治疗

摘要

本发明涉及配制用于皮肤应用的药物组合物，其包含在药学上可接受的载体中的治疗有效量的洛匹那韦和利托那韦，并且其中洛匹那韦:利托那韦的重量比(w/w)在9:1和18:1之间。这样的组合物可用于治疗或预防皮肤癌和皮肤的恶变前病况。

说明书

技术领域

本文提供了用于治疗可能与病毒感染有关或无关的皮肤癌和皮肤良性增生性病症和/或抑制其发展或进展的方法和组合物。特别地，提供了包含洛匹那韦(lopinavir)和利托那韦(ritonavir)的组合物，其用于治疗此类癌症和病症和/或抑制其发展或进展。

背景技术

存在许多不同形式的癌症，并且据信该疾病有许多不同原因。癌症的发病率各有不同，但在大多数发达国家中，它是仅次于心脏病的第二大致死原因。当前的估计表明，目前活着的美国人中有三分之一会患有某种形式的癌症。众所周知，需要开发用于治疗癌症的新的和改进的疗法。此外，还需要开发可用于抑制普通人群、易感高危个体中的癌症发展的治疗剂或在已经受影响的个体中用作预防疾病再发生的药剂。

在全球范围内，皮肤癌是最常见的癌症。黑色素瘤是皮肤癌的一种重要且具侵袭性的形式，但与非黑色素瘤皮肤癌(NMSC)相比，其实际上相对较少。NMSC主要由基底细胞癌(BCC)和鳞状细胞癌(SCC)组成，并且全世界的病例数超过了所有其他非皮肤癌的总和。仅在美国，2012年就有超过500万的NMSC病例(Rogers等人JAMA Dermatol.2015；151(10):1081-1086))，而澳大利亚和新西兰的NMSC发病率是这一数字的4倍，是世界上最高的。此外，还已知患病率正在增加(https://www.cancer.org.au/about-cancer/types-of-cancer/skin-cancer.html)。就NMSC的死亡率而言，尽管SCC通常不如BCC常见，但它是最致命的死亡原因，而BCC是一种较为惰性的疾病，通常不会转移。造成这些恶性肿瘤的因素有很多，其包括皮肤类型、暴露于紫外线辐射、致癌病毒、HIV或相关的AIDS、免疫抑制疗法和多种化学致癌物。

光化性角化病(AK)是皮肤的癌前病况，如果不治疗，则有20％的机会进展为SCC。最显著的是，生活在NMSC发生率高的地区并且也可能暴露于增加该疾病的风险的上述因素的任意一种的浅肤色易感个体中，AK的患病率也更高。例如，据估计40岁以上的澳大利亚人中有40％会在其生命中的某个时候发展出AK。

人类肿瘤病毒被认为是人类癌症的主要原因并且有大量证据支持这些病毒通过在被感染的细胞中诱导遗传不稳定性而导致癌症的论点。例如，人乳头瘤病毒(HPV)，特别是16型和18型，产生E6和E7癌蛋白(oncoprotein)，已知它们可诱导遗传不稳定，从而产生异常数量的中心体、多核化和核异型。HPV感染尤其与宫颈癌有关。发明人注意到，皮肤β型人乳头瘤病毒(HPV)可以与UV和其他因素协同作用以促进AK的发展(Accardi&GheitPresse Med.2014Dec；43(12Pt 2):e435-43)。此外，AK通常可以在限定的区域内以多处病变的形式出现，这被称为“区域癌化”，这使得治疗选择变得复杂。

关于AK和NMSC的当前治疗，这取决于疾病的程度、组织学类型、患者的年龄、病变的位置以及它是原发性还是复发性疾病。例如，莫氏手术(Mohs surgery)通常用于治疗患有浅表性BCC的年轻人，而放射线可用于老年人，特别是在病变位置使得手术困难的情况下。尽管已将口服全身治疗用于治疗NMSC，但由于副作用，这些通常仅限于患有侵袭性复发疾病的高危患者。这些的示例包括联合干扰素-α和顺铂的类维生素A、5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他滨(capecitabine)和非甾体类抗炎药(NSAID)。

局部应用的治疗的优点是可以限制全身性暴露于药物并减少副作用。这些中的许多当前正在使用，例如；5-FU、咪喹莫特(Imiquimod)、西多福韦(Cidofovir)和使用光活化药物的光动力疗法。尽管该病经常复发，但手术通常被认为是最有效的治疗方法，这促进了药理学替代疗法的发展，所述药理学替代疗法既可以用作一线治疗，也可以作为外科手术的辅助手段(Amaral&Garbe Expert Opin Pharmacother.2017May；18(7):689-699)。

采用5-FU或咪喹莫特治疗AK、SCC和BCC的常规局部治疗方案为间歇应用或连续应用，每天一次或两次，持续4至16周，取决于病变的类型和严重程度以及所用药物的浓度。5-FU和咪喹莫特的不同治疗方案及其疗效系统地综述于Love等人2009(ArchDermatol.2009Dec；145(12):1431-8)。

举例来说，局部咪喹莫特乳膏有3种强度；2.5％(Zyclara)；3.75％(Zyclara)和5％(Aldara)。对于AK，咪喹莫特适用于免疫活性成人面部或头皮上的临床上典型的、非角化过度的、非肥大性的病变，其使用以下剂量和方案:每天将2.5％或3.75％的Zyclara应用至受影响区域的皮肤，持续两个2周的治疗周期，其间间隔2周的无治疗期。可将5％的Aldara每周两次应用于一个限定的治疗区域(连续的区域<25cm

对于AK的局部5-FU治疗，可以使用0.5％的乳膏(微球配方)，每天一次应用至受影响区域。还可以将1％、2％和5％的乳膏以足以覆盖病变的量每天两次应用，并持续至炎性反应达到糜烂阶段。治疗持续时间通常为2到4周，疗法后1至2个月通常不会出现愈合。对于BCC，仅使用5％的乳膏，并且以足以覆盖病变的量每天两次应用。持续治疗直至炎性反应达到糜烂阶段，持续时间通常为3至6周，尽管治疗可能需要10至12周的延长期。

