植物微RNA及其使用方法

摘要

本发明公开了新的微RNA和它们的前体，还公开了包含这些新的miRNA、miRNA前体、miRNA启动子和对应于miRNA的miRNA识别位点的重组DNA构建体。本发明包括表现出营养‑应答表达的新的miRNA和miRNA前体。本发明也公开了miRNA诱骗序列。本发明还提供了在其基因组中含有本发明重组DNA构建体的非天然转基因植物细胞、植物和种子，以及利用本发明重组DNA构建体来调控基因表达的方法。

说明书

本申请是申请日为2007年10月12日、申请号为 2007800457886、发明名称为“植物微RNA及其使用方法”的发明 专利申请的分案申请。

相关申请的交叉引用和序列表的结合

本申请要求于2006年10月12日申请的美国临时专利申请 60/851,187、2007年3月29日申请的美国临时专利申请60/908,826 和2007年8月31日申请的美国临时专利申请60/969,195的优先权 权益，所述专利申请通过引用全部结合到本文中。在2007年10月 11日创建的文件名为“38-21_54769_D.txt”的文件中所含有的且为 2209千字节(用操作系统MS-Windows统计)的序列表，在名称为 “Copy 1”、“Copy 2”和“CRF”的3个光盘(CD-R)上以计算机可 读形式提交，其在本文中提交并通过引用结合到本文中。下列文件 名中含有的序列表通过引用全部结合到本文中：文件名 “38-21(54769)A.txt”(用操作系统MS-Windows统计为734千字节， 创建于2006年10月11日，在名称为“Copy 1”、“Copy 2”和CRF 的3个光盘上以计算机可读形式与美国临时专利申请60/851,187一 起于2006年10月12日提交)、文件名“38-21_54769_B.txt”(用操 作系统MS-Windows统计为1517千字节，创建于2007年3月29日， 并以电子文件形式与美国临时专利申请60/908,826一起于2007年3 月29日提交)和文件名“38-21_54769_C.txt”(用操作系统 MS-Windows统计为2369千字节，创建于2007年8月30日，并以 电子文件形式与美国临时专利申请60/969,195一起于2007年8月31 日提交)。

发明领域

本发明公开了新的微RNA(microRNA)和微RNA前体，还公开 了包含这些新的miRNA、miRNA前体和对应于miRNA的miRNA 识别位点的重组DNA构建体。本发明包括表现出非生物-胁迫-应答 表达的新的miRNA和miRNA前体。本发明还提供miRNA诱骗序列 (decoysequence)，在其基因组中含有本发明重组DNA构建体的非天 然转基因植物细胞、植物和种子，以及利用本发明重组DNA构建体 来调控基因表达的方法。

发明背景

已经描述了参与RNA介导的基因抑制的若干细胞途径，其各自 在特征性途径和特异性组成上不同。有关综述参见例如Brodersen和 Voinnet(2006),Trends Genetics,22:268-280、以及Tomari和Zamore (2005)Genes&Dev.,19:517-529。siRNA途径包括将双链RNA(“RNA双链体”)非定相切割(non-phased cleavage)为小干扰RNA (siRNA)。微RNA途径包括微RNA(miRNA)，是通常介于约19至约 25个核苷酸(在植物中通常为约20-24个核苷酸)的非蛋白质编码 RNA，其指导靶转录物的反式切割，负调节参与各种调节和发育途 径的基因表达。植物miRNA以一组特征来定义，包括由DCL1加工 成约21个核苷酸的单个特异性miRNA的茎环前体，表达来自具有2 个核苷酸的3’突出端(overhang)的RNA双链体的一对miRNA和miRNA*，并能反式沉默特定靶标。参见Bartel(2004)Cell, 116:281-297；Kim(2005)NatureRev.Mol.Cell Biol.,6:376-385； Jones-Rhoades等(2006)Annu.Rev.Plant Biol.,57:19-53；Ambros等 (2003)RNA,9:277-279。在反式作用siRNA(ta-siRNA)途径中，miRNA 的作用是在需要RNA依赖性RNA聚合酶来产生RNA双链体的过程 中指导siRNA初级转录物的同步加工；反式作用siRNA定义为缺乏 二级结构，缺乏启动双链RNA产生的miRNA靶位点，需要DCL4 和RNA依赖性RNA聚合酶(RDR6)并产生多个完美定相的(perfectly phased)～21个核苷酸小RNA(small RNA)，其具有含2个核苷酸的3’ 突出端的完美匹配的双链体(参见Allen等(2005)Cell,121:207-221)。

微RNA(miRNA)是非蛋白质编码RNA，通常介于约19至约25 个核苷酸(在植物中通常为约20-24个核苷酸)，其指导靶转录物的反 式切割，负调节参与各种调节和发育途径的基因表达(Bartel(2004) Cell,116:281-297)。在某些情况下，miRNA的作用是指导siRNA初级转录物的同步加工(参见Allen等(2005)Cell,121:207-221)。

已经鉴定出一些微RNA基因(MIR基因)并且在数据库中是公众 可得的(“miRBase”,在microrna.sanger.ac.uk/sequences在线可得)。本 申请人已在2005年12月15日申请的美国专利申请11/303,745中公 开了新的MIR基因、成熟miRNA和miRNA识别位点，通过引用结 合到本文中。其它MIR基因和成熟miRNA也描述于美国专利申请公 布说明书2005/0120415和2005/144669A1，通过引用结合到本文中。 已经报告MIR基因存在于基因间区域，在基因组中或单独或成簇存 在，但也可完整或部分地位于其它基因(蛋白质编码基因或非蛋白质 编码基因)的内含子中。有关miRNA生物起源的最新综述，可参见 Kim(2005)Nature Rev.Mol.Cell Biol.,6:376-385。至少在某些情况 下，MIR基因转录可处于MIR基因自身启动子的启动控制之下。MIR 基因转录可能通常由RNA聚合酶II介导(参见例如Aukerman和 Sakai(2003)Plant Cell,15:2730-2741；Parizotto等(2004)Genes Dev.,18:2237-2242)，因此可适合已用于其它聚合酶II转录基因的基 因沉默方法。初级转录物(其可以是多顺反子)称为“pri-miRNA”， 即miRNA前体分子，其可以相当大(数千碱基)并含有一个或多个局 部双链或“发夹”区以及通常具有mRNA的5’“帽子”和聚腺苷 酸化尾。参见例如Kim(2005)Nature Rev.Mol.Cell Biol.,6:376-385 中的图1。

在植物细胞中，认为微RNA前体分子在细胞核中大量加工。 pri-miRNA加工为更短的miRNA前体分子，其也包含茎环或折回结 构，称为“pre-miRNA”。在植物中，miRNA和siRNA由不同切酶(DICER)样(DCL)酶来形成，而在拟南芥属(Arabidopsis)中，认为核 DCL酶(DCL1)是成熟miRNA形成所需的；参见例如Ambros等(2003) RNA,9:277-279，和Xie等(2004)PLoS Biol.,2:642-652。有关微RNA 生物起源和功能的其它综述可参见例如Bartel(2004)Cell, 116:281-297；Murchison和Hannon(2004)Curr.Opin.Cell Biol., 16:223-229；Dugas和Bartel(2004)Curr.Opin.Plant Biol.,7:512-520。 因此，可根据RNA(例如成熟miRNA或miRNA前体RNA分子的 RNA序列)，或者根据DNA(例如对应于成熟miRNA RNA序列的 DNA序列或者编码MIR基因或MIR基因片段或miRNA前体的DNA 序列)，对微RNA进行描述。

估计MIR基因家族在至少某些基因组中占1％并能影响或调节 全部基因中大约三分之一的表达(参见例如Tomari等(2005)Curr. Biol.,15:R61-64；G.Tang(2005)TrendsBiochem.Sci.,30:106-14；Kim (2005)Nature Rev.Mol.Cell Biol.,6:376-385)。因为在包括动植物在 内的真核生物中，miRNA是重要的调节元件，所以miRNA的转基 因抑制可导致例如对重要生物学过程的了解或者允许操纵某些途径 (例如调节细胞分化、增殖和细胞凋亡)，可用于例如生物技术应用。 参见例如O'Donnell等(2005)Nature,435:839-843；Cai等(2005)Proc. Natl.Acad.Sci.USA,102:5570-5575；Morris和McManus(2005)Sci. STKE,pe41 (stke.sciencemag.org/cgi/reprint/sigtrans；2005/297/pe41.pdf)。微RNA (MIR)基因具有许多标志性特征，包括在植物物种中的保守性、稳定 的折回结构和由切酶(Dicer)样酶对特定miRNA/miRNA*双链体进行 加工(Ambros等(2003)RNA,9:277-279)。这些特征已用于在植物中鉴 定miRNA及其相应基因(Xie等(2005)Plant Physiol.,138:2145-2154； Jones-Rhoades和Bartel(2004)Mol.Cell,14:787-799；Reinhart等(2002)Genes Dev.,16:1616-1626；Sunkar和Zhu(2004)Plant Cell, 16:2001-2019)。公众可得的微RNA基因的目录列在miRBase上 (Griffiths-Jones等(2003)Nucleic Acids Res.,31:439-441)。

MiRNA在拟南芥的非常特殊的细胞类型中表达(参见例如 Kidner和Martienssen(2004)Nature,428:81-84,Millar和Gubler(2005) Plant Cell,17:705-721)。抑制可限制在细胞类型的侧面、边缘或其它 分界线，认为它是合适细胞类型图式形成和特化所必需的(参见例如 Palatnik等(2003)Nature,425:257-263)。已经发现，含内源miR171 识别位点的GFP报道基因的抑制限制转基因拟南芥特定细胞的表达 (Parizotto等(2004)GenesDev.,18:2237-2242)。已经证实miRNA的识 别位点在mRNA的所有区域，包括5’非翻译区、编码区和3’非翻译 区，表明miRNA靶位点相对于编码序列的位置可能并非一定会影响 抑制(参见例如Jones-Rhoades和Bartel(2004),Mol.Cell,14:787-799, Rhoades等(2002)Cell,110:513-520,Allen等(2004)Nat.Genet., 36:1282-1290,Sunkar和Zhu(2004)PlantCell,16:2001-2019)。

本文所公开的成熟miRNA是从通常隶属于在远缘植物物种中保 守的规范家族(canonical family)的MIR基因加工而来。这些MIR基 因及其所编码的成熟miRNA也可用于例如改变发育途径，例如通过 影响细胞分化或形态发生(参见例如Palatnik等(2003)Nature, 425:257-263；Mallory等(2004)Curr.Biol.,14:1035-1046)，作为用于 工程(非天然)miRNA的序列来源，这类工程miRNA经设计成为沉 默序列而不是天然miRNA序列所靶向的转录物(参见例如Parizotto 等(2004)Genes Dev.,18:2237-2242；另见美国专利申请公布说明书 2004/3411A1和2005/0120415，通过引用结合到本文中)并能使 dsRNA稳定化。MIR基因本身(或其天然5’非翻译区或3’非翻译区、 或其天然启动子或参与其转录的其它元件)可作为靶基因用于基因抑 制(例如通过本发明方法)，其中MIR基因所编码的miRNA的抑制是 所需的。MIR基因的启动子可具有非常特殊的表达图式(expression pattern)(例如细胞特异性、组织特异性或时间特异性)，因此可用于 重组构建体，来诱导与之操作性连接的DNA序列的这类特异性转 录。

本发明提供从植物(包括作物，例如玉米、水稻和大豆)中鉴定出 的新的微RNA和微RNA前体、以及重组DNA构建体，所述构建体 包含这些新的miRNA、miRNA前体、miRNA识别位点、miRNA诱 骗序列和对应于miRNA的miRNA启动子。也公开并要求保护在其 基因组中含有本发明重组DNA构建体的非天然转基因植物细胞、植 物和种子。还提供了用本发明重组DNA构建体进行基因抑制的方 法、以及提供具有所需表型的转基因植物、尤其是在干旱、营养缺 乏、冷或热胁迫等非生物胁迫条件下具有高产量(相对于非转基因植 物而言)的转基因植物的方法。

发明概述

一方面，本发明提供重组DNA构建体，其包含用于调节至少一 个靶基因表达的至少一个可转录DNA元件，其中至少一个可转录 DNA元件选自：(a)可转录为具有选自以下植物miRNA前体序列折 回结构的miRNA前体的DNA元件：SEQ ID NO.1036–2690、SEQ IDNO.3922–5497、SEQ ID NO.6684–8408、SEQ ID NO.8561– 8741、SEQ ID NO.8743、SEQ IDNO.8800和SEQ ID NO.8816– 8819，其中miRNA前体包含玉米、水稻或大豆的miRNA前体序列的至少90％核苷酸的连续区段；(b)可转录为从选自以下植物miRNA 前体序列折回结构获得的工程miRNA前体的DNA元件：SEQ ID NO. 1036–2690、SEQ ID NO.3922–5497、SEQ IDNO.6684–8408、 SEQ ID NO.8561–8741、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和 SEQ IDNO.8816–8819，其中工程miRNA前体包含修饰的成熟 miRNA；(c)位于转基因转录单元内或其附近并可转录为包含miRNA 识别位点的RNA的DNA元件，所述miRNA识别位点可被选自以下 的成熟miRNA识别：SEQ ID NO.1–1035、SEQ ID NO.2730– 3921、SEQ ID NO.5498–6683、SEQ ID NO.8409–8560、SEQ ID NO 8742、SEQ ID NO.8744、SEQ ID NO.8812–8815、SEQ IDNO. 8845和SEQ ID NO.8850，或者可被从选自以下植物miRNA前体序 列获得的成熟miRNA识别：SEQ ID NO.1036–2690、SEQ ID NO. 3922–5497、SEQ ID NO.6684–8408、SEQ IDNO.8561–8741、 SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816–8819； 和(d)用于抑制从选自以下植物miRNA前体序列获得的内源miRNA 表达的DNA元件：SEQ ID NO.1036–2690、SEQ ID NO.3922– 5497、SEQ ID NO.6684–8408、SEQ ID NO.8561–8741、SEQ IDNO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816–8819。

本发明的另一方面提供包含任何本发明重组DNA构建体的非天 然转基因植物细胞。还提供含有本发明非天然转基因植物细胞的非 天然转基因植物，包括任何发育时期的植物，并包括由本文所公开 的非天然转基因植物细胞制备而来的再生植物或再生植物的后代植 物(其可以是近交或杂交后代植物)、或这类非天然转基因植物的种 子。也提供并要求保护在其基因组中具有本发明所提供的任何重组 DNA构建体的转基因种子。

再一方面，本发明提供影响基因抑制的方法，所述方法包括以 下步骤：(a)提供非天然转基因植物，其包括由本发明的非天然转基 因植物细胞制备而来的再生植物或再生植物的后代植物；和(b)在非 天然转基因植物中转录重组DNA构建体；其中转录产生的RNA能 够在非天然转基因植物中抑制至少一个靶基因，因此相对于在没有 所述重组DNA构建体转录时的表达而言，至少一个靶基因被抑制。

又一方面，本发明提供同时影响至少一个靶基因的基因抑制和 至少一个目标基因的基因表达的方法，所述方法包括以下步骤：(a) 提供非天然转基因植物，其包括由本发明非天然转基因植物细胞制 备而来的再生植物或再生植物的后代植物，其中重组DNA构建体还 包含用于表达至少一个目标基因的基因表达元件；和(b)在非天然转 基因植物中转录重组DNA构建体，其中，当重组DNA构建体在非 天然转基因植物中转录时，产生能够抑制至少一个靶基因的转录 RNA和编码至少一个目标基因的转录RNA，因此相对于在没有所述重组DNA构建体转录时的表达而言，至少一个靶基因被抑制，而且 至少一个目标基因同时表达。

再一方面，本发明提供重组DNA构建体，其包含对给定成熟 miRNA无应答的合成miRNA-无应答的转基因序列，其中合成 miRNA-无应答的转基因序列是：(a)由天然miRNA-应答序列获得， 即通过缺失或修饰天然miRNA-应答序列内被特定成熟miRNA识别 的所有天然miRNA识别位点，和(b)不被给定成熟miRNA识别。

另一方面，本发明提供重组DNA构建体，其包含表现出对非生 物胁迫应答的表达图式的miRNA启动子，例如，表现出特征为在营 养胁迫下抑制miRNA的表达图式的miRNA启动子，表现出特征为 在水胁迫下抑制miRNA的表达图式的miRNA启动子，或者表现出 特征为在温度胁迫下抑制miRNA的表达图式的miRNA启动子。

又一方面，本发明提供重组DNA构建体，其可转录为包含至少 一个miRNA诱骗序列的RNA转录物，所述诱骗序列被内源成熟 miRNA识别并结合，但不切割；包括在其基因组中具有该构建体的 转基因植物细胞、植物和种子，以及使用该构建体的方法。本发明 相关方面包括重组DNA构建体和用于抑制内源miRNA诱骗序列的 方法。也公开了识别并结合其它小RNA(ta-siRNA、nat-siRNA和定 相小RNA)但不被切割、因而降低小RNA活性的类似诱骗序列。

本发明的其它具体实施方案在以下发明详述中公开。

本发明还涉及以下项目：

项目1.一种重组DNA构建体，所述构建体包含：

(a)合成miRMON18-无应答的转基因序列，其中所述合成 miRMON18-无应答的转基因序列是：

(i)由天然miRMON18-应答序列获得，即通过缺失或修饰所述 天然miRMON18-应答序列内的所有天然miRMON18 miRNA识别位 点，和

(ii)不被具有序列SEQ ID NO.393、SEQ ID NO.3227或SEQ ID NO.8742的成熟miRMON18 miRNA识别；或

(b)合成miRNA-无应答的转基因序列，其中所述合成miRNA- 无应答的转基因序列是：

(i)由天然miRNA-应答序列获得，即通过缺失或修饰所述天然 miRNA-应答序列内被至少一个选自以下的特定成熟miRNA识别的 所有天然miRNA识别位点：SEQ ID NO.1–1035、SEQ ID NO.2730 –3921、SEQ ID NO.5498–6683、SEQ ID NO.8409–8560、SEQ ID NO8742、SEQ ID NO.8744、SEQ ID NO.8812–8815、SEQ ID NO. 8845和SEQ ID NO.8850，和

(ii)不被所述至少一个特定成熟miRNA识别；或

(c)合成miR399-无应答的转基因序列，其中所述合成miR399- 无应答的转基因序列是：

(i)由天然miR399-应答序列获得，即通过缺失或修饰所述天然 miR399-应答序列内的所有天然miR399识别位点，和

(ii)不被成熟miR399 miRNA识别；或

(d)合成miR319-无应答的转基因序列，其中所述合成miR399- 无应答的转基因序列是：

(i)由天然miR319-应答序列获得，即通过缺失或修饰所述天然 miR319-应答序列内的所有天然miR319 miRNA识别位点，和

(ii)不被成熟miR319 miRNA识别。

项目2.一种重组DNA构建体，所述构建体包含用于调节至少 一个靶基因表达的至少一个可转录DNA元件，其中所述至少一个可 转录DNA元件选自：

(a)(i)转录为具有选自以下植物miRNA前体序列折回结构的 miRNA前体的DNA元件：SEQ ID NO.1036–2690、SEQ ID NO. 3922–5497、SEQ ID NO.6684–8408、SEQ IDNO.8561–8741、 SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816–8819， 其中所述miRNA前体包含所述植物miRNA前体序列的至少90％核 苷酸的连续区段，而且所述重组DNA构建体任选还包含并非所述 miRNA前体序列天然启动子的启动子；或(ii)转录为具有选自以下 植物miRNA前体序列折回结构的miRNA前体的DNA元件：SEQ ID NO.1036–2690、SEQ IDNO.3922–5497、SEQ ID NO.6684– 8408、SEQ ID NO.8561–8741、SEQ ID NO.8743、SEQ IDNO.8800 和SEQ ID NO.8816–8819，其中所述miRNA前体包含所述植物前 体miRNA序列的至少90％核苷酸的连续区段，而且所述至少一个靶 基因是植物内源基因，而且所述重组DNA构建体任选还包含并非所 述miRNA前体序列天然启动子的启动子，而且其中所述重组DNA构建体在所述植物中的表达导致对所述至少一个靶基因的抑制；

(b)(i)转录为具有miRMON18前体序列折回结构的miRNA前 体并加工为成熟miRMON18 miRNA的DNA元件，而且所述重组 DNA构建体任选还包含并非所述miRMON18前体序列天然启动子 的启动子；或(ii)转录为具有miRMON18前体序列折回结构的 miRNA前体并加工为成熟miRMON18 miRNA的DNA元件，而且所 述至少一个靶基因是植物内源基因，而且所述重组DNA构建体任选 还包含并非所述miRMON18前体序列天然启动子的启动子，而且其 中所述重组DNA构建体在所述植物中的表达导致对所述至少一个 靶基因的抑制；

(c)(i)转录为从选自以下植物miRNA前体序列的植物miRNA 前体序列折回结构获得的工程miRNA前体的DNA元件：SEQ ID NO. 1036–2690、SEQ ID NO.3922–5497、SEQ IDNO.6684–8408、 SEQ ID NO.8561–8741、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和 SEQ IDNO.8816–8819，其中所述工程miRNA前体包含修饰的成 熟miRNA；或(ii)转录为从选自以下植物miRNA前体序列折回结构 获得的工程miRNA前体的DNA元件：SEQ ID NO.1036–2690、SEQ ID NO.3922–5497、SEQ ID NO.6684–8408、SEQ ID NO.8561– 8741、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816– 8819，其中所述工程miRNA前体包含修饰的成熟miRNA，其中所 述至少一个靶基因是植物内源基因或者所述植物的有害动物或病原 体的内源基因，而且其中所述重组DNA构建体在所述植物中的表达 导致对所述至少一个靶基因的抑制；

(d)(i)转录为从miRMON18前体序列折回结构获得的工程 miRNA前体的DNA元件，其中所述工程miRNA前体包含修饰的成 熟miRMON18 miRNA；或(ii)转录为从miRMON18前体序列折回结 构获得的工程miRNA前体的DNA元件，其中所述工程miRNA前体 包含修饰的成熟miRMON18 miRNA，其中所述至少一个靶基因是植 物内源基因或者所述植物的有害动物或病原体的内源基因，而且其 中所述重组DNA构建体在所述植物中的表达导致对所述至少一个 靶基因的抑制；

(e)(i)位于转基因转录单元内或其附近并转录为包含miRNA识 别位点的RNA的DNA元件，所述miRNA识别位点被选自以下的成 熟miRNA识别：SEQ ID NO.1–1035、SEQ IDNO.2730–3921、 SEQ ID NO.5498–6683、SEQ ID NO.8409–8560、SEQ ID NO 8742、SEQ IDNO.8744、SEQ ID NO.8812–8815、SEQ ID NO.8845 和SEQ ID NO.8850，或者被从选自以下植物miRNA前体序列获得 的成熟miRNA识别：SEQ ID NO.1036–2690、SEQ ID NO.3922–5497、SEQ ID NO.6684–8408、SEQ ID NO.8561–8741、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816–8819；或(ii)位 于转基因转录单元内或其附近并转录为包含miRNA识别位点的 RNA的DNA元件，所述miRNA识别位点被选自以下的成熟miRNA 识别：SEQ ID NO.1–1035、SEQ ID NO.2730–3921、SEQ ID NO. 5498–6683、SEQ ID NO.8409–8560、SEQ ID NO8742、SEQ ID NO.8744、SEQ ID NO.8812–8815、SEQ ID NO.8845和SEQ ID NO.8850，或者被从选自以下植物miRNA前体序列获得的成熟 miRNA识别：SEQ ID NO.1036–2690、SEQ IDNO.3922–5497、 SEQ ID NO.6684–8408、SEQ ID NO.8561–8741、SEQ ID NO. 8743、SEQ IDNO.8800和SEQ ID NO.8816–8819，并且所述至少 一个靶基因包含由所述转基因转录单元编码的转基因，而且其中所 述重组DNA构建体在植物中的表达导致所述转基因在并非天然表 达所述成熟miRNA的所述植物的细胞中表达；

(f)(i)位于转基因转录单元内或其附近并转录为包含miRNA识 别位点的RNA的DNA元件，所述miRNA识别位点被成熟 miRMON18 miRNA或从miRMON18前体序列获得的成熟miRNA识 别；或(ii)位于转基因转录单元内或其附近并转录为包含miRNA识 别位点的RNA的DNA元件，所述miRNA识别位点被成熟 miRMON18 miRNA或从miRMON18前体序列获得的成熟miRNA识 别，并且所述至少一个靶基因包含由所述转基因转录单元编码的转 基因，而且其中所述重组DNA构建体在植物中的表达导致所述转基 因在并非天然表达所述成熟miRMON18 miRNA的所述植物的细胞 中表达；

(g)(i)用于抑制从选自以下植物miRNA前体序列获得的内源 miRNA表达的DNA元件：SEQ ID NO.1036–2690、SEQ ID NO. 3922–5497、SEQ ID NO.6684–8408、SEQ IDNO.8561–8741、 SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816–8819； 或(ii)用于抑制从选自以下植物miRNA前体序列获得的内源miRNA 表达的DNA元件：SEQ ID NO.1036–2690、SEQ ID NO.3922– 5497、SEQ ID NO.6684–8408、SEQ ID NO.8561–8741、SEQ IDNO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816–8819，其中所述 至少一个靶基因是植物内源基因，而且所述内源基因的表达在发生 所述内源miRNA天然表达的所述植物细胞中受到抑制，而且其中所 述重组DNA构建体在所述细胞中的表达导致所述内源基因在所述 细胞中表达；和

(h)(i)用于抑制从miRMON18前体序列获得的内源成熟 miRMON18 miRNA表达的DNA元件，所述至少一个靶基因是植物 内源基因，而且所述内源基因的表达在发生所述内源成熟 miRMON18 miRNA天然表达的所述植物细胞中受到抑制，而且其中 所述重组DNA构建体在所述细胞中的表达导致所述内源基因在所 述细胞中表达；或(ii)用于抑制从miRMON18前体序列获得的内源 成熟miRMON18 miRNA表达的DNA元件，其中所述至少一个靶基 因是植物内源基因，而且所述内源基因的表达在发生所述内源成熟 miRMON18 miRNA天然表达的所述植物细胞中受到抑制，而且其中 所述重组DNA构建体在所述细胞中的表达导致所述内源基因在所 述细胞中表达。

项目3.一种包含启动子的重组DNA构建体，所述启动子选自：

(a)表现出特征为受到非生物胁迫调节的表达图式的miRNA启 动子；

(b)表现出特征为受到营养胁迫调节的表达图式的miRNA启动 子，其中所述营养胁迫包括选自缺氮和缺磷的至少一种营养缺乏；

(c)在叶组织中表现出在氮充足条件下强表达、而在缺氮条件下 抑制的玉米miRNA启动子；

(d)在叶组织中表现出在磷充足条件下强表达、而在缺磷条件下 抑制的玉米miRNA启动子；

(e)具有序列SEQ ID NO.8804的miRMON18启动子；和

(f)与SEQ ID NO.8804区段具有至少85％同一性的至少约50 个连续核苷酸的片段；

其中所述启动子与基因抑制元件和基因表达元件中的至少一个 操作性连接。

项目4.项目4的重组DNA构建体，其中所述启动子至少与天 冬酰胺合成酶基因的编码区操作性连接。

项目5.一种重组DNA构建体，所述构建体转录为包含至少一 个miRNA诱骗序列的RNA转录物，所述诱骗序列被内源成熟 miRNA识别并结合、但不切割，其中

所述内源miRNA是选自以下的至少一种miRNA：

(a)选自以下成熟miRNA的成熟miRNA：SEQ ID NO.1–1035、 SEQ ID NO.2730–3921、SEQ ID NO.5498–6683、SEQ ID NO. 8409–8560、SEQ ID NO 8742、SEQ ID NO.8744、SEQ ID NO.8812 –8815、SEQ ID NO.8845和SEQ ID NO.8850；或

(b)从选自以下植物miRNA前体序列获得的成熟miRNA：SEQ ID NO.1036–2690、SEQID NO.3922–5497、SEQ ID NO.6684– 8408、SEQ ID NO.8561–8741、SEQ ID NO.8743、SEQID NO.8800 和SEQ ID NO.8816–8819；和

所述miRNA诱骗序列包含约19个至约36个连续RNA核苷酸 的RNA序列，其中

所述miRNA诱骗序列被所述内源成熟miRNA识别并结合，导 致所述miRNA诱骗序列与所述内源成熟miRNA之间的碱基配对， 因而形成包含以下的抗切割RNA双链体：

(a)所述miRNA诱骗序列与所述内源成熟miRNA之间在所述内 源成熟miRNA位置9、10或11上的至少一个错配，或在所述miRNA 诱骗序列对应于所述内源成熟miRNA位置10-11的位置上的至少一 个插入，

(b)所述miRNA诱骗序列与所述内源成熟miRNA之间在所述 内源成熟miRNA位置1、2、3、4、5、6、7、8和9上的0、1或2 个错配，和

(c)所述miRNA诱骗序列与所述内源成熟miRNA之间在所述内 源成熟miRNA位置12至最后一位上的0、1、2或3个错配，其中 在所述内源成熟miRNA位置12至最后一位上的每个所述错配都邻 近至少一个互补碱基对。

