单核细胞、工程化巨噬细胞或工程化树突状细胞。
在一些实施方式中，本发明涉及表达结合CD2的CAR和结合CD2的PEBL的工程化免疫细胞，包括本文概述的那些。在一些实施方式中，除了包含具有与SEQ ID NO：5的至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)的同一性的氨基酸序列的CAR以外，工程化免疫细胞还表达PEBL，其包含具有与SEQ ID NO：1-4中的任何一个的至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)的同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，除了包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CAR之外，工程化免疫细胞还表达PEBL，其包含选自由SEQ ID NO：1-4的任何一个组成的组的氨基酸序列。
在一些情况下，工程化免疫细胞表达与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少90％同一性的PEBL和与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少90％同一性的CAR。在一些情况下，工程化免疫细胞表达与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少90％同一性的PEBL和与SEQ IDNO：5的氨基酸序列具有至少90％同一性的CAR。在一些情况下，工程化免疫细胞表达与SEQID NO：3的氨基酸序列具有至少90％同一性的PEBL和与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少90％同一性的CAR。在一些情况下，工程化免疫细胞表达与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少90％同一性的PEBL和与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少90％同一性的CAR。在一些实施方式中，工程化的免疫细胞表达SEQ ID NO：1的PEBL和SEQ ID NO：5的CAR。。在一些实施方式中，工程化的免疫细胞表达SEQ ID NO：1的PEBL和SEQ ID NO：5的CAR。在一些实施方式中，工程化的免疫细胞表达SEQ ID NO：2的PEBL和SEQ ID NO：5的CAR。在一些实施方式中，工程化的免疫细胞表达SEQ ID NO：3的PEBL和SEQ ID NO：5的CAR。在一些实施方式中，工程化免疫细胞表达SEQ ID NO：4的PEBL和SEQ ID NO：5的CAR。在某些实施方式中，工程化免疫细胞是工程化T细胞、工程γδT细胞、PBMC衍生的T细胞、工程化自然杀伤(NK)细胞、工程化NK/T细胞、工程化单核细胞、工程化巨噬细胞或工程化树突状细胞。
本文所概述的PEBL防止将靶蛋白转运到细胞膜。例如，将上述针对CD2的PEBL保留在细胞内，例如在ER中。针对CD2的PEBL可以与CD2在细胞内共定位。因此，细胞表面上的CD2表达被抑制。在一些实施方式中，此类PEBL消除了CD2的表面表达。在一些情况下，PEBL不会引起工程化免疫细胞中的免疫表型变化。而且，PEBL不影响或减少工程化免疫细胞的增殖。在一些实施方式中，PEBL与CAR，例如抗CD2-4-1BB-CD3ζCAR共表达。在某些情况下，结合CD2的PEBL在表达CD2 CAR的免疫细胞中的表达或存在可防止其他CD2 CAR-T细胞杀灭该细胞。
在某些实施方式中，提供了工程化免疫细胞，其包含：核酸，其包含编码与定位结构域连接的靶结合分子(例如，PEBL)的核苷酸序列，其中所述靶结合分子是结合CD2的抗体，并且所述定位结构域包含保留信号传导结构域，所述保留信号传导结构域包含选自内质网(ER)序列、高尔基保留序列和蛋白体定位序列组成的组的氨基酸序列。在某些情况下，PEBL还包括衍生自CD8α、CD8β、4-1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS或FGFR2B。
在一些情况下，工程化细胞包含核酸，该核酸包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列。在某些情况下，CAR包含4-1BB和CD3ζ的细胞内信号传导结构域，以及结合CD2的抗体。在某些实施方式中，在靶结合分子的上下文中结合CD2的抗体包括：表1中列出的VH序列和VL序列。
在一些实施方式中，工程化免疫细胞是工程化T细胞、工程化自然杀伤(NK)细胞、工程化NK/T细胞、工程化单核细胞、工程化巨噬细胞或工程化树突细胞。在一些情况下，工程化免疫细胞是同种异体细胞。在其它情况下，工程化免疫细胞是自体细胞。