一种用于皮肤癌和癌前皮肤病况的耐受性好、有效、廉价、非手术、自我应用的局部治疗将具有巨大的潜力，特别是考虑到常规疗法的费用和毒性。

在WO2015/059485中公开了治疗由病毒引起的癌症的最新进展，其描述了蛋白酶抑制剂洛匹那韦和利托那韦(其以前曾用作口服摄入药物用于逆转录病毒感染(如HIV)的临床管理)在临床上可用于组织局部施用，以预防或治疗由人类乳头瘤病毒引起的恶性肿瘤。作者特别惊讶地发现，

本发明源于发明人进行的工作，以配制洛匹那韦和利托那韦的定制配方用于局部应用于宫颈。他们出乎意料地确定，在包含洛匹那韦和利托那韦的已知药物产品(例如LOPIMUNE或

发明内容

本文公开了包含洛匹那韦和利托那韦的组合物，其作为药物以用于治疗皮肤癌或皮肤良性增生性病症(例如，疣)或预防此类癌症和病症的发展。

根据本发明的第一方面，提供了配制用于局部应用于真皮的药物组合物，其在药学上可接受的载体中包含治疗有效量的洛匹那韦和利托那韦，其中洛匹那韦:利托那韦的重量(w/w)比在9:1和18:1之间。

根据本发明的第二方面，提供了根据本发明的第一方面的药物组合物，其作为药物以用于治疗皮肤癌或皮肤良性增生性病症和/或抑制皮肤癌或皮肤良性增生性病症的发展或进展。

根据本发明的第三方面，提供了一种在需要这种治疗或抑制的受试者中治疗皮肤癌或皮肤良性增生性病症和/或抑制皮肤癌和皮肤的良性增生性病症的发展或进展的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据本发明第一方面的药物组合物。

所述组合物可用于治疗多种皮肤癌(包括黑色素瘤)。然而，在一个优选的实施方案中，本发明涉及治疗患有非黑色素瘤皮肤癌或有风险发展非黑色素瘤皮肤癌的受试者。最优选地，治疗患有BCC或SCC或有风险发展BCC或SCC的受试者。

AK是SCC的主要前期病变，因此代表可以根据本发明治疗的病症。

在一个实施方案中，所述癌症或良性增生性病症是由病毒感染引起的，更优选由致癌病毒引起，特别是由人类肿瘤病毒例如人类乳头瘤病毒(HPV)引起。所述癌症或良性增生性病症可能是由皮肤β型HPV引起的。

附图说明

当结合附图阅读时，将进一步理解所述发明内容以及以下详细描述。为了说明所公开的组合物和方法，在附图中示出了所述组合物和方法的示例性实施方案；然而，所述组合物和方法不限于所公开的具体实施方案。在所述附图中：

图1显示了在NC3000图像细胞血细胞计数器(ChemoMetec A/S，Dk)上进行的DNA片段化和细胞周期分析的典型图形输出，其使用核型正常、人端粒酶永生化的N-Tert人皮肤角质形成细胞，所述角质形成细胞用DMSO对照和总浓度为20μM的不同比例的洛匹那韦和利托那韦处理。

图2显示了用不同比例的洛匹那韦和利托那韦处理的N-Tert细胞的DNA片段化和细胞周期分析的完整输出的盒须图(box and whisker plot)，如图1所示，其中每个数据点是四个独立分析的结果。

图3显示了用总浓度为25μM的不同比例的洛匹那韦和利托那韦处理的自发转化的非整倍体人HaCat皮肤细胞的DNA片段化和细胞周期分析的完整输出的盒须图，其中每个数据点是四个独立分析的结果。

图4显示了用总浓度为25μM的不同比例的洛匹那韦和利托那韦处理的非整倍体A431 SCC细胞系的DNA片段化和细胞周期分析的盒须图，其中每个数据点是四个独立分析的结果。

具体实施方式

通过参考以下结合附图的详细描述，可以更容易地理解所公开的组合物和方法，所述附图形成了本公开的一部分。应当理解，所公开的组合物和方法不限于本文描述和/或示出的特定组合物和方法，并且本文所用的术语仅用于通过示例的方式描述特定实施方案，而不旨在限制所要求保护的组合物和方法。

除非上下文另外明确指出，否则对特定值的引用至少包括该特定值。当表达值的范围时，另一实施方案包括从一个特定值和/或至另一特定值。对范围内陈述的值的进一步的引用，包括该范围内的每个值。所有范围都是包含性的和可组合的。

应当理解，为清楚起见，本文在单独的实施方案的上下文中描述的所公开的组合物和方法的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为简洁起见，在单个实施方案的上下文中描述的所公开的组合物和方法的某些特征也可以单独地或以任何子组合提供。

本文使用以下缩写：人乳头瘤病毒(HPV)；非黑色素瘤皮肤癌(NMSC)；基底细胞癌(BCC)；鳞状细胞癌(SCC)；光化性角化病(AK)；5-氟尿嘧啶(5-FU)；活性药物成分(API)；以及非甾体类抗炎药(NSAID)。

如本文所用，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数。

当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，将理解的是，所述特定值形成另一实施方案。此外，术语“约”在涉及数字范围、截止值或特定值时用于表示所述值与所列值的差异可能至多为10％。由于本文使用的许多数值是通过实验确定的，本领域技术人员应该理解，这种确定可以并且经常会在不同的实验之间变化。由于这种固有的变化，本文所用的值不应被视为过度限制。因此，术语“约”用于涵盖与特定值的±10％或更小的差异、±5％或更小的差异、±1％或更小的差异、±0.5％或更小的差异、±0.1％或更小的差异。

如本文所用，“治疗”等术语是指降低症状的严重性和/或频率、消除症状和/或所述症状的潜在原因、降低症状和/或其潜在原因的频率或可能性，延迟、预防和/或减缓癌症或良性增生性病症的进展，以及改善或补救由癌症或病症直接或间接引起的损害。