项目6.项目5的重组DNA构建体，其中所述至少一个miRNA 诱骗序列包含：(a)天然存在的miRNA诱骗序列，或(b)合成miRNA 诱骗序列，或(c)天然存在的miRNA诱骗序列和合成miRNA诱骗序 列两者。

项目7.项目5的重组DNA构建体，其中所述至少一个miRNA 诱骗序列被选自以下的至少一种miRNA识别并结合、但不切割：

(a)具有序列SEQ ID NO.393、SEQ ID NO.3227或SEQ ID NO. 8742的成熟miRMON18 miRNA或者从选自SEQ ID NO.1763、SEQ ID NO.3936和SEQ ID NO.8800的miRMON18前体序列获得的成 熟miRNA；

(b)具有序列SEQ ID NO.8815、SEQ ID NO.8816、SEQ ID NO. 8817或SEQ IDNO.8818的成熟miR399或者从选自SEQ ID NO. 8819、SEQ ID NO.8820、SEQ ID NO.8821和SEQ ID NO.8822的 miR399前体序列获得的成熟miRNA；和

(c)具有序列SEQ ID NO.8845的成熟miR319。

项目8.一种非天然转基因植物细胞，所述细胞包含项目1-7中 任一项的重组DNA构建体。

项目9.一种非天然转基因植物，所述植物包括由项目8的非天 然转基因植物细胞制备而来的再生植物，或由项目8的非天然转基 因植物细胞制备而来的再生植物的后代植物，其中相对于缺乏所述 重组DNA构建体的植物而言，所述非天然转基因植物具有选自以下 性状的至少一个改变的性状：

(b)提高非生物胁迫耐性；

(c)提高生物胁迫耐性；

(d)提高针对所述植物的有害动物或病原体的抗性；

(e)改变初级代谢产物组成；

(f)改变次级代谢产物组成；

(g)改变微量元素、类胡萝卜素或维生素组成；

(h)提高产量；

(i)提高氮或其它营养物的利用能力；

(j)改变农艺学特性；

(k)改变生长或生殖特性；和

(l)提高收获、贮存或加工品质。

项目10.一种影响基因抑制的方法，所述方法包括：

(a)提供非天然转基因植物，所述植物包括由包含项目2的重组 DNA构建体的非天然转基因植物细胞制备而来的再生植物，或者由 包含项目2的重组DNA构建体的非天然转基因植物细胞制备而来的 再生植物的后代植物；和

(b)在所述非天然转基因植物中转录所述重组DNA构建体；

其中所述转录产生能够在所述非天然转基因植物中抑制所述至 少一个靶基因的RNA，

因此相对于在没有所述重组DNA构建体转录时的表达而言，至 少一个靶基因被抑制。

项目11.项目10的方法，其中所述至少一个靶基因是选自以下 的至少一个基因：对所述非天然转基因植物而言是天然的基因，所 述非天然转基因植物中的转基因，以及对所述非天然转基因植物的 病毒、细菌、真菌或无脊椎动物害虫或病原体而言是天然的基因。

项目12.项目10的方法，其中所述至少一个靶基因是多个靶基 因。

项目13.项目10的方法，其中所述基因抑制包括空间特异性基 因抑制、时间特异性基因抑制、发育特异性基因抑制或诱导型基因 抑制。

项目14.一种同时影响至少一个靶基因的基因抑制和至少一个 目标基因的基因表达的方法，所述方法包括：

(a)提供非天然转基因植物，所述植物包括由包含项目2的重组 DNA构建体的非天然转基因植物细胞制备而来的再生植物，或者由 包含项目2的重组DNA构建体的非天然转基因植物细胞制备而来的 再生植物的后代植物，其中所述重组DNA构建体还包含用于表达所 述至少一个目标基因的基因表达元件；和

(b)在所述非天然转基因植物中转录所述重组DNA构建体，其 中，当所述重组DNA构建体在所述非天然转基因植物中转录时，产 生能够抑制所述至少一个靶基因的转录RNA和编码所述至少一个目 标基因的转录RNA，

因此相对于在没有所述重组DNA构建体转录时的表达而言，所 述至少一个靶基因被抑制，而且所述至少一个目标基因同时表达。

项目15.一种非天然转基因植物，所述植物由包含项目2的重 组DNA构建体的非天然转基因植物细胞制备而来，其中用于调节至 少一个靶基因表达的所述至少一个可转录DNA元件包含转录为具 有选自以下miRMON18前体序列折回结构的miRNA前体的DNA元 件：SEQ ID NO.1763、SEQ ID NO.3936和SEQ ID NO.8800，其 中所述miRNA前体包含所述miRMON18前体序列的至少90％核苷 酸的连续区段并加工为具有序列SEQ ID NO.393、SEQID NO.3227 或SEQ ID NO.8742的成熟miRMON18 miRNA，而且所述至少一个 靶基因是植物内源基因，而且其中所述重组DNA构建体在所述植物 中的表达导致所述至少一个靶基因被抑制，其中所述至少一个靶基 因包含SPX结构域。

项目16.一种非天然转基因植物，所述植物由包含项目2的重 组DNA构建体的非天然转基因植物细胞制备而来，所述重组DNA 构建体还包含转基因转录单元，其中用于调节至少一个靶基因表达 的所述至少一个可转录DNA元件包含位于所述转基因转录单元内 或其附近并转录为包含miRNA识别位点的RNA的DNA元件，所述 miRNA识别位点被具有序列SEQID NO.393、SEQ ID NO.3227或 SEQ ID NO.8742的成熟miRMON18 miRNA识别或者被从选自SEQ ID NO.1763、SEQ ID NO.3936和SEQ ID NO.8800的miRMON18 前体序列获得的成熟miRMON18 miRNA识别，而且所述至少一个靶 基因包含由所述转基因转录单元编码的所述转基因，而且其中所述 重组DNA构建体在植物中的表达导致所述转基因在并非天然表达所述成熟miRMON18 miRNA的所述植物的细胞中表达，其中所述至 少一个靶基因包含SPX结构域。

项目17.一种提供具有至少一个改变的性状的非天然转基因作 物的方法，所述方法包括在所述非天然转基因作物中抑制至少一个 内源miRNA诱骗序列，因而相对于不表达所述重组DNA构建体的 作物而言，导致所述非天然转基因作物表现出选自以下性状的至少一个改变的性状：

(i)提高非生物胁迫耐性；

(ii)提高生物胁迫耐性；

(iii)提高针对所述植物的有害动物或病原体的抗性；

(iv)改变初级代谢产物组成；

(v)改变次级代谢产物组成；

(vi)改变微量元素、类胡萝卜素或维生素组成；

(vii)提高产量；

(viii)提高氮或其它营养物的利用能力；

(ix)改变农艺学特性；

(x)改变生长或生殖特性；和

(xi)提高收获、贮存或加工品质。

项目18.一种在缺氮或缺磷条件下提供产量提高的非天然转基 因作物的方法，所述方法包括在所述非天然转基因作物中表达项目7 的重组DNA构建体。

附图简述

图1描绘了选自以下植物miRNA前体序列的折回结构的非限制 性实例：SEQ IDNO.1036–2690、SEQ ID NO.3922–5497、SEQ ID NO.6684–8408、SEQ ID NO.8561–8741、SEQID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816–8819，更准确地讲，具有SEQ ID NO.1136的miRNA前体序列折回结构，其包含2个短茎环、1个环 和2个凸起(bulge)。miRNA前体通过in planta方式加工为成熟 miRNA(在该特定实例中，加工成具有SEQ ID NO.32的成熟miRNA)。

图2和图3描绘了用于抑制靶基因(例如内源miRNA)表达的 DNA元件的非限制性实例，如实施例3所述。

图4描绘了从不同玉米组织分离的成熟miRNA的RNA印迹结 果，如实施例4所述。

图5描绘了探针组(probeset)序列的转录概况，包括具有对玉米 雄性生殖组织(花粉)具有特异性的表达图式的miRNA前体序列，如 实施例4所述。

图6描绘了用于大豆植物干旱期的从1.0(无影响或对照)至4.0 的相对评分系统，如实施例5所述。

如实施例6所述，图7A描绘了玉米miRMON18前体(SEQ ID NO. 3936)的折回结构，图7B描绘了水稻miRMON18前体(SEQ ID NO. 1763)的折回结构，图7C描绘了拟南芥(Arabidopsis thaliana)miR827 前体(SEQ ID NO.8743)的折回结构。图7D描绘了miR827(SEQ ID NO.8744)和miRMON18(SEQ ID NO.393、SEQ ID NO.3227或SEQ ID NO.8742)的比较，带编号的箭头标明成熟miRNA的位置1、10 和21；位置10的核苷酸还具有下划线。

图8描绘了通过成熟miRMON18 21聚体的RNA印迹测定的 miRMON18的表达图式(图8A)和miRMON18前体的转录概况分析 (transcription profiling)(图8B)，如实施例6所述。

图9描绘了在来自缺水(干旱)(图9A)、低温(图9B)和缺氮条件 (图9C)下生长的植物的玉米组织中玉米miRMON18前体(SEQ ID NO.3936)的表达分析，如实施例6所述。

图10描绘了玉米(Zea mays var.LH244)小RNA的RNA印迹结 果，表明miRMON18在玉米胚乳和籽粒中表达提高，在叶片中由缺 氮诱导的强miRMON18抑制(图10A)，以及在磷充足条件下叶片组 织中的强miRMON18表达和在缺磷条件下miRMON18抑制(图 10B)，如实施例6所述。

图11描绘了含有玉米SPX结构域(如果存在的话，用下划线标 明序列)和玉米MFS结构域(用粗体字标明序列)的新的玉米 miRMON18靶基因的多序列比对，如实施例7所述。

图12描绘了构建用于已鉴定SPX基因的系统树，如实施例7 所述；已经实验证实含有预测miRMON18识别位点(在来自并非拟南 芥的物种的基因中)或预测miR827识别位点(在来自拟南芥的基因中) 的基因用粗体字标明。

图13描绘了miRMON18基因组序列(SEQ ID NO.8800)，如实 施例8所述。它显示了以大写字母表示的在核苷酸2173–2788的 miRMON18转录物、以小写字母表示的在核苷酸211–2172的miRMON18启动子元件、以小写字母表示的在核苷酸2173–2308 的前导元件、以下划线加上小写字母表示的在核苷酸2144–2147的 规范TATA盒(末端是转录起始位点上游的25个核苷酸)、以下划线 加上大写字母表示的在核苷酸2419–2439的成熟miRMON18和以下划线加上大写字母表示的在核苷酸2322–2341的miRMON18*。

图14描绘了水稻序列Os02g45520(SEQ ID NO.8784)和 Os04g48390(SEQ IDNO.8786)以及玉米序列MRT4577_36529C (SEQ ID NO.8788)的miRMON18的预测切割，如实施例9所述。

图15描绘了miRMON18前体(图15A)和miRMON18靶标(图15B) 之间的负相关，如实施例9所述。图15B显示玉米序列 MRT4577_36529C(SEQ ID NO.8788)，表明在缺氮条件下比在氮充 足条件下表达水平更高，即表达图式与miRMON18前体的表达图式 相反，如图15A所示。

图16描绘了载体pMON107261，其包含驱动玉米miRMON18 转录物(例如SEQ IDNO.8800核苷酸2173–2788)表达的CaMV 35S 启动子，如实施例10所述。

图17A描绘了玉米miR399前体的折回结构；图17B描绘了转 录概况分析实验结果，表明Zm-miR399 pri-miRNA在缺氮条件(黑柱) 下受抑制，而在氮充足条件(白柱)下表达，如实施例11所述。

图18描绘了miR399诱骗序列的玉米cDNA序列与共有序列 SEQ ID NO.8834的比对，揭示出至少两组基因含有miR399诱骗序 列，如实施例11所述。

图19描绘了比较玉米miR399诱骗序列和miR399前体表达的 实验结果，如实施例11所述。图19A显示组1miR399诱骗基因 MRT4577_47862C.7(SEQ ID NO.8827)的转录概况，图19B显示组 2miR399诱骗基因MRT4577_36567C.8(SEQ ID NO.8829)的转录概 况，表明这些miR399诱骗序列受到缺氮的下调。这些结果通过测定 成熟miR399表达(图19C)和miR399诱骗序列MRT4577_47862C.7 (SEQ ID NO.8827)表达(图19D)的RNA印迹得以证实。

图20描绘了比较不同温度条件下玉米内源miR399诱骗cDNA 序列和相应玉米miR399前体的表达的转录概况分析实验，如实施例 11所述。在氮充足条件期间，在玉米叶片中，尤其是在白天时，组 2miR399诱骗基因MRT4577_36567C.8(SEQ ID NO.8829)表现出至 少10倍以上的较高表达(图20A)。在根(图20B)和芽(图20C)中，在 延长低温处理后，这同一基因表现出至少2倍下调。

图21描绘了在玉米和大豆的不同组织中内源miR399诱骗 cDNA序列的表达，如实施例11所述。图21A描绘了以下序列的表 达水平：组1玉米miR399诱骗序列SEQ ID NO.8827(MRT4577_47862C,代表为探针A1ZM005814_at和 A1ZM005813_s_at)，和组2玉米miR399诱骗序列SEQ ID NO.8829 (MRT4577_36567C,代表为探针A1ZM048024_at)、以及玉米 pri-miR399序列SEQ ID NO.8818(MRT4577_22487C.6代表为探针 A1ZM033468_at)。图21B描绘了以下序列的表达水平：大豆miR399 诱骗序列SEQ ID NO.8842(MRT3847_217257C.2,代表为探针 A1GM031412_at)、SEQ ID NO.8844(MRT3847_236871C.2,代表为 探针A1GM053788_at)、SEQ ID NO.8836(MRT3847_238967C.1,代 表为探针A1GM035741_at)和SEQ IDNO.8838 (MRT3847_241832C.1,代表为探针A1GM069937_at)。

图22A描绘了大豆内源miR319诱骗SEQ ID NO.8847 (MRT3847_41831C.6,代表为探针A1GM001017_at)在不同大豆组 织中的转录概况分析数据；图22B描绘了玉米内源miR319诱骗SEQ ID NO.8849(MRT4577_577703C.1,代表为探针A1ZM012886_s_at) 在不同玉米组织中的转录概况分析数据，如实施例11所述。

发明详述

除非另有说明，否则所用的所有科技术语都具有本发明所属领 域普通技术人员公知的含义。通常，所用的命名法和下述制造或实 验室步骤都是本领域众所周知的和常用的。常规方法用于这些步骤， 例如本领域和各种通用参考文献所提供的那些。除非另有说明，否 则就本说明书而言的核酸序列是给定的，当从左到右阅读时，按 5’→3’的方向。按照说明，核酸序列可以DNA或RNA形式提供；一 个公开必定限定另一个，这是本领域普通技术人员已知的。当给出 的术语为单数时，本发明人也以该术语的复数形式来考虑本发明所述方面。所用的命名法和下述实验室步骤是本领域众所周知的和常 用的。当通过引用结合到本文中的参考文献中所用的术语和定义有 出入时，本申请所用的术语应当具有所给出的定义。所用的其它技 术术语具有所属领域公知的含义，如各种技术词典所示例。本发明人并不受限于作用机制或作用方式。其中所提供的参考文献仅用于 说明性目的。

重组DNA构建体

本发明提供重组DNA构建体，其包含用于调节至少一个靶基因 表达的至少一个可转录DNA元件，其中至少一个可转录DNA元件 选自：(a)可转录为具有选自以下植物miRNA前体序列折回结构的 miRNA前体的DNA元件：SEQ ID NO.1036–2690、SEQ ID NO. 3922–5497、SEQ ID NO.6684–8408、SEQ ID NO.8561–8741、 SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQID NO.8816–8819， 其中miRNA前体包含玉米、水稻或大豆的miRNA前体序列的至少 90％核苷酸的连续区段；(b)可转录为从选自以下植物miRNA前体序 列折回结构获得的工程miRNA前体的DNA元件：SEQ ID NO.1036 –2690、SEQ ID NO.3922–5497、SEQ ID NO.6684–8408、SEQ ID NO.8561–8741、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816–8819，其中工程miRNA前体包含修饰的成熟miRNA；(c) 位于转基因转录单元内或其附近并可转录为包含miRNA识别位点 的RNA的DNA元件，所述miRNA识别位点可被选自以下的成熟 miRNA识别：SEQ ID NO.1–1035、SEQ ID NO.2730–3921、SEQ ID NO.5498–6683、SEQ ID NO.8409–8560、SEQ ID NO 8742、SEQ ID NO.8744、SEQ ID NO.8812–8815、SEQ ID NO.8845和 SEQ IDNO.8850，或者可被从选自以下植物miRNA前体序列获得 的成熟miRNA识别：SEQ IDNO.1036–2690、SEQ ID NO.3922– 5497、SEQ ID NO.6684–8408、SEQ ID NO.8561–8741、SEQID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816–8819；和(d)用于 抑制从选自以下植物miRNA前体序列获得的内源miRNA表达的 DNA元件：SEQ ID NO.1036–2690、SEQ IDNO.3922–5497、SEQ ID NO.6684–8408、SEQ ID NO.8561–8741、SEQ ID NO.8743、 SEQ IDNO.8800和SEQ ID NO.8816–8819。在标题“靶基因”下 描述了其表达可使用本发明重组DNA构建体来调节的靶基因。至少 一个可转录DNA元件的实施方案和用途描述如下。

(A)天然miRNA在非天然条件下的表达。

在重组DNA构建体的一个实施方案中，用于调节至少一个靶基 因表达的至少一个可转录DNA元件包含可转录为具有选自以下植 物miRNA前体序列折回结构的miRNA前体的DNA元件：SEQ ID NO.1036–2690、SEQ ID NO.3922–5497、SEQ ID NO.6684– 8408、SEQ IDNO.8561–8741、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800 和SEQ ID NO.8816–8819，其中miRNA前体包含玉米、水稻或大 豆的miRNA前体序列的至少90％核苷酸的连续区段。在优选的实施方案中，至少一个靶基因是植物内源基因，重组DNA构建体在植物 中的表达导致对至少一个靶基因的抑制。至于“miRNA前体”是指 比自miRNA前体加工而来的成熟miRNA大的转录RNA，其通常预 测可形成含有非完美互补双链RNA区的折回结构。参见Bartel(2004) Cell,116:281-297；Kim(2005)Nature Rev.Mol.Cell Biol.,6:376-385； Jones-Rhoades等(2006)Annu.Rev.Plant Biol.,57:19-53；Ambros等 (2003)RNA,9:277-279。微RNA前体的实例包括但不限于初级 miRNA转录物(pri-miRNA)以及天然来自pri-miRNA的pre-miRNA；miRNA前体也包含非天然RNA序列，预测其可形成含有非完美互 补双链RNA区的折回结构并一般通过一个或多个切割步骤在体内加 工为成熟miRNA。至于“miRNA前体序列”是指这样的RNA序列： 其至少包含miRNA前体核苷酸，但也可包含额外核苷酸(致使 miRNA前体包含玉米、水稻或大豆的miRNA前体序列至少90％核 苷酸的连续区段)。各miRNA前体自身形成折回结构，其与由至少 部分相应miRNA前体序列所形成的折回结构相同或几乎相同。

在这些实施方案中，miRNA前体不必包含选自以下植物miRNA 前体序列中所含有的所有核苷酸：SEQ ID NO.1036–2690、SEQ ID NO.3922–5497、SEQ ID NO.6684–8408、SEQID NO.8561– 8741、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816– 8819，但优选包含选自以下植物miRNA前体序列的至少80％、或至 少85％、或至少90％、或至少95％、或至少97％、或至少98％、或 至少99％核苷酸的连续区段：SEQ ID NO.1036–2690、SEQ ID NO.3922–5497、SEQ ID NO.6684–8408、SEQ ID NO.8561–8741、 SEQ ID NO.8743、SEQ IDNO.8800和SEQ ID NO.8816–8819。

在优选的实施方案中，至少一个靶基因是植物内源基因，因此 重组DNA构建体在植物中的表达导致对至少一个靶基因的抑制。重 组DNA构建体在转基因植物细胞中的转录可调节含有与miRNA前 体所编码的成熟miRNA基本互补并被其识别的序列(“miRNA识别 位点”)的任何基因(内源基因或转基因)的表达。通常，重组DNA构 建体的转录导致对含有被miRNA前体所编码的成熟miRNA识别的 miRNA识别位点的内源基因的抑制。在优选的实施方案中，重组 DNA构建体还包含并非miRNA序列天然启动子的启动子。这允许 成熟miRNA在并不能天然表达的空间或时间或诱导条件下得以表 达。例如，可将重组DNA构建体设计成包含组成型启动子，因而能 组成型地表达仅在黑暗条件下才能天然表达的成熟miRNA(即当以 处于天然启动子控制之下的内源miRNA前体的形式表达时)。在标 题“启动子”下描述了可与该重组DNA构建体一起使用的启动子。

在一个非限制性实例中，重组DNA构建体包含用于调节至少一 个靶基因表达的可转录DNA元件，其中至少一个可转录DNA元件 包含可转录为miRNA前体的DNA元件，所述miRNA前体是由具有 SEQ ID NO.1136的玉米miRNA前体序列的约90％核苷酸组成的连 续区段，并且预测其具有的折回结构与具有SEQ ID NO.1136的 miRNA前体序列的折回结构基本相同(即在相同或大致相同的位置 上具有双链RNA茎和单链环或凸起的区域)。具有SEQID NO.1136 的miRNA前体序列的折回结构包含约118个核苷酸，其在折回结构 的闭合端的环上伸出两个短茎环，并在折回结构的主要双链“茎” 内具有两个小凸起(图1)。通过inplanta方式自miRNA前体(其是包 含具有SEQ ID NO.1136的玉米miRNA前体序列的约90％核苷酸的 连续区段)加工而来的成熟miRNA，优选与由具有SEQ ID NO.1136 的miRNA前体序列的折回结构(即具有SEQ ID NO.32的成熟 miRNA)所编码的相同。该重组DNA构建体的转录优选导致对含有 被具有SEQ ID NO.32的成熟miRNA识别的miRNA识别位点的至 少一个内源基因的抑制。尽管具有SEQ ID NO.1136的玉米miRNA 前体序列在玉米籽粒组织、而不是在叶片中天然表达(参见表2)，但 是重组DNA构建体还可包含并非具有SEQ IDNO.1136的miRNA 前体序列的天然启动子的启动子，例如组成型启动子，以允许具有 SEQID NO.32的成熟miRNA能在除籽粒组织之外的组织中转录。

(B)成熟的工程miRNA的表达。

在重组DNA构建体的另一个实施方案中，用于调节至少一个靶 基因表达的至少一个可转录DNA元件包含可转录为从选自以下植 物miRNA前体序列折回结构获得的工程miRNA前体的DNA元件： SEQ ID NO.1036–2690、SEQ ID NO.3922–5497、SEQ ID NO. 6684–8408、SEQ ID NO.8561–8741、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816–8819，其中工程miRNA前体包含修 饰的成熟miRNA。在优选的实施方案中，至少一个靶基因是植物内 源基因或者所述植物的有害动物或病原体的内源基因，重组DNA构 建体在植物中的表达导致对至少一个靶基因的抑制。至于“工程” 是指例如选自以下植物miRNA前体序列的天然miRNA前体序列中 的核苷酸被改变(替换、缺失或添加)：SEQ ID NO.1036–2690、SEQ IDNO.3922–5497、SEQ ID NO.6684–8408、SEQ ID NO.8561– 8741、SEQ ID NO.8743、SEQ IDNO.8800和SEQ ID NO.8816– 8819，因而产生具有与天然miRNA前体序列折回结构基本相同的折 回结构的工程miRNA前体，但其中由工程miRNA前体加工而来的 成熟miRNA具有修饰序列(即不同于天然成熟miRNA的序列)，所 述修饰序列经设计用于抑制靶基因，该靶基因不同于被天然miRNA 前体序列天然抑制的靶基因。

用于测定天然miRNA前体序列中核苷酸改变以产生工程 miRNA前体、用于制备本发明重组DNA构建体的一个通用的非限 制性方法包括下列步骤：

(a)选择对靶基因具有特异性的至少18个核苷酸的例如玉米 cDNA数据库和基因组DNA数据库的独特靶序列，例如通过使用序 列比对工具例如BLAST(参见例如Altschul等(1990)J.Mol.Biol., 215:403-410；Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.,25:3389-3402)，以 鉴定靶转录直向同源物和对无关基因的任何潜在匹配，因而避免非 靶序列的无意沉默。

(b)分析靶基因中不需要的序列(例如与来自非目标物种(尤其是 动物)的序列匹配)，并评价每个潜在19聚体区段的GC含量、Reynolds 评分(参见Reynolds等(2004)NatureBiotechnol.,22:326-330)和特征 是自由能为负差异(“ΔΔG”)的功能不对称(参见Khvorova等(2003) Cell,115:209-216)。优选选择具有以下所有或大部分特征的19聚体：(1)Reynolds评分>4，(2)GC含量介于约40％至约60％，(3)负ΔΔG， (4)末端腺苷，(5)缺乏连续4轮以上的同一核苷酸；(6)位置靠近靶基 因的3’端；(7)与miRNA前体转录物的差异最小。优选选择多个(3 个或更多)19聚体用于试验。

(c)测定所选19聚体的反向互补，用于制备修饰的成熟miRNA； 优选位置20的额外核苷酸与所选靶序列匹配，优选选择位置21的 核苷酸不配对，以防靶转录物上扩散沉默。

(d)测定工程miRNA前体，例如，在土壤杆菌(Agrobacterium) 介导的瞬时烟草(Nicotiana benthamiana)测定，用于修饰的成熟 miRNA表达和靶抑制。和

(e)将最有效的工程miRNA前体克隆到构建体中，用于玉米的 稳定转化(参见标题“制备和使用重组DNA构建体”和“制备和使 用非天然转基因植物细胞和非天然转基因植物”下的部分)。

(C)转基因的表达与miRNA识别位点

在重组DNA构建体的另一个实施方案中，重组DNA构建体还 包含转基因转录单元，其中用于调节至少一个靶基因表达的至少一 个可转录DNA元件包含位于转基因转录单元内或其附近并可转录 为包含miRNA识别位点的RNA的DNA元件，所述miRNA识别位 点可被从选自以下植物miRNA前体序列获得的成熟miRNA识别： SEQ ID NO.1036–2690、SEQ IDNO.3922–5497、SEQ ID NO. 6684–8408、SEQ ID NO.8561–8741、SEQ ID NO.8743、SEQ IDNO.8800和SEQ ID NO.8816–8819，并且至少一个靶基因包含转 基因转录单元所编码的转基因，而且其中重组DNA构建体在植物中 的表达导致转基因在成熟miRNA并不能天然表达的植物细胞中得 以表达。miRNA识别位点的优选实施方案是预测可被选自以下成熟 miRNA中的至少一个成熟miRNA识别的那些：SEQ ID NO.1– 1035、SEQ ID NO.2730–3921、SEQ IDNO.5498–6683、SEQ ID NO.8409–8560、SEQ ID NO 8742、SEQ ID NO.8744、SEQ ID NO.8812–8815、SEQ ID NO.8845和SEQ ID NO.8850，或者被从选自 以下植物miRNA前体序列获得的至少一个成熟miRNA识别的那些： SEQ ID NO.1036–2690、SEQ ID NO.3922–5497、SEQID NO. 6684–8408、SEQ ID NO.8561–8741、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ IDNO.8816–8819。使用以下文献所述的序列互 补法则等本领域已知方法，可完成对识别位点的预测：Zhang(2005) Nucleic Acids Res.,33:W701-704和Rhoades等(2002)Cell, 110:513-520。

对miRNA识别位点的预测允许鉴定和证实受到来自天然表达 miRNA前体的miRNA调节的内源基因；这可用于例如消除或修饰 内源基因内的miRNA识别位点，以便使该基因的表达从由天然调节 基因表达的内源miRNA的调节中解脱出来。例如，可以增加涉及位 置2至13的碱基(在具有连续21个核苷酸的miRNA识别位点中)的 错配数，以防被miRNA识别并切割。

这些重组DNA构建体尤其可用于转基因在特定的空间、时间或 诱导模式下的inplanta表达，而无需具有该特定表达图式的启动子。 这些重组DNA构建体允许例如由组成型启动子或表达超出所需细 胞或组织类型的启动子转录的基因的限制性表达。限制性表达可以 是在空间或时间上受限制，例如局限在特定组织或细胞类型或形式， 或局限在特定发育期、生殖期、生长期或季节期。当在特定条件下(例 如在拥挤、异株克生作用(allelopathic interaction)或有害动物或病原 体侵染等生物胁迫下，或者在冷或热胁迫、干旱胁迫、营养胁迫、 重金属或盐胁迫等非生物胁迫下)表达miRNA时，相应miRNA识别位点可用于条件特异性抑制，即在特定条件下抑制转基因。在一个 非限制性实例中，本发明重组DNA构建体可用于在非水胁迫条件下 在植物中表达转基因，其中本发明重组DNA构建体编码：(a)转基因， 其处于组成型启动子控制之下，和(b)miRNA识别位点，其由仅在水胁迫条件下才特异性表达的成熟miRNA识别。在另一个非限制性实 例中，本发明重组DNA构建体可用于在植物受到有害动物伤害的条 件下在植物根部限制性表达杀虫蛋白，其中本发明重组DNA构建体 编码：(a)表达杀虫蛋白的转基因，其处于由创伤特异性诱导的启动子的控制之下，和(b)miRNA识别位点，其被在非根组织中表达的成 熟miRNA识别。