在一些实施方式中，工程化免疫细胞缺乏CD2表面表达至少6个月。在其他实施方式中，工程化免疫细胞缺乏CD2表面表达至少12个月。在特定的实施方式中，工程化免疫细胞缺乏CD2表面表达至少20个月。在一些实施方式中，工程化免疫细胞缺乏CD2表面表达至少24个月。
在一些实施方式中，与不产生CD2 PEBL的免疫细胞相比，工程化的免疫细胞具有显著降低的CD2表面表达至少6个月。在其他实施方式中，工程化免疫细胞具有降低的CD2表面表达至少12个月。在特定的实施方式中，工程化免疫细胞具有降低的CD2表面表达至少20个月。在一些实施方式中，工程化免疫细胞具有降低的CD2表面表达至少24个月。
在某些实施方式中，工程化免疫细胞以与可比较免疫细胞相比基本上相等的速率增殖。在一些实施方式中，表达CAR的工程化免疫细胞和抗CD2 PEBL的增殖类似于表达相应CAR的免疫细胞的增殖。
在一些实施方式中，本发明的工程化免疫细胞具有增强的治疗功效。此类工程化的免疫细胞可用于治疗受试者的癌症。在某些实施方式中，所述癌症是CD2相关的癌症或T细胞恶性肿瘤，例如T细胞白血病或T细胞淋巴瘤，例如T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)，T细胞幼淋巴细胞性白血病，T细胞大颗粒性淋巴细胞白血病，肠病相关的T细胞淋巴瘤，肝脾性T细胞淋巴瘤，皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤，皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)及其亚型，蕈样肉芽肿，Sézary综合征，原发性皮肤γ-δT细胞淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤(NHL)的T谱系亚群的恶性肿瘤，包括但不限于未做其他规定的外周T细胞淋巴瘤(PTCL)(PTCL-NOS)和血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤，以及间变性大细胞淋巴瘤。在某些实施方式中，T细胞恶性肿瘤是早期T细胞祖细胞急性淋巴细胞白血病(ETP-ALL)。
在一些实施方式中，与表达相应CAR的免疫细胞相比，表达CAR和抗CD2 PEBL的本发明的工程化免疫细胞具有增强或增加的治疗作用。在一些实施方式中，表达CAR和抗CD2PEBL的工程化免疫细胞具有与表达相应CAR的免疫细胞相当的治疗效果。
在另一个实施方式中，本发明涉及用于产生本发明的工程化免疫细胞的方法，所述方法包括将以下引入到免疫细胞：包括编码嵌合抗原受体的核苷酸序列的核酸和包括编码连接到定位结构域的靶结合分子(例如，PEBL分子)的核苷酸序列的核酸，从而产生工程化免疫细胞。
在某些实施方式中，工程化免疫细胞是工程化T细胞、工程化自然杀伤(NK)细胞、工程化NK/T细胞、工程化单核细胞、工程化巨噬细胞或工程化树突细胞。在一些实施方式中，工程化T细胞是任何类型的T细胞。在某些实施方式中，工程化T细胞是gamma-delta(γδ)T细胞。在某些实施方式中，工程化T细胞是由PBMC衍生的T细胞产生的。
在某些实施方式中，包括核苷酸序列的核酸离体或体外引入到免疫细胞。在其他实施方式中，将包含核苷酸序列的核酸体内引入免疫细胞。
包括待引入的核苷酸序列的核酸可以是单个双顺反子构建体，所述单个双顺反子构建体含有本文所描述的嵌合抗原受体和连接到定位结构域的靶结合分子(例如，scFv)。如本文所述，单个双顺反子构建体可以通过在编码本文所述的嵌合抗原受体的2个cDNA(例如，CAR)和靶结合分子(例如，scFv)之间插入内部核糖体进入位点(IRES)或2A肽编码区位点来制备。用于使多于一个靶缺失的三顺反子递送系统的设计应当也是可行的。可替代地，可以执行对单独构建体(例如，CAR和PEBL)进行的单独转导(同时或顺序地)。引入外源核酸的方法在本文进行了例示，并且是本领域众所周知的。
在一些实施方式中，编码CAR的核苷酸序列和编码PEBL的核苷酸序列被顺序地引入。在其它实施方式中，编码CAR的核苷酸序列和编码PEBL的核苷酸序列被同时引入。在某些情况下，编码CAR的核苷酸序列和编码PEBL的核苷酸序列是可操作地连接的，并且因此可以被引入单个表达载体或质粒上。
在一些实施方式中，在一种或多种细胞因子的存在下培养免疫细胞，所述细胞因子包括但不限于IL-2、IL-7、IL-15及其任何组合。在某些情况下，在能够增强或诱导T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞增殖的试剂的存在下培养免疫细胞。在某些情况下，在结合TCR/CD3复合物分子的试剂和/或结合CD28的试剂存在下培养免疫细胞。在某些实施方式中，培养工程化免疫细胞的方法包括在存在选自由以下组成的组的情况下进行培养：CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40和HVEM。在某些实施方式中，培养方法包括在存在与CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40或HVEM结合的试剂的情况下进行培养。用于培养本文描述的工程化免疫细胞的其他方法可以在例如US20190136186、US20190062706和US20170037369中找到。