如本文所用，短语“治疗有效剂量”是指包含洛匹那韦和利托那韦的组合物的量，如本文所述，其有效达到特定的生物学或治疗结果，所述生物学或治疗结果例如但不限于本文所公开的、所描述的或举例说明的生物学或治疗结果。所述治疗有效剂量可根据如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及所述组合物在受试者中引起所需响应的能力等因素而变化。这样的结果包括但不限于通过本领域中任何合适的方法确定的良性或恶性疾病的减少、缓解和/或消退或预防良性或恶性疾病的发展。

如本文所用，“受试者”包括脊椎动物、哺乳动物、家畜或优选地，人类。

“药学上可接受的载体”可以是本领域普通技术人员已知的可用于配制药物组合物的任何生理载体。所述载体是最适合用于通过局部应用将API递送至皮肤的载体。

本文公开了包含洛匹那韦和利托那韦的组合物，其作为药物用于治疗皮肤癌或皮肤良性增生性病症(例如，疣)或预防此类癌症和病症的发展。

洛匹那韦(CAS#192725-17-0)是一种蛋白酶抑制剂，其化学名称为[1S-[1R*(R*),3R*,4R*]]-N-[4-[(2,6-二甲基苯氧基)乙酰基]氨基]-3-羟基-5-苯基-1-(苯基甲基)戊基]四氢-α-(1-甲基乙基)-2-氧杂-1(2H)-嘧啶乙酰胺。其分子式为C

利托那韦(CAS#155214-67-5)是一种蛋白酶抑制剂，其化学名称为10-羟基-2-甲基-5-(1-甲基乙基)-1-[2-(1-甲基乙基)-4-噻唑基]-3,6-二氧杂-8,11双(苯基甲基)-2,4,7,12-四氮杂十三烷-13酸,5-噻唑基甲基酯,[5S-(5R*,8R*,10R8,11R*)]。其分子式为C

出人意料地，鉴于现有技术，本发明人发现，用于治疗皮肤癌或皮肤良性增生性病症或预防其发展、或用于预防此类癌症或此类病症的发展的洛匹那韦:利托那韦的摩尔比应该最佳地在10:1-18:1的摩尔比范围内。在一个实施方案中，所述范围可能是10.5:1-18:1。优选地，所述范围为11.5:1-17:1，更优选地为11.5:1-16.0:1，并且甚至更优选地为11.5:1-15:1。所述范围可以是下列摩尔比：约11.75:1；约12:1；约12.5:1；约13:1；约13.5:1；约13.75:1；约14.0:1；或约14.5:1。

在一个实施方案中，摩尔比范围可能是10:1-16:1。优选地，所述范围为10:1-14:1。用于治疗皮肤癌或皮肤良性增生性病症或预防其发展、或用于预防此类癌症或此类病症的发展的洛匹那韦:利托那韦的摩尔比可能为约10:1、12:1或14:1。

在优选的实施方案中，所述洛匹那韦∶利托那韦的摩尔比为约12:1。在另一个优选实施方案中，所述洛匹那韦∶利托那韦的摩尔比为约13.8:1。

应当理解，洛匹那韦的分子量为628.8道尔顿，利托那韦的分子量为720.95道尔顿。因此，摩尔比和w/w比将不相同，当将摩尔比转换为w/w时，应采用0.872的因数。因此，本发明人发现，用于治疗宫颈癌或宫颈良性增生性病症或预防其发展、或用于预防此类癌症或此类病症的发展的洛匹那韦:利托那韦的w/w比可能在9:1-18:1的重量比范围内。所述范围可能是10:1-18:1。例如，所述范围可以是9.5:1-16:1或10.0:1-16:1。优选地，所述范围为10.0:1-15.0:1，更优选地为10.25:1-14.5:1并且最优选地为10.5:1-13.0:1。所述范围可以是下列w/w比：约10.25:1；约10.5:1；约10.75:1；约11:1；约11.25:1；约11.5:1；约11.75:1；约12.0:1；约12.25:1；约12.5:1；约12.75:1；约13.0:1；约13.25:1；约13.5:1；约13.75:1；约14.0:1或约14:25:1。在优选的实施方案中，所述洛匹那韦∶利托那韦的w/w比为约10.5:1。在最优选的实施方案中，所述洛匹那韦∶利托那韦的w/w比为约12:1。

根据本发明的第一方面的组合物可用于治疗皮肤癌，并且特别可用于治疗NMSC(诸如BCC和SCC)。本发明特别适用于，但绝不仅适用于由致癌病毒(例如高风险或甚至低风险形式的人类乳头瘤病毒(HPV))引起的皮肤癌。所述组合物特别可用于治疗与皮肤β型人乳头瘤病毒(HPV)感染有关的癌症。

根据本发明的第一方面的组合物也可用于预防皮肤癌的发展。因此，可以通过局部施用根据本发明的组合物来治疗正常受试者(即没有可检测到的癌症的受试者)、具有恶性肿瘤前(pre-malignant)细胞的受试者或特别是有癌症倾向的受试者，以预防癌症的发展。

根据本发明的组合物不仅可用于治疗实际的癌症，而且令人惊讶地可用于治疗癌前病况，特别是对于可能表现出癌前AK病变的受试者。因此，包含洛匹那韦和利托那韦的组合物可以有利地用于治疗此类病况，并且还可以起到预防癌症的作用。

本发明特别适用于，但绝不仅适用于由致癌病毒(例如高风险或甚至低风险形式的人类乳头瘤病毒(HPV))引起的癌前病况和皮肤癌。所述组合物特别可用于治疗与皮肤β型人乳头瘤病毒(HPV)感染有关的癌症和病症。

可以将所述组合物给予具有发展癌症(最特别是BCC或SCC)的遗传倾向的受试者，或甚至面临环境风险的受试者(例如暴露于致癌物的人，皮肤过度暴露于阳光下等)。在一个优选的实施方案中，可以将所述组合物给予长期暴露于阳光下的人和/或患有AK的受试者。