转基因转录单元包含至少一个转基因和任选额外序列，例如但 不限于启动子、启动子增强子、终止子、信使RNA稳定或去稳定序 列(参见例如Newman等(1993)Plant Cell,5:701-714；Green(1993) Plant Physiol.,102:1065-1070；和Ohme-Takagi等(1993)Proc.Natl. Acad.Sci.USA,90:11811-11815)、用于将转基因转录物定位或转运至 特定场所(例如线粒体、质体、核仁、过氧化物酶体、内质网等)的序 列、或转基因所需加工相关的其它序列。转基因转录单元所编码的 转基因可包含任何一个或多个目标基因，包括编码序列、非编码序 列或这两者。目标基因可包含“靶基因”下所列出的任何基因，其 优选的实例包括转录因子编码基因和酶编码基因的可翻译(编码)序 列，所述酶参与目标分子(例如但不限于氨基酸、脂肪酸和其它脂质、 糖类和其它碳水化合物、生物聚合物和次级代谢物(包括生物碱类、 萜类、聚酮类、非核糖体肽和混合生物合成来源的次级代谢物))的生 物合成或分解代谢。

(D)对内源或天然miRNA的抑制。

在重组DNA构建体的又一个实施方案中，用于调节至少一个靶 基因表达的至少一个可转录DNA元件包含用于对从选自以下植物 miRNA前体序列获得的内源miRNA表达进行抑制的DNA元件： SEQ ID NO.1036–2690、SEQ ID NO.3922–5497、SEQ ID NO. 6684–8408、SEQ ID NO.8561–8741、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816–8819。在优选的实施方案中，至少 一个靶基因是植物内源基因，而且该内源基因的表达在发生内源miRNA天然表达的植物细胞中被抑制，因此重组DNA构建体在细 胞中的表达导致内源基因在细胞中的表达。

用于抑制表达的DNA元件包含以下至少一个：

(a)包含至少一个反义DNA区段的DNA，该反义DNA区段对 靶基因的至少一个区段而言是反义的；

(b)包含多拷贝的至少一个反义DNA区段的DNA，该反义DNA 区段对靶基因的至少一个区段而言是反义的；

(c)包含至少一个有义DNA区段的DNA，该有义DNA区段是 靶基因的至少一个区段；

(d)包含多拷贝的至少一个有义DNA区段的DNA，该有义DNA 区段是靶基因的至少一个区段；

(e)可转录为RNA并通过形成双链RNA而抑制靶基因的DNA， 并且该DNA包含至少一个反义DNA区段和至少一个有义DNA区 段，该反义DNA区段对靶基因的至少一个区段而言是反义的，而该 有义DNA区段是靶基因的至少一个区段；

(f)可转录为RNA并通过形成一个双链RNA而抑制靶基因的 DNA，并且该DNA包含多个连续反义DNA区段和多个连续有义 DNA区段，这些反义DNA区段对靶基因的至少一个区段而言是反 义的，而这些有义DNA区段是靶基因的至少一个区段；

(g)可转录为RNA并通过形成多个双链RNA而抑制靶基因的 DNA，并且该DNA包含多个反义DNA区段和多个有义DNA区段， 这些反义DNA区段对靶基因的至少一个区段而言是反义的，而这些 有义DNA区段是靶基因的至少一个区段，并且其中多个反义DNA 区段和多个有义DNA区段以一系列反向重复序列方式排列；

(h)包含从植物miRNA获得的核苷酸的DNA；

(i)包含siRNA的核苷酸的DNA；

(j)可转录为能结合配体的RNA适配子(aptamer)的DNA；和

(k)可转录为能结合配体的RNA适配子的DNA，和可转录为能 调节靶基因表达的调节RNA的DNA，其中调节依赖于调节RNA的 构象，而调节RNA的构象受到RNA适配子结合状态的变构影响。

用于抑制表达的DNA元件在实施例3中进一步描述并如图2和 图3所示。

在某些实施方案中，重组DNA构建体包含这样的DNA：其设 计成可转录为单链RNA或至少部分双链RNA(例如以“相吻茎环 (kissing stem-loop)”排列)、或可转录为假定二级结构或三维构型(例 如靶基因或适配子的反义序列的大环)的RNA，该RNA赋予转录物 额外的所需特性，例如稳定性提高、体内半衰期延长或者细胞特异 性或组织特异性提高。在一个实例中，间隔区可转录为能连接连续 RNA区段第一系列和第二系列的稳定环(参见例如Di Giusto和King (2004)J.Biol.Chem.,279:46483-46489)。在另一个实例中，重组DNA构建体包含可转录为包含RNA适配子(例如可结合细胞特异性配体 的适配子)在内的RNA的DNA，允许针对重组RNA双链体的细胞特 异性或组织特异性寻靶(targetting)。

通过常用技术制备重组DNA构建体，例如在标题“制备和使用 重组DNA构建体”下描述的那些并示例于工作实施例。重组DNA 构建体尤其可用于制备非天然转基因植物细胞、非天然转基因植物 和转基因种子，如以下“转基因植物细胞和转基因植物”中所讨论。

通过以下“微RNA诱骗序列”中详述的替代方法可控制miRNA 对其靶基因的作用。

本发明的重组DNA构建体可设计为抑制任何靶基因。靶基因可 以是可翻译(编码)序列，或者可以是非编码序列(例如非编码的调节 序列)或者这两者，并且可包含至少一个选自以下的基因：真核靶基 因、非真核靶基因、微RNA前体DNA序列和微RNA启动子。靶基 因对于其中重组DNA构建体可转录的细胞(例如植物细胞或动物细 胞)而言可以是天然(内源)的，或者对于其中重组DNA构建体可转录 的动植物的有害动物或病原体而言可以是天然的。靶基因可以是外 源基因，例如植物中的转基因。靶基因可以是抑制所靶向的天然基因，有或没有同时表达外源转基因，例如通过在重组DNA构建体或 在分离的重组DNA构建体中包含基因表达元件。例如，最好用外源 转基因同源物取代天然基因。

靶基因可包含单个基因或单个基因的一部分(其可靶向抑制)、或 者可包含例如靶基因的多个连续区段、靶基因的多个非连续区段、 靶基因的多个等位基因或者来自一种或多种物种的多个靶基因。靶 基因可包含来自任何物种(包括但不限于细菌和病毒等非真核生物； 真菌；植物，包括单子叶植物和双子叶植物，例如作物、观赏植物 和非驯化植物即野生植物；无脊椎动物，例如节肢动物、环节动物、 线虫和软体动物；和脊椎动物，例如两栖类、鱼类、鸟类、驯化或 野生哺乳动物，甚至人)的任何序列。

在一个实施方案中，靶基因对于其中重组DNA构建体可转录的 植物而言是外源的，但对于植物的有害动物或病原体(例如病毒、细 菌、真菌、卵菌和无脊椎动物，其中无脊椎动物例如昆虫、线虫和 软体动物)而言是内源的。靶基因可包含多个靶基因、或者一个或多 个基因的多个区段。在一个优选的实施方案中，靶基因是植物的无 脊椎动物害虫或病原体基因。这些实施方案尤其可用于提供对一种 或多种植物有害动物或病原体具有抗性的非天然转基因植物，例如， 对线虫(例如大豆胞囊线虫或根结线虫)的抗性或对害虫的抗性。

靶基因可以是可翻译(编码)序列，或者可以是非编码序列(例如 非编码的调节序列)或者这两种。靶基因的非限制性实例包括非翻译 (非编码)序列，例如但不限于5’非翻译区、启动子、增强子、或其它 非编码转录区、3’非翻译区、终止子和内含子。靶基因包括编码以下 RNA的基因：微RNA、小干扰RNA、核糖体或核酶的RNA成分、 核仁小RNA和其它非编码RNA(参见例如在rfam.wustl.edu上为公 众提供的非编码RNA序列；Erdmann等(2001)Nucleic Acids Res., 29:189-193；Gottesman(2005)Trends Genet.,21:399-404；Griffiths-Jones等(2005)Nucleic Acids Res.,33:121-124)。靶基因的一 个具体实例包含微RNA识别位点(也就是说，在RNA链上的位点， 该位点可结合成熟miRNA并诱导切割)。靶基因的另一个具体实例 包含对非天然转基因植物的有害动物或病原体而言是天然的微RNA 前体序列，也就是说，编码微RNA的初级转录物、或由该初级转录 物加工而来的RNA中间产物(例如核局限的pri-miRNA或 pre-miRNA，其可从核输出至细胞质)。参见例如Lee等(2002)EMBO Journal,21:4663-4670；Reinhart等(2002)Genes&Dev., 16:161611626；Lund等(2004)Science,303:95-98；和Millar和 Waterhouse(2005)Funct.Integr.Genomics,5:129-135。靶基因也可包 含转录因子编码基因和酶编码基因的可翻译(编码)序列，所述酶参与 目标分子(例如但不限于氨基酸、脂肪酸和其它脂质、糖类和其它碳 水化合物、生物聚合物和次级代谢物(包括生物碱类、萜类、聚酮类、 非核糖体肽和混合生物合成来源的次级代谢物)的生物合成或分解代 谢。

在多个优选的实施方案中，靶基因是植物有害动物或病原体的 必需基因。必需基因包括有害动物或病原体发育为能育的生殖成体 所需要的基因。必需基因包含当沉默或受到抑制时能导致生物体(作 为成体或处于任何发育期，包括配子)死亡或者导致生物体无法成功 繁殖(例如雄性或雌性亲本不育或者合子、胚胎或幼虫致死)的基因。 有关线虫必需基因的描述可参见例如Kemphues,K.“Essential Genes (必需基因)”(2005年12月24日),WormBook主编，The C.elegans Research Community,WormBook,doi/10.1895/wormbook.1.57.1,可得 自以下网址：www.wormbook.org。线虫必需基因的非限制性实例包括精子主要蛋白、RNA聚合酶II和几丁质合酶(参见例如美国专利申 请公布说明书US20040098761 A1)；额外的大豆胞囊线虫必需基因在 以下文献中提供：美国专利申请11/360,355(2006年2月23日申请)， 通过引用结合到本文中。有关昆虫基因的描述公众可从以下数据库 中得到：果蝇基因组数据库(Drosophila genome database，可得自以 下网址：flybase.bio.indiana.edu/)。已经通过基于细胞培养的RNA干 扰筛选，分析了大部分预测果蝇基因的功能，结果鉴定出438个必 需基因；参见Boutros等(2004)Science,303:832-835，支持性材料可 得自以下网址： www.sciencemag.org/cgi/content/full/303/5659/832/DC1。有关细菌和 真菌必需基因的描述可得自必需基因数据库(Database ofEssential Genes，简称“DEG”，可得自以下网址：tubic.tju.edu.cn/deg/)；参 见Zhang等(2004)Nucleic Acids Res.,32:D271-D272。

植物有害无脊椎动物包括但不限于有害线虫、有害软体动物(鼻 涕虫和蜗牛)。目标植物病原体包括真菌、卵菌、细菌(例如引起叶斑 病、枯萎病、冠瘿病和细菌性萎蔫病的细菌)、柔膜细菌和病毒(例如 引起花叶病、脉结病、斑驳(flecking)、斑点(spotting)或异常生长的 病毒)。另见G.N.Agrios,“Plant Pathology”(第4版),Academic Press, SanDiego,1997,第635页,对真菌、细菌、柔膜细菌(包括支原体和 螺原体)、病毒、线虫、寄生性高等植物和有鞭毛的原生动物的有关 描述，所有这些都是目标植物有害动物或病原体。另见由美国植物 病理学会植物病害通用名称标准化委员会(Committee onStandardization of Common Names for Plant Diseases of The AmericanPhytopathological Society)编写的以下文献中不断更新的植物害虫和 病原体和病害名录：American Phytopathological Society“Common Names of Plant Diseases”，Committee on Standardization of Common Names for Plant Diseases of TheAmerican Phytopathological Society编, 1978-2005，可得自以下网址：www.apsnet.org/online/common/top.asp。

特别有兴趣的真菌性植物病原体的非限制性实例包括例如引起 以下病害的真菌：白粉病、锈病、叶斑病和叶枯病、猝倒病、根腐 病、颈腐病、棉铃腐病、茎溃疡病、树枝溃疡病(twig canker)、维管 萎蔫病(Vascular wilt)、黑穗病或霉病，包括但不限于镰孢(Fusarium spp.)、层锈菌(Phakospora spp.)、丝核菌(Rhizoctonia spp.)、曲霉(Aspergillus spp.)、赤霉(Gibberella spp.)、梨孢(Pyricularia spp.)和链 格孢(Alternaria spp.)。真菌性植物病原体的具体实例包括豆薯层锈菌 (Phakosporapachirhizi)(亚洲大豆锈病)、高粱柄锈菌(Puccinia sorghi) (玉米普通锈病)、多堆柄锈菌(Puccinia polysora)(玉米南方锈病)、尖 镰孢(Fusarium oxysporum)和其它镰孢(Fusarium spp.)、链格孢 (Alternaria spp.)、青霉(Penicillium spp.)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、大斑病突脐蠕孢菌(Exserohilum turcicum)(玉米大斑病)、玉 蜀黍双极蠕孢(Bipolaris maydis(玉米小斑病)、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)(玉米黑粉病)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)(玉米赤霉(Gibberella zeae))、轮状镰孢(Fusarium verticilliodes)(串珠状赤霉 (Gibberella moniliformis))、增生镰孢(F.proliferatum)(藤仓赤霉中间 变种(G.fujikuroi var.intermedia))、半粘镰孢(F.subglutinans)(半粘赤 霉(G.subglutinans))、玉米色二孢(Diplodia maydis)、丝轴团散黑粉菌 (Sporisorium holci-sorghi)、禾生刺盘孢(Colletotrichum graminicola)、大斑病毛球腔菌(Setosphaeria turcica)、玉蜀黍出芽短梗霉 (Aureobasidium zeae)、油菜核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)以及美国 专利6,194,636的表4和表5中提供的各种真菌种类，所述文献通过 引用全部结合到本文中。植物病原体的非限制性实例包括起先归类 为真菌、但最近归类为卵菌的病原体。特别有兴趣的卵菌性植物病 原体的具体实例包括腐霉属(Pythium)(例如瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum))和疫霉属(Phytophthora)(例如致病疫霉 (Phytophthora infestans)、大豆疫霉(Phytophthorasojae))的成员和引 起霜霉病的生物体(例如粉霜霉(Peronospora farinosa))。

细菌性病原体的非限制性实例包括引起黄化病的支原体和螺原 体(例如引起玉米矮缩病的孔氏螺原体(Spiroplasma kunkelii))、真细 菌例如燕麦假单胞菌(Pseudomonas avenae)、须芒草假单胞菌 (Pseudomonas andropogonis)、斯氏欧文氏菌(Erwinia stewartii)、丁香 假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonas syringaepv.syringae)、苛养木 杆菌(Xylella fastidiosa)以及美国专利6,194,636的表3中所列举的各 种细菌种类，所述专利文献通过引用全部结合到本文中。

特别有兴趣的病毒性植物病原体的非限制性实例包括玉米矮缩 花叶病毒(MDMV)、甘蔗花叶病毒(SCMV，以前称为MDMV B株)、 小麦条纹花叶病毒(WSMV)、玉米褪绿矮缩病毒(MCDV)、大麦黄矮 病毒(BYDV)、香蕉簇顶病毒(BBTV)以及美国专利6,194,636的表2中所列举的各种病毒，所述专利文献通过引用全部结合到本文中。

无脊椎动物害虫的非限制性实例包括胞囊线虫(Heterodera spp.) 尤其是大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)、根结线虫(Meloidogyne spp.)、纽带线虫(Hoplolaimusspp.)、矮化线虫(Tylenchorhynchus spp.)、 螺旋线虫(Helicotylenchus spp.)、根腐线虫(短体线虫(Pratylenchus spp.))、环线虫(Criconema spp.)、真滑刃线虫(Aphelenchusspp.)或滑 刃线虫(Aphelenchoides spp.)、玉米根虫、盲蝽(Lygus spp.)、蚜虫和 类似吸食树汁的昆虫例如根瘤蚜(葡萄根瘤蚜(Daktulosphaira vitifoliae))、玉米螟、切根虫、粘虫、叶蝉、日本金龟子、草蜢(蝗虫) 和其它有害鞘翅目、双翅目和鳞翅目。无脊椎动物害虫的具体实例 包括能够侵染作物根系的害虫，例如北方玉米根虫(Diabrotica barberi)、南方玉米根虫(Diabrotica undecimpunctata)、西方玉米根虫 (Diabrotica virgifera)、玉米根蚜(Anuraphis maidiradicis)、黑色切根 虫(球菜夜蛾(Agrotis ipsilon))、透翅缓夜蛾(Crymodes devastator)、暗 黑切根虫(Feltia ducens)、泥背切根虫(Agrotisgladiaria)、金针虫 (Melanotus spp.,Aeolus mellillus)、小麦金针虫(Aeolusmancus)、砂地 金针虫(Horistonotus uhlerii)、玉米象甲(Sphenophorus maidis)、梯牧草象甲(Sphenophorus zeae)、早熟禾象甲(Sphenophorus parvulus)、南 方玉米象甲(Sphenophorus callosus)、蛴螬(金龟子(Phyllophaga spp.))、玉米种蝇(灰地种蝇(Delia platura))、葡萄肖叶甲(Colaspis brunnea)、玉米籽步甲(Stenolophuslecontei)和玉米籽细步甲(Clivinia impressifrons)，以及美国专利6,194,636的表6中所列举的寄生性线 虫，所述专利文献通过引用全部结合到本文中。

特别有兴趣的无脊椎动物害虫，尤其是但不限于南半球地区(包 括美洲中南部地区)包括蚜虫、玉米根虫、贪夜蛾、夜蛾(noctuideae)、 马铃薯瓢虫、草盲蝽(Lygus spp.)、任何半翅目、同翅目或异翅目、 任何鳞翅目、任何鞘翅目、线虫、切根虫、谷实夜蛾(earworms)、粘 虫、螟虫、卷叶螟等。本发明具体涵盖的节肢动物害虫包括各种切 根虫，包括切根虫(Agrotis repleta)、黑色切根虫(球菜夜蛾(Agrotis ipsilon))、切根虫(Aniclaignicans)、粒化切根虫(Feltia subterranea)、 “gusanoáspero”(Agrotis malefida)；地中海粉螟(Anagasta kuehniella)、方颈扁甲(Cathartus quadricollis)、跳甲(Chaetocnema spp)、米蛾(Corcyra cephalonica)、玉米根虫或“vaquita de SanAntonio”(Diabotica speciosa)、甘蔗螟(Diatraea saccharalis)、南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus)、褐臭蝽(Euschistus spp.)、谷实夜蛾 (Helicoverpazea)、扁平谷盗(Laemophloeus minutus)、稻毛胫夜蛾 (Mocis latipes)、锯谷盗(Oryzaephilus surinamensis)、紫斑谷螟(Pyralis farinalis)、印度谷螟(Plodiainterpunctella)、玉米叶蚜(Rhopalosiphum maidis)、福土蝽(brown burrowing bug)或“chinche subterránea” (Scaptocoris castanea)、麦二岔蚜(Schizaphis graminum)、米象 (Sitophilus zeamais)、麦蛾(Sitotroga cerealella)、草地粘虫(Spodopterafrugiperda)、大谷盗(Tenebroides mauritanicus)、二斑叶螨(Tetranychus urticae)、赤拟谷盗(Triboleum castaneum)、棉叶波纹夜蛾(Alabama argillacea)、棉铃象甲(Anthonomus grandis)、棉蚜(Aphis gossypii)、 甘薯粉虱(Bemisia tabaci)、各种蓟马(Frankliniella spp.)、棉铃虫(谷 实夜蛾(Helicoverpa zea))、“oruga bolillera”(例如Helicoverpa geletopoeon)、烟夜蛾(Heliothis virescens)、稻绿蝽(Nezaraviridula)、 棉红铃虫(Pectinophora gossypiella)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、 叶螨(Tetranychus spp.)、葱蓟马(Thrips tabaci)、温室白粉虱 (Trialeurodesvaporarium)、大豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)、斑点玉 米叶甲(spotted maizebeetle)或“astilo moteado”(Astylus atromaculatus)、“oruga de la alfalfa”(Coliaslesbia)、“chinche marrón”或“chinche de los cuernos”(Dichelops furcatus)、“alquiche chico”(Edessa miditabunda)、blister beetles(Epicauta spp.)、“barrenador del brote”(Epinotia aporema)、“oruga verde del yuyo colorado”(Loxostege bifidalis)、根结线虫、“oruga cuarteadora” (Mocis repanda)、南方绿盲蝽(Nezara viridula)、“chinche de la alfalfa” (Piezodorus guildinii)、苜蓿绿夜蛾(Plathypena scabra)、大豆尺夜蛾 (Pseudoplusia includens)、尺夜蛾“isoca medidoradel girasol” (Rachiplusia nu)、黄毛灯蛾(Spilosoma virginica)、黄条粘虫(Spodoptera ornithogalli)、各种象虫(象虫科(Curculionidae))、各种金 针虫(叩甲科(Elateridae))和各种蛴螬(金龟子科(Scarabaeidae))。本发 明所具体包括的有害线虫包括以下植物的有害线虫：玉米(针刺线虫 (Belonolaimus spp.)、毛刺线虫(Trichodorusspp.)、长针线虫 (Longidorus spp.)、锥线虫(Dolichodorus spp.)、鳗线虫(Anguinaspp.)、 短体线虫、根结线虫、胞囊线虫)、大豆(大豆胞囊线虫、根结线虫、 针刺线虫)、香蕉(相似穿孔线虫(Radopholus similis)、根结线虫、螺 旋线虫)、甘蔗(甘蔗胞囊线虫(Heterodera sacchari)、短体线虫、根结 线虫)、橙子(半穿刺线虫(Tylenchulus spp.)、穿孔线虫(Radopholus spp.)、针刺线虫、短体线虫、剑线虫(Xiphinema spp.))、咖啡(根结线 虫、短体线虫)、椰子(伞滑刃线虫(Bursaphelenchus spp.))、番茄(根结 线虫、针刺线虫、根瘤线虫(Nacobbus spp.)、葡萄(根结线虫、剑线 虫、半穿刺线虫、小环线虫(Criconemella spp.)、柠檬和酸橙(半穿刺 线虫、穿孔线虫、针刺线虫、短体线虫、剑线虫、可可(根结线虫、 肾形小盘旋线虫(Rotylenchulus reniformis)、菠萝(根结线虫、短体线虫、肾形小盘旋线虫、木瓜(根结线虫、肾形小盘旋线虫)、葡萄柚(半 穿刺线虫、穿孔线虫、针刺线虫、短体线虫、剑线虫)和蚕豆(根结线 虫)。

来自有害动物的靶基因可包括精子主要蛋白、α微管蛋白、β微 管蛋白、液泡ATP酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、RNA聚合酶II、几丁 质合酶、细胞色素、miRNA、miRNA前体分子、miRNA启动子等物 质的无脊椎动物基因，以及其它基因例如以下文献中公开的那些： 美国专利申请公布说明书2006/0021087 A1、PCT专利申请 PCT/US05/11816和美国专利申请公布说明书2004/0098761 A1中的 表II，所述文献通过引用结合到本文中。来自病原体的靶基因可包 括病毒翻译起始因子、病毒复制酶、miRNA、miRNA前体分子、真 菌微管蛋白、真菌液泡ATP酶、真菌几丁质合酶、真菌MAP激酶、 真菌Pac1 Tyr/Thr磷酸酶、参与营养运输的酶(例如氨基酸转运蛋白 或糖转运蛋白)、参与真菌细胞壁生物合成的酶、角质酶、黑素生物合成酶、多聚半乳糖醛酸酶、果胶酶、果胶裂合酶、纤维素酶、蛋 白酶等物质的基因，与植物无毒性基因相互作用的基因，以及其它 参与病原体在受感染植物中的侵袭和复制的基因。因此，靶基因对 于其中重组DNA构建体可转录的植物而言不一定是内源的。本发明 的重组DNA构建体可在植物中转录并用于抑制可侵染植物的病原 体或有害动物的基因。

合适靶基因的具体的非限制性实例也包括氨基酸分解代谢基因 (例如但不限于编码赖氨酸-酮戊二酸还原酶(LKR)和酵母氨酸脱氢酶 (SDH)的玉米LKR/SDH基因、及其同源物)、玉米醇溶蛋白基因、参 与脂肪酸合成(例如植物微粒体脂肪酸去饱和酶和植物酰基-ACP硫 酯酶，例如但不限于美国专利号6,426,448、6,372,965和6,872,872 公开的那些)的基因、参与多步生物合成途径的基因，其中可能有兴 趣调节一种或多种中间产物的水平，例如编码聚羟基链烷酸酯生物 合成酶的基因(参见例如美国专利号5,750,848)；和编码细胞周期控 制蛋白的基因，例如编码具有细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂 样活性的蛋白质的基因(参见例如在国际专利申请公布号WO 05007829A2中公开的基因)。靶基因可包括编码不想要的蛋白质(例 如变应原或毒素)的基因，或编码不想要的化合物(例如不想要的味道 或气味成分)生物合成酶的基因。因此，本发明的一个实施方案是非 天然转基因植物或该植物的组织，该植物通过抑制变应原性蛋白或 毒素而得以改良，例如变应原性降低的花生、大豆或小麦籽粒。靶 基因可包括参与水果成熟的基因，例如多聚半乳糖醛酸酶的基因。 靶基因可包括这样的基因：其表达优选局限于特定细胞或组织或发 育期，或者其表达优选是瞬时的，也就是说，其中组成型或一般性 抑制、或遍及许多组织的抑制，并非是想要的。因此，合适靶基因 的其它实例包括蛋白质编码基因，当其在转基因植物中表达时，使 得转基因植物对有害动物或病原体具有抗性(参见例如美国专利号 5,763,245中公开的胆固醇氧化酶基因)；其表达受到有害动物或病原 体诱导的基因；和可诱导或恢复能育性的基因(参见例如美国专利号 6,759,575所述的芽孢杆菌RNA酶抑制剂/芽孢杆菌RNA酶 (barstar/barnase)基因)；本段落所引用的所有专利都通过引用全部结 合到本文中。

重组DNA构建体可设计成对靶基因的抑制更具特异性，例如通 过将重组DNA构建体设计成编码成熟miRNA，使其包含与非靶基 因序列基本不相同(或不互补)的区域。非靶基因可包含不会沉默或抑 制的任何基因，无论是在含有重组DNA构建体的植物中还是在可能 接触到重组DNA构建体的生物体中。非靶基因序列可包含来自任何 物种(包括但不限于细菌和病毒等非真核生物；真菌；植物，包括单 子叶植物和双子叶植物，例如作物、观赏植物和非驯化植物即野生 植物；无脊椎动物，例如节肢动物、环节动物、线虫和软体动物； 和脊椎动物，例如两栖类、鱼类、鸟类、驯化或野生哺乳动物，甚 至人)的任何序列。

在一个实施方案中，靶基因对于给定物种而言是内源基因，这 些给定物种例如给定植物(例如但不限于农业或商业上重要的植物， 包括单子叶植物和双子叶植物)，而非靶基因可以是例如非靶物种(例 如另一种植物)的基因，或是病毒、真菌、细菌、无脊椎动物或脊椎 动物、甚至人的基因。一个非限制性实例是这样的：其中重组DNA 构建体设计为抑制靶基因而不抑制非靶基因，该靶基因对一种物种 (例如西方玉米根虫(Diabroticavirgifera virgifera LeConte))而言是内 源基因，而该非靶基因是例如来自相关、甚至密切相关物种(例如北 方玉米根虫(Diabrotica barberi Smith and Lawrence)或南方玉米根虫 (Diabrotica undecimpunctata))的基因。

在其它实施方案(例如其中最好能抑制跨越多个物种的靶基因) 中，最好能设计重组DNA构建体，使其抑制这多个物种(在其中靶 基因是沉默的)共同的靶基因序列。因此，可选择对一个分类单元具 有特异性(例如对一个属、一个科或者甚至更大的分类单元(例如一个 门，例如节肢动物门)具有特异性)、但对其它分类单元(例如植物或 脊椎动物或哺乳动物)不具特异性的RNA双链体。在该实施方案的 一个非限制性实例中，可选择用于基因沉默的重组DNA构建体，从 而靶向致病真菌(例如镰孢菌)，而不靶向来自有益真菌的任何基因序 列。

在该实施方案的另一个非限制性实例中，可选择在玉米根虫中 用于基因沉默的重组DNA构建体对叶甲属(Diabrotica)所有成员具 有特异性。在该实施方案的又一个实例中，可选择这类靶向叶甲属 的重组DNA构建体，使其不靶向来自有益鞘翅目(例如捕食性瓢虫 (coccinellid beetle)，通常称为瓢虫)或其它有益昆虫种类的任何基因 序列。

用于沉默靶基因的本发明重组DNA构建体的所需特异性程度取 决于各种因素。这些因素可包括重组DNA构建体所编码的成熟微 RNA的大小和核酸序列、以及降低这种成熟miRNA对非靶基因的 抑制潜力的相对重要性。在一个非限制性实例中，当预期这种成熟miRNA大小为21个碱基对时，一个特别优选的实施方案包括编码成 熟miRNA并用于沉默靶基因的DNA，其中成熟miRNA包含与非靶 基因序列基本不相同的序列，例如与非靶基因序列的21个连续核苷 酸只有少于18、或少于17、或少于16、或少于15的匹配。