在一些实施方式中，获得外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方式中，从人类受试者收获外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方式中，从健康人受试者收获外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方式中，从患有癌症的人类受试者收获外周血单核细胞(PBMC)，包括本文所述的任何。在一些实施方式中，根据制造商的建议，用(a)CD3微珠或(b)CD4和CD8微珠进行T细胞的阳性选择。在某些情况下，细胞以每80μl MACS缓冲液1×10
在一些实施方式中，在选择和激活的一天后(第1天)，使用静态转导在MOI为1-10(例如，MOI 1、MOI 2、MOI 3、MOI 4、MOI 5、MOI 6、MOI 7、MOI 8、MOI 9和MOI 10)的情况下用慢病毒转导T细胞，所述慢病毒包含编码本文所述的PEBL的多核苷酸和/或编码本文的CAR的多核苷酸。在一些情况下，监测T细胞培养物并将其维持在每ml培养基0.5-2×10
在各个方面，还提供了用于产生本文所描述的工程化免疫细胞的试剂盒。本试剂盒可用于产生例如同种或自体效应T细胞。
因此，本文提供的试剂盒包含核酸，该核酸包含编码PEBL的核苷酸序列，例如抗CD2 PEBL。在一些实施方式中，试剂盒包含核酸，该核酸包含编码PEBL的核苷酸序列，例如抗CD2 PEBL，以及核酸，该核酸包含编码CAR的核苷酸序列。可以根据本文所描述的实施方式中的任何实施方式设计试剂盒。
在某些实施方式中，编码CAR的核苷酸序列和/或编码PEBL的核苷酸序列进一步包括允许，例如，克隆和/或表达的序列(例如，质粒或载体序列)。例如，核苷酸序列可以作为质粒的一部分提供，以便于克隆到其他质粒和/或表达载体中，例如用于转染到细胞(例如免疫细胞)中。在某些实施方式中，编码CAR的核苷酸序列和编码PEBL的核苷酸序列提供在单个质粒或载体上。在某些实施方式中，核苷酸序列提供在分开的质粒或表达载体上。在一些实施方式中，选择表达载体用于病毒表达。
通常，试剂盒被隔区化以便于使用，并且可以包含一个或多个装有试剂的容器。在某些实施方式中，试剂盒组分中的所有试剂盒组分一起包装。可替代地，试剂盒的一个或多个单独组分可以提供在与其它试剂盒组分分开的包装中。试剂盒也可以包含使用试剂盒组件的说明。
VI.治疗的方法
一方面，本发明涉及工程化免疫细胞的用途，所述工程化免疫细胞包含含有编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列的核酸和含有编码连接至用于治疗癌症的定位结构域的单链可变片段(scFv)的核苷酸序列的核酸，包括将治疗量的工程化免疫细胞给药于需要其的受试者。
在其他方面，本发明涉及工程化的免疫细胞的用途，所述工程化的免疫细胞包括含有编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列的核酸和含有编码连接至用于治疗自身免疫疾病的定位结构域的靶结合分子的核苷酸序列的核酸(例如，scFv)，其包括将治疗量的工程改造的免疫细胞给药于需要其的受试者。
在其他方面，本发明还涉及工程化的免疫细胞的用途，所述工程化的免疫细胞包含核酸，所述核酸包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列，包含编码针对CD2的靶结合分子(例如抗CD2 scFv)的核苷酸序列的核酸，该核苷酸序列连接到用于治疗传染病的定位结构域，包括将治疗量的所述工程化免疫细胞给药于需要其的受试者。
在一些方面，工程化免疫细胞通过输注给药到受试者。输注免疫细胞(例如，同种异体免疫细胞或自体免疫细胞)的方法是本领域已知的。为了改善疾病的症状，向受体给药充足数量的细胞。通常，在单次设置中输注10
在一些方面，提供了基本上纯净的工程化免疫细胞群，其包含本文所述的任何工程化免疫细胞，其中至少90％，例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的工程化免疫细胞缺乏CD2表达。在某些情况下，基本纯净的群体包括至少80％，例如至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多缺少CD2表达的工程化免疫细胞。
在其他方面，还提供了一种在有需要的受试者中治疗癌症或自身免疫疾病的方法，其包括向该受试者给药治疗量的具有本文所述的任何实施方式的工程化免疫细胞，从而治疗有需要的受试者的癌症或自身免疫疾病。在一些方面，提供了一种在有此需要的受试者中治疗癌症或自身免疫疾病的方法，其包括向所述受试者给药治疗量的具有本文所述的任何实施方式的基本上纯的工程化免疫细胞群，从而治疗有需要的受试者的癌症自身免疫疾病。