所述组合物可以作为单一疗法(即，单独使用两种抑制剂)或与用于癌症疗法中的其他化合物或疗法(例如，化疗剂、放疗)组合用于预防或治疗癌症。

最优选地，将所述组合物用于治疗人类。然而，应该理解的是，所述组合物也可以具有一些兽医用途。

药物组合物

根据本发明的组合物被配制成适合于局部应用的药物，特别是配制成用于向皮肤施用的药物。

合适的制剂包括但不限于凝胶剂、乳膏剂、糊剂、软膏剂或洗剂。在一些方面，所述药物组合物可以被配制成凝胶剂。在一些方面，所述药物组合物可以被配制成乳膏剂。在一些方面，所述药物组合物可以被配制成糊剂。

在一些方面，所述药物组合物可以被配制成软膏剂。在一些方面，所述药物组合物可以被配制成洗剂。

在优选的实施方案中，所述组合物被配制成使得其适合于将API局部递送至皮肤(例如，作为软膏剂、凝胶剂、糊剂、洗剂或乳膏剂)，以用于预防皮肤癌(例如，BCC或SCC)的发展或治疗皮肤癌(例如，BCC或SCC)，或用于预防AK的发展或治疗AK。

当用于治疗皮肤癌(或预防皮肤癌的发展)时，可以将所述组合物配制成可通过本领域已知的技术直接应用于皮肤的凝胶剂、洗剂、糊剂、乳膏剂或软膏剂。

将根据本发明使用的优选组合物配制成用作皮肤软膏剂或乳膏剂，其包含根据本发明的重量比的洛匹那韦和利托那韦。

在一个实施方案中，所述药学上可接受的载体可以是液体，并且所述组合物可以是溶液。在另一个实施方案中，所述载体可以是凝胶，并且所述组合物可以是应用于皮肤的凝胶剂。在另一个实施方案中，所述载体可以是乳液(或其他药学上可接受的基质)，并且所述组合物可以是皮肤乳膏剂。在进一步的实施方案中，所述载体可以是光滑且油性的，并且所述组合物可以是应用于皮肤的软膏剂。

液体载体可用于制备凝胶剂、洗剂、乳膏剂、溶液、悬浮液和乳液。活性成分可以溶解或悬浮在药学上可接受的液体载体中，例如水、有机溶剂、两者的混合物或药学上可接受的油或脂肪。所述液体载体可以包含其他合适的药物添加剂，例如增溶剂、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、悬浮剂、增稠剂、着色剂、粘度调节剂、稳定剂或渗透调节剂。合适的液体载体的实例包括水(部分含有上述添加剂，例如纤维素衍生物，优选羧甲基纤维素钠溶液)、醇(包括一元醇和多元醇，例如乙二醇)及其衍生物，以及油(例如分馏的椰子油和花生油)。所述载体也可以是油性酯，如油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。用于加压组合物的液体载体可以是卤代烃或其他药学上可接受的推进剂。

在一个实施方案中，所述组合物通常可以使用聚乙二醇作为洛匹那韦和利托那韦的主要载体。所述载体的其余部分可以由例如油酸、PEG35、蓖麻油、纯净水、明胶、山梨醇特殊多元醇或其任意组合组成。洛匹那韦和利托那韦几乎不溶于水，优选使用这种有机碱(或其等效物)。

优选的药物组合物是乳膏剂、洗剂或软膏剂，并且包含最适于应用于皮肤的载体。这些形式中的一些在所述组合物中存在水。然而，含水的局部用组合物与易于通过水解降解的API一起使用并不总是理想的，因为这可能导致药物产品的保质期短和/或要求将所述组合物在特定条件下储存以使活性API的降解最小化。洛匹那韦和利托那韦是可能易于降解的API的实例。因此，优选地可以包括非水性载体。这样的载体通常是光滑的油性组合物，并且通常包含显著比例(w/w)的药学上可接受的油或脂肪(例如油酸)。这种载体可以包含其他合适的药物添加剂，例如增溶剂、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、悬浮剂、增稠剂、着色剂、粘度调节剂、稳定剂或渗透调节剂。

应当理解，洛匹那韦和利托那韦在根据本发明的组合物中的量将取决于确切的组分，尤其是所述组合物的载体。

仅作为示例，组合物(例如下文所述的优选的组合物)中的洛匹那韦的合适的量可以为约0.1-30％w/w。在一些实施方案中，洛匹那韦在所述组合物中的量可以为约1.0-25％w/w。在一些实施方案中，洛匹那韦在所述组合物中的量可以为2.0-20％w/w。例如，软膏剂可包含约5％、6％、10％或12％(w/w)的洛匹那韦。

利托那韦在此类组合物中的合适的量为约0.01-3％w/w。在一些实施方案中，利托那韦在所述组合物中的量可以为约0.1-2.5％w/w。在一些实施方案中，利托那韦在所述组合物中的量可以为0.15-1.5％w/w。例如，软膏剂可包含约0.4775％、0.5％、0.625％或0.955％(w/w)的利托那韦。

优选的组合物可包含约8重量％至约14重量％的洛匹那韦和约0.75重量％至约1.4重量％的利托那韦。例如，所述组合物可以包含10重量％的洛匹那韦和0.955重量％的利托那韦，或者所述组合物可以包含12重量％的洛匹那韦和1重量％的利托那韦。

另一优选的组合物可包含约4重量％至约7重量％的洛匹那韦和约0.375重量％至约0.75重量％的利托那韦。例如，所述组合物可以包含5重量％的洛匹那韦和0.4775重量％的利托那韦，或者所述组合物可以包含6重量％的洛匹那韦和0.5重量％的利托那韦。

用于应用于皮肤的组合物

根据本发明使用的一种优选的组合物是药物组合物，其包含：

a)不饱和游离脂肪酸；

b)硬化剂；以及

c)重量比为9:1至18:1的洛匹那韦和利托那韦；

其中所述不饱和游离脂肪酸的存在量为药物组合物总重量的至少20重量％，并且其中所述药物组合物在室温下为半固体。

洛匹那韦:利托那韦的重量比可以如本发明的第一方面所限定。优选地，洛匹那韦:利托那韦的重量比在10:1和14:1之间，更优选在10.5:1和13.5:1之间，并且最优选为约12.0:1(w/w)。