在某些实施方案中，最好设计用于沉默靶基因的重组DNA构建 体，使其包含预测不会产生不想要的多肽的区域，例如通过筛选重 组DNA构建体中的可编码不想要多肽的序列或其密切同源物。不想 要的多肽包括但不限于与已知变应原性多肽同源的多肽和与已知多 肽毒素同源的多肽。编码这些不想要的潜在变应原性肽的公众可得 的序列可得自例如食物变应原研究和来源项目(Food Allergy Research and Resource Program，FARRP)的变应原数据库(可得自 allergenonline.com)或食品安全数据库生物技术信息(Biotechnology Information for Food Safety Databases)(可得自 www.iit.edu/～sgendel/fa.htm)(另外参见例如Gendel(1998)Adv.Food Nutr.Res.,42:63-92)。不想要的序列也可包括例如注释为已知毒素或 潜在或已知变应原并在例如以下公众可得的数据库中具有的多肽序 列：GenBank,EMBL,SwissProt等等，其可通过Entrez系统(www.ncbi.nih.gov/Entrez)来搜索。不想要的潜在变应原性肽序列的 非限制性实例包括大豆的大豆球蛋白，花生的油质蛋白和凝集素， 小麦的麦谷蛋白，牛乳的酪蛋白，乳清蛋白和乳球蛋白，以及各种 贝类的原肌球蛋白(allergenonline.com)。不想要的潜在毒性肽的非限 制性实例包括破伤风梭菌(Clostridium tetani)的破伤风毒素tetA、金 黄色葡萄球菌的腹泻毒素、以及毒物(例如来自芋螺(Conus spp.)的芋 螺毒素和来自节肢动物和爬行动物的神经毒素 (www.ncbi.nih.gov/Entrez)。

在一个非限制性实例中，可筛选重组DNA构建体，以消除编码 以下多肽的可转录序列，所述多肽与已知变应原或毒素具有超过8 个连续氨基酸的完美同源性，或者与超过至少80个氨基酸具有至少 35％同一性；这样的筛选可以在任何和所有可能读框上以两个方向进 行，在以AUG(在相应DNA中为ATG)开头的潜在可读框上，或在 所有可能读框上，无论它们是否以AUG(或ATG)开头。当有“命中” 或匹配时，也就是说，当鉴别出编码与已知变应原或毒素具有超过8 个连续氨基酸的完美同源性(或与超过至少80个氨基酸具有至少35％同一性)的潜在多肽的序列时，可避免、消除或修饰对应于该命 中的核酸序列，当选择序列用于RNA进行沉默靶基因时。在一个实 施方案中，这样设计重组DNA构建体，使其不含以AUG(在相应 DNA中为ATG)开头的潜在可读框。

可通过本领域技术人员已知的任何方法，来达到避免、消除或 修饰不想要的序列。在某些情况下，结果可以是据信在自然界不存 在的新的序列，例如，可通过将“干净”序列一起连接成待用于RHA 双链体的新的嵌合序列，从而避免某些序列。

申请人知道，在某些微RNA介导的基因沉默中，不完美匹配的 miRNA序列在基因沉默中可能是有效的。例如，已经知道在邻近 miRNA互补位点中心的错配，比起更远位置的错配而言，对miRNA 的基因沉默的影响更强一些。参见例如Mallory等(2004)EMBO J., 23:3356-3364中的图4。在另一个实例中，已经报道，错配碱基对的 位置和形成错配的核苷酸特征，这两者都影响给定siRNA沉默靶基 因的能力，而且腺嘌呤-胞嘧啶错配，除了G:U摆动碱基对之外，具 有良好耐受性(参见Du等(2005)Nucleic Acids Res.,33:1671-1677)。 因此，给定链的重组DNA构建体不必与规定靶基因总是具有100％ 序列同一性，但一般会优选与规定靶基因具有基本的序列同一性， 例如与规定靶基因具有约95％、约90％、约85％或约80％序列同一 性。对于互补性的描述，重组DNA构建体的一条链优选设计成与规 定目标(例如目标信使RNA或目标非编码RNA)具有基本互补性，例 如与规定目标具有约95％、约90％、约85％或约80％互补性。在一 个非限制性实例中，在编码21个核苷酸的成熟miRNA的重组DNA 构建体的情况下，所编码的成熟miRNA可设计为与靶RNA的21个 连续核苷酸基本、但并非完美互补；优选位置21的核苷酸与靶RNA 中的相应位置不配对，以避免传递性。

本领域技术人员将能判断，相对于其它标准的重要性而言，筛 选预测对靶基因具有更高特异性或预测不产生不想要的多肽的区域 的重要性，所述其它标准例如但不限于与规定靶基因具有的％序列同 一性或预测给定序列的基因沉默效率。例如，编码成熟miRNA的本 发明重组DNA构建体可设计为在若干物种中都具有活性，因此本领 域技术人员可确定，在重组DNA构建体中包含编码对若干目标物种 具有特异性的成熟miRNA的DNA更为重要，而筛选预测具有更高 基因沉默效率的区域或筛选预测能产生不想要的多肽的区域则没那 么重要。

通常，本发明的重组DNA构建体包含在植物细胞起作用、并与 可转录DNA元件操作性连接的启动子。在不同实施方案中，启动子 选自组成型启动子、空间特异性启动子、时间特异性启动子、发育 特异性启动子和诱导型启动子。

适用于本发明重组DNA构建体的非组成型启动子包括空间特异 性启动子、时间特异性启动子和诱导型启动子。空间特异性启动子 可包括细胞器特异性启动子、细胞特异性启动子、组织特异性启动 子或器官特异性启动子(例如质体特异性启动子、根特异性启动子、 花粉特异性启动子或种子特异性启动子，用于分别抑制第一靶RNA 在质体、根部、花粉或种子中的表达)。在许多情况下，种子特异性 启动子、胚特异性启动子、糊粉特异性启动子或胚乳特异性启动子 尤为有用。时间特异性启动子可包括在植物生长周期的某些发育阶 段期间、或在不同昼夜时间中、或在一年的不同季节中能启动表达 的启动子。诱导型启动子包括由例如但不限于以下生物胁迫或非生 物胁迫的化学物或环境条件诱导的启动子：例如缺水即干旱、热、 冷、高或低营养或盐水平、高或低光照水平、或者有害动物或病原体侵染。表达特异性动子也可包括通常为组成型表达、但以不同程 度或“强度”表达的启动子，包括通常认为是“强启动子”或“弱 启动子”的启动子。

特别有兴趣的启动子包括以下非限制性实例：从土壤杆菌 (Agrobacterium)T-DNA分离的章鱼碱(opaline)合酶启动子；花椰菜 花叶病毒35S启动子；增强型启动子元件或嵌合启动子元件，例如 连接增强子元件(来自玉米热激蛋白70的内含子)的增强型花椰菜花 叶病毒(CaMV)35S启动子；根特异性启动子，例如美国专利 5,837,848；6,437,217和6,426,446中公开的那些；美国专利6,433,252 中公开的玉米L3油质蛋白启动子；美国专利申请公布说明书 2004/0216189中公开的用于编码质体局限性醛缩酶的植物核基因的 启动子；美国专利6,084,089中公开的低温诱导型启动子；美国专利 号6,140,078中公开的盐诱导型启动子；美国专利6,294,714中公开 的光诱导型启动子；美国专利6,252,138中公开的病原体诱导型启动 子；和美国专利申请公布说明书2004/0123347 A1中公开的缺水诱导型启动子，所有上述专利和专利公布说明书公开的启动子及其应用， 尤其是在植物中的重组DNA构建体功能，所述文献都通过引用结合 到本文中。

启动子元件可包括并非天然启动子或启动子元件或其同源物、 但可调节基因表达的核酸序列。这类“基因独立性”调节序列的实 例包括天然存在的RNA序列或人工设计的RNA序列，其可包含配 体结合区或适配子和调节区(其可以是顺式作用的)。参见例如Isaacs 等(2004)Nat.Biotechnol.,22:841-847；Bayer和Smolke(2005)NatureBiotechnol.,23:337-343；Mandal和Breaker(2004)Nature Rev.Mol. Cell Biol.,5:451-463；Davidson和Ellington(2005)Trends Biotechnol., 23:109-112；Winkler等(2002)Nature,419:952-956；Sudarsan等(2003) RNA,9:644-647；和Mandal和Breaker(2004)Nature Struct.Mol.Biol., 11:29-35。可选择或设计这些“核糖核酸调节物(riboregulator)”具体 的空间或时间特异性，例如仅在给定浓度的合适配体存在(或不存在) 时才调节外源基因的翻译。

可通过适合预定用途的任何方法来制备本发明重组DNA构建 体，考虑到例如所需表达类型和在构建体用来转录的植物中使用的 方便性。制备和使用DNA构建体和载体的通用方法是本领域众所周 知的，详述于例如包括以下在内的手册和实验室指南：Sambrook和Russell,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”(第3版),Cold Spring HarborLaboratory Press,NY,2001。构建DNA构建体和载体 并用于转化的有用技术的实例公开于美国专利申请公布说明书 2004/0115642A1，通过引用结合到本文中。也可使用GATEWAY

在某些实施方案中，重组DNA构建体的DNA序列包含对于植 物已经经过密码子优化的序列，其中重组DNA构建体在所述植物中 表达。例如，可通过本领域已知方法，使在植物中表达的重组DNA 构建体具有经密码子优化的所有或部分序列(例如第一基因抑制元件或基因表达元件)，用于在植物中表达。参见例如美国专利5,500,365 中有关植物密码子优化的描述，通过引用结合到本文中；另见De Amicis和Marchetti(2000)Nucleic AcidsRes.,28:3339-3346。

转基因植物细胞和植物

本发明另一方面提供非天然转基因植物细胞，其包含本发明的 任何重组DNA构建体，如以上标题“重组DNA构建体”下所述。 还提供含有本发明非天然转基因植物细胞的非天然转基因植物。本 发明的非天然转基因植物包括任何发育期的植物，并包括由本文所公开的转基因植物细胞制备而来的再生植物或再生植物的后代植物 (其可以是近交或杂交后代植物)、或这类转基因植物的种子。也提供 并要求保护在其基因组中具有本发明所提供的重组DNA构建体的 转基因种子。可通过本领域众所周知的方法制备本发明的非天然转 基因植物细胞、非天然转基因植物和转基因种子，如以下标题“制 备和使用非天然转基因植物细胞和非天然转基因植物”下所述。

非天然转基因植物细胞可包括分离的植物细胞(例如单独的植物 细胞或在人工培养基中或人工培养基上生长的细胞)，或可包括未分 化组织(例如愈伤组织或任何聚集的植物细胞)中的植物细胞。非天然 转基因植物细胞可包括至少一种分化组织中的植物细胞，所述分化 组织选自叶(例如叶柄和叶片)、根、茎(例如块茎、根状茎、匍匐茎、 鳞茎和球茎)、茎秆(例如木质部、韧皮部)、木材、种子、果实(例如 坚果、谷物、肉质果)和花(例如雄蕊、花丝、花药、花粉、心皮、雌 蕊、子房、胚珠)。

本发明的非天然转基因植物细胞或非天然转基因植物可以是任 何合适的目标植物细胞或植物。瞬时转化和稳定转化的植物细胞都 包含在本发明之内。特别优选稳定转化的转基因植物。在多个优选 的实施方案中，非天然转基因植物是可收获种子的能育的转基因植 物，而且本发明还要求保护这些转基因植物的转基因种子，其中种 子优选也含有本发明的重组构建体。

尽管本发明的重组DNA构建体用于产生本发明的非天然转基因 植物细胞、非天然转基因植物或转基因种子，但转化可包括任何众 所周知的并已证明的方法和组成。用于植物转化的合适方法其实包 括将DNA导入细胞的任何方法，例如通过直接递送DNA(例如通过PEG介导的原生质体转化、通过电穿孔、通过用碳化硅纤维搅拌、 以及通过DNA包被颗粒加速(acceleration of DNA coated particles))、 通过土壤杆菌介导的转化、通过病毒或其它载体等。一种植物转化 的优选方法是微弹轰击，例如以下文献所述：美国专利5,015,580(大 豆)、5,550,318(玉米)、5,538,880(玉米)、6,153,812(小麦)、6,160,208 (玉米)、6,288,312(水稻)和6,399,861(玉米)和6,403,865(玉米)，所 有这些文献都通过引用结合到本文中。

植物转化的另一种优选方法是土壤杆菌介导的转化。在一个优 选的实施方案中，可通过含二元Ti质粒系统的土壤杆菌转化的方法， 得到本发明的非天然转基因植物细胞，其中土壤杆菌携带第一Ti质 粒和含有野生型Ti质粒的至少一个T-DNA边界的第二嵌合质粒、 在转化植物细胞中具有功能并与本发明基因抑制构建体操作性连接 的启动子。参见例如美国专利5,159,135所述的二元系统，通过引用 结合到本文中。另见De Framond(1983)Biotechnology,1:262-269； 和Hoekema等,(1983)Nature,303:179。在这样的二元系统中，可在 合适的替代宿主(例如大肠杆菌)中方便地构建含有T-DNA边界的较 小质粒，并转移至土壤杆菌中。

用于土壤杆菌介导的植物(尤其是作物)转化的具体方法包括例 如以下文献中公开的方法：美国专利5,004,863、5,159,135和 5,518,908(棉花)；5,416,011、5,569,834、5,824,877和6,384,301(大 豆)；5,591,616和5,981,840(玉米)；5,463,174(芸薹属)和美国专利申 请公布说明书2004/0244075(玉米)，所有这些文献都通过引用结合 到本文中。对于以下双子叶植物和单子叶植物等许多植物而言都报 道了类似方法：花生(Cheng等(1996)Plant Cell Rep.,15:653)；芦笋 (Bytebier等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,84:5345)；大麦(Wan 和Lemaux(1994)Plant Physiol.,104:37)；水稻(Toriyama等(1988) Bio/Technology,6:10；Zhang等(1988)Plant Cell Rep.,7:379；小麦 (Vasil等(1992)Bio/Technology,10:667；Becker等(1994)Plant J., 5:299),苜蓿(Masoud等(1996)Transgen.Res.,5:313)；和番茄(Sun等 (2006)Plant CellPhysiol.,47:426-431)。另见美国专利申请公布说明 书2003/0167537A1中有关转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)植物的 载体、转化方法和生产的描述，其中转录因子由CaMV35S启动子组 成型表达，该文献通过引用结合到本文中。也可通过用其它载体的 转化而得到转基因植物细胞和转基因植物，所述其它载体例如但不 限于病毒载体(例如烟草蚀纹病毒(tobacco etch potyvirus,TEV)、大麦 条状花叶病毒(BSMV)、以及Edwardson和Christie("The Potyvirus Group:Monograph No.16,1991,Agric.Exp.Station,Univ.ofFlorida) 中所述的有关病毒、质粒、粘粒、YAC(酵母人工染色体)、BAC(细 菌人工染色体)或任何其它合适的克隆载体，当用于例如以下合适转 化方案时：细菌感染(例如用如上所述的土壤杆菌)、二元细菌人工染 色体构建体、DNA的直接递送(例如通过PEG介导的转化、脱水/抑 制介导的DNA摄取、电穿孔、用碳化硅纤维搅拌和微弹轰击)。本 领域普通技术人员显而易见的是，各种转化方法都可用于或经修改 用于自许多目标植物物种产生稳定的转基因植物。

优选在组织培养基和受控环境中实施能提供含稳定整合的重组 DNA的转基因植物细胞和转基因植物的转化方法。“培养基”是指 用于在体外(即在完整的活生物体之外)培养细胞的多种营养混合物。 受体细胞靶标包括但不限于分生组织细胞、愈伤组织、未成熟胚或 部分胚、以及配子细胞例如小孢子、花粉、精子和卵细胞。可再生 为能育植物的任何细胞都可作为有用的受体细胞，用于本发明的实 践。愈伤组织可来自各种组织来源，包括但不限于未成熟胚或部分 胚、幼苗顶端分生组织、小孢子等。能够增殖为愈伤组织的这些细 胞可作为受体细胞，用于遗传转化。用于制备本发明非天然转基因 植物的实用的转化方法和材料(例如各种培养基和受体靶细胞、未成 熟胚的转化、以及其后的能育转基因植物的再生)都公开于例如美国 专利6,194,636和6,232,526和美国专利申请公布说明书2004/0216189，通过引用结合到本文中。转基因植物包括转基因植物 组织或部分，例如转基因砧木或转基因嫁接或接穗材料，其可与非 转基因植物组织或部分组合使用。

在通常的转化实践中，在任何一个转化实验中，DNA仅能导入 到少量靶细胞中。标记基因通常用于提供鉴定稳定转化的细胞的有 效系统，这样的细胞是通过接受转基因DNA构建体并将它整合到其 基因组中而得到的。优选的标记基因提供赋予选择剂(例如抗生素或 除草剂)抗性的选择标记。植物细胞对其具有抗性的任何抗生素或除 草剂都可以是有用的选择剂。使潜在的转化细胞接触选择剂。在存 活细胞群体中的细胞就是赋予抗性的基因整合并以允许细胞存活的 足够量表达的细胞。还可进一步测定细胞，以证实重组DNA的稳定 整合。常用的选择标记基因包括赋予抗生素抗性或除草剂抗性的基 因，这些抗生素例如卡那霉素或巴龙霉素(nptII)、潮霉素B(aph IV) 和庆大霉素(aac3和aacC4)，这些除草剂例如草铵膦(bar或pat)和草 甘膦(EPSPS)。有用的选择标记基因和选择剂的实例可参见美国专利 5,550,318、5,633,435、5,780,708和6,118,047，所有这些文献都通过 引用结合到本文中。也可使用筛选标记或报道基因，例如提供可目 测鉴定转化子的能力的标记。有用的筛选标记的非限制性实例包括 例如表达这样的蛋白质的基因：该蛋白质通过作用于发色底物(例如 β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)(uidA)或萤光素酶(luc))而产生可检测颜色，或者它自身是可检测的，例如绿色荧光蛋白(GFP)(gfp)或免疫原性分 子。本领域技术人员将会知道，许多其它有用标记或报道基因都可 使用。

重组构建体在本发明非天然转基因植物中转录而表达靶基因(或 同时表达目标基因)，可通过蛋白质检测方法(例如蛋白质印迹、 ELISA和其它免疫化学方法)、酶活性测定或核酸检测方法(例如DNA 印迹、RNA印迹、PCR、RT-PCR、荧光原位杂交)等任何合适的方法，来检测或测定所述靶基因表达上的变化。根据大量可用的手册， 这些方法是本领域普通技术人员众所周知的；参见例如Joseph Sambrook和David W.Russell,“MolecularCloning:A Laboratory Manual”(第3版),Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY,2001； Frederick M.Ausubel等(编著)“Short Protocols in Molecular Biology” (第5版),John Wiley和Sons,2002；John M.Walker(编著)“Protein Protocols Handbook”(第2版),Humana Press,2002；和Leandro

重组DNA在本发明非天然转基因植物中转录而表达靶基因(或 同时表达目标基因)，还可通过其它合适的方法来检测或测定所述靶 基因表达上的变化，包括测定能直接或间接指示靶基因在重组DNA 可转录的转基因植物(相对于不转录重组DNA的转基因植物)中的表 达(或目标基因的同时表达)的任何其它性状，例如总体或显微形态学 性状、生长率、产量、生殖或补充(recruitment)率、对有害动物或病 原体的抗性、或对生物或非生物胁迫(例如缺水胁迫、盐胁迫、营养 胁迫、热或冷胁迫)的耐性。这些方法可用于直接测定表型性状或间 接测定(例如在植物中，这些测定包括植物部分测定例如叶或根的测 定，以测定非生物胁迫耐性)。

通过例如表达或抑制其它基因，可将本发明的重组DNA构建体 与赋予额外性状(例如就转化植物而言，包括除草剂抗性、抗虫性、 低温发芽耐性、缺水耐性等性状)的其它重组DNA叠加在一起 (stack)。用于调节基因表达增减的构建体公开于美国专利申请公布说 明书2004/0126845 A1，通过引用结合到本文中。

可收获能育转基因植物的种子并用于培育后代，包括在其基因 组中包含重组DNA构建体的本发明非天然转基因植物的杂交后代。 因此，除了用重组DNA构建体直接转化植物之外，可通过将具有重 组DNA的第一植物与缺乏构建体的第二植物杂交，制备本发明的非 天然转基因植物。例如，可将重组DNA导入适于转化的植物系中以 产生非天然转基因植物，其可与第二植物系杂交，将重组DNA渐渗 入所得后代中。可将携带一个重组DNA(导致靶基因表达变化)的本 发明非天然转基因植物与具有赋予一种或多种额外性状(例如但不限于除草剂抗性、抗虫性或抗病性、环境胁迫抗性、营养含量改变和 产量提高)的其它重组DNA的植物系杂交，产生具有同时赋予所需 靶序列表达行为和额外性状的重组DNA的后代植物。

通常，在合并性状的育种中，提供额外性状的转基因植物是雄 性品系，而携带基础性状的转基因植物是雌性品系。这种杂交后代 发生分离，使得某些植物携带同时具有双亲性状的DNA，而某些只 携带一方亲本性状的DNA；可通过与亲本重组DNA缔合的标记来 鉴定这类植物。可将携带同时具有双亲性状的DNA的后代植物与雌 性亲本系多次回交，例如通常6-8代，产生具有与一个原始转基因亲 本系基本相同的基因型的后代植物，如果没有其它转基因亲本系的 重组DNA的话。

本发明的再一方面是自本发明转基因种子培育而来的非天然转 基因植物。本发明涵盖自含有重组DNA的转基因种子直接培育而来 的非天然转基因植物以及植物后代，包括近交或杂交植物系，其通 过将自转基因种子直接培育而来的转基因植物与并非由同一转基因 种子培育而来的第二植物杂交而制备。

杂交可包括例如以下步骤：

(a)按照本发明，种植第一亲本植物(例如非转基因或转基因) 和转基因的第二亲本植物的种子；

(b)将第一和第二亲本植物的种子培育为长花的植物；

(c)用第二亲本的花粉给第一亲本的花授粉；和

(d)在携带能育花的亲本植物上收获长出的种子。

最好是将重组DNA渐渗入原种中，例如通过回交，将一个来源 的特定所需性状转移到缺乏该性状的近交或其它植物中。这可通过 例如以下步骤来完成：将优良近交系(“A”)(回归亲本)与携带具有目 标性状的合适基因(例如按照本发明制备的构建体)的供体近交系 (“B”)(非回归亲本)第一次杂交。在第一次杂交的所得后代中选出具 有从非回归亲本“B”转移的所需性状的后代，所选后代再与优良回 归亲本“A”回交。经过选择所需性状的5代以上回交后，后代在控 制所转移性状的基因座上是半合子，但在大多数或几乎所有其它基 因上都类似于优良亲本。回交的的最后一代自己生长出的后代，对 所转移(即一次或多次转化事件)的基因而言是纯系。

经过一序列育种操纵，所选DNA构建体可从一个品系移至完全 不同的另一品系，而无需进一步重组操纵。因此可产生近交植物， 其可真实育种用于一个或多个DNA构建体。通过将不同近交植物杂 交，可得到具有不同DNA构建体组合的大量不同杂种。按照这种方式，可产生具有通常与杂交有关的所需农艺学特性(“杂交优势”) 以及由一种或多种DNA构建体赋予的所需特性的植物。

遗传标记可用于帮助将本发明的一个或多个DNA构建体从一个 遗传背景渐渗到另一个。相对于常规育种而言，有助于选择的标记 具有优势，因为它可用于避免因表型变异而引起的错误。此外，遗 传标记可提供数据，无论原种种质(elite germplasm)在具体杂交的单 个后代中的相对程度如何。例如，当具有所需性状并具有非农艺学 所需遗传背景的植物与原种亲本杂交时，遗传标记可用于选择不仅 具有目标性状、而且具有相当大比例的所需种质的后代。这样，将 一种或多种性状的基因渐渗到特定遗传背景所需的传代次数最小。 采用标记有助于在本发明非天然转基因植物的育种中进行选择，有 用的分子标记的种类例如但不限于SSR和SNP，可参见PCT申请公 布说明书WO 02/062129和美国专利申请公布号2002/0133852、 2003/0049612和2003/0005491，各自通过引用全部结合到本文中。

在某些本发明的非天然转基因植物细胞和非天然转基因植物 中，最好同时表达(或抑制)目标基因，同时也调节靶基因的表达。因 此，在某些实施方案中，非天然转基因植物含有重组DNA，所述重 组DNA还包含基因表达(或抑制)元件，用于表达至少一个目标基因， 而靶基因表达的调节优选受到至少一个目标基因在转基因植物中同 时表达(或抑制)的影响。

因此，如本文所述，通过采用本领域已知的或本文所公开的任 何合适的瞬时或稳定、整合或非整合的转化方法，可得到本发明的 非天然转基因植物细胞或非天然转基因植物。重组DNA构建体可在 任何植物细胞或组织中或者在完整植物的任何发育期转录。转基因 植物可来自任何单子叶植物或双子叶植物，例如但不限于具有商业 或农业价值的植物，例如作物(尤其是作为人类食物或动物饲料的作 物)、生产木材或纸浆的树木、蔬菜植物、水果植物和观赏植物。目 标植物的非限制性实例包括谷类作物(例如小麦、燕麦、大麦、玉米、 黑麦、小黑麦、水稻、稷、高粱、奎藜籽(quinoa)、苋菜和荞麦)；饲 料作物(例如饲用禾草和饲用双子叶植物，包括苜蓿、野豌豆、三叶 草等)；油料作物(例如棉花、红花、向日葵、大豆、甘兰型油菜(亦 称双低油菜,canola)、白菜型油菜(rapeseed)、亚麻、花生和油棕)； 树坚果(例如核桃、腰果、榛子、山核桃、杏仁等)；甘蔗、椰子、枣 椰、橄榄、甜菜、茶和咖啡；木材用树或纸浆用树；蔬菜作物例如 豆类(例如菜豆、豌豆、兵豆、苜蓿、花生)、莴苣、芦笋、朝鲜蓟、 芹菜、胡萝卜、萝卜、芸薹类(例如甘蓝、羽衣甘蓝、芥菜和其它叶 用芸薹类、椰菜、花椰菜、孢子甘蓝、芜菁、球茎甘蓝)、食用葫芦 科类(例如黄瓜、甜瓜、夏西葫芦、冬西葫芦)、食用葱属(例如洋葱、 大蒜、韭菜、火葱、细香葱)、茄科(Solanaceae)的食用成员(例如番茄、 茄子、马铃薯、辣椒、灯笼果(groundcherry))、和藜科(Chenopodiaceae) 的食用成员(例如甜菜、牛皮菜、菠菜、奎藜籽、苋菜)；水果作物例 如苹果、梨、柑橘类水果(例如橙子、酸橙、柠檬、葡萄柚等)、核果 类(例如杏、桃、李、油桃)、香蕉、菠萝、葡萄、猕猴桃、木瓜、鳄 梨和浆果类；和观赏植物，包括观赏用花卉植物、观赏用乔木和灌 木、观赏用地被植物和观赏草。优选的双子叶植物包括但不限于甘 兰型油菜、椰菜、甘蓝、胡萝卜、花椰菜、白菜、黄瓜、干豆类、 茄子、茴香、四季豆、葫芦、莴苣、甜瓜、秋葵、豌豆、辣椒、西 葫芦(pumpkin)、萝卜、菠菜、南瓜(squash)、西瓜、棉花、马铃薯、 奎藜籽、苋菜、荞麦、红花、大豆、甜菜和向日葵。优选的单子叶 植物包括但不限于小麦、燕麦、大麦、玉米(包括甜玉米和其它品种)、 黑麦、小黑麦、水稻、观赏用禾草和饲用禾草、高粱、稷、洋葱、 韭菜和甘蔗，更优选玉米、小麦和水稻。

植物转化的最终目标是得到对人类有用的植物。就此而言，本 发明的非天然转基因植物可用于对生产者或消费者视为有价值的任 何实际目的。例如，人们可以希望收获转基因植物本身，或收获转 基因植物的转基因种子(用于种植)，或者可以用转基因植物或其种子 来生产各种产品，例如油、淀粉、乙醇或其它发酵产品、动物饲料 或人类食物、医药和各种工业产品。例如，玉米可广泛用于食品及 饲料业、以及工业应用。有关玉米用途的进一步讨论可参见例如美 国专利号6,194,636、6,207,879、6,232,526、6,426,446、6,429,357、6,433,252、6,437,217和6,583,338，通过引用结合到本文中，以及PCT 公布说明书WO 95/06128和WO 02/057471。因此，本发明也提供由 本发明的转基因植物细胞、植物或种子制备而来的商品，包括但不 限于收获的叶、根、苗、块茎、茎、果实、种子或其它植物部分、 食物、油类、提取物、发酵或消化产物、碾碎或完整的谷物或植物 种子、或任何食品或非食品(包含由本发明转基因植物细胞、植物或 种子制备而来的商品)。本文所涵盖的对一种或多种商品中本发明重 组DNA构建体的一个或多个核酸序列的检测，是该商品含有或源自 本发明转基因植物细胞、植物或种子的实际证据。