在某些实施方式中，如本文所述，所述方法包括给药治疗量的工程化免疫细胞，所述工程化免疫细胞包含具有编码针对结合至定位结构域的CD2的靶结合分子的核苷酸序列的核酸的核酸。在一些情况下，第二核酸包括编码CAR的核苷酸序列。在一些实施方式中，CAR包含4-1BB和CD3ζ的细胞内信号传导结构域，以及与细胞因子例如CD2结合的抗体。
在一些实施方式中，改造的免疫细胞对于需要治疗的受试者是自体的。在其它实施方式中，工程化免疫细胞对需要治疗的受试者是同种异体的。
在某些实施方式中，通过静脉内输注、动脉内输注、手术后直接注射入肿瘤和/或肿瘤床灌注、在肿瘤部位植入人工支架、鞘内给药和眼内给药。
在某些实施方式中，工程化免疫细胞通过输注给药到受试者。输注免疫细胞(例如，同种异体免疫细胞或自体免疫细胞)的方法是本领域已知的。为了改善疾病的症状，向受体给药充足数量的细胞。通常，在单次设置中输注10
在某些实施方式中，根据本发明的治疗癌症的方法与至少一种其它已知的癌症疗法(例如，化学疗法)相结合。在一些实施方式中，根据本发明的治疗癌症的方法在治疗上与抑制阴性检查点调节剂的药剂组合，例如针对PD-1、CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT或另一种免疫检查点分子的抗体。由于通常存在于淋巴瘤中的免疫抑制环境，这种组合在治疗T细胞淋巴瘤时可能特别有效。
在其他方面，还提供了具有本文所述的任何实施方式的工程化免疫细胞在治疗癌症中的用途，包括将治疗量(治疗群体)的工程化免疫细胞给药于需要其的受试者。在某些实施方式中，经工程改造的免疫细胞通过静脉内输注、动脉内输注、腹膜内输注、手术后直接注射入肿瘤和/或肿瘤床灌注、在肿瘤部位植入人工支架、鞘内注射而给药给受试者。
在一些实施方式中，在给药(例如输注)本文概述的工程化免疫细胞之前，用非清髓性化学疗法治疗受试者。在一些实施方式中，非清髓性化疗是环磷酰胺60mg/kg/d，持续2天(在输注工程化免疫细胞之前的第27天和26天)，氟达拉滨25mg/m
其他的预处理方法在Gassner等人的《癌症免疫疗法(CancerImmunol.Immunother.)》2011，60，75-85，Muranski等人，Nat.Clin.Pract.Oncol.,2006,3,668-681,Dudley等人,J.Clin.Oncol.2008,26,5233-5239和Dudley等人,J.Clin.Oncol.2005，23，2346-2357中有描述，其全部内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，在接受非清髓性化疗和输注工程化的免疫细胞之后，受试者接受静脉内给药细胞因子，例如IL-2、IL-7、IL-15或其任意组合。在一些实施方式中，在接受非清髓性化疗之后，患者接受与IL-2、IL-7、IL-15或其任何组合组合的工程化免疫细胞群。在一些情况下，IL-2、IL-7、IL-15或其任何组合在细胞群体后给药。在某些情况下，IL-2、IL-7、IL-15或其任何组合与细胞群同时给药。IL-2包括IL-2(aldeskeukin)，其生物类似物或其变体。
在一些实施方式中，IL-2包括高剂量IL-2方案，例如但不限于在给药本文所述的治疗有效群体的工程化免疫细胞后的第二天开始静脉内给药，其中IL-2被给药剂量为0.037mg/kg或0.044mg/kg IU/kg(患者体重)，每八小时使用15分钟推注静脉滴注，直到耐受为止，最多14剂。休息9天后，可以重复进行另外14剂的给药计划，总共最多28剂。
在其它实施方式中，IL-2的剂量的大约18x10
在一些实施方式中，工程化的免疫细胞或工程化的免疫细胞群作为联合治疗的一部分给药，例如与另一种治疗干预措施(例如抗体或工程化的细胞或受体)同时或以任何顺序依次进行或药剂，例如细胞毒性或治疗剂。在一些实施方式中，将细胞与一种或多种另外的治疗剂共同或与另一种治疗干预一起以任何顺序同时或顺序地共同给药。在一些实施方式中，将细胞与时间足够接近的另一种疗法共同给药，以使细胞群增强一种或多种其他治疗剂的作用，反之亦然。在一些实施方式中，在一种或多种其他治疗剂之前给药细胞。在一些实施方式中，在一种或多种另外的治疗剂之后给药细胞。在一些实施方式中，一种或多种另外的试剂包括细胞因子，例如IL-2，以增强持久性。在一些实施方式中，该方法包括给药化学治疗剂。在一些实施方式中，治疗剂抑制阴性检查点调节剂，例如但不限于针对PD-1、CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT或另一免疫检查点分子的抗体。