常规组合物使用植物油和/或聚山梨酸酯作为增稠组合物的剂。有利地，确立了：不饱和的游离脂肪酸和硬化剂可以用于制备在室温下为半固体的药物组合物，其可以以静止的材料状态存在，直到施加外应力导致所述材料流动。这样的外部应力可以是将组合物应用到靶组织(即皮肤)上，并且发明人发现，这种组合物对于将洛匹那韦和利托那韦递送至皮肤特别有效。

有利地，所述药物组合物仅包含游离脂肪酸(不饱和游离脂肪酸和/或饱和游离脂肪酸)形式的脂肪，例如所述组合物中的所有脂肪酸均以游离脂肪酸的形式存在。这允许所述药物组合物在室温下生产，这在以下情况是有利的：API易于降解，并且其中当所述API暴露于热时降解的速率和/或程度增加。

不饱和游离脂肪酸

所述不饱和游离脂肪酸可以选自油酸、亚油酸、α-亚油酸、棕榈油酸、巨头鲸鱼酸和蓖麻油酸。所述不饱和游离脂肪酸优选地是油酸。

在一个实施方案中，所述组合物中存在的总不饱和脂肪酸(结合的和游离形式的脂肪酸)中，至少90重量％为游离形式(即未酯化的或未结合至其他组分如甘油)，至少95重量％可以是游离形式，至少98重量％可以是游离形式，至少99重量％可以是游离形式，或至少99.5重量％可以是游离形式。技术人员将知道用于确定游离脂肪酸含量相对于总脂肪酸含量的方法。例如，可以通过使游离脂肪酸与发色化合物反应，从而改变发色化合物吸收电磁辐射的频率来测量游离脂肪酸含量。因此，可以通过使用合适的波长监测发色化合物来确定反应的发色化合物的浓度，其转而可以用于确定样品中的游离脂肪酸含量。

应当理解，可商购的游离脂肪酸产品可以包含少量其他游离脂肪酸。例如，油酸通常包含7-12％的饱和游离脂肪酸(例如硬脂酸和棕榈酸)以及其他不饱和游离脂肪酸(例如亚油酸)(《药物赋形剂手册》，第二版，请参见油酸条目)。术语“饱和游离脂肪酸”或“不饱和游离脂肪酸”应理解为是指药典等级(例如美国药典和/或英国药典)的饱和游离脂肪酸或不饱和游离脂肪酸，并且饱和的游离脂肪酸或不饱和的游离脂肪酸可以包含少量其他游离脂肪酸。

在一个实施方案中，所述不饱和的游离脂肪酸不是甘油三酯或聚山梨酸酯的形式。

所述组合物中存在的总饱和脂肪酸(结合的和游离形式的不饱和以及饱和脂肪酸)中，至少90重量％，例如至少95重量％、例如至少98重量％、例如至少99重量％，或例如至少99.5重量％，可以为游离形式，即未酯化的或未结合至其他组分(如甘油)的。

硬化剂

所述硬化剂是用于使所述组合物硬化的赋形剂，使得所述组合物在室温下为半固体。方便地，所述硬化剂是饱和的游离脂肪酸，例如C

在一个实施方案中，所述组合物中存在的总饱和脂肪酸(结合的和游离形式的脂肪酸)中，至少90重量％，例如至少95重量％、例如至少98重量％、例如至少99重量％，或例如至少99.5重量％，为游离形式，即未酯化的或未结合至其他组分(如甘油)。技术人员将知道用于确定游离脂肪酸含量相对于总脂肪酸含量的方法。例如，可以通过使游离脂肪酸与发色化合物反应，从而改变发色化合物吸收电磁辐射的频率来测量游离脂肪酸含量。因此，可以通过使用合适的波长监测发色化合物来确定反应的发色化合物的浓度，其转而可以用于确定样品中的游离脂肪酸含量。

在一个实施方案中，所述饱和的游离脂肪酸不是甘油三酯或聚山梨酸酯的形式。

所述不饱和游离脂肪酸优选为油酸，并且所述硬化剂优选为硬脂酸。

所述组合物的其他组分

根据本发明的组合物可任选地包括粘膜粘附剂(muco-adhesive agent)和如下所述的其他赋形剂。

所述组合物可以包含粘膜粘附剂。所述粘膜粘附剂可以是非离子聚合物或离子聚合物。在一个实施方案中，所述非离子聚合物是纤维素醚。在一个实施方案中，所述纤维素醚选自甲基纤维素、乙基纤维素和羟丙基甲基纤维素。

在优选的实施方案中，所述粘膜粘附剂是羟丙基甲基纤维素。在一个实施方案中，所述羟丙基甲基纤维素的甲氧基取代度为19至24重量％，而羟丙基取代度为4至12重量％。

在另一个实施方案中，所述离子聚合物是聚丙烯酸钠。

任选地，所述组合物中可以包含额外的赋形剂。

在一个实施方案中，所述组合物还包含增稠剂。增稠剂是这样一种赋形剂，当将其添加到混合物中时，会增加混合物的粘度，并在将所述活性药物成分递送至应用部位的过程中赋予所述无水组合物更大的物理稳定性和/或控制。在一个实施方案中，所述增稠剂选自单二甘油酯(mono di glyceride)、地蜡(ceresin wax)和氢化植物油。