在优选的实施方案中，相对于缺乏重组DNA构建体的植物而言， 由本发明非天然转基因植物细胞制备而来的非天然转基因植物(即在 其基因组中含有本发明重组DNA构建体的转基因植物)具有至少一 个额外改变的性状，其选自以下性状：

(a)提高非生物胁迫耐性；

(b)提高生物胁迫耐性；

(c)改变初级代谢产物组成；

(d)改变次级代谢产物组成；

(e)改变微量元素、类胡萝卜素或维生素组成；

(f)提高产量；

(g)提高氮或其它营养物的利用能力；

(h)改变农艺学特性；

(i)改变生长或生殖特性；和

(j)提高收获、贮存或加工品质。

在特别优选的实施方案中，非天然转基因植物的特性是提高对 非生物胁迫的耐性(例如对缺水或干旱、热、冷、非优化营养或盐水 平、非优化光照水平的耐性)或者对生物胁迫(例如拥挤、异株克生作 用或受伤)的耐性；改变初级代谢产物(例如脂肪酸、油、氨基酸、蛋 白质、糖或碳水化合物)组成；改变次级代谢产物(例如生物碱类、萜 类、聚酮类、非核糖体肽和混合生物合成来源的次级代谢物)组成； 改变微量元素(例如铁、锌)、类胡萝卜素(例如β-胡萝卜素、番茄红 素、叶黄素、玉米黄质或其它类胡萝卜素和叶黄素)或维生素(例如生 育酚)组成；提高产量(例如在非胁迫条件下产量提高或在生物或非生 物胁迫下产量提高)；提高氮或其它营养物的利用能力；改变农艺学 特性(例如延迟成熟；延迟衰老；更早熟或更晚熟；改善耐荫性；提 高根茎倒伏的抗性；提高对茎的“green snap”的抗性；光周期反应 的改变)；改变生长或生殖特性(例如有意矮化；有意雄性不育，用于 例如例如改进杂交步骤；营养体生长率提高；提高发芽率；提高雄 性或雌性生育力)；提高收获、贮存或加工品质(例如提高贮存期间对 有害动物的抗性，提高对破损的抗性、提高对消费者的吸引)；或这 些性状的任何组合。

在一个优选的实施方案中，转基因种子或由非天然转基因植物 产生的种子具有改变的初级代谢产物(例如脂肪酸、油、氨基酸、蛋 白质、糖或碳水化合物)组成，改变的次级代谢产物(例如生物碱类、 萜类、聚酮类、非核糖体肽和混合生物合成来源的次级代谢物)组成， 改变的微量元素(例如铁、锌)、类胡萝卜素(例如β-胡萝卜素、番茄 红素、叶黄素、玉米黄质或其它类胡萝卜素和叶黄素)或维生素(例如 生育酚)组成，提高的收获、贮存或加工品质，或这些状性的组合。 例如，最好改变作物(例如甘兰型油菜、棉花、红花、大豆、甜菜、 向日葵、小麦、玉米或水稻)种子的氨基酸(例如赖氨酸、甲硫氨酸、 色氨酸或总蛋白)、油(例如脂肪酸组成或总油)、碳水化合物(例如单 糖或淀粉)、微量元素、类胡萝卜素或维生素含量，优选还包括提高 种子收获、贮存或加工品质，并因此提供改良的种子，用于动物饲 料或人类食物。在另一个实例中，最好改变转基因植物或转基因植 物种子的天然成分的含量，例如以降低具有低水平赖氨酸、甲硫氨 酸或色氨酸的蛋白质含量，或提高所需氨基酸或脂肪酸的含量，或 降低变应原性蛋白或糖蛋白(例如花生变应原，包括ara h1；小麦变 应原，包括醇溶蛋白和麦谷蛋白；大豆变应原，包括P34变应原、 球蛋白、大豆球蛋白和伴大豆球蛋白(conglycinins)或有毒代谢产物 (例如木薯中产生氰基的糖苷，茄科成员中的龙葵(solanum)生物碱) 的含量。

基因抑制的方法

本发明再一方面提供影响基因抑制的方法，所述方法包括以下 步骤：(a)提供非天然转基因植物，其包括由本发明非天然转基因植 物细胞制备而来的再生植物、或再生植物的后代植物(如以上标题“转 基因植物细胞和植物”下所述)；和(b)在非天然转基因植物中转录重 组DNA构建体；其中转录产生在非天然转基因植物中能够抑制至少 一个靶基因的RNA，因此相对于在没有转录重组DNA构建体时的 表达而言，至少一个靶基因被抑制。

至少一个靶基因是至少一个选自以下的基因：对转基因植物而 言是天然的基因，转基因植物中的转基因，以及对转基因植物的病 毒、细菌、真菌或无脊椎动物害虫或病原体而言是天然的基因。合 适的靶基因如以上标题“靶基因”下所述。在某些实施方案中，至少一个靶基因是单个靶基因。在其它实施方案中，至少一个靶基因 是多个靶基因。靶基因抑制包括非特异性抑制，例如组成型表达抑 制，以及特异性表达抑制，例如空间特异性基因抑制、时间特异性 基因抑制、发育特异性基因抑制或诱导型基因抑制。通过本领域技 术人员已知技术，可达到对至少一个靶基因抑制的特异性，例如通 过选择具有所需特异性表达图式的启动子，或者通过选择具有所需 特异性表达图式的成熟miRNA识别的微RNA识别位点。

通过本领域已知方法进行重组DNA构建体的转录。在某些实施 方案中，转录是组成型的即是非特异性的，例如在组成型启动子控 制之下。在其它实施方案中，转录在特定空间、时间或诱导条件下 发生。例如，重组DNA构建体可包含空间特异性启动子、时间特异性启动子或诱导特异性启动子。在另一个实例中，重组DNA构建体 可包含核糖体开关(riboswitch)(可转录为能结合配体的RNA适配子 的DNA，和可转录为能调节靶基因表达的调节RNA的DNA，其中 调节依赖于调节RNA的构象，而调节RNA的构象受到RNA适配子 结合状态的变构影响)，因此允许重组DNA构建体的转录受到RNA 适配子结合状态和配体存在(或不存在)的控制。

本发明还提供同时影响至少一个靶基因的基因抑制和至少一个 目标基因的基因表达的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供非天 然转基因植物，其包括由本发明非天然转基因植物细胞制备而来的 再生植物或再生植物的后代植物(如以上标题“转基因植物细胞和植 物”下所述)，其中重组DNA构建体还包含用于表达至少一个目标 基因的基因表达元件；和(b)在非天然转基因植物中转录重组DNA 构建体，其中当重组DNA构建体在非天然转基因植物中转录时，产 生能够抑制至少一个靶基因的转录RNA和编码至少一个目标基因的 转录RNA，其中相对于在没有所述重组DNA构建体转录时的表达 而言，至少一个靶基因被抑制，而且至少一个目标基因同时表达。

目标基因可包含来自任何物种(包括但不限于细菌和病毒等非真 核生物；真菌；植物，包括单子叶植物和双子叶植物，例如作物、 观赏植物和非驯化植物即野生植物；无脊椎动物，例如节肢动物、 环节动物、线虫和软体动物；和脊椎动物，例如两栖类、鱼类、鸟 类和哺乳动物)的任何编码或非编码序列。由基因表达元件所表达的 非编码序列的非限制性实例包括但不限于5’非翻译区、启动子、增 强子或其它非编码转录区、3’非翻译区、终止子、内含子、微RNA、 微RNA前体DNA序列、小干扰RNA、核糖体或核酶的RNA成分、 核仁小RNA、能结合配体的RNA适配子、和其它非编码RNA。目 标基因的非限制性实例还包括但不限于可翻译(编码)序列，例如编码 转录因子的基因和编码参与目标分子(例如氨基酸、脂肪酸和其它脂 质、糖和其它碳水化合物、生物聚合物和次级代谢产物，包括生物 碱类、萜类、聚酮类、非核糖体肽和混合生物合成来源的次级代谢 物)的生物合成或分解代谢的酶的基因。目标基因对于其中本发明重 组DNA构建体可转录的细胞(例如植物细胞)而言可以是天然的基 因，或者可以是非天然的基因。目标基因可以是标记基因，例如， 编码抗生素抗性、抗真菌剂抗性或除草剂抗性的选择标记基因，或 编码易于检测的性状(例如在植物细胞中，八氢番茄红素合酶或赋予 植物特定色素的其它基因)的标记基因，或编码可检测分子的基因， 所述可检测分子例如荧光蛋白、萤光素酶或可分别通过蛋白质或核 酸检测方法而检测的独特多肽或核酸“标签”)。选择标记是特别用 于鉴定本发明构建体的成功加工中的目标基因。目标基因包括在以 上标题“靶基因”下描述为靶基因的那些基因。

由基因表达元件表达的目标基因可包含至少一个选自以下的基 因：真核靶基因、非真核靶基因和微RNA前体DNA序列。目标基 因可包含单个基因或多个基因(例如多拷贝的单基因、单基因的多个 等位基因、或包含来自多个物种的基因的多个基因)。在一个实施方案中，基因表达元件可包含自我水解的肽序列，例如位于编码一种 或多种多肽的多个序列之间(参见例如来自病毒、锥虫和细菌等不同 物种的2A和“2A样”自我切割序列，公开于Donnelly等(2001),J.Gen. Virol.,82:1027-1041)。在另一个实施方案中，基因表达元件可包含核 糖体“skip”序列，例如位于编码一种或多种多肽的多个序列之间(参 见例如口蹄疫病毒(FMDV)2A核糖体“skip”序列，公开于Donnelly 等(2001),J.Gen.Virol.,82:1013-1025)。

非生物-胁迫-应答miRNA

本发明另一方面涉及表现出对非生物胁迫应答的表达图式的 miRNA，例如表现出特征为被营养胁迫而调节miRNA的表达图式的 miRNA，表现出特征为被水胁迫而调节miRNA的表达图式的 miRNA，或表现出特征为被温度胁迫而调节miRNA的表达图式的 miRNA。

实施例6–11描述了在作物中鉴定的新的miRNA，其俗名为 miRMON18，其表现出特征为在营养胁迫(即缺氮、缺磷或氮磷同时 缺乏)下抑制miRNA的表达图式。成熟miRMON18是序列为 uuagaugaccaucagcaaaca的21个核苷酸的miRNA，是从水稻(SEQ ID NO.393)、玉米(SEQ ID NO.3227)和大豆(SEQ ID NO.8742)的小 RNA文库中克隆而来的。在水稻(SEQID NO.1763)和玉米(SEQ ID NO.3936)中鉴定出前体序列。

本发明的重组DNA构建体在以上标题“重组DNA构建体”下 有详细描述，可用于本文所公开的任何miRNA，例如选自以下的成 熟miRNA：SEQ ID NO.1–1035、SEQ ID NO.2730–3921、SEQ ID NO.5498–6683、SEQ ID NO.8409–8560、SEQ ID NO 8742、SEQ ID NO.8744、SEQ ID NO.8812–8815、SEQ ID NO.8845和SEQ ID NO.8850，或从选自以下植物miRNA前体序列获得的成熟miRNA： SEQ ID NO.1036–2690、SEQ ID NO.3922–5497、SEQ ID NO. 6684–8408、SEQ ID NO.8561–8741、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816–8819。本发明重组DNA构建体的描 述也可一般性用于本发明的实施方案，其可更具体地涉及具有特定 表达图式的miRNA，例如本节所描述的营养-胁迫-应答的植物 miRNA(例如miRMON18和实施例所述的其它miRNA)。以下描述涉 及miRMON18，但也可用于被非生物胁迫调节的其它miRNA，尤其 是表现出特征为在营养胁迫下抑制miRNA的表达图式的miRNA， 表现出特征为在水胁迫下抑制miRNA的表达图式的miRNA，或表 现出特征为在温度胁迫下抑制miRNA的表达图式的miRNA；被非 生物胁迫调节的miRNA的非限制性实例包括miR399和miR319。

因此，本发明提供重组DNA构建体，其包含用于调节至少一个 靶基因表达的至少一个可转录DNA元件，其中至少一个可转录DNA 元件选自：(a)可转录为具有选自SEQ IDNO.1763和SEQ ID NO. 3936的miRMON18前体序列折回结构的miRNA前体并加工为具有 序列uuagaugaccaucagcaaaca(SEQ ID NO.393、SEQ ID NO.3227或 SEQ ID NO.8742)的成熟miRMON18 miRNA的DNA元件；(b)可转 录为从选自SEQ ID NO.1763和SEQ ID NO.3936的miRMON18前 体序列折回结构获得的工程miRNA前体的DNA元件，其中工程 miRNA前体包含修饰的成熟miRMON18 miRNA；(c)位于转基因转 录单元内或其附近并可转录为包含miRNA识别位点的RNA的DNA 元件，所述miRNA识别位点可被从选自SEQ ID NO.1763和SEQ IDNO.3936的miRMON18前体序列获得的成熟miRNA识别；和(d)用 于抑制从选自SEQ IDNO.1763和SEQ ID NO.3936的miRMON18 前体序列获得的内源miRNA表达的DNA元件。这些涉及miRMON18 的实施方案详述如下。

(A)天然miRMON18在非天然条件下的表达。

本发明提供重组DNA构建体，其包含用于调节至少一个靶基因 表达的至少一个可转录DNA元件，其中至少一个可转录DNA元件 包含可转录为具有选自SEQ ID NO.1763和SEQID NO.3936的 miRMON18前体序列折回结构的miRNA前体并加工为具有SEQ ID NO.393、SEQID NO.3227或SEQ ID NO.8742序列的成熟 miRMON18 miRNA的DNA元件，并且至少一个靶基因是植物内源 基因，并且其中重组DNA构建体在植物中的表达导致对至少一个靶 基因的抑制。在一个优选的实施方案中，miRNA前体包含miRMON18 前体序列的至少90％核苷酸的连续区段。这些构建体尤其可用于以 并非天然miRMON18表达图式的表达图式来表达miRMON18(例如 在不同组织、在不同时间或以不同表达水平)。

miRMON18前体不必包含选自SEQ ID NO.1763和SEQ ID NO. 3936的miRMON18前体序列中所含有的所有核苷酸，但优选包含选 自SEQ ID NO.1763和SEQ ID NO.3936的miRMON18前体序列的 至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少97％、 或至少98％、或至少99％核苷酸的连续区段。在一个优选的实施方 案中，miRNA前体包含选自SEQ ID NO.1763和SEQ ID NO.3936 的miRMON18前体序列的至少90％核苷酸的连续区段。无论所使用 的具体核苷酸序列如何，miRMON18前体构成与由选自SEQ ID NO. 1763和SEQID NO.3936的miRMON18前体序列构成的折回结构相 同或近似相同的折回结构并经过一个或多个步骤在体内加工为具有 SEQ ID NO.393、SEQ ID NO.3227或SEQ ID NO.8742序列的成 熟miRMON18 miRNA。

在优选的实施方案中，至少一个靶基因是包含至少一个 miRMON18识别位点(靶位点)的植物内源基因，而且重组DNA构建 体在植物中的表达导致对至少一个靶基因的抑制。在优选的实施方 案中，至少一个靶基因是植物内源基因，因此重组DNA构建体在植 物中的表达导致对至少一个靶基因的抑制。在优选的实施方案中， 重组DNA构建体还包含并非天然miRMON18启动子的启动子。这 允许在不能天然表达的空间或时间或诱导条件下表达成熟 miRMON18 miRNA。例如，重组DNA构建体可设计为包含组成型 启动子，因而可组成型表达成熟miRMON18，其表达图式的特征为 在营养胁迫(即缺氮、缺磷或氮磷同时缺乏)下抑制miRNA；这将会 导致miRMON18靶基因的组成型抑制。在另一个实例中，重组DNA 构建体可设计为包含诱导型根特异性启动子，因此当诱导时在根中 表达成熟miRMON18；这将会导致在诱导时在根组织对miRMON18 靶基因的抑制。可用于该重组DNA构建体的启动子在标题“启动子” 下有描述。

(B)来自miRMON18的成熟的工程miRNA的表达。

在另一个实施方案中，重组DNA构建体包含用于调节至少一个 靶基因表达的至少一个可转录DNA元件，其中用于调节至少一个靶 基因表达的至少一个可转录DNA元件包含可转录为从选自SEQ ID NO.1763和SEQ ID NO.3936的miRMON18前体序列折回结构获得 的工程miRNA前体的DNA元件，其中工程miRNA前体包含修饰的 成熟miRMON18 miRNA，其中至少一个靶基因是植物内源基因或者 所述植物的有害动物或病原体的内源基因，而且其中重组DNA构建 体在植物中的表达导致对至少一个靶基因的抑制。

在优选的实施方案中，至少一个靶基因是植物内源基因或者所 述植物的有害动物或病原体的内源基因，而且重组DNA构建体在植 物中的表达导致对至少一个靶基因的抑制。合适的靶基因描述于以 上标题“靶基因”下。至于“工程”是指选自SEQ ID NO.1763和SEQ ID NO.3936的天然miRMON18前体序列中的核苷酸被改变(替 换、缺失或添加)，因而产生具有与天然miRMON18前体序列折回结 构基本相同的折回结构的工程miRNA前体，但其中由工程 miRMON18前体加工而来的成熟miRNA具有修饰序列(即不同于天 然成熟miRMON18的序列)，所述修饰序列可设计为抑制靶基因，该 靶基因不同于被天然miRMON18前体序列天然抑制的靶基因。用于 测定天然miRMON18前体序列中核苷酸改变以产生工程miRNA前体的一个通用的非限制性方法描述于以上标题“成熟的工程miRNA 的表达”下。

(C)转基因的表达和miRMON18识别位点。

在另一个实施方案中，重组DNA构建体包含用于调节至少一个 靶基因表达的至少一个可转录DNA元件，并且还包含转基因转录单 元，其中用于调节至少一个靶基因表达的至少一个可转录DNA元件 包含位于转基因转录单元内或其附近并可转录为包含miRNA识别位点的RNA的DNA元件，所述miRNA识别位点可被具有SEQ ID NO.393、SEQ ID NO.3227或SEQID NO.8742序列的成熟 miRMON18 miRNA识别，或者被从选自SEQ ID NO.1763和SEQ IDNO.3936的miRMON18前体序列获得的成熟miRMON18 miRNA识 别，并且至少一个靶基因包含转基因转录单元所编码的转基因，而 且其中重组DNA构建体在植物中的表达导致转基因在成熟 miRMON18 miRNA并不能天然表达的植物细胞中得以表达。使用以 下文献所述的序列互补法则等本领域已知方法，可完成对 miRMON18识别位点的预测：Zhang(2005)NucleicAcids Res., 33:W701-704和Rhoades等(2002)Cell,110:513-520；以下工作实施 例中提供了miRMON18识别位点的非限制性实例。

对miRMON18识别位点的预测允许鉴定和证实受到来自天然表 达miRMON18前体的成熟miRMON18调节的内源基因；这可用于 例如消除或修饰内源基因内的miRMON18识别位点，以便将该基因 的表达从由天然调节基因表达的内源miRMON18的调节中解脱出 来。在一个实施方案中，可增加miRMON18识别位点与成熟 miRMON18之间的错配数(尤其是对应于成熟miRMON18的位置2 至13的错配)，以防被内源miRMON18识别并切割。

这些重组DNA构建体尤其可用于根据miRMON18的内源表达 而限制的转基因的inplanta表达，也就是说，当例如在营养胁迫(即 缺氮、缺磷或氮磷同时缺乏)下miRMON18被抑制时，表达转基因。 转基因的表达还可通过使用合适启动子来控制。在一个非限制性实例中，本发明的重组DNA构建体可用于在缺氮(或缺磷)条件下在植 物根部表达转基因，其中本发明的重组DNA构建体编码：(a)转基因， 其处于根特异性启动子控制之下，和(b)miRNA识别位点，其由仅在 缺氮(或磷)条件下才被特异性抑制的成熟miRMON18识别。

转基因转录单元包含至少一个转基因和任选额外序列，例如但 不限于启动子、启动子增强子、终止子、信使RNA稳定或去稳定序 列(参见例如Newman等(1993)Plant Cell,5:701-714；Green(1993) Plant Physiol.,102:1065-1070；和Ohme-Takagi等(1993)Proc.Natl. Acad.Sci.USA,90:11811-11815)、用于将转基因转录物定位或转运至 特定场所(例如线粒体、质体、核仁、过氧化物酶体、内质网等)的序 列、或转基因所需加工相关的其它序列。转基因转录单元所编码的 转基因可包含任何一个或多个目标基因，包括编码序列、非编码序 列或这两者。目标基因可包含“靶基因”下所列出的任何基因，其 优选的实例包括转录因子编码基因和酶编码基因的可翻译(编码)序 列，所述酶参与目标分子(例如但不限于氨基酸、脂肪酸和其它脂质、 糖类和其它碳水化合物、生物聚合物和次级代谢物(包括生物碱类、 萜类、聚酮类、非核糖体肽和混合生物合成来源的次级代谢物))的生 物合成或分解代谢。

(D)对内源或天然miRMON18的抑制。

在另一个实施方案中，重组DNA构建体包含用于调节至少一个 靶基因表达的至少一个可转录DNA元件，其中至少一个可转录DNA 元件包含用于对从选自SEQ ID NO.1763和SEQ ID NO.3936的 miRMON18前体序列获得的内源成熟miRMON18 miRNA表达进行 抑制的DNA元件，其中至少一个靶基因是植物内源基因，而且其中 该内源基因的表达在发生内源成熟miRMON18 miRNA天然表达的 植物细胞中被抑制，而且其中重组DNA构建体在细胞中的表达导致 内源基因在细胞中的表达。这些构建体尤其可用于抑制天然或内源 miRMON18，因此允许具有一个或多个miRMON18识别位点的基因 表达。在优选的实施方案中，至少一个靶基因是植物内源基因并包 含一个或多个miRMON18识别位点，而且内源基因的表达在发生成 熟miRMON18的天然表达的植物细胞中被抑制，因此重组DNA构 建体在细胞中的表达导致内源靶基因在细胞中的表达。

用于抑制表达的DNA元件包含以下至少一个：

(a)包含至少一个反义DNA区段的DNA，该反义DNA区段对 靶基因的至少一个区段而言是反义的；

(b)包含多拷贝的至少一个反义DNA区段的DNA，该反义DNA 区段对靶基因的至少一个区段而言是反义的；

(c)包含至少一个有义DNA区段的DNA，该有义DNA区段是 靶基因的至少一个区段；

(d)包含多拷贝的至少一个有义DNA区段的DNA，该有义DNA 区段是靶基因的至少一个区段；

(e)可转录为RNA并通过形成双链RNA而抑制靶基因的DNA， 并且该DNA包含至少一个反义DNA区段和至少一个有义DNA区 段，该反义DNA区段对靶基因的至少一个区段而言是反义的，而该 有义DNA区段是靶基因的至少一个区段；

(f)可转录为RNA并通过形成一个双链RNA而抑制靶基因的 DNA，并且该DNA包含多个连续反义DNA区段和多个连续有义 DNA区段，这些反义DNA区段对靶基因的至少一个区段而言是反 义的，而这些有义DNA区段是靶基因的至少一个区段；

(g)可转录为RNA并通过形成多个双链RNA而抑制靶基因的 DNA，并且该DNA包含多个反义DNA区段和多个有义DNA区段， 这些反义DNA区段对靶基因的至少一个区段而言是反义的，而这些 有义DNA区段是靶基因的至少一个区段，并且其中多个反义DNA 区段和多个有义DNA区段以一系列反向重复序列方式排列；

(h)包含从植物miRNA获得的核苷酸的DNA；

(i)包含siRNA的核苷酸的DNA；

(j)可转录为能结合配体的RNA适配子的DNA；和

(k)可转录为能结合配体的RNA适配子的DNA，和可转录为能 调节靶基因表达的调节RNA的DNA，其中调节依赖于调节RNA的 构象，而调节RNA的构象受到RNA适配子结合状态的变构影响。

用于抑制表达的DNA元件在实施例3中进一步描述并如图2和 图3所示。通过以下“微RNA诱骗序列”中详述的替代方法可控制 miRNA对其靶基因的作用。

在某些实施方案中，重组DNA构建体包含这样的DNA：其设 计成可转录为单链RNA或至少部分双链RNA(例如以“相吻茎环” 排列)、或可转录为假定二级结构或三维构型(例如靶基因或适配子的 反义序列的大环)的RNA，该RNA赋予转录物额外的所需特性，例 如稳定性提高、体内半衰期延长或者细胞特异性或组织特异性提高。 在一个实例中，间隔区可转录为能连接连续RNA区段第一系列和第 二系列的稳定环(参见例如Di Giusto和King(2004)J.Biol.Chem., 279:46483-46489)。在另一个实例中，重组DNA构建体包含可转录为包含RNA适配子(例如可结合细胞特异性配体的适配子)在内的 RNA的DNA，允许针对重组RNA双链体的细胞特异性或组织特异 性寻靶。

(E)miRNA-无应答的转基因，包括miRMON18-无应答的转基 因。

也公开并要求保护重组DNA构建体，其包含对给定成熟miRNA 无应答的合成miRNA-无应答的转基因序列，其中合成miRNA-无应 答的转基因序列是：(a)由天然miRNA-应答序列获得，即通过缺失或 修饰天然miRNA-应答序列内被给定成熟miRNA识别的所有天然 miRNA识别位点，和(b)不被给定成熟miRNA识别。非限制性实施 方案包括重组DNA构建体，其包含对选自以下的成熟miRNA无应 答的合成miRNA-无应答的转基因序列：SEQ IDNO.1–1035、SEQ ID NO.2730–3921、SEQ ID NO.5498–6683、SEQ ID NO.8409– 8560、SEQ IDNO 8742、SEQ ID NO.8744、SEQ ID NO.8812– 8815、SEQ ID NO.8845和SEQ ID NO.8850，或者对从选自以下植 物miRNA前体序列获得的成熟miRNA无应答：SEQ ID NO.1036– 2690、SEQ ID NO.3922–5497、SEQ ID NO.6684–8408、SEQ ID NO.8561–8741、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816–8819，其中合成miRNA-无应答的转基因序列是：(a)由天 然miRNA-应答序列获得，即通过缺失或修饰天然miRNA-应答序列 内被给定成熟miRNA识别的所有天然miRNA识别位点，和(b)不被 给定成熟miRNA识别。使用以下文献所述的序列互补法则等本领域 已知方法，可完成对识别位点的预测：Zhang(2005)Nucleic AcidsRes., 33:W701-704和Rhoades等(2002)Cell,110:513-520。

一个非限制性优选实施方案是重组DNA构建体，其包含合成 miRMON18-无应答的转基因序列，其中合成miRMON18-无应答的 转基因序列是：(a)由天然miRMON18-应答序列获得，即通过缺失或 修饰天然miRMON18-应答序列内的所有天然miRMON18 miRNA识 别位点(也就是说，缺失或修饰被具有SEQ ID NO.393、SEQ ID NO. 3227或SEQ ID NO.8742序列的成熟miRMON18 miRNA识别或者 被从选自SEQ ID NO.1763和SEQ ID NO.3936的miRMON18前体 序列获得的成熟miRMON18 miRNA识别的任何识别位点)，和(b)不 被成熟miRMON18miRNA识别。

(F)非生物-胁迫-应答的miRNA启动子，包括miRMON18启 动子。

也公开并要求保护重组DNA构建体，其包含表现出特征为被非 生物胁迫而调节的表达图式的miRNA启动子，例如，表现出特征为 被营养胁迫而调节miRNA的表达图式的miRNA启动子，表现出特 征为被水胁迫而调节miRNA的表达图式的miRNA启动子，或表现 出特征为被温度胁迫而调节miRNA的表达图式的miRNA启动子。 优选的实施方案包括重组DNA构建体，其包含表现出特征为被营养 胁迫而调节miRNA的表达图式的miRNA启动子，其中营养胁迫包 括选自缺氮和缺磷的至少一种营养缺乏。在一个实施方案中，启动 子是被缺氮抑制的miRNA启动子。在另一个实施方案中，启动子是 被缺无机磷抑制的miRNA启动子。在又一个实施方案中，启动子是 被同时缺氮和缺磷抑制的miRNA启动子。在再一个实施方案中，启 动子是被缺氮或缺磷上调的miRNA启动子。

特别优选的实施方案包括重组DNA构建体，其包含表现出特征 为在营养胁迫下抑制miRNA的表达图式的miRNA启动子，其中营 养胁迫包括选自缺氮和缺磷的至少一种营养缺乏，并且其中启动子 包含以下至少一个：(a)在叶组织中表现出在氮充足条件下强表达、而在缺氮条件下抑制的玉米miRNA启动子；(b)在叶组织中表现出在 磷充足条件下强表达、而在缺磷条件下抑制的玉米miRNA启动子； (c)具有SEQ ID NO.8804序列的miRMON18启动子；(d)与SEQ ID NO.8804区段具有至少85％同一性的至少约50个连续核苷酸的片 段。也优选这样的实施方案：其中启动子与以下至少一个操作性连 接：(a)基因抑制元件，和(b)基因表达元件；优选这些实施方案可用 于在植物中表达重组DNA构建体。