在给药本文所述的工程化免疫细胞后，在一些实施方式中，例如通过许多已知方法中的任何一种来测量工程化细胞群的生物学活性。评估的参数包括在体内例如通过成像或在体外(例如通过ELISA或流式细胞术)工程化的或天然的T细胞或其他免疫细胞与抗原的特异性结合。在某些实施方式中，工程化细胞破坏靶细胞的能力可以使用本领域已知的任何合适方法来测量，例如描述于例如Kochenderfer等人，J.Immunotherapy，32(7):689-702(2009)中的细胞毒性测定法，和Herman等人，J.Immunological Methods，285(1)：25-40(2004)。在某些实施方式中，通过测定一种或多种细胞因子例如CD107a、IFNγ、IL-2和TNF的表达和/或分泌来测量细胞的生物学活性。在某些方面，通过评估临床结果例如降低癌症负担或负担来测量生物学活性。
VII.本发明的示例性实施方式
一方面，本发明提供了编码抗CD2-4-1BB-CD3ζ嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸，其包含抗CD2单链可变片段(scFv)结构域，CD8α铰链跨膜结构域，4-1BB细胞内信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。
在任何实施方式的多核苷酸中，所述CAR的抗CD2 scFv结构域包含具有与SEQ IDNO：22或SEQ ID NO：23的至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的氨基酸序列。在任何实施方式的多核苷酸中，所述CAR的CD8α铰链跨膜结构域包含具有与SEQ ID NO：15的至少90％序列同一性的氨基酸序列。在任何实施方式的多核苷酸中，所述CAR的所述4-1BB细胞内信号传导结构域包含具有与SEQID NO：16的至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的氨基酸序列。在任何实施方式的多核苷酸中，所述CAR的所述CD3ζ信号传导结构域包含具有与SEQ ID NO：17的至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的氨基酸序列。在任何实施方式的多核苷酸中，CAR包含具有与SEQ ID NO：5的至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的氨基酸序列。在某些情况下，CAR具有与SEQID NO：10中的任何一个的至少80％(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的核酸序列。
本文提供了分离的病毒载体，其包含编码本文描述的CAR的任何一种多核苷酸。在本发明的某些方面，将包含编码本文概述的CAR的多核苷酸中的任一种的分离的病毒载体引入免疫细胞。
本文还提供了工程化的免疫细胞，其包含本文所述的抗CD2-4-1BB-CD3ζ嵌合抗原受体。任何实施方式的工程化免疫细胞是工程同种异体细胞。任何实施方式的工程化免疫细胞是工程自体细胞。任何实施方式的工程化免疫细胞是工程化T细胞。任何实施方式的工程化免疫细胞是携带工程γ-T细胞受体的T细胞。任何实施方式的工程化免疫细胞是工程化NK细胞。任何实施方式的工程化免疫细胞是携带工程γ-T细胞受体的T细胞。
本文提供了分离的病毒载体，其包含编码CD2阻断多肽的多核苷酸，所述CD2阻断多肽包含与连接至细胞定位结构域的N端的CD2结合的单链可变片段(scFv)，其中细胞定位结构域包含选自内质网(ER)保留序列，高尔基保留序列和蛋白体定位序列组成的组，其中所述CD2阻断多肽结合细胞内的内源性CD2。
在实施方式中任一项的分离的病毒载体中，所述scFv包含：(i)具有与SEQ ID NO：18的至少90％序列同一性的可变重链(VH)序列和具有与SEQ ID NO：19的至少90％的序列同一性的可变轻链(VL)序列，或(ii)具有与SEQ ID NO：20的至少90％的序列同一性的可变重链(VH)序列和具有与SEQ ID NO：21的至少90％的序列同一性的可变轻链(VL)序列。
在任何一个实施方式的分离的病毒载体中，所述ER保留序列包含选自由KDEL、KKXX、KKMP和KKTN组成的组的氨基酸序列，其中X可以是任何氨基酸；或所述高尔基保留序列选自由以下组成的组：YGRL(SEQ ID NO：40)、YQRL(SEQ ID NO：41)、YKGL(SEQ ID NO：42)和YXXL(SEQ ID NO：43)，其中X可以是任何氨基酸。在实施方式中任一项的分离的病毒载体中，所述CD2阻断多肽还包含连接在所述scFv和包含KKMP或KKTN的所述ER保留序列结构域或包含YGRL、YQRL、YKGL的所述Golgi保留序列结构域之间的跨膜结构域，其中所述跨膜结构域是选自由以下组成的组中的任何一个的跨膜结构域：CD8α、CD8β、4-1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS和FGFR2B。在实施方式中任一项的分离的病毒载体中，所述跨膜结构域包含CD8α的铰链-跨膜结构域。