优选的组合物

在一个实施方案中，提供了用于局部应用于皮肤的组合物，其包括：

a.利托那韦；

b.洛匹那韦；

c.油酸；以及

d.硬脂酸。

这样的组合物可以进一步包含选自单二甘油酯、地蜡和氢化植物油的成分的一种、多种或全部。

在一个实施方案中，提供了用于局部应用的组合物，其包括：

e.利托那韦；

f.洛匹那韦；

g.羟丙基甲基纤维素；

h.油酸；

i.硬脂酸；以及

j.丁羟甲苯。

在一个实施方案中，所述组合物包括：

a.约1.2至约1.4重量％的利托那韦；

b.约9至约11重量％的洛匹那韦；

c.约0.5至1.5重量％的羟丙基甲基纤维素；

d.约55至约65重量％的油酸；

e.约28至约32重量％的硬脂酸；以及

f.约0.05至约0.5重量％的丁羟甲苯；

其中所有重量％均基于所述组合物的总重量计。

在一个实施方案中，所述组合物包括：

a.约0.5至约0.7重量％的利托那韦；

b.约4至约6重量％的洛匹那韦；

c.约0.5至1.5重量％的羟丙基甲基纤维素；

d.约55至约65重量％的油酸；

e.约28至约32重量％的硬脂酸；以及

f.约0.05至约0.5重量％的丁羟甲苯；

其中所有重量％均基于所述组合物的总重量计。

优选的组合物包括：

a.利托那韦；

b.洛匹那韦；

c.羟丙基甲基纤维素；

d.油酸；

e.硬脂酸；

f.丁羟甲苯；

g.单二甘油酯；

h.地蜡；

i.氢化植物油；

j.聚乙二醇100硬脂酸酯；以及

k.单油酸甘油酯；

在一个实施方案中，所述组合物包括：

a.约0.9至约1.1重量％的利托那韦；

b.约9至约11重量％的洛匹那韦；

c.约0.5至约1.5重量％的羟丙基甲基纤维素；

d.约55至约65重量％的油酸；

e.约4至约5重量％的硬脂酸；

f.约0.1至约0.3重量％的丁羟甲苯；

g.约4至约6重量％的单二甘油酯；

h.约5至约7重量％的地蜡；

i.约9至约11重量％的氢化植物油；

j.约1至约3重量％的聚乙二醇100硬脂酸酯；以及

k.约2至约4重量％的单油酸甘油酯；

其中所有重量％均基于所述组合物的总重量计。

在一个实施方案中，所述组合物包括：

a.约0.9至约1.1重量％的利托那韦；

b.约11至约13重量％的洛匹那韦；

c.约0.5至约1.5重量％的羟丙基甲基纤维素；

d.约50至约60重量％的油酸；

e.约4至约5重量％的硬脂酸；

f.约0.1至约0.3重量％的丁羟甲苯；

g.约4至约6重量％的单二甘油酯；

h.约5至约7重量％的地蜡；

i.约9至约11重量％的氢化植物油；

j.约1至约3重量％的聚乙二醇100硬脂酸酯；以及

k.约2至约4重量％的单油酸甘油酯；

其中所有重量％均基于所述组合物的总重量计。

在一个实施方案中，所述组合物包括：

a.约0.4至约0.6重量％的利托那韦；

b.约4至约6重量％的洛匹那韦；

c.约0.5至约1.5重量％的羟丙基甲基纤维素；

d.约55至约65重量％的油酸；

e.约4至约5重量％的硬脂酸；

f.约0.1至约0.3重量％的丁羟甲苯；

g.约4至约6重量％的单二甘油酯；

h.约5至约7重量％的地蜡；

i.约9至约11重量％的氢化植物油；

j.约1至约3重量％的聚乙二醇100硬脂酸酯；以及

k.约2至约4重量％的单油酸甘油酯；

其中所有重量％均基于所述组合物的总重量计。

在一个实施方案中，所述组合物包括：

a.约0.4至约0.6重量％的利托那韦；

b.约5至约7重量％的洛匹那韦；

c.约0.5至约1.5重量％的羟丙基甲基纤维素；

d.约55至约65重量％的油酸；

e.约4至约5重量％的硬脂酸；

f.约0.1至约0.3重量％的丁羟甲苯；

g.约4至约6重量％的单二甘油酯；

h.约5至约7重量％的地蜡；

i.约9至约11重量％的氢化植物油；

j.约1至约3重量％的聚乙二醇100硬脂酸酯；以及

k.约2至约4重量％的单油酸甘油酯；

其中所有重量％均基于所述组合物的总重量计。

优选的组合物在实施例4和表1-4中公开。

给药

应该理解的是，所需的洛匹那韦和利托那韦的量由生物活性和生物有效性决定，而生物活性和生物有效性又部分取决于所用组合物的精确的施用方式、理化性质以及所述组合物是用作单一疗法或是在与其他口服或局部药物的联合疗法中使用。实际上，除了将相同化合物或其他活性药物成分口服给药外，还可以局部应用所述至少一种活性药物成分。施用频率还将受到上述因素的影响，特别是活性药物成分在被治疗的受试者体内的半衰期。

每日剂量可以糊剂、乳膏剂、洗剂、软膏剂或用于局部施用的类似组合物的形式给予，并且每天一次、每天两次、每天三次或每天如临床医生认为必要的那么多次应用至皮肤。

优选地，所述组合物是糊剂、乳膏剂、洗剂、软膏剂或用于局部施用的类似组合物，其包含不饱和游离脂肪酸；硬化剂(如上所限定的)；以及重量比在9:1和18:1之间的洛匹那韦和利托那韦。

在一个实施方案中，根据病变的类型和严重程度以及所用API的浓度，用于AK、SCC和BCC的常规局部治疗方案为间歇应用或连续应用，每天一次或两次，持续4至16周。

治疗区域可能包括在病变(肿瘤或AK)周围1cm的癌旁组织。

可用组合物治疗AK，将所述组合物以足以覆盖病变的量每天一次或两次施用于受影响的区域。

所施用的最佳的剂量可以由本领域技术人员确定，并且将随制剂的强度、施用方式和疾病状况的进展而变化。取决于所治疗的特定受试者的其他因素将导致需要调节剂量，所述其他因素包括例如受试者的年龄、体重、饮食和施用时间。

给予的洛匹那韦的合适量为约0.1mg至约10.0g的日剂量。在一些实施方案中，洛匹那韦的日剂量可以为约10mg至约5.0g。在一些实施方案中，洛匹那韦的日剂量可以为约25mg至约1.0g。方便地，洛匹那韦的日剂量可在25mg至500mg之间(例如约300mg或150mg)。

给予的利托那韦的合适量为约0.01mg至约1.0g的日剂量。在一些实施方案中，利托那韦的日剂量可以为约1.0mg至约250.0mg。在一些实施方案中，利托那韦的日剂量可以为约2.5mg至约100mg。方便地，利托那韦的日剂量可在5mg至50mg之间(例如约25mg、28.65mg、12.5mg或14.325mg)。