非限制性实例包括具有SEQ ID NO.8800的核苷酸211–2172 序列的启动子；与SEQID NO.8800的核苷酸211–2172具有至少 85％、至少90％、至少95％、或至少98％同一性的至少约50、至少 约100、至少约150、至少约200、至少约300、至少约400、或至少 500个连续核苷酸的片段，其中所述片段在至少一种植物组织中具有 启动子活性，其特征为在氮充足条件下强表达、而在缺氮条件下抑 制，或者在磷充足条件条件下强表达、而在缺磷条件下抑制；而且 至少约50、至少约100、至少约150、至少约200、至少约300、至 少约400、或至少500个连续核苷酸的片段与SEQ ID NO.8804具有 至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％同一性，其中所述片 段在至少一种植物组织中具有启动子活性，其特征为在氮充足条件 下强表达、而在缺氮条件下抑制，或者在磷充足条件条件下强表达、 而在缺磷条件下抑制。

(G)非生物-胁迫-应答的转基因植物细胞和植物。

还公开和要求保护非天然转基因植物细胞，其包含该标题(“非 生物-胁迫-应答的miRNA”)下所公开的任何重组DNA构建体。一 个优选的实施方案包括由包含重组DNA构建体的非天然转基因植 物细胞制备而来的非天然转基因植物，该重组DNA构建体包含用于调节至少一个靶基因表达的至少一个可转录DNA元件，其中至少一 个可转录DNA元件包含可转录为具有选自SEQ ID NO.1763、SEQ ID NO.3936和SEQ ID NO.8800的miRMON18前体序列折回结构 的miRNA前体的DNA元件，其中miRNA前体包含miRMON18前 体序列的至少90％核苷酸的连续区段并加工为具有序列 uuagaugaccaucagcaaaca(SEQ ID NO.393、SEQ IDNO.3227或SEQ ID NO.8742)的成熟miRMON18 miRNA，而且至少一个靶基因是植 物内源基因并包含SPX结构域，而且其中重组DNA构建体在植物 中的表达导致对至少一个靶基因的抑制；通常重组DNA构建体还包 含并非天然miRMON18启动子的启动子，以驱动成熟miRMON18 的表达。

另一个优选的实施方案包括由包含重组DNA构建体的非天然转 基因植物细胞制备而来的非天然转基因植物，该重组DNA构建体包 含用于调节至少一个靶基因表达的至少一个可转录DNA元件，其中 至少一个可转录DNA元件包含用于对从选自SEQ ID NO.1763、SEQ ID NO.3936和SEQ ID NO.8800的miRMON18前体序列获得 的内源成熟miRMON18 miRNA表达进行抑制的DNA元件，其中至 少一个靶基因是植物内源基因并包含SPX结构域，而且内源基因的 表达在发生内源成熟miRMON18 miRNA天然表达的植物细胞中被 抑制，而且其中重组DNA构建体在细胞中的表达导致内源基因在细 胞中的表达。用于抑制内源成熟miRMON18 miRNA表达的合适DNA 元件描述于以上标题“对内源或天然miRMON18的抑制”下。

微RNA诱骗序列

植物微RNA通过以下方式调节其靶基因：识别并结合靶转录物 中几乎完美互补的序列(miRNA识别位点)，再通过RNA酶III酶(例 如Ago1)切割转录物。在植物中，给定miRNA识别位点与相应成熟 miRNA之间的某些错配是不能忍受的，尤其是成熟miRNA位置10 和11的错配核苷酸。以5’至3’方向给出成熟miRNA内的位置；为 了清楚起见，图7D描绘了miRNA、miR827(SEQ ID NO.8744)和 miRMON18(SEQ ID NO.393、SEQ ID NO.3227或SEQ ID NO.8742)的实例，带编号的箭头标明成熟miRNA的位置1、10和21； 位置10的核苷酸还具有下划线。在成熟miRNA的位置10和11上 通常需要给定miRNA识别位点与相应成熟miRNA之间的完美互补。 参见例如Franco-Zorrilla等(2007)Nature Genetics,39:1033-1037；和 Axtell等(2006)Cell,127:565-577。

植物miRNA的这一特征可用于达到预测“微RNA诱骗序列” 的法则，也就是说，该序列可被内源成熟miRNA识别并结合而导致 miRNA诱骗序列与内源成熟miRNA之间的碱基配对，因而形成因 miRNA诱骗序列与成熟miRNA间存在错配而不被切割的抗切割 RNA双链体。错配包括规范错配(例如G-A、C-U、C-A)以及G::U 摆动配对和得失位(indels)(核苷酸插入或缺失)。一般而言，这些法 则定义(1)所需错配，和(2)允许但并非必需的错配。

所需错配包括：(a)miRNA诱骗序列与内源成熟miRNA之间在 内源成熟miRNA位置9、10或11上的至少1个错配，或者，(b)在 对应于内源成熟miRNA的位置9、10或11的miRNA诱骗序列的位 置上的1、2、3、4或5个插入(即额外核苷酸)。在优选的实施方案 中，存在(a)miRNA诱骗序列与内源成熟miRNA之间在内源成熟 miRNA的位置10和/或11上的至少1个错配，或(b)在对应于内源成 熟miRNA的位置10和/或11的miRNA诱骗序列的位置上的至少1个插入。

允许但并非必需的错配包括：(a)miRNA诱骗序列与内源成熟 miRNA之间在内源成熟miRNA位置1、2、3、4、5、6、7、8和9 上的0、1或2个错配，和(b)miRNA诱骗序列与内源成熟miRNA 之间在内源成熟miRNA位置12至最后一位(即21个核苷酸的成熟 miRNA的位置21)上的0、1、2或3个错配，其中在内源成熟miRNA 位置12至最后一位上的每个错配都邻近至少一个互补碱基对(即使 得在内源成熟miRNA位置12至最后一位上有不超过2个连续错配)。 在优选的实施方案中，在内源成熟miRNA的位置1、2、3、4、5、6、 7和8上不存在错配(即所有都是互补碱基对)。

miRNA诱骗序列可以是任何长度，只要能被内源成熟miRNA 识别并结合，形成抗切割的RNA双链体。在优选的实施方案中， miRNA诱骗序列包含约18至约36个核苷酸。特别要求保护的实施 方案包括18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30 和31个核苷酸的miRNA诱骗序列。在非限制性实例中，具有在成 熟miRNA位置10上的4个核苷酸插入的所需错配和在成熟miRNA 位置20上的1个核苷酸插入的允许错配的miRNA诱骗序列(对于21 个核苷酸的成熟miRNA)总共具有26个核苷酸；具有在成熟miRNA 位置11上的5个核苷酸插入的所需错配以及在成熟miRNA位置20 上的1个规范错配和在成熟miRNA位置23上的1个核苷酸插入的 允许错配的miRNA诱骗序列(对于25个核苷酸的成熟miRNA)总共 具有31个核苷酸。

因此，本发明的一个实施方案包括重组DNA构建体，其可转录 为包含至少一个miRNA诱骗序列的RNA转录物，该miRNA诱骗序 列可被内源成熟miRNA识别并结合、但不切割(例如不被淘金者蛋 白(Argonaute)或AGO样蛋白切割)，其中内源miRNA是选自以下的 至少一种miRNA：(a)选自以下成熟miRNA的成熟miRNA：SEQ ID NO.1–1035、SEQ ID NO.2730–3921、SEQ ID NO.5498–6683、SEQ ID NO.8409–8560、SEQ ID NO 8742、SEQ ID NO.8744、SEQ ID NO.8812–8815、SEQ ID NO.8845和SEQ ID NO.8850，或(b) 从选自以下植物miRNA前体序列获得的成熟miRNA：SEQ ID NO. 1036–2690、SEQ ID NO.3922–5497、SEQ IDNO.6684–8408、 SEQ ID NO.8561–8741、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和 SEQ IDNO.8816–8819；而且miRNA诱骗序列包含约19个至约 36个连续RNA核苷酸的RNA序列，其中miRNA诱骗序列被内源 成熟miRNA识别并结合，导致miRNA诱骗序列与内源成熟miRNA 之间的碱基配对，因而形成包含以下的抗切割RNA双链体：(a)所述 miRNA诱骗序列与所述内源成熟miRNA之间在所述内源成熟 miRNA位置9、10或11上的至少一个错配，或在所述miRNA诱骗 序列对应于所述内源成熟miRNA位置10-11的位置上的至少一个插 入，(b)所述miRNA诱骗序列与所述内源成熟miRNA之间在所述内 源成熟miRNA位置1、2、3、4、5、6、7、8和9上的0、1或2个 错配，和(c)所述miRNA诱骗序列与所述内源成熟miRNA之间在所 述内源成熟miRNA位置12至最后一位上的0、1、2或3个错配， 其中在所述内源成熟miRNA位置12至最后一位上的每个所述错配 都邻近至少一个互补碱基对。

本发明的重组DNA构建体包含至少一个miRNA诱骗序列，并 且包含多个miRNA诱骗序列(可以是单miRNA诱骗序列的多拷贝， 或不同miRNA诱骗序列的拷贝，或这两者的组合)。在一个实例中， 多拷贝的miRNA诱骗序列在重组DNA构建体中串联排列，该设计 用于降低相应成熟miRNA的活性。在另一个实例中，通过表达可转 录为多个不同miRNA诱骗序列的单个嵌合重组DNA构建体，来降 低不同的成熟miRNA的活性。miRNA诱骗序列的表达可被不同启 动子驱动，这些启动子包括但不限于组织特异性启动子、细胞特异 性启动子、时间特异性启动子、诱导型启动子或组成型启动子，例 如在标题“启动子”下描述的任何启动子。miRNA诱骗序列可位于 转录物的不同位置。在也可转录为编码序列、非编码序列(例如miRNA)或这两者的重组DNA构建体中，miRNA诱骗序列优选位于 内含子内或聚腺苷酸化信号之后，以允许编码序列、非编码序列或 这两者的正常转录。

在本发明的另一些实施方案中，类似诱骗序列可用于调节参与 双链RNA介导的基因抑制的其它小RNA的活性，包括反式作用小 干扰RNA(ta-siRNA)、天然反义转录siRNA(nat-siRNA)和定相小 RNA(可参见以下文献：美国专利申请11/897,611，2007年8月31 日申请，其通过引用结合到本文中)。基本上采用与预测miRNA诱 骗序列相同的法则，来预测这些类似ta-siRNA诱骗序列、nat-siRNA 诱骗序列和定相小RNA诱骗序列，并且具有与miRNA诱骗序列类 似的用途。

miRNA诱骗序列可以是天然存在的序列或人工序列。在一个实 施方案中，至少一个miRNA诱骗序列包含天然存在的miRNA诱骗 序列，例如，通过生物信息学而鉴定的内源miRNA诱骗序列。在另 一个实施方案中，至少一个miRNA诱骗序列包含合成miRNA诱骗 序列，例如，经从头开始设计为结合给定成熟miRNA并形成抗切割 RNA双链体的序列。

因此，本发明的一个实施方案是重组DNA构建体，其可转录为 包含至少一个miRMON18诱骗序列的RNA转录物，该miRMON18 诱骗序列可被内源成熟miRMON18识别并结合、但不切割(例如不被 淘金者蛋白(Argonaute)或AGO样蛋白切割)，其中内源miRMON18是选自以下的至少一个：(a)成熟miRMON18，或(b)从植物 miRMON18前体序列获得的成熟miRNA；和包含约19个至约36个 连续RNA核苷酸的RNA序列的miRMON18诱骗序列，其中miRMON18诱骗序列可被内源成熟miRMON18识别并结合，导致 miRMON18诱骗序列与内源成熟miRMON18之间的碱基配对，因而 形成包含以下的抗切割RNA双链体：(a)miRNA诱骗序列与内源成 熟miRMON18之间在内源成熟miRMON18位置9、10或11上的至 少一个错配，或在miRMON18诱骗序列对应于内源成熟miRMON18 位置10-11的位置上的至少一个插入，(b)miRMON18诱骗序列与内 源成熟miRMON18在内源成熟miRMON18位置1、2、3、4、5、6、 7、8和9上的0、1或2个错配，和(c)miRMON18诱骗序列与内源 成熟miRMON18之间在内源成熟miRMON18位置12至最后一位上 的0、1、2或3个错配，其中在内源成熟miRMON18位置12至最后一位上的每个错配都邻近至少一个互补碱基对；而且其中至少一 个miRMON18诱骗序列被成熟miRMON18 miRNA识别并结合、但 不切割。在优选的实施方案中，成熟miRMON18具有SEQ ID NO. 393、SEQ ID NO.3227或SEQ ID NO.874的序列，或者是从选自 SEQ IDNO.1763和SEQ ID NO.3936的miRMON18前体序列获得 的成熟miRNA。本发明还提供在选自缺氮和缺磷的至少一种营养缺 乏下提供产量提高的非天然转基因作物的方法，该方法包括在非天 然转基因作物中表达可转录为包含至少一个miRMON18诱骗序列的 RNA转录物的重组DNA构建体。

本发明的另一个实施方案是重组DNA构建体，其可转录为包含 至少一个miRMON18诱骗序列的RNA转录物，该miRMON18诱骗 序列可被内源成熟miR399识别并结合、但不切割(例如不被淘金者 蛋白或AGO样蛋白切割)，其中内源miR399是选自以下的至少一个： (a)成熟miR399，或(b)从选自SEQ ID NO.8816–8819的miR399前 体序列获得的成熟miRNA；而且miR399诱骗序列包含约19个至约 36个连续RNA核苷酸的RNA序列，其中miR399诱骗序列被内源 成熟miR399识别并结合，导致miR399诱骗序列与内源成熟miR399 之间的碱基配对，因而形成包含以下的抗切割RNA双链体：(a) miR399诱骗序列与内源成熟miR399之间在所述内源成熟miR399 位置9、10或11上的至少一个错配，或在miR399诱骗序列对应于 内源成熟miR399位置10-11的位置上的至少一个插入，(b)miR399 诱骗序列与内源成熟miR399之间在内源成熟miR399位置1、2、3、 4、5、6、7、8和9上的0、1或2个错配，和(c)miR399诱骗序列 与内源成熟miR399之间在内源成熟miR399位置12至最后一位上 的0、1、2或3个错配，其中在内源成熟miR399位置12至最后一 位上的每个错配都邻近至少一个互补碱基对；而且其中至少一个 miR399诱骗序列被成熟miR399识别并结合、但不切割。在优选的 实施方案中，成熟miR399具有SEQ ID NO.8812–8815的序列，或 者是从选自SEQ ID NO.8816–8819的miR399前体序列获得的成熟 miRNA。本发明还提供在选自缺氮和缺磷的至少一种营养缺乏下提 供产量提高的非天然转基因作物的方法，该方法包括在非天然转基 因作物中表达可转录为包含至少一个miR399诱骗序列的RNA转录 物的重组DNA构建体。

本发明的再一个实施方案是对内源miRNA诱骗序列的抑制，例 如通过基因抑制元件(例如在标题“用于抑制表达的DNA元件”下 所述)，尤其是被细胞特异性启动子或组织特异性启动子或诱导型启 动子驱动。

本文所述的任何这些重组DNA构建体都可通过常用技术来制 备，例如在标题“制备和使用重组DNA构建体”下所述并参见工作 实施例。重组DNA构建体尤其可用于制备非天然转基因植物细胞、 非天然转基因植物和转基因种子，如以下“转基因植物细胞和转基 因植物”所述。

包含miRNA诱骗序列的重组DNA构建体可用于提供经工程改 造以抑制内源基因的合成miRNA的独特表达图式；这尤其可用于防 止由合成miRNA在某些组织中的不想要的表达而引起的不利表型。 例如，合成miRNA可用于仅在植物的特定组织中才抑制内源基因，例如通过重组DNA构建体在植物中的表达，该重组DNA构建体包 含：(a)驱动合成miRNA表达的组成型启动子，和(b)驱动miRNA诱 骗序列表达的组织特异性启动子，该miRNA诱骗序列经设计用于隐 蔽合成miRNA。

本发明还提供用于提供改良的作物的方法。本发明一方面包括 提供具有至少一个改变的性状的非天然转基因作物的方法，该方法 包括在非天然转基因作物中表达可转录为包含至少一个miRNA诱 骗序列的RNA转录物的重组DNA构建体，该miRNA诱骗序列被内源成熟miRNA识别并结合、但不切割(例如不被淘金者蛋白或AGO 样蛋白切割)，其中内源miRNA是选自以下的至少一种miRNA：(a) 选自以下成熟miRNA的成熟miRNA：SEQ ID NO.1–1035、SEQ ID NO.2730–3921、SEQ ID NO.5498–6683、SEQ ID NO.8409– 8560、SEQ ID NO8742、SEQ ID NO.8744、SEQ ID NO.8812– 8815、SEQ ID NO.8845和SEQ ID NO.8850，或(b)从选自以下植物 miRNA前体序列获得的成熟miRNA：SEQ ID NO.1036–2690、SEQ IDNO.3922–5497、SEQ ID NO.6684–8408、SEQ ID NO.8561– 8741、SEQ ID NO.8743、SEQ IDNO.8800和SEQ ID NO.8816– 8819；而且miRNA诱骗序列包含约19个至约36个连续RNA核苷酸的RNA序列，其中miRNA诱骗序列被内源成熟miRNA识别并结 合，导致miRNA诱骗序列与内源成熟miRNA之间的碱基配对，因 而形成包含以下的抗切割RNA双链体：(a)所述miRNA诱骗序列与 所述内源成熟miRNA之间在所述内源成熟miRNA位置9、10或11 上的至少一个错配，或在所述miRNA诱骗序列对应于所述内源成熟 miRNA位置10-11的位置上的至少一个插入，(b)所述miRNA诱骗 序列与所述内源成熟miRNA之间在所述内源成熟miRNA位置1、2、 3、4、5、6、7、8和9上的0、1或2个错配，和(c)所述miRNA诱 骗序列与所述内源成熟miRNA之间在所述内源成熟miRNA位置12 至最后一位上的0、1、2或3个错配，其中在所述内源成熟miRNA 位置12至最后一位上的每个所述错配都邻近至少一个互补碱基对， 因而相对于不表达重组DNA构建体的作物而言，导致非天然转基因 作物表现出选自以下的至少一个改变的性状：

(i)提高非生物胁迫耐性；

(ii)提高生物胁迫耐性；

(iii)提高针对植物的有害动物或病原体的抗性；

(iv)改变初级代谢产物组成；

(v)改变次级代谢产物组成；

(vi)改变微量元素、类胡萝卜素或维生素组成；

(vii)提高产量；

(viii)提高氮或其它营养物的利用能力；

(ix)改变农艺学特性；

(x)改变生长或生殖特性；和

(xi)提高收获、贮存或加工品质。

另一方面，本发明提供具有至少一个改变的性状的非天然转基 因作物的方法，该方法包括在非天然转基因作物中抑制至少一个内 源miRNA诱骗序列，该内源miRNA诱骗序列被内源成熟miRNA识 别并结合、但不切割(例如不被淘金者蛋白或AGO样蛋白切割)，其中内源miRNA是选自以下的至少一种miRNA：(a)选自以下成熟 miRNA的成熟miRNA：SEQ IDNO.1–1035、SEQ ID NO.2730– 3921、SEQ ID NO.5498–6683、SEQ ID NO.8409–8560、SEQ IDNO 8742、SEQ ID NO.8744、SEQ ID NO.8812–8815、SEQ ID NO. 8845和SEQ ID NO.8850，或(b)从选自以下植物miRNA前体序列获 得的成熟miRNA：SEQ ID NO.1036–2690、SEQ IDNO.3922– 5497、SEQ ID NO.6684–8408、SEQ ID NO.8561–8741、SEQ ID NO.8743、SEQ IDNO.8800和SEQ ID NO.8816–8819；而且 miRNA诱骗序列包含约19个至约36个连续RNA核苷酸的RNA序 列，其中miRNA诱骗序列被内源成熟miRNA识别并结合，导致 miRNA诱骗序列与内源成熟miRNA之间的碱基配对，因而形成包 含以下的抗切割RNA双链体：(a)所述miRNA诱骗序列与所述内源 成熟miRNA之间在所述内源成熟miRNA位置9、10或11上的至少 一个错配，或在所述miRNA诱骗序列对应于所述内源成熟miRNA 位置10-11的位置上的至少一个插入，(b)所述miRNA诱骗序列与所 述内源成熟miRNA之间在所述内源成熟miRNA位置1、2、3、4、 5、6、7、8和9上的0、1或2个错配，和(c)所述miRNA诱骗序列 与所述内源成熟miRNA之间在所述内源成熟miRNA位置12至最后 一位上的0、1、2或3个错配，其中在所述内源成熟miRNA位置12 至最后一位上的每个所述错配都邻近至少一个互补碱基对；因而相 对于不表达重组DNA构建体的作物而言，导致非天然转基因作物表 现出选自以下的至少一个改变的性状：

(i)提高非生物胁迫耐性；

(ii)提高生物胁迫耐性；

(iii)提高针对植物的有害动物或病原体的抗性；

(iv)改变初级代谢产物组成；

(v)改变次级代谢产物组成；

(vi)改变微量元素、类胡萝卜素或维生素组成；

(vii)提高产量；

(viii)提高氮或其它营养物的利用能力；

(ix)改变农艺学特性；

(x)改变生长或生殖特性；和

(xi)提高收获、贮存或加工品质。

可通过包括在非天然转基因作物中表达基因抑制元件(例如在标 题“对内源或天然miRNA的抑制”下所述的用于抑制表达的DNA 元件)的任何方法或通过任何其它的基因抑制方法，来达到对至少一 个内源miRNA诱骗序列的抑制。

在一个非限制性实例中，转基因植物在营养充足条件下过量表 达针对miRNA(其在营养充足条件下高水平天然表达而在营养缺乏 条件下低水平天然表达)的至少一个miRNA诱骗序列，因而导致植 物在营养缺乏下的性能或产量提高，对营养的利用力提高。例如， miRMON18和miR399在缺氮或缺磷条件下低水平表达，而在氮磷 充足的条件下高水平表达，因而它们的天然靶基因在缺氮或缺磷条 件下被抑制，而在氮磷充足条件下以相对高的水平表达；这导致转 基因植物对氮和/或磷的利用力提高。因此，相对于不表达重组DNA构建体的植物而言，过量表达包含至少一个miRMON18诱骗序列(或 至少一个miR399诱骗序列)的重组DNA构建体的转基因植物，导致 在氮磷充足条件下以较高水平表达miRMON18天然靶基因(或miR399天然靶基因)。在一个非限制性实例中，预期过量表达包含至 少一个miRMON18诱骗序列的重组DNA构建体的转基因植物能积 累相对高水平的天然miRMON18靶标(例如含有SPX结构域的基因， 例如图12所示的基因，如实施例7、9和10所述)。

实施例

本实施例描述鉴定作物(水稻和玉米)微RNA和它们的前体(折回) 结构的方法的非限制性实施方案，用于制备本发明的重组DNA构建 体。通过高通量测序(Margulies等(2005)Nature,437:376-380)，从成 熟水稻(Oryza sativa cv.Nipponbare)成熟谷粒(一式三份)和秧苗以及 从玉米(Zea mays)叶和玉米籽粒(授粉后39天)中克隆若干小(19-25个 核苷酸)RNA文库。由此得到的序列用于分别在水稻基因组序列和 玉米基因组序列中进行miRNA预测，使用来自先前已表征的miRNA 的一组法则，再按照手册指南来消除不良预测的折回结构。与注释 tRNA、rRNA、转座子/反转录转座子和其它已知重复序列、以及叶 绿体基因组或线粒体基因组完美匹配的小RNA排除在分析之外。

基因组研究学会(Institute for Genome Research)的水稻基因组注 释4.0版(公众可得自www.tigr.org)用于预测～310个核苷酸的两个侧 翼基因组区段，其中给定的小RNA位于所述区段左端或右端附近， 因而得到由280个核苷酸+小RNA+10个核苷酸组成的序列，或由 10个核苷酸+小RNA+280个核苷酸组成的序列。按照以下文献所 述，用Vienna软件包中的RNAfold程序，预测由此得到的各区段的 折回结构：Hofacker等(1994)Monatsh.f.Chemie,125:167-188。为了 便于结构预测，各小RNA的假丰度(pseudo-abundance)定为2。

根据从以下文献所述修饰而来的已证实的miRNA前体的特性， 来过滤结构：Jones-Rhoades等(2006)Annu.Rev.Plant.Biol., 57:19-53。对于水稻miRNA，过滤要求包括：(1)小RNA必须全部位 于预测折回(茎环)结构的一个臂内；(2)小RNA与其相反臂中的对应 物区段的核苷酸序列必须彼此具有至少75％互补性；和(3)小RNA及 其对应物，当形成不完美双链体时，必须不含多于3个核苷酸的对 称凸起(bulge)或多于2个核苷酸的不对称凸起。满足以上标准的预 测结构还可进一步过滤，即通过选择(1)仅长度为20或21个核苷酸 并且5’端碱基为尿嘧啶的小RNA；或(2)测序至少10次的小RNA。 最终过滤步骤包括：(1)选择与基因组具有少于23个完美匹配的小 RNA，以除去重复元件，和(2)用于预测的区段不含来自负链的小 RNA。在当鉴定出多个重叠小RNA的情况下，选择其中最丰富的成 员作为代表性的序列。

就玉米miRNA预测而言，预测/过滤步骤是从用于水稻miRNA 的步骤修改而来，因为尚不可使用完整玉米基因组。独立分析来自 玉米叶和玉米籽粒文库的小RNA，以便使用小RNA丰度来进行 miRNA预测。将小RNA作图到Maize Assembled Gene Islands(MAGI 第4版)，这是公众可得的装配玉米基因组序列数据库，描述于Fu 等(2005),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,102:12282-12287。具有来自正负 链的小RNA的序列排除在外。采用与水稻所用的相同需要，预测和 过滤微RNA折回结构，并且进一步手工检查，以消除具有大(>100 个核苷酸)或高不配对环区的结构。通过过滤而排除的先前表征的 miRNA用于表明假阴性。

分析来自水稻的大小范围在19-25个核苷酸的总共260676个独 特小RNA中推定的新miRNA。过滤并手工检查后，对应于1072基 因座的840个小RNA被鉴定为新的水稻miRNA。过滤后，捕获了 miRNA数据库“miRBase”(可得自microrna.sanger.ac.uk/sequences/) 中存在的27个已知miRNA家族和原始独特序列组22个家族。根据 已表征miRNA(miRBase)估计的18.5％的假阴性率表明，通过该方法 捕获大部分miRNA。从来自玉米籽粒的总共126691个小RNA中， 鉴定出对应于MAGI第4.0版玉米基因组序列中的281基因座的116 个新的玉米miRNA；同样，从来自玉米叶的总共53103个小RNA 中，鉴定出对应于302基因座的79个新的玉米miRNA。水稻miRNA 和玉米miRNA以及它们相应的miRNA前体序列、以及各miRNA前 体序列中成熟miRNA的核苷酸位置，可按其各自的序列标识号归于 下表1：玉米籽粒miRNA(SEQID NO.1–116)、玉米叶miRNA(SEQ ID NO.117–195)、水稻miRNA(SEQ ID NO.196–1035)、玉米籽 粒miRNA前体序列(SEQ ID NO.1036–1316)、玉米叶miRNA前体 序列(SEQ IDNO.1317–1618)和水稻miRNA前体序列(SEQ ID NO. 1619–2690)。总共174个预测的新的玉米miRNA(代表528基因组 座位)包括与先前在并非玉米的物种中鉴定的已知miRNA相同的9个miRNA直向同源物；这些都列于下表2。

表1：玉米和水稻miRNA和miRNA前体

表1(续)

表1(续)

表1(续)

表1(续)

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表1(续)

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表1(续)

表1(续)

表1(续)

表2:玉米miRNA

*“ptc”,毛果杨(Populus trichocarpa)；“osa”,水稻(Oryza sativa)； “ath”,拟南芥(Arabidopsis thaliana)；“sbi”,高粱(Sorghum bicolor)

根据以下文献所述的序列互补法则，使用基因组研究学会 (Institute forGenome Research)的水稻基因组注释第4.0版(公众可得 自www.tigr.org)，对预测是新的水稻miRNA的靶标的水稻基因进行 了预测：Zhang(2005)Nucleic Acids Res.,33:W701-704和Rhoades等 (2002)Cell,110:513–520。这些预测靶标是包含至少一个miRNA识 别位点的序列，该识别位点被选自以下的成熟miRNA识别：SEQ ID NO.1–1035、SEQ ID NO.2730–3921、SEQ ID NO.5498–6683、 SEQ ID NO.8409–8560、SEQ ID NO 8742、SEQ ID NO.8744、SEQ ID NO.8812–8815、SEQ ID NO.8845和SEQ ID NO.8850，或被 从选自以下植物miRNA前体序列获得的成熟miRNA识别：SEQ ID NO.1036–2690、SEQ ID NO.3922–5497、SEQ IDNO.6684– 8408、SEQ ID NO.8561–8741、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800 和SEQ IDNO.8816–8819。表3列出被水稻成熟miRNA(SEQ ID NO.197)识别的miRNA识别位点(SEQ IDNO.2691–2729)的非限 制性实例。

表3

表3(续)

表3(续)

预测水稻靶标 miRNA识别位点

3(续)

预测水稻靶标 miRNA识别位点

本实施例描述重组DNA构建体的非限制性实施方案，其中用于 调节至少一个靶基因表达的至少一个可转录DNA元件包含用于抑 制从选自以下植物miRNA前体序列获得的内源miRNA的表达的 DNA元件：SEQ ID NO.1036–2690、SEQ ID NO.3922–5497、SEQ IDNO.6684–8408、SEQ ID NO.8561–8741、SEQ ID NO.8743、 SEQ ID NO.8800和SEQ IDNO.8816–8819。更具体地讲，本实施 例说明用于抑制靶基因(例如内源miRNA或内源miRNA诱骗序列) 表达的DNA元件的非限制性实例。