在实施方式中任一项的分离的病毒载体中，所述CD2阻断多肽包含具有与选自SEQID NO：1-4组成的组的任何一个的至少90％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，CD2阻断多肽包含具有与SEQ ID NO：6-9中的任何一个的至少80％(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性。
在本发明的一些方面，将包含编码本文概述的任何CD2阻断多肽的多核苷酸的分离的病毒载体引入免疫细胞。
本文还提供了一种工程化免疫细胞，其包含本文所述的CD2阻断多肽。任何实施方式的工程化免疫细胞是工程同种异体细胞。任何实施方式的工程化免疫细胞是工程自体细胞。任何实施方式的工程化免疫细胞是工程化T细胞。任何实施方式的工程化免疫细胞是工程化NK细胞。
一方面，本文提供了包含多肽的工程化免疫细胞，所述多肽包含与细胞定位结构域连接的靶结合分子，其中，靶结合分子是结合CD2蛋白(例如，人CD2蛋白)的抗体，细胞定位结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：内质网(ER)保留序列、高尔基保留序列和蛋白体定位序列，并且连接到定位结构域的靶结合分子不由工程化细胞分泌。
在一些实施方式中，结合CD2蛋白(例如人CD2蛋白)的抗体是抗CD2单链可变片段(scFv)。在一些实施方式中，scFv包含具有与SEQ ID NO：18的至少90％的序列同一性的可变重链(V
在一些实施方式中，scFv包含具有与SEQ ID NO：20的至少90％的序列同一性的可变重链(V
在一些实施方式中，细胞定位结构域包含选自KDEL、KKXX、KKMP或KKTN的氨基酸序列，其中X可以是任何氨基酸。在某些实施方式中，多肽还包含连接在靶结合分子和细胞定位结构域之间的跨膜结构域。在某些情况下，跨膜结构域衍生自CD8α、CD8β、4-1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS或FGFR2B。
在某些实施方式中，跨膜结构域包含衍生自CD8α的铰链-跨膜结构域。
在各种实施方式中，工程化免疫细胞的多肽包含具有与SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：3的至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的氨基酸序列。该多肽可以包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
在某些实施方式中，工程化的免疫细胞的多肽包含具有与SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：4的至少90％的序列同一性的氨基酸序列。该多肽可以包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
在一些实施方式中，工程化免疫细胞还包含嵌合抗原受体(CAR)。在某些情况下，CAR是抗CD2-4-1BB-CD3ζCAR。抗CD2-4-1BB-CD3ζCAR可以包含具有与SEQ ID NO：5的至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的氨基酸序列。抗CD2-4-1BB-CD3ζCAR可以结合CD2(例如人CD2)。在一些情况下，这种抗CD2-4-1BB-CD3ζCAR可以被称为“CD2 CAR”。
在一些实施方式中，工程化免疫细胞诱导CD2+细胞的细胞毒性。
在一些实施方式中，内源CD2表达在工程化免疫细胞中被阻断。内源性CD2表达的阻滞可能持续至少6个月。内源性CD2表达的阻滞可能持续至少12个月。在一些实施方式中，工程化免疫细胞以与相当的免疫细胞基本相等的速率增殖。
在一些实施方式中，工程化免疫细胞是工程同种异体细胞或工程自体细胞。在其他实施方式中，工程化免疫细胞是工程化T细胞，例如γ-δT细胞。
在另一方面，本文提供了在有需要的受试者中治疗癌症或自身免疫疾病的方法，其包括向受试者给药治疗量的包含本文所述的工程化免疫细胞中的任一种的组合物，从而治疗有需要的受试者的癌症或自身免疫疾病。在一些情况下，该组合物还包含药学上可接受的载体。该癌症可以是T细胞恶性肿瘤或CD2相关的癌症。在一个实施方式中，T细胞恶性肿瘤是早期T细胞祖细胞急性淋巴细胞白血病(ETP-ALL)或另一种T细胞白血病。在另一个实施方式中，T细胞恶性肿瘤是淋巴瘤，包括但不限于皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、蕈样肉芽肿、Sezary综合征或外周T细胞淋巴瘤(PTCL)。
在一些实施方式中，给药是通过静脉内输注，动脉内输注，腹膜内输注，手术后直接注射入肿瘤和/或灌注肿瘤床，在肿瘤部位植入人工支架或鞘内给药。
在另一方面，本文提供了编码包含连接至细胞定位结构域的靶结合分子的多肽的多核苷酸。在一些情况下，靶结合分子是结合CD2蛋白(例如人CD2蛋白)的抗体，细胞定位结构域包含选自内质网(ER)保留序列，高尔基的氨基酸序列。保留序列和蛋白体定位序列以及与定位结构域连接的靶结合分子不被工程化细胞分泌。