在一个实施方案中，每天可以将约300mg的洛匹那韦和约28.65mg的利托那韦施用于皮肤病变。

在另一个实施方案中，每天可以将约150mg的洛匹那韦和约14.325mg的利托那韦施用于皮肤病变。

在另一个实施方案中，每天可以将约300mg的洛匹那韦和约25mg的利托那韦施用于皮肤病变。

在另一个实施方案中，每天可以将约150mg的洛匹那韦和约12.5mg的利托那韦施用于皮肤病变。

应当理解，需要向受试者施用的组合物的量将取决于洛匹那韦和利托那韦在所述组合物中的浓度以及需要治疗的病变的尺寸。举例来说，可以施用优选的组合物(例如，如上所述的优选的糊剂、乳膏剂、洗剂或软膏剂)，使得将0.05g至5.0g的组合物应用于5×5cm的病变部位。更优选地，可以向5×5cm的病变部位应用0.1至4.0g组合物。在一个实施方案中，可以将0.5g(豌豆大小)量的组合物应用至5×5cm的病变部位。

根据本发明的组合物可以被揉搓进入皮肤中并且暴露于空气中。或者，所述组合物可以通过敷料应用和被敷料覆盖(如本领域已知的那样)，以将所述组合物保持在适当的位置，并将所述组合物与空气和/或污染的衣物隔离。

只要需要治疗，就可以将所述药物施用于受试者。治疗所需的时长取决于要治疗或预防的确切病况及其严重程度。本领域技术人员将理解，应考虑多种因素来维持治疗，所述因素将包括根除任何致癌病毒(例如HPV)；减少或根除具有癌前表型或癌表型的细胞；或缩小或根除任何肿瘤或其他病变(例如疣)的任何需要。

在一个优选的实施方案中，可以向受试者施用足够量的组合物，以每天提供约300mg的洛匹那韦和约28.65mg的利托那韦；或每天约150mg的洛匹那韦和约14.325mg的利托那韦。

在另一个优选的实施方案中，可以向受试者施用足够量的组合物，以每天提供约300mg的洛匹那韦和约25mg的利托那韦；或每天约150mg的洛匹那韦和约12.5mg的利托那韦。

在优选的实施方案中，表1、2、3或4中公开的软膏剂可以每天一次或两次局部应用于皮肤。可以将0.05g至5.0g的软膏剂应用于5×5cm的病变部位。更优选地，可以将0.1至4.0g应用于5×5cm的病变部位。在一个实施方案中，可以将约3.0g的所述组合物应用于5×5cm的病变部位。在一个实施方案中，可以将约2.5g的所述组合物应用于5×5cm的病变部位。在一个实施方案中，可以将约1.0g的所述组合物应用于5×5cm的病变部位。在一个实施方案中，可以将0.5g(豌豆大小)量的组合物应用至5×5cm的病变部位。

实施例

实施例1：评估总API浓度为20μM的、比例为8:1-16:1w/w的洛匹那韦:利托那韦对hTERT细胞的作用

N-TERT细胞是一种永生的、未转化的细胞系，其衍生自p53为野生型且核型正常的分化的细胞。它们无限增殖并且可以通过多种处理被转化。因此，这些细胞代表了评估洛匹那韦和利托那韦对AK(未转化且异常增生的癌前病变)的作用的良好模型。如Dickson等人(2000年)所述(Mol Cell Biol Feb 2000p1436-1447)，将源自新生儿包皮角质形成细胞的N-TERT细胞用于这些实验中。

1.1方法

1.1.1细胞培养

在5％CO

对从T75融合起始培养物中接种到T25烧瓶的细胞进行实验，将其在5％CO

1.1.2处理

第五天后，将EGF与DMSO对照或20μM总API(由单独的洛匹那韦或不同比例的洛匹那韦和利托那韦组成)一起添加回培养物中，随后如结果部分所示，继续孵育另外2天。

1.1.3在NC3000图像细胞仪(Chemometec Ltd，挪威)中进行DNA片段化测定。

用API培养的最后一天后，将所述细胞用胰蛋白酶消化、沉淀并使用标准化程序用PBS洗涤。然后根据制造商的DNA片段化测定程序(Chemometec Ltd，挪威)，将所述细胞在70％乙醇中固定至少4个小时，在PBS中洗涤、计数，然后用DAPI染色。然后使用八腔室载玻片以NC3000图像细胞细胞计数器分析染色的细胞。

1.2结果

图1显示DAPI染色的N-Tert细胞的代表性图像，所述细胞已经用DMSO对照、单独的洛匹那韦以及根据本发明的比例为14:1w/w的洛匹那韦:利托那韦处理过。图像细胞计数器根据量化每个样品中每个细胞的特征性DAPI-DNA染色，将来自细胞周期的4个阶段的细胞区分开来，并且将其代表性输出显示在随附的图形分析中。标记为M1的细胞比例对应于经历凋亡性DNA片段化的细胞(Sub G1，其中N＝<2N DNA)，而M2-M4代表细胞周期的正常G1、S和G2期。

图2显示了如第1.1.1-1.1.3和1.2节所述，以8:1、10:1、12:1、14:1和16:1(w/w)的比例的洛匹那韦和利托那韦进行处理后的N-Tert细胞的DNA片段化和细胞周期分析的盒须图。对于采用多种处理方法处理的细胞，计算了具有<2N DNA的凋亡Sub G1细胞与具有完整2N-4N DNA的细胞(G1、S和G2)的百分比，数据以盒须图的形式显示，并在随后的所有图中使用。还使用R程序通过成对排列检验分析了数据的统计学显著性。

发明人惊讶地注意到，对于10:1、12:1、14:1和16:1(w/w)的API，凋亡活性的统计学显著的峰(对应于细胞的诱导的细胞死亡)是明显的，与单独的洛匹那韦或8:1(超出本发明范围的比例)相比(参见图2)。包括图1来说明从何处推导出图2的数据(参见上面的1.1.3)。