图2A示意性描绘了用于抑制靶基因(例如内源miRNA)表达的 DNA元件的非限制性实例。这些DNA元件包含用于抑制至少一个 第一靶基因的至少一个第一基因抑制元件(“GSE”或“GSE1”)，其中第 一基因抑制元件嵌入内含子中，其一侧或两侧邻接非蛋白质编码 DNA。这些DNA元件利用内含子(在许多实施方案中，优选得自5’ 非翻译区的内含子或表达增强内含子)来递送基因抑制元件，而无需 任何蛋白质编码外显子(编码序列)的存在。DNA元件可任选包含用 于抑制至少一个第二靶基因的至少一个第二基因抑制元件(“GSE2”)，用于表达至少一个目标基因(其可以是编码序列或非编码 序列或这两者)的至少一个基因表达元件(“GEE”)或这两者。在含有任 选基因表达元件的实施方案中，基因表达元件可位于内含子之外(例 如与内含子相邻)。在某些实施方案中，含有第一基因抑制元件的内 含子是终止子的3’。

为了根据现有技术而更明确地区分本发明的DNA元件(含有至 少一个基因抑制元件，其嵌入在一侧或两侧侧接非蛋白质编码DNA 的一个内含子中)，图2B示意性描绘了重组DNA构建体的现有技术 的实例。这些构建体可含有位于邻近侧接蛋白质编码序列的内含子、 或在两个不连续的内含子之间的基因抑制元件(其中基因抑制元件并 不包含在这两个不连续内含子的任一个之内)，或可包含含有嵌入在 内含子中的基因抑制元件的基因表达元件，该内含子侧接多个外显 子(例如包含蛋白质编码序列的外显子)。

图3描绘了用于抑制靶基因(例如内源miRNA)表达的DNA元件 的各种非限制性实例，其可用于本发明的重组DNA构建体。当划出 一条单链时(图3A至图3E)，这些都按常规以5’至3’(左到右)转录 方向来描绘；箭头表明反义序列(箭头指向左)、或有义序列(箭头指向右)。这些DNA元件可包含：包含至少一个反义DNA区段的DNA， 该反义DNA区段对至少一个第一靶基因的至少一个区段而言是反 义的，或包含多拷贝的至少一个反义DNA区段的DNA，该反义DNA 区段对至少一个第一靶基因的至少一个区段而言是反义的(图3A)； 包含至少一个有义DNA区段的DNA，该区段是至少一个第一靶基 因的至少一个区段，或包含多拷贝的至少一个有义DNA区段的 DNA，该有义DNA区段是至少一个第一靶基因的至少一个区段(图3B)；可转录为RNA并通过形成双链RNA而抑制至少一个第一靶基 因的DNA，并且该DNA包含至少一个反义DNA区段和至少一个有 义DNA区段，该反义DNA区段对至少一个靶基因的至少一个区段 而言是反义的，而该有义DNA区段是至少一个第一靶基因的至少一 个区段(图3C)；可转录为RNA并通过形成一个双链RNA而抑制至 少一个第一靶基因的DNA，并且该DNA包含多个连续反义DNA区 段和多个连续有义DNA区段，这些反义DNA区段对至少一个第一靶基因的至少一个区段而言是反义的，而这些有义DNA区段是至少 一个第一靶基因的至少一个区段(图3D)；可转录为RNA并通过形成 多个双链RNA而抑制至少一个第一靶基因的DNA，并且该DNA包 含多个反义DNA区段和多个有义DNA区段，这些反义DNA区段对 至少一个第一靶基因的至少一个区段而言是反义的，而这些有义 DNA区段是至少一个第一靶基因的至少一个区段，并且其中所述多 个反义DNA区段和多个有义DNA区段以一系列反向重复序列方式 排列(图3E)；和包含从miRNA获得的核苷酸的DNA、或包含siRNA 的核苷酸的DNA(图3F)。

图3F描绘了可由DNA元件的实施方案转录而来的、用于抑制 靶基因表达(例如内源miRNA)的双链RNA的各种非限制性排列，用 于本发明的重组DNA构建体。当形成这样的双链RNA时，它可抑 制一个或多个靶基因，并且可形成一个双链RNA或多个双链RNA、 或一个双链RNA“茎”或多个“茎”。当形成多个双链RNA“茎” 时，它们可以“锤头”或“三叶草”形式排列。在某些实施方案中， 双链茎可形成“假结(pseudoknot)”排列(例如当一个双链茎的间隔区 或环RNA形成第二双链茎部分时)；参见例如以下文献中对假结构 造的描述：Staple和Butcher(2005)PLoS Biol.,3(6):e213。间隔DNA (位于dsRNA区之间或邻近dsRNA区)是任选的，但通常包含和一般 包含不符合靶基因的DNA(尽管在某些实施方案中可包含靶基因的 有义或反义DNA)。间隔DNA可包含以下序列：其可转录为单链RNA 或至少部分双链RNA(例如以“相吻茎环”排列)、或可转录为假定 二级结构或三维构型(例如靶基因或适配子的反义序列的大环)的 RNA，该RNA赋予转录物额外的所需特性，例如稳定性提高、体内 半衰期延长或者细胞特异性或组织特异性提高。

用于抑制靶基因表达的DNA元件和方法的其它描述可参见例如 美国专利申请公布说明书2006/0200878，其通过引用结合到本文中。

本实施例描述使用微RNA、微RNA前体、微RNA识别位点和 微RNA启动子来调节至少一个靶基因表达的方法的非限制性实施方 案。

miRNA或其识别位点的不同潜在用途由miRNA的表达图式来 表示。有关给定成熟miRNA的表达的空间或时间分布或诱导性的知 识可用于例如设计以空间或时间或诱导型特异性方式来表达的重组 构建体。确定成熟miRNA的表达图式的一个非限制性方法是通过分 离成熟miRNA(或其前体)并通过用合适探针(即对成熟miRNA或 miRNA前体具有特异性的探针)的RNA印迹来分析表达图式。

图4描绘了从不同玉米组织中分离的成熟miRNA的RNA印迹 结果的非限制性实施例。将一个探针与来自两个家族(miR156和 miR157)的成熟miRNA杂交。各个成熟miRNA在特定细胞或组织中 以不同水平表达，例如Zm-miR390在根和成长叶中不表达或仅以低 水平表达，而miR156在根、叶和雄花穗(tassel)中表达。因此，例如， 包含由组成型启动子驱动的转基因转录单元和被玉米miR390成熟 miRNA识别的miRNA识别位点的本发明重组DNA构建体可用于转 基因在根和成长叶组织中表达，但不在高水平表达成熟miR390的组 织中表达。为了进一步说明本发明的构建体和方法在调控转基因表 达中的用途，用报道基因作为转基因本身，或者作为转基因的替代 物。例如，当需要报道基因(例如绿色荧光蛋白,GFP)在玉米秆和未 成熟穗组织中表达时，将miR156靶位点包含在GFP表达盒中并在 稳定的转基因玉米植物中、在CaMV 35S启动子控制之下表达。在 强表达miR156的组织(例如根、叶和雄花穗)中，GFP表达被抑制。 抑制表型可局限于受抑制组织内非常特殊的细胞类型，而邻近细胞 表现出在邻近表达成熟miR156的细胞的GFP的表达或表达梯度。

确定成熟miRNA的表达图式的另一个非限制性方法是通过分析 包含成熟miRNA序列的核酸序列的转录概况，例如通过包括以下步 骤的通用方法：

(a)提供包含茎环区的起始miR序列，例如来自“miRBase”数 据库(可得自microrna.sanger.ac.uk/sequences)中的公众可得的miR序 列；

(b)使用序列分析算法，例如本领域众所周知的BLAST(参见 Altschul等(1990)J.Mol.Biol.,215:403-410)，鉴定同源或相同序列(例 如根据用玉米全基因组DNA制备的微阵列探针组上的专有序列)； 和

(c)分析步骤(b)中鉴定的同源探针组序列的转录概况并鉴定在 所需组织(即雄性或雌性生殖组织)中具有表达图式的miRNA。

优选加上第4步：

(d)对于发现具有所需转录概况的同源探针组序列来说，证实对 miRNA基因的鉴定，即通过将起始miR序列的茎环序列与探针组序 列进行比对，或者对于潜在新的miRNA，确定序列预测能折叠成 miRNA的茎环结构特征。还优选使用任选步骤，其中包括针对额外序列数据组(dataset)(而不是探针组序列数据组)的一个或多个 BLAST比较(在以上步骤(b)之前)，允许对落入miR基因预测折回区 之外的探针进行进一步鉴定；假阳性(例如因为在包含不正确剪接片 段重叠群(contigs)的额外序列数据组的匹配所致的假阳)，因其缺乏 miRNA特征(例如合适折回结构)而得以鉴定并除去。

图5描绘了探针组序列的转录概况，这些序列用前述段落所述 方法鉴定为包含对玉米雄性生殖组织(花粉)具有特异性的表达图式 的miRNA前体序列。这些miRNA前体适用于本发明重组DNA构建 体，其设计用于在非天然条件下(例如在对miRNA前体而言并非天然启动子的启动子的控制之下)表达天然miRNA(在该实施例中，为 花粉特异性miRNA)。这些miRNA前体也可用于提供可经修饰或工 程改造以抑制并非天然或内源靶基因的靶基因的“支架(scaffold)” 序列。本发明的重组DNA构建体的一个非限制性实例包含用于驱动编码苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)杀虫蛋白或蛋白片段 (“Bt”)的转基因转录单元表达的强组成型启动子和花粉特异性 miRNA的识别位点，导致Bt在除花粉之外的植物组织中强表达。另 外，这些miRNA前体的天然启动子可用于任何目标基因的花粉特异 性表达。

在一个替代方法中，使用例如以下文献所述的序列互补法则， 可鉴定现有(天然或内源)miRNA识别位点：Zhang(2005)Nucleic Acids Res.,33:W701-704和Rhoades等(2002)Cell,110:513-520。使天 然miRNA识别位点充分突变(例如通过化学诱变)，以减少或防止切 割(参见Mallory等(2004)Curr.Biol.,14:1035-1046)。因此，可使含 有天然miRNA识别位点并具有所需效应(例如叶片或种子大小增加) 的基因发生突变，因而其表达水平比当存在未突变天然或内源 miRNA识别位点时更高。一个实施方案是用工程同源物替代天然基 因，其中天然miRNA已发生突变或者甚至缺失，这样对给定miRNA 切割的敏感性更低。

该方法的另一具体实例是在玉米根中基本不表达、但在大多数 其它组织表达的成熟miRNA(例如但不限于miRNA162、miRNA164 或miRNA390，如图4所示)的一个或多个识别位点包含在重组DNA 构建体中，用于以转基因的形式表达苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白或蛋白片段(“Bt”,参见例如以下文献中公开的苏云金芽孢杆菌杀虫序列 和方法及其应用：美国专利号6,953,835和美国临时专利申请号 60/713,111，2005年8月31日申请，通过引用结合到本文中)，例如 在包含表达盒e35S/Bt/hsp17的构建体中。表达盒中包含这些识别位点中的一个或多个，能降低转录物在并非根的大多数组织中的表达， 但在根中维持高水平的Bt靶RNA表达，例如最好用于害虫例如玉 米根虫的防治。在类似实施方案中，构建体中包含不同miRNA识别 位点的组合，以便在一种或多种特定组织中得到所需表达图式。

本实施例描述作物微RNA及其前体(折回)结构的额外非限制性 实施方案，用于制备本发明的重组DNA构建体。通过30个玉米文 库的高通量测序(Margulies等(2005)Nature,437:376-380)，总共得到 1327933个独特小RNA(长度为20-24个核苷酸)。所得序列用于根据 玉米基因组序列来预测玉米微RNA及其前体结构，使用以上实施例 1所述的方法。在1576个专有玉米基因组序列中预测共有1192小 RNA是新miRNA。玉米miRNA及其相应的miRNA前体、以及各 miRNA前体序列中成熟miRNA的核苷酸位置，可按其各自的序列 标识号归于下表4：玉米miRNA(SEQ ID NO.2730–3921)和玉米 miRNA前体序列(SEQ IDNO.3922–5497)。

表4:玉米和水稻miRNA和miRNA前体

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本实施例描述作物微RNA及其前体(折回)结构的额外非限制性 实施方案，用于制备本发明的重组DNA构建体。

自在水胁迫和对照条件下生长的玉米(Zea mays)或大豆(Glycine max)制备小RNA文库(表5)。用从1.0(无影响或对照)至4.0的相对 评分系统评价干旱期的大豆；大豆植物各期的实例见图6。由此得到 的小RNA序列用于分别根据玉米或大豆基因组序列预测额外的新的 微RNA及其前体(折回)结构，使用以上实施例1所述的方法。从玉 米中，在1725个玉米基因组序列中预测1186个玉米miRNA，而从 大豆中，在181个大豆基因组序列中预测134个大豆miRNA(表6)。 这些miRNA及其相应的miRNA前体序列、以及各miRNA前体序列 中成熟miRNA的核苷酸位置，可按其各自的序列标识号归于下表6： 玉米miRNA(SEQ IDNO.5498–6683)、玉米miRNA前体序列(SEQ ID NO.6684–8408)、大豆miRNA(SEQ IDNO.8409–8560)和大豆 miRNA前体序列(SEQ ID NO.8561–8741)。

表5

*对于自大豆制备的文库39和41，将所示各期的样品合并在一起； 大豆干旱期用以下相对评分系统进行评价：

1.0＝无影响

1.5＝分生组织或1片三小叶枯萎

2.0＝2片三小叶枯萎

2.5＝所有三小叶都枯萎

3.0＝底部三小叶完全干枯易碎

3.5＝除顶部一片之外，所有三小叶都完全干枯易碎，顶部三小叶仍 然柔软

4.0＝所有都完全干枯易碎

表6:玉米和大豆miRNA和miRNA前体

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微RNA及其前体和启动子，尤其是在水充足和水不足(干旱或 水胁迫)条件下具有差异表达图式的那些，可用于在经历水胁迫的作 物中工程改造所需性状(例如提高产量、提高发芽率)。在对其它非生 物或生物胁迫条件具有特异性的表达图式的其它miRNA中也发现 类似用途，这类miRNA例如在营养充足和营养不足条件、或者在热 胁迫和热非胁迫条件下具有差异表达图式的miRNA。合适方法包括 将外源miRNA识别位点引入序列，缺失或修饰序列中的内源miRNA 识别位点，工程改造天然miRNA或miRNA前体序列，以便识别并 非内源靶序列的序列，以及利用miRNA启动子来提供特定表达图 式。

本实施例描述具有特定表达图式的作物miRNA(miRMON18)的 鉴定，所述表达图式的特征为在氮充足条件下强表达、而在缺氮条 件下抑制，或者在磷充足条件下强表达、而在缺磷条件下抑制。

按照实施例1和实施例5所述技术，从水稻(Oryza sativa cv. Nipponbare)、玉米(Zea mays var.LH244)和大豆(Glycine max var. A3525)的不同组织和发育期克隆小RNA并鉴定推定的miRNA。将 各文库的小RNA丰度标准化，并按照转录物/四分之一百万序列(transcripts per quarter million sequence,tpq)来计算。在水稻(SEQ ID NO.393)、玉米(SEQ ID NO.3227)和大豆(SEQ ID NO.8742)小RNA 文库中鉴定出具有序列uuagaugaccaucagcaaaca的推定的成熟miRNA (小RNA编号为370903，已确定俗名为“miRMON18”)。该序列与 miRBase中的已知miRNA不匹配。

从水稻基因组中鉴定出miRMON18前体序列为ccaugaaccuguuuuguugcuggucaucuagcuacccgugcaugccuggagauuggagaau aauugacgaugcagcagucggcuuauuggcucuugggcacgcgugg

RNA印迹证实miRMON18 21聚体在采自正常(非胁迫)条件下生 长的植物的至少水稻(谷粒和秧苗)和玉米(籽粒、叶和根)组织样品中 表达，见图8A。微RNA前体起源自由RNA聚合酶II产生的聚腺苷 酸化转录物，玉米miRMON18前体(SEQ ID NO.3936,对应于探针 组A1ZM068928_at)的标准转录概况分析进一步证实在玉米胚乳、愈 伤组织和幼苗中表达提高(图8B)，而在该样品其它组织中的表达落 入500单位的检测截止阈值以下。

对玉米miRMON18前体(SEQ ID NO.3936)在缺水(干旱)(图 9A)、低温(图9B)和缺氮条件下(图9C)生长的植物的玉米组织中的表 达进行了分析。miRMON18前体的表达在根、芽、穗、籽粒和雄花 穗中相对不受水条件的影响，而相对于水充足条件而言，在缺水条 件下在叶和穗丝(silk)中的表达增加(图9A)；表达也相对不受温度的 影响(图9B)。然而，miRMON18表达对氮条件高度应答，其中相对 于在充足氮(20毫摩尔(mM)硝酸铵)时观察到的表达而言，在氮限制 (2毫摩尔(mM)硝酸铵)时观察到约2倍抑制(图9C)。通过对小RNA 样品的RNA印迹的磷光体成像定量测定(phosphor image quantification)，证实了这种氮-应答表达图式，在3个时间点显示出 对成熟miRMON18 21聚体的平均9.6倍的抑制(图10A)。因此， miRMON18在玉米胚乳和玉米籽粒中显示出总表达增加，而在缺氧 诱导的叶中强抑制。

在另一实验中，在水培系统中在充足磷下培养玉米，直到V3期， 然后剥夺磷多达3天。在磷剥夺开始后的第1天和第3天采集叶组 织样品。在第3天，让植物恢复到磷充足条件，恢复后30分钟和6 小时采样。在各时间点从在磷充足条件下持续培养的植物中采集对照样品。图10B描绘了用miRMON18探针分析的RNA印迹结果， 证明在该实验中，在叶组织中，玉米miRMON18成熟miRNA在磷 充足条件下表现出强表达，而在缺磷条件下表现出抑制。

本实施例描述具有被作物miRNA(miRMON18)天然调节的 miRNA识别位点(miRMON18识别位点)的基因的鉴定，其中表达图 式的特征为在氮充足条件下强表达、而在缺氮条件下抑制，或者在 磷充足条件下强表达、而在缺磷条件下抑制。

鉴定出成熟miRMON18(uuagaugaccaucagcaaaca,SEQ ID NO. 393,SEQ IDNO.3227或SEQ ID NO.8742)的推定靶标，其包含SPX (“SYG1/Pho81/XPR1”)结构域家族中的基因进化枝。SPX结构域属于 名称为Pfam PF03105的蛋白质家族/结构域，并且发现它是若干蛋白 质的N-端的疏水结构域，通常包含约180个残基的一段，其具有 35-47个氨基酸的3个较小亚结构域；参见例如Janelia Farms Research Campus of the Howard HughesMedical Institute的Pfam数据库的SPX 词条，公众可得自pfam.janelia.org/family？acc＝PF03105。

SPX结构域家族中的大多数蛋白质在其C-端都包含其它保守结 构域。例如，SPX结构域家族中的若干蛋白质在其C-端也包含EXS (“ERD1、XPR1和SYG1”)结构域，PfamPF03124，其可参与蛋白质 分选；参见例如pfam.janelia.org/family？acc＝PF03124。其它SPX蛋 白包括保守VTC(液泡转运蛋白(vacuolar transporter)陪伴分子2)结 构域，PfamPF09359；参见例如pfam.janelia.org/family？acc＝PF09359。 若干SPX蛋白包含保守MFS_1或MFS(“major facilitator superfamily”)结构域，Pfam PF07690，其可参与小的糖和无机盐等小 溶质的转运，以应答化学渗透离子梯度；参见 pfam.janelia.org/family？acc＝PF07690。SPX结构域可能是转录因子， 并且可作为二聚化结构域。

SPX蛋白包含PHO基因所编码的那些，其可参与将无机磷加载 到根的木质部；参见例如Wang等(2004)Plant Physiol.,135:400-411， 该作者描述了对若干PHO1同源物的鉴定、在这些蛋白质内SPX结 构域的保守性、以及PHO1启动子在根、叶、茎或花等维管组织和某 些非维管组织中的优势表达。SPX结构域家族中的蛋白质可能参与 G-蛋白缔合的信号转导(因此可能是无机磷的感受器)；参见Ticconi 和Abel(2004)Trends Plant Sci.,9:548-555。PHO1基因同时包含SPX 结构域和EXS结构域。PHO进化枝成员也包含RING结构域(At1g02860和At2g38920)或MFS结构域(At4g22990、At4g11810和 At1g63010)；参见Wang等(2004)Plant Physiol.,135:400-411，尤其是 图3和图6。

目前，已报道名称为NLA的基因是在拟南芥中低氮利用率的适 应性所需的；参见Peng等(2007)Plant Cell,50:320-337。NLA (“AtNLA”,locus At1g02860),称为UniProtKB/Swiss-Prot检索号 Q2V4F9，具有序列MRT3702_101115C,SEQ ID NO.8745；有关NLA 蛋白的注释公众可自beta.uniprot.org/uniprot/Q2V4F9和 pfam.janelia.org/protein？id＝Q94C80_ARATH。具有序列SEQ ID NO. 8745的拟南芥NLA基因含有SPX结构域、MFS_1结构域和RING 结构域，并包含位于核苷酸位置135至155的miR827识别位点(靶) 序列TGTTTGTTGATGGTCATCTAA(SEQ ID NO.8746)，其已证实 为拟南芥miR827的靶标。NLA编码C3HC4-型环指(RING-finger)泛 蛋白连接酶(AT1G02860.1,SEQ ID NO.8747)；该基因若发生突变就 会破坏拟南芥对氮限制的适应性。

对AtNLA基因的10个额外克隆进行了测序。克隆1、4和5含 有部分AtNLA序列(SEQID NO.8748)。克隆2含有缺乏SPX结构 域的AtNLA序列(SEQ ID NO.8749)。克隆3含有缺乏RING结构域 的AtNLA序列(SEQ ID NO.8750)。克隆6含有具有位于核苷酸位置 2142–2162的破坏的miR827识别位点(靶序列)的基因组AtNLA片 段(SEQ ID NO.8751)。克隆7含有另一AtNLA序列(At1g63010,SEQ ID NO.8752)。克隆8含有具有位于核苷酸位置2142–2162的破坏 的miR827识别位点(靶序列)的另一基因组AtNLA片段(At1g63010, SEQ IDNO.8753)。克隆9含有缺乏SPX结构域的另一AtNLA序 列(At1g63010,SEQ ID NO.8754)。克隆10含有缺乏MFS结构域的 AtNLA序列(At1g63010,SEQ ID NO.8755)。

大量“实际”cDNA自玉米基因组和cDNA序列装配，描述了 miRMON18所靶向的独立基因。这些新的miRMON18靶标 (“SPX_MFS_117961287”,来自BAC的GI:117961287)中的第一个具 有序列SEQ ID NO.8756并包含核苷酸位置326–328的ATG起始 密码子和核苷酸位置2414–2416的TGA终止密码子；由SEQ ID NO. 8756编码的最长可读框(翻译框＝2)具有氨基酸序列SEQ ID NO. 8757。这第一个新的miRMON18靶基因的一个替代剪接形式是SEQ IDNO.8758(“SPX_MFS_117961287_2”)，其包含核苷酸位置87–89 的ATG起始密码子和核苷酸位置1137–1139的TGA终止密码子； 由SEQ ID NO.8758编码的最长可读框(翻译框＝3)具有氨基酸序列 SEQ ID NO.8759。

这些新的miRMON18靶标中的第二个具有序列SEQ ID NO. 8760(“SPX_MFS2”,来自BAC的GI:118200525)并包含核苷酸位置 201–203的ATG起始密码子和核苷酸位置2295–2297的TGA终止 密码子；由SEQ ID NO.8760编码的最长可读框(翻译框＝3)具有氨 基酸序列SEQ ID NO.8761。这个第二新的miRMON18靶基因的一 个替代剪接形式是SEQ IDNO.8762(“SPX_MFS_117961287_2”)， 其包含核苷酸位置145–147的ATG起始密码子和核苷酸位置1189 –1191的TGA终止密码子；由SEQ ID NO.8762编码的最长可读框 (翻译框＝1)具有氨基酸序列SEQ ID NO.8763。

第三个新的miRMON18靶标包含来自EST数据的凹凸(stitched) cDNA序列并具有序列SEQ ID NO.8764(来自BAC的GI: 126116193)并在核苷酸位置217–219和1034–1036包含2个可能 的ATG起始密码子以及在核苷酸位置2093–2095包含TGA终止密 码子。通过同源性从两个可能可读框预测2种蛋白质；第一种蛋白(预 测移码为1)含有625个氨基酸并具有序列SEQ ID NO.8765，而第 二种蛋白含有353个氨基酸并具有序列SEQ ID NO.8766。

用ClustalW(1.82版)对这些新的玉米miRMON18靶基因所编码 的肽进行比对；所得多序列比对见图11，显示出玉米SPX结构域(用 下划线序列表示，如果有的话)和玉米MFS结构域(用黑体序列表示)。

自BAC115312385的额外克隆工作证实第一miRMON18靶的序 列(“SPX_MFS_117961287”,SEQ ID NO.8756)并产生基因组 SPX_MFS2序列SEQ ID NO.8767，其中进一步鉴定出前导序列(用 斜体表示)、5’内含子(用下划线表示)、外显子(用大写字母表示)和miRMON18识别位点(位于SEQ ID NO.8767核苷酸2628–2648并 用黑体表示)：

导序列(用斜体表示)、5’内含子(用下划线表示)、外显子(用大写 字母表示)和miRMON18识别位点(位于SEQ ID NO.8767核苷酸 2628–2648并用黑体表示)：

对于SPX基因，搜索TIGR转录物数据库中的SPX:MFS结构域 编码序列。这些基因的鉴定可支持高等植物中存在保守调节途径。 通过搜索起始密码子上游5’非翻译区中与miRMON18互补的保守序 列，发现推定的miRMON18靶位点。在葡萄(Vitis vinifera)中鉴定出 推定的mirMON18靶(TA40434_29760)，其序列为SEQ ID NO. 8768，其中miRMON18识别位点位于SEQ ID NO.8768的核苷酸323 –343。同样，在莴苣(Lactuca sativa)中鉴定出miRMON18靶标 (TA5852_4236)，其序列为SEQ ID NO.8769，其中miRMON18识别 位点位于SEQ ID NO.8769的核苷酸64–84。

在玉米、水稻和大豆等各种不同物种中鉴定出含有直向SPX-结 构域的基因，包括NLA样基因。当序列可用时，在5’UTR中鉴定出 推定的miRMON18或miR827靶序列(识别位点)。图12描绘了为已 鉴定SPX基因而构建的系统树，通过ClustalW比对氨基酸序列，用10000次迭代测定自引(bootstrap)值；通过实验证实的含有预测 miRMON18识别位点(在来自并非拟南芥的物种的基因中)或预测 miR827识别位点(在来自拟南芥的基因中)的基因用黑体表示。除了 含有SPX结构域和RING结构域的拟南芥NLA基因AtNLA (MRT3702_101115C,At1g02860,SEQ ID NO.8770，其包含在核苷酸 135–155的miR827识别位点并编码序列为SEQ ID NO.8771的蛋 白质)之外，系统树中的基因还有玉米NLA样基因ZmNLA(SEQID NO.8772，编码序列为SEQ ID NO.8773的蛋白质)、大豆NLA样 基因GmNLA(SEQ IDNO.8774，编码序列为SEQ ID NO.8775的 蛋白质)、水稻NLA样基因OsNLA(SEQ ID NO.8776，编码序列为 SEQ ID NO.8777的蛋白质)；拟南芥序列At1g63010(SEQ ID NO. 8778，其包含核苷酸153–173的miR827识别位点并编码序列为SEQ ID NO.8779的蛋白质)、AT2g26660(SEQ ID NO.8780，编码序列 为SEQ ID NO.8781的蛋白质)和AT5g20150(SEQ ID NO.8782，编 码序列为SEQ ID NO.8783的蛋白质)；水稻序列Os02g45520(SEQ ID NO.8784，其包含核苷酸395–415的miRMON18识别位点，并 编码序列为SEQ ID NO.8785的蛋白质)和Os04g48390(SEQ ID NO. 8786，其包含核苷酸334–354的miRMON18识别位点，并编码序 列为SEQ ID NO.8787的蛋白质)；和玉米序列MRT4577_36529C (SEQ ID NO.8788，其包含核苷酸1660–1680的miRMON18识别 位点，并编码序列为SEQ ID NO.8789的蛋白质)、MRT4577_51705C (SEQ ID NO.8790，编码序列为SEQ ID NO.8791的蛋白质)、 MRT4577_375264C(SEQID NO.8792，编码序列为SEQ ID NO. 8793的蛋白质)、MRT4577_46983C(SEQ ID NO.8794，编码序列为 SEQ ID NO.8795的蛋白质)、MRT4577_340665C(SEQ ID NO. 8796，编码序列为SEQ ID NO.8797的蛋白质)和MRT4577_319995C (SEQ ID NO.8798，编码序列为SEQ IDNO.8799的蛋白质)。