在特定的实施方式中，结合CD2蛋白(例如人CD2蛋白)的抗体是抗CD2单链可变片段(scFv)。在某些实施方式中，scFv包含具有与SEQ ID NO：18的至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的可变重链(V
在其他实施方式中，scFv包含具有与SEQ ID NO：20的至少90％的序列同一性的可变重链(V
在一些实施方式中，细胞定位结构域包含选自KDEL、KKXX、KKMP或KKTN的氨基酸序列，其中X可以是任何氨基酸。在某些实施方式中，多肽还包含连接在靶结合分子和细胞定位结构域之间的跨膜结构域。在某些情况下，跨膜结构域衍生自CD8α、CD8β、4-1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS或FGFR2B。
在某些实施方式中，跨膜结构域包含衍生自CD8α的铰链-跨膜结构域。
在某些实施方式中，工程化免疫细胞的多肽包含具有与SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：3的至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的氨基酸序列。该多肽可以包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
在各种实施方式中，工程化免疫细胞的多肽包含具有与SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：4的至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的氨基酸序列。该多肽可以包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文所述的PEBL包含具有与SEQ ID NO：6-9中的任何一个的至少80％(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的核酸序列。
在一些实施方式中，本文提供了包含本文所述的多核苷酸中的任一种的表达载体。在某些情况下，表达载体还包括编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列。该CAR可以是抗CD2-4-1BB-CD3ζCAR。在一些实施方式中，抗CD2-4-1BB-CD3ζCAR包含具有与SEQ ID NO:5的至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，表达载体包含具有与SEQ ID NO：10的任何一个的至少80％(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的核酸序列。在某些情况下，表达载体包含SEQ ID NO：10的核酸序列。在一些实施方式中，表达载体包含具有与SEQ ID NO：6-9中的任何一个的至少80％(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的核酸序列。在某些情况下，表达载体包含SEQ ID NO：6-9中任一项的核酸序列。
在一些实施方式中，本文提供的宿主细胞包含本文描述的任何一种表达载体。
在另一方面，本文提供了一种产生工程化免疫细胞的方法，该方法包括：将本文公开的多核苷酸或表达载体中的任何一个引入免疫细胞。在一些实施方式中，内源CD2表达在工程化免疫细胞中被阻断。在一些实施方式中，工程化免疫细胞是工程同种异体细胞或工程自体细胞。在其他实施方式中，工程化免疫细胞是工程化T细胞，例如γ-δT细胞。
一方面，本文提供了分离的抗CD2-4-1BB-CD3ζ嵌合抗原受体(CAR)分子，其包含抗CD2单链可变片段(scFv)结构域、CD8α铰链跨膜结构域、4-1BB细胞内信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。抗CD2单链可变片段(scFv)结构域可包含具有与SEQ ID NO：22或SEQ IDNO：23的至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的氨基酸序列。CD8α铰链跨膜结构域可包括具有与SEQ ID NO：15的至少90％序列同一性的氨基酸序列。4-1BB细胞内信号传导结构域可包含具有与SEQ ID NO：16的至少90％序列同一性的氨基酸序列。CD3ζ信号传导结构域可以包含具有与SEQ ID NO：17的至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，分离的CAR分子包含具有与SEQ ID NO:5的至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的氨基酸序列。在另一方面，本文提供了编码本文所述的任何分离的CAR分子的分离的核酸分子。抗CD2-4-1BB-CD3ζCAR可以结合CD2(例如人CD2)。