这些数据表明，根据本发明的比例的洛匹那韦和利托那韦具有治疗皮肤增生性病症(例如AK)的潜在功效。

实施例2：评估总API浓度为25μM的、比例为10:1-14:1w/w的洛匹那韦:利托那韦对HaCaT细胞的作用

HaCaT细胞是源自皮肤活检的自发转化但非恶性的人类细胞系(Boukamp等人,(1988)J cell Biol 106(3)p761-71)。所述细胞表现出非整倍性、表达p53突变并且具有与向癌性病变(如BCC或SCC)进展的AK相当的表型。因此，所述细胞系代表了评估洛匹那韦和利托那韦对皮肤的癌前病况和早期癌性病况(例如AK)的作用的良好模型，如报道的抗凋亡蛋白survivin在NMSC、AK和HaCaT细胞中的表达(Grossman et al.(1999)Lab Invest 79(9)p1121-6)所证明的那样。

2.1方法

遵循1.1中描述的基础方法，除了以下：

2.1.1细胞培养

在5％CO

与N-Tert细胞一样。将HaCaT细胞从T75起始培养物中接种到T25烧瓶中，并在添加有5％FBS的DMEM中扩增3天。然后撤除FBS，并将细胞在5％CO

2.1.2：处理

然后将含有5％FCS和DMSO对照或总API浓度为25μM的仅洛匹那韦或不同比例的洛匹那韦和利托那韦的DMEM生长培养基添加到同步化的HaCaT细胞中，并在5％CO

2.2结果

图3显示了以DMSO(对照)；单独的20μM洛匹那韦；以及10:1、12:1、和14:1(w/w)的洛匹那韦和利托那韦处理后，经历凋亡性DNA片段化(Sub G1)的HaCaT细胞和具有完整2N-4N DNA(G1、S&G2)的HaCaT细胞的百分比的盒须图。

发明人注意到，当利托那韦以10:1、12:1和14:1的比例被包含在内时，由洛匹那韦引起的凋亡活性增加。

这说明，通过显示针对正在向皮肤癌进展的AK病变的特征性细胞的活性，按本发明比例的洛匹那韦和利托那韦将具有用于治疗皮肤增生性病症(如AK)；以及用于治疗癌症本身的功效。

实施例3：评估总API浓度为20μM的、比例为8:1、12:1和18:1w/w的洛匹那韦:利托那韦对A431细胞的作用

A431细胞是源自85岁妇女皮肤活检的完全恶性表皮样癌细胞系(https://en.wikipedia.org/wiki/A431_cells)。所述细胞具有突变型p53，并被认为具有与NMSC，尤其是SCC一致的表型(Oleson(2017)Anticancer Drugs 28(10)p1106-1117)。因此，所述细胞系代表了用于评估洛匹那韦和利托那韦对完全恶性的NMSC的作用的良好模型。

3.1方法

遵循2.1中描述的方法，除了以下：

3.1.1：将A431细胞接种到T25烧瓶中，并在DMEM+5％FBS中扩增3天，然后去除FBS2天以使细胞同步化。

3.1.2：然后添加DMEM+5％FCS和DMSO对照或总API浓度为25μM的仅洛匹那韦或如结果部分所述的不同比例的洛匹那韦和利托那韦，并将细胞孵育2天，然后将其收获以进行DNA片段化和细胞周期分析，如1.1.3节所述。

3.2结果

图4显示了以DMSO(对照)；单独的20μM洛匹那韦；以及8:1、12:1、和18:1(w/w)的洛匹那韦和利托那韦处理后，经历凋亡性DNA片段化(Sub G1)的A431细胞和具有完整2N-4NDNA(G1、S&G2)的A431细胞的百分比的盒须图。

发明人注意到，当API以12:1或18:1的比例被包含在内时，由洛匹那韦或8:1的洛匹那韦:利托那韦引起的凋亡活性增加。已显示在12:1时转化细胞的杀伤作用改善非常显著。

这说明根据本发明的比例的洛匹那韦和利托那韦对于预防或治疗完全恶性皮肤癌(如SCC)具有功效。

实施例1–3中给出的这些数据表明，对于诱导的细胞死亡，根据本发明的比例的洛匹那韦和利托那韦比单独的洛匹那韦或落在本发明限定范围外的比例的洛匹那韦和利托那韦具有显著更大的作用。优选的API比例在每种细胞系模型中均有效的事实清楚地表明，以限定的比例，洛匹那韦和利托那韦可用于治疗皮肤良性增生性病症(例如AK)和/或抑制其发展或进展；用于防止增生性病症进展为皮肤癌；以及用于治疗恶性皮肤癌本身(例如BCC或SCC)。

实施例4：优选制剂的制备

对于以下列出的所有制剂，所使用的所有材料均为药物级(美国药典或欧洲药典)，除了白地蜡为日本药用赋形剂级。

下面根据表1-4描述根据本发明的组合物的制造。

i.将以下材料添加到混合器中-3、4、5、6、7、8、9、1、10、11

ii.将空气从容器内部排除

iii.在低剪切混合下加热至70℃，以获得清澈透明的熔体。

iv.将以下材料添加到混合器中-2

v.将空气从容器内部排除

vi.通过低剪切混合，以将HPMC良好地分散在所述熔体中

vii.在低剪切混合时将所述物料温度降至45℃

viii.排出至存储容器并在存储期间将空气排除。

ix.将组合物包装到铝管中，所述铝管适于分配1.0-5.0g的组合物。铝管可以包含20-50ml体积的组合物。

表1

表2

表3

表4

实施例5：用洛匹那韦/利托那韦对浅表性基底细胞癌(BCC)受试者进行局部治疗的功效的临床研究。

所述研究的目的是获得关于局部应用表4的软膏剂以治疗浅表性BCC的疗效的概念验证试验数据；以及评估当局部应用于BCC病变持续30天的周期时，每天3剂0.85gm的耐受性。

将所述软膏剂包装在带有乳胶密封的75gm试管中，并打算以3次约0.8gm的应用来施用2.5gm的总日剂量，将其充分按揉以进入到病变部位。

实施例5描述了施用根据本发明的优选组合物的优选方法。