几千碱基对的序列是玉米和水稻NLA样编码序列的可用上游， 其中从初步测序工作中未鉴定出miRMON18靶位点。根据表达概况 分析数据，看来ZmNLA(SEQ ID NO.8772)RNA水平对氮利用率不 应答。相比之下，图12所示的SPX-MFS结构域进化枝(SEQ ID NO. 8788、SEQ ID NO.8786、SEQ ID NO.8784和SEQ ID NO.8778)在 充足氮条件下、在玉米和拟南芥中受到抑制，并且预测会受到 miRMON18的调节；该进化枝中的序列含有经实验证实的miRMON18(或miR827)识别位点。树的顶端所显示的SPX进化枝 (SEQ ID NO.8798、SEQ IDNO.8796、SEQ ID NO.8794、SEQ ID NO.8782、SEQ ID NO.8780、SEQ ID NO.8792和SEQ IDNO.8790) (图12)仅含有可识别的SPX结构域，被有限氮抑制，并且也可预测 会受到miRMON18的调节。在玉米中，对应于进化枝1的基因(SEQ ID NO.8798、SEQ ID NO.8796、SEQID NO.8794、SEQ ID NO. 8792和SEQ ID NO.8780)的TxP数据与miRMON18前体表达相关；miRMON18前体的表达和进化枝1基因的表达都在氮充足条件下被 上调。SPX-MFS进化枝2中的基因(SEQ ID NO.8788、SEQ ID NO. 8786、SEQ ID NO.8784和SEQ ID NO.8778)受到miRMON18的直 接抑制，而进化枝1基因缺乏直接靶标，表明miRMON18可通过抑 制进化枝2基因而间接调节进化枝1基因表达。

本实施例描述具有特定表达图式的作物miRNA(miRMON18)启 动子的鉴定，所述表达图式的特征为在氮充足条件下强表达、而在 缺氮条件下抑制，或者在磷充足条件下强表达、而在缺磷条件下抑 制。

玉米miRMON18基因的进一步表征涉及miRMON18前体(SEQ ID NO.3936)与cDNA文库和微阵列元件的BLAST匹配，和来自玉 米(Zea mays var.LH244)的miRMON18基因组序列(SEQ ID NO. 8800)的反向PCR克隆，使用基于来自克隆LIB5025-018-A1-XP1-B6 的cDNA序列(SEQ ID NO.8801)的反向PCR引物。该miRMON18 基因组序列(SEQ ID NO.8800)具有图13所示的注释序列，其中以大 写字母给出SEQ ID NO.8800的核苷酸2173–2788的miRMON18转录物。该基因组序列也包含以小写字母表示的SEQ ID NO.8800 的核苷酸211–2172的miRMON18启动子元件、以小写字母表示的 SEQ ID NO.8800的核苷酸2173–2308的前导元件、以下划线加上 小写字母表示的SEQ ID NO.8800的核苷酸2144–2147的规范 TATA盒(末端是转录起始位点上游的25个核苷酸)、以下划线加上 大写字母表示的SEQ ID NO.8800的核苷酸2419–2439的成熟 miRMON18、以及以下划线加上大写字母表示的SEQ ID NO.8800的核苷酸2322–2341的miRMON18*。

为了证实miRMON18启动子的表达图式，在二元载体中构建了 2个重组DNA构建体(SEQ ID NO.8802和SEQ ID NO.8803)，其包 含驱动新霉素磷酸转移酶II(nptII)作为选择标记的水稻肌动蛋白1 启动子。质粒pMON111971中的构建体(SEQ ID NO.8802)依次包含miRMON18启动子(SEQ ID NO.8804)和驱动GUS基因(SEQ ID NO. 8806)表达的miRMON18前导序列(SEQ ID NO.8805)、和NOS终止 序列(SEQ ID NO.8807)。质粒pMON111967中的构建体(SEQ ID NO.8803)含有DnaK内含子(SEQ ID NO.8808)并且还依次包含 miRMON18启动子(SEQ ID NO.8804)、miRMON18前导序列(SEQ ID NO.8805)、GUS基因(SEQ ID NO.8806)和NOS终止序列(SEQ ID NO.8807)。用标题“制备和使用非天然转基因植物细胞和非天然 转基因植物”下所述的标准技术，用土壤杆菌介导的转化和抗生素 选择，将载体转化到玉米中。在氮充足和磷充足条件下，在转化玉 米叶中观察到强miRMON18-启动子驱动的GUS的表达。在缺氮或 缺磷条件下在转化玉米叶中GUS表达被抑制。

用于驱动转基因以天然miRMON18基因的表达图式而表达的 (即在氮充足条件下强表达、而在缺氮条件下抑制，或者在磷充足条 件下强表达、而在缺磷条件下抑制)替代miRMON18启动子序列包含 具有SEQ ID NO.8800的核苷酸211–2172的序列的启动子；与SEQID NO.8800的核苷酸211–2172具有至少85％、至少90％、至少 95％、或至少98％同一性的至少约50、至少约100、至少约150、至 少约200、至少约300、至少约400、或至少500个连续核苷酸的片 段，其中所述片段在至少一种植物组织中具有启动子活性，其特征 是在氮充足条件下强表达、而在缺氮条件下抑制，或者在磷充足条 件下强表达、而在缺磷条件下抑制；和与SEQ ID NO.8804具有至 少85％、至少90％、至少95％、或至少98％同一性的至少约50、至 少约100、至少约150、至少约200、至少约300、至少约400、或至 少500个连续核苷酸的片段，其中所述片段在至少一种植物组织中 具有启动子活性，其特征是在氮充足条件下强表达、而在缺氮条件 下抑制，或者在磷充足条件下强表达、而在缺磷条件下抑制。通过 常规技术证实对替代启动子序列的鉴定，例如证实TATA盒在启动 子序列内和证实在至少一种植物组织中的启动子活性(例如通过测定 重组DNA构建体包含启动子驱动的报道基因(例如GUS或萤光素酶) 在瞬时表达实验或在稳定转化的植物中的表达)。

本实施例描述作物miRNA(miRMON18)识别位点的鉴定，其中 表达图式的特征为在氮充足条件下强表达、而在缺氮条件下抑制， 或者在磷充足条件下强表达、而在缺磷条件下抑制。也公开了 miRNA、miRNA启动子和miRNA识别位点的使用方法。非限制性 实例包括在缺氮或缺磷条件下提供产量提高的非天然转基因作物的 方法，即通过在转基因作物中表达包含miRMON18-无应答的转基因 的重组DNA构建体，以及在缺氮或缺磷条件下提供产量提高的非天 然转基因作物的方法，即通过在转基因作物中表达包含miRMON18 识别位点的重组DNA构建体包含miRMON18识别位点，所述位点 已经添加到正常miRMON18-无应答的基因的序列中。

使用以下文献所述的序列互补法则等本领域已知方法，可完成 对识别位点的预测：Zhang(2005)Nucleic Acids Res.,33:W701-704和 Rhoades等(2002)Cell,110:513–520。经实验证实预测miRNA识别位 点的一个非限制性方法是称为RNA连接酶介导的cDNA5’端快速扩 增(“5’RLM-RACE”)的技术，其鉴定miRNA切割模式；参见例如 Kasschau等(2003)Dev.Cell,4:205-217和Llave等(2002)Science, 297:2053-2056。该方法依赖于RNA衔接分子与切割位点5’端的连接 并且依赖于RNA酶III酶(包括Ago1)留下的5’磷酸。对所得PCR产 物进行了测序，与预测miRNA在相对于miRNA 5’端而言的核苷酸 10和11之间的切割位点比对的克隆的相对数量提供对miRNA活性 的估计值。图14描绘了对水稻序列Os02g45520(SEQ ID NO.8784) 和Os04g48390(SEQ ID NO.8786)和玉米序列MRT4577_36529C (SEQ ID NO.8788)的miRMON18的预测切割。5’RLM-RACE测定 的结果用于证实在水稻序列Os02g45520(SEQ ID NO.8784)和 Os04g48390(SEQ ID NO.8786)中的预测miRMON18识别位点(靶位 点)切割，其中对24个克隆中的3个和16个克隆中的13个分别测序， 发现具有预测切割模式(在相对于miRMON18 5’端而言的核苷酸10 和11)。5’-RACE实验也部分证实了玉米SPX_MFS2序列SEQ ID NO. 8767中的miRMON18识别位点(数据未显示)。

实验证实了预测miRNA识别位点的另一非限制性方法是检查推 定靶标的表达水平，例如通过转录概况分析实验。可以预测，当不 表达miRNA时，真正的miRNA靶标的表达水平是高的，而当表达 miRNA时，miRNA靶标的表达水平则是低的。因此，当不表达 miRMON18时(即在缺氮或缺磷条件下)，miRMON18靶标预测具有 较高表达，而当表达miRMON18时(即在氮磷充足条件下)， miRMON18靶标预测表达则较低。图15B描绘了含有预测 miRMON18识别位点的玉米序列MRT4577_36529C(SEQ ID NO. 8788)的表达概况。MRT4577_36529C(SEQID NO.8788)不受水利用 率或温度的影响(在水充足或干旱条件下、或者在低温或常温下，观 察到转录物水平没有大的差异；数据未显示)，但在缺氮条件下比在 氮充足条件下表现出更高的表达水平，即表达图式与miRMON18的 相反，如图15A所示(另见图9和图10)，表明MRT4577_36529C(SEQ ID NO.8788)的确受到miRMON18的调节。

这些数据证实，miRMON18调节含有保守SPX结构域的基因。 miRMON18的表达在缺氮或缺磷时被抑制，允许在这样的条件下表 达内源miRMON18-调节的基因。对成熟miRMON18 miRNA或 miRMON18靶标(至少在miRMON18识别位点包含的基因)表达的操 作可用于改变植物对缺氮或缺磷的应答。

本发明一方面包括在缺氮或缺磷条件下提供产量提高的非天然 转基因作物的方法，即通过在转基因作物中表达miRMON18-无应答 的转基因。一个实施方案是在非天然转基因作物中表达包含合成 miRMON18-无应答的转基因序列的重组DNA构建体，其中合成miRMON18-无应答的转基因序列是：(a)由天然miRMON18-应答序 列获得，即通过缺失或修饰天然miRMON18-应答序列内的所有天然 miRMON18 miRNA识别位点(也就是说，消除或改变天然 miRMON18-应答序列的核苷酸)，所述识别位点被具有SEQ ID NO. 393、SEQ IDNO.3227或SEQ ID NO.8742序列的成熟miRMON18 miRNA识别，或被从选自SEQ ID NO.1763、SEQ ID NO.3936和 SEQ ID NO.8800的miRMON18前体序列获得的成熟miRMON18 miRNA识别，和(b)不被成熟miRMON18 miRNA识别。在一个非限 制性实例中，在图12所示的任何含保守SPX-结构域的基因中的 miRMON18识别位点都缺失或修饰，使得修饰SPX基因不被内源成熟miRMON18(SEQ ID NO.393、SEQ ID NO.3227或SEQ ID NO. 8742)识别和结合，而且因此从miRMON18的调节中解脱出来并因此 也从缺氮或缺磷的影响中解脱出来。在一个非限制性具体实例中， 玉米基因MRT4577_36529C(SEQ ID NO.8788)可从miRMON18调 节中解脱出来并因此通过表达修饰MRT4577_36529C基因而从缺氮 或缺磷的影响中解脱出来，其中miRMON18识别位点在其5’非翻译 区(SEQ ID NO.8788的核苷酸1660–1680)已经缺失或修饰，使得修 饰MRT4577_36529C基因不被成熟miRMON18(SEQ ID NO.393、 SEQ ID NO.3227或SEQ ID NO.8742)识别和结合。修饰 miRMON18-无应答的MRT4577_36529C用组成型启动子或组织特异 性启动子在玉米中表达，在氮充足和磷充足条件下提高营养摄取和 利用并导致在正常条件下、优选在缺氮或缺磷条件下使产量提高。

或者，miRMON18识别位点经工程改造成为正常miRMON18- 无应答-基因，其在氮充足条件下被抑制，而在缺氮条件时表达；这 是一个有用的方法，例如用氮转运基因，其在氮或磷限制条件下具 有增加的表现或产量，而在非限制条件下表达时则没有益处。

可用于根据对miRMON18或SPX基因表达的操作而提高氮或磷 利用的方法和重组DNA构建体的额外非限制性实例如下所述。

(A)

在植物中上调AtNLA(At1g02860,其含有SPX-RING结构域, SEQ ID NO.8745)的预测表型对低氮或低磷条件而言是组成型适应 性的并提高植物对营养的总体运输和利用；在SPX-RING进化枝 (SEQ ID NO.8772、SEQ ID NO.8770、SEQ ID NO.8774和SEQ IDNO.8776)中有关基因的上调预测也具有类似表型(图12)。载体编号 1至5是嵌合转录物，其包含非靶向5’非翻译区和3’非翻译区和 AtNLA编码区(SEQ ID NO.8745)；载体编号6包含基因组AtNLA (SEQ ID NO.8745)片段，其包含自内源AtNLA启动子至终止序列的 序列(以防止异位表达)，但其中天然miR827识别位点已缺失或修饰， 以防止被成熟miR827识别。

上调SPX-MFS进化枝基因(SEQ ID NO.8788、SEQ ID NO. 8786、SEQ ID NO.8784和SEQ ID NO.8778)(图12)的预测表型是 增加营养(尤其是氮和/或磷)运输，尤其是从来源到库(sink)组织，导 致产量增加。载体编号7、9和10是嵌合转录物，其包含非靶向5’ 非翻译区和3’非翻译区和At1g63010编码区(SEQ ID NO.8778)；载 体编号8包含基因组At1g63010(SEQ ID NO.8778)片段，其包含自 内源At1g63010启动子至终止序列的序列(以防止异位表达)，但其中 天然miR827识别位点已缺失或修饰，以防止被成熟miR827识别；载体编号11是嵌合转录物，其包含非靶向5’非翻译区和3’非翻译区 和Os04g48390编码区(SEQ ID NO.8786)；载体编号12包含基因组 Os04g48390(SEQ ID NO.8786)片段，其包含自内源Os04g48390启 动子至终止序列的序列(以防止异位表达)，但其中天然miRMON18 识别位点已缺失或修饰，以防止被成熟miRMON18(或在拟南芥中为 成熟miR827)识别。

通过MRT4577_319995C(SEQ ID NO.8798)的表达，用载体13- 15(表7)，评价了未分类功能、但预测被低氮利用率阻遏的SPX进 化枝基因的上调效应。

类似表达实验在玉米中进行。构建包含具有保守SPX结构域的 基因(参见图12)的载体(表7)并转化玉米。载体变异体包括含SPX基 因的基因组序列的载体和含SPX基因克隆的、受天然启动子驱动的 cDNA的载体。在非限制性实例中，载体16-18使用来自 MRT4577_36529C(SEQ ID NO.8788)的编码序列，并具有破坏的 miRMON18识别位点，允许在仅可表达天然启动子的充足氮条件下 表达转基因。也会制备仅表达来自MRT4577_36529C(SEQ IDNO. 8788)的MFS结构域的第三构建体(其代表缺乏SPX的天然替代剪接 同种型)并在玉米中测试氮的同化。

表7

*35S,花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子；FDA,果糖二磷酸醛缩 酶启动子(维管束鞘(bundle sheath)启动子)；PPDK,丙酮酸正磷酸二 激酶启动子(叶肉细胞启动子)；RCc3,水稻RCc3基因启动子(根特异 性启动子)

(B)

(C)

在另一实例中，将Os04g48390(SEQ ID NO.8786)的5’UTR与 由组成型启动子驱动的GUS融合；构建含有内源水稻序列的一种形 式(其中存在于miRMON18切割位点上的AUG已修饰为GUG)和另 一形式(其中在miRMON18切割位点上的AUG已修饰为GUG)。也 评价了将串联(2个或更多)合成miRMON18识别位点引入到3’UTR 的第三构建体。在不同营养(氮或磷)条件下生长的转化玉米植物和不 同组织中评价这些载体的GUS表达。

(D)

本实施例描述重组DNA构建体，其可转录为包含至少一个 miRNA诱骗序列的RNA转录物，所述miRNA诱骗序列被内源成熟 miRNA识别并结合，但不切割。在本发明的一个优选的实施方案中， 内源成熟miRNA是对营养胁迫应答的miRNA—例如成熟miRNA， 其表达可受到营养缺乏条件的上调或下调，相对于营养充足条件下 的表达而言。更具体地讲，本实施例描述对营养胁迫应答的成熟 miRNA(miR827、miRMON18和miR399)的miRNA诱骗序列。

实施例6–10描述表现出以下表达图式的2种miRNA即miR827 (SEQ ID NO.8744)和miRMON18(SEQ ID NO.393、SEQ ID NO. 3227或SEQ ID NO.8742)，其表达图式的特征为营养胁迫对miRNA 的调节(例如在缺氮、缺磷或氮磷同时缺乏条件下抑制miRNA)。另 一miRNA即在拟南芥中鉴定的miR399具有序列 UGCCAAAGGAGAGUUGCCCUG(SEQ ID NO.8812)；通过小RNA 测序，在玉米(SEQ ID NO.8813)水稻(SEQ ID NO.8814)和大豆 (SEQ ID NO.8815)中鉴定出相同miRNA。

发现玉米miR399基因可应答氮利用率。从专有cDNA数据组 中鉴定出玉米miR399前体，其包含具有序列SEQ ID NO.8816的 Zm-miR399 cDNA序列(MRT4577_22484C.8)，其在SEQ ID NO.8816 的核苷酸71–175含有Zm-miR399前体(SEQ ID NO.8817)；并包含 具有序列SEQ ID NO.8818的另一Zm-miR399 cDNA序列 (MRT4577_22487C.6)，其在SEQ IDNO.8818的核苷酸136–330 含有Zm-miR399前体(SEQ ID NO.8819)。玉米miR399前体的折回结构见图17A；图17B描绘了用对应于MRT4577_22487C.6(SEQ ID NO.8818)的探针A1ZM033468_at的转录概况分析实验结果，这些结 果表明Zm-miR399 pri-miRNA(SEQ IDNO.8817)在缺氮条件下被抑 制(黑色条柱)，而在氮充足条件下表达(白色条柱)。

在拟南芥中，已经报道miR399能应答无机磷利用率并抑制基因 进化枝，这些基因包含拟南芥PHO2基因(At2g33770，编码E2结合 酶(conjugase))和来自各种植物的推定PHO2直向同源物。无机磷剥 夺可诱导miR399的表达；miR399在磷充分供应条件下过量表达可 阻遏PHO2的表达并导致叶中的高磷浓度。参见Fujii等(2005)Curr. Biol.,15:2038-2043；Chiou等(2006)Plant Cell,18:412-421；Aung等 (2006)Plant Physiol..141:1000-1011；和Bari等(2006)Plant Physiol., 141:988-999。

在拟南芥IPS1转录物和基因的Mt4-TPSI家族的其它成员中发 现的一个保守的23个核苷酸的基序据报道对miR399具有序列互补 性，除了对应于成熟miR399的位置10和11的错配环之外，这可阻 止miR399:IPS1双链体的切割；参见Franco-Zorrilla等(2007)Nature Genetics,39:1033-1037。也含有对应于成熟miRNA位置10和11的 错配的一个类似的非切割序列据报道用于miR390；参见Axtell等 (2006)Cell,127:565-577。

开发了用于预测内源“微RNA诱骗序列”的法则，该序列可被 内源成熟miRNA识别并结合，导致miRNA诱骗序列与内源成熟 miRNA之间的碱基配对，因而形成因miRNA诱骗序列与成熟miRNA 间存在错配而不被切割的抗切割RNA双链体。一般而言，这些法则 定义(1)所需错配，和(2)允许但并非必需的错配。错配包括规范错配 (例如G-A、C-U、C-A)以及G::U摆动配对和得失位(indels)(核苷 酸插入或缺失)。

所需错配包括：(a)miRNA诱骗序列与内源成熟miRNA之间在 内源成熟miRNA位置9、10或11上的至少1个错配，或者，(b)在 对应于内源成熟miRNA的位置9、10或11的miRNA诱骗序列的位 置上的1、2、3、4或5个插入(即额外核苷酸)。在优选的实施方案 中，存在(a)miRNA诱骗序列与内源成熟miRNA之间在内源成熟 miRNA的位置10和/或11上的至少1个错配，或(b)在对应于内源成 熟miRNA的位置10和/或11的miRNA诱骗序列的位置上的至少1个插入。

允许但并非必需的错配包括：(a)miRNA诱骗序列与内源成熟 miRNA之间在内源成熟miRNA位置1、2、3、4、5、6、7、8和9 上的0、1或2个错配，和(b)miRNA诱骗序列与内源成熟miRNA 之间在内源成熟miRNA位置12至最后一位(即21个核苷酸的成熟 miRNA的位置21)上的0、1、2或3个错配，其中在内源成熟miRNA 位置12至最后一位上的每个错配都邻近至少一个互补碱基对(即使 得在内源成熟miRNA位置12至最后一位上有不超过2个连续错配)。 在优选的实施方案中，在内源成熟miRNA的位置1、2、3、4、5、6、 7和8上不存在错配(即所有都是互补碱基对)。

这些法则可用于从专有cDNA数据组中鉴定出大量含有内源 miRNA诱骗序列的玉米序列或大豆序列。表8提供针对miRMON18 (SEQ ID NO.393、SEQ ID NO.3227或SEQ IDNO.8742)的玉米 (Zea mays)内源miRNA诱骗序列；miRNA诱骗序列中的错配在 miRNA与miRNA诱骗序列之间的比对中用下划线表示。

表8

表9提供针对miR399(SEQ ID NO.8812、SEQ ID NO.8813、 SEQ ID NO.8814或SEQID NO.8815)的玉米(Zea mays)内源 miRNA诱骗序列；miRNA诱骗序列中的错配在miRNA与miRNA 诱骗序列之间的比对中用下划线表示。

表9

在2个cDNA序列(SEQ ID NO.8831和SEQ ID NO.8833)的负 链中鉴定出微RNAmiR399诱骗序列。表9提供的cDNA序列的6 框翻译分析没有显示任何长可读框，对这些相同序列进行BLAST搜 索，在公共数据库中也没有鉴定出任何蛋白质，表明这些基因可能 是非编码序列。miR399诱骗序列的玉米cDNA序列的比对见图18， 其中共有序列为SEQ IDNO.8834，并且显示出至少两组基因含有 miR399诱骗序列：第一组含有密切相关基因MRT4577_47862C.7 (SEQ ID NO.8827)、MRT4577_521786C.1(SEQ ID NO.8831)和MRT4577_135578C.1(SEQ ID NO.8833)，而第二组含有 MRT4577_36567C.8(SEQ IDNO.8829)。在含有miR399诱骗序列 (SEQ ID NO.8827、SEQ ID NO.8831和SEQ ID NO.8833)的第一组 玉米基因的miRNA诱骗序列与拟南芥IPS1(AT3G09922.1)miR399 “模拟”位点(由Franco-Zorrilla等报道，Franco-Zorrilla等(2007) Nature Genetics,39:1033-1037)之间仅有1个核苷酸差异；SEQ ID NO. 8826、SEQ ID NO.8830和SEQ ID NO.8832的位置12上的保守G 在拟南芥miR399“模拟”位点中被C取代。然而，玉米基因(SEQ ID NO.8827、SEQ IDNO.8831和SEQ ID NO.8833)与拟南芥IPS1 (AT3G09922.1)基因之间的同源性局限于miRNA诱骗序列位点。

表10提供针对miR399(SEQ ID NO.8812、SEQ ID NO.8813、SEQ ID NO.8814或SEQID NO.8815)的大豆(Glycine max)内源 miRNA诱骗序列；miRNA诱骗序列中的错配在miRNA与miRNA 诱骗序列之间的比对中用下划线表示。转录概况分析数据用于比较 内源miRNA诱骗cDNA序列和相应miRNA前体的表达；探针组包 括A1GM035741_at(对应于SEQ IDNO.8836)、A1GM069937_at(对 应于SEQ ID NO.8838)、A1GM074873_at(对应于SEQ ID NO.8840)、A1GM031412_at(对应于SEQ ID NO.8842)和 A1GM053788_at(对应于SEQ IDNO.8844)。

表10

转录概况分析实验用于比较玉米内源miR399诱骗cDNA序列和 相应的玉米miR399前体在不同氮条件下的表达。组1miR399诱骗 基因MRT4577_47862C.7(SEQ ID NO.8827)在缺氮条件下在玉米叶 中表现出约2倍下调(图19A)；组2miR399诱骗基因 MRT4577_36567C.8(SEQ ID NO.8829)在缺氮条件下在玉米叶中表 现出至少10倍以上的更明显下调(图19B)。通过RNA印迹对成熟 miR399(图19C)和miR399诱骗序列MRT4577_47862C.7(SEQID NO.8827)(图19D)的表达测定，证实这些结果。用来自低氮(2毫摩 尔)或高氮(20毫摩尔)下生长的玉米V6叶的5微克总RNA/泳道，进 行RNA印迹，同样检测成熟21个核苷酸的miR399(图19C)和 miR399诱骗序列MRT4577_47862C.7(SEQ ID NO.8827)(图19D， 主要条带在约600bp)的印迹。玉米miR399诱骗序列在氮充足条件 下更高表达水平反映出玉米miR399前体在氮充足条件下更高表达 水平(图17B)。

类似转录概况分析实验用于比较玉米内源miR399诱骗cDNA序 列和相应的玉米miR399前体在不同温度条件下的表达。组2miR399 诱骗基因MRT4577_36567C.8(SEQ IDNO.8829)在氮充足条件下在 玉米叶中表现出至少10倍以上的高表达，尤其是在白天时间里(图 20A)。这同样的基因当长期低温后在根(图20B)和芽(图20C)中表现 出至少2倍的下调。

也将内源miR399诱骗cDNA序列在玉米和大豆的不同组织中的 表达进行比较。图21A描绘了以下序列的表达水平：组1玉米 miR399诱骗序列SEQ ID NO.8827(MRT4577_47862C,代表为探针 A1ZM005814_at和A1ZM005813_s_at)和组2玉米miR399诱骗序列 SEQID NO.8829(MRT4577_36567C,代表为探针 A1ZM048024_at)、以及玉米pri-miR399序列SEQID NO.8818 (MRT4577_22487C.6,代表为探针A1ZM033468_at)。图21B描绘了 以下序列的表达水平：大豆miR399诱骗序列SEQ ID NO.8842 (MRT3847_217257C.2,代表为探针A1GM031412_at)、SEQ ID NO. 8844(MRT3847_236871C.2,代表为探针A1GM053788_at)、SEQID NO.8836(MRT3847_238967C.1,代表为探针A1GM035741_at)和 SEQ ID NO.8838(MRT3847_241832C.1,代表为探针 A1GM069937_at)。

这些数据证实在包括玉米和大豆在内的作物中的新的氮-应答表 达图式，用于成熟miR399(和miR399前体)以及内源miR399诱骗 序列。miR399的各种用途包括过量表达成熟miR399(例如通过过量 表达pri-miR399序列)，表达设计用于抑制并非天然成熟miR399所 天然靶向基因的基因的工程miR399，表达处于miR399启动子控制 之下的转基因(编码序列或非编码序列或这两者)，表达添加或除去 miR399识别位点的转基因，过量表达miR399诱骗序列，以及抑制 内源miR399诱骗序列。

表11提供针对miR319,UUGGACUGAAAGGAGCUCCU(SEQ ID NO.8845)的大豆(Glycinemax)和玉米(Zea mays)内源miRNA诱骗 序列，所述miR319已在大量植物物种(包括拟南芥、水稻、玉米和 大豆)中鉴定出来(参见公众可得的miRBase中的实例，microrna.sanger.ac.uk/cgi-bin/sequences/query.pl？terms＝miR319)； miRNA诱骗序列中的错配在miRNA与miRNA诱骗序列的比对中用 下划线表示。图22A描述了在不同大豆组织中大豆内源miR319诱 骗SEQ ID NO.8847(MRT3847_41831C.6,代表为探针 A1GM001017_at)的转录概况分析数据；图22B描述了不同玉米组织 中玉米内源miR319诱骗SEQ IDNO.8849(MRT4577_577703C.1, 代表为探针A1ZM012886_s_at)的转录概况分析数据。

表11

由miR319调节的靶基因是参与叶发育的TCP基因和参与花发 育的MYB基因。本发明的一个实施方案是通过抑制内源成熟miR319 在转基因植物中的转录来改变植物的叶或花结构或发育模式，或通 过miR319诱骗序列在转基因植物中的过量表达而改变内源miR319 活性。

在再一个实施例中，miR398b(SEQ ID NO.8850)已经显示出调 节CSD1和CSD2(铜/锌过氧化物歧化酶)的表达；参见Sunkar等 (2006)Plant Cell,18:2051-2065。过氧化物歧化酶有助于通过将O

按照以上所公开的内容所述，可制备和使用本文所公开和要求 保护的所有材料与方法，而无需过多的实验。尽管根据优选的实施 方案和说明性的实施例已经描述了本发明的材料与方法，但对本领 域技术人员显而易见的是，在不偏离本发明的构思、精神和范围的 条件下，可以对本文所述的材料与方法进行修改。本领域技术人员 显而易见的所有这些类似替换和修改都视为落入所附权利要求书所 定义的本发明的精神、范围和构思之内。