在另一方面，本文提供了工程化的免疫细胞，其包含包含抗CD2-4-1BB-CD3ζ嵌合抗原受体(CAR)的多肽，该嵌合抗原受体包含抗CD2单链可变片段(scFv)结构域、CD8α铰链跨膜结构域、4-1BB细胞内信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。抗CD2-4-1BB-CD3ζCAR可以结合CD2(例如人CD2)。
在一些实施方式中，抗CD2单链可变片段(scFv)结构域包含具有与SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23的至少90％(例如90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％)的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，CD8α铰链跨膜结构域包括具有与SEQ ID NO：15的至少90％的序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，4-1BB细胞内信号传导结构域包含具有与SEQ ID NO：16的至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的氨基酸序列。在特定实施方式中，CD3ζ信号传导结构域包含具有与SEQ ID NO：17的至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，分离的CAR分子包含具有与SEQ ID NO：5的至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，分离的CAR分子包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列。在一些实施方式中，分离的CAR分子包含SEQ ID NO：10的核酸序列。
在一些实施方式中，工程化免疫细胞是工程同种异体细胞或工程自体细胞。在其他实施方式中，工程化免疫细胞是工程化T细胞，例如γ-δT细胞。
为了所有目的，诸如WO 2016/126213和PCT/US2017/063048的说明书，权利要求书和附图的内容通过引用整体并入本文。
实例
实例1：阻断T细胞中CD2表达以进行有效的嵌合抗原受体治疗
该实施方式说明了用新方法与第二代CAR结合阻断CD2表达，从而产生有效的抗CD2 CAR-T细胞。这种实用的策略为癌症患者提供了新的治疗选择。
图1提供了示例性的抗CD2嵌合抗原受体(CAR)。抗CD2单克隆抗体9.6的scFv连接至先前在实验室中开发的CD8α信号肽、CD8α铰链跨膜结构域以及抗CD19-4-1BB-CD3 CAR的4-1BB和CD3ζ的胞内结构域。将抗CD2单克隆抗体9.6或9-1的scFv连接至CD8α信号肽，以及编码定位结构域和任选地CD8α铰链跨膜结构域的序列。将它们亚克隆到鼠干细胞病毒(MSCV)载体中。在某些情况下，MSCV是包含萤火虫荧光素酶基因的MSCV内部核糖体进入位点(IRES)-绿色荧光蛋白(GFP)逆转录病毒载体。
将9.6抗CD2CAR逆转录病毒载体构建体转导至白血病细胞(白血病细胞系)中。根据本领域技术人员已知的标准方案进行逆转录病毒上清液的制备和转导。表达结果示于图2。
具有CD2基因的CCRF-CEM细胞也用9.6抗CD2CAR逆转录病毒载体构建体转导。将所得细胞维持在补充有10％FBS和1％Pen-Strep的RPMI-1640培养基中。评估了9.6抗CD2的活性。图3显示在存在CD2靶细胞的情况下，抗CD2CAR诱导了CD2和CD69(激活标记)的表达。
为了确定抗CD2CAR在外周血T淋巴细胞中的作用，通过逆转录病毒(例如慢病毒)转导或电穿孔将抗CD2CAR引入原代T细胞。
图4显示了CAR表达。
图5显示了当CD2+靶细胞(MOLT-4)与用抗CD2CAR转导或用仅含有GFP的载体转导的白血病细胞共培养时，抗CD2CAR的功能。在某些情况下，将细胞以1：1E：T共培养。结果表明，9.6抗CD2 CAR-T细胞对CD2+靶细胞具有细胞毒性。
图6显示了抗CD2 PEBL构建体的示例性实施方式。逆转录病毒将9.6PEBL和9-1PEBL转导入白血病细胞。图7的直方图显示CD2表达的下调。
图8显示9.6PEBL II下调人外周血T细胞中的CD2表达。
本文引用的所有专利、公开的申请和参考文献的教导均通过引用整体并入本文。
虽然通过参考这些示例实施方式具体地示出和描述了本发明，但本领域的技术人员应当理解的是，在不脱离由所附权利要求涵盖的本发明的范围的情况下，可以在其中做出形式和细节方面的各种改变。
机译： 封锁CD2表面表达及嵌合抗原受体表达及T细胞恶性肿瘤免疫疗法
机译： T细胞恶性肿瘤免疫治疗嵌合抗原受体CD2表面表达及表达
机译： T细胞恶性肿瘤免疫治疗嵌合抗原受体CD2表面表达及表达
