一种物理法细胞破碎的微结构装置及其细胞破碎和加工方法

摘要

本发明物理法细胞破碎的微结构装置的结构为：氮气输入管道、细胞悬浮液输入管道、破碎腔室以及破碎板。采用有机聚合物模塑法加工出破碎腔室及其相连的流道，然后用热键合实现破碎腔室的封接，其他部分可用焊接的方法实现连接。细胞破碎系统利用物理碰撞的方法使细胞发生破裂，提取细胞中目标成分进行下一步实验。细胞悬浮液以喷雾状通过管道出口，喷雾颗粒的粒径大约为5微米。高速载气氮气流速为200‑300m/s，将喷雾状微粒子送入破碎腔室，高速撞击破碎板，得以破碎。然后在破碎腔室中收集细胞残留物并从出口输出进行后续微流控实验。

说明书

技术领域

本发明涉及一种物理法细胞破碎的微结构装置及其细胞破碎和加工方法，属于细胞破碎领域。

背景技术

微流控芯片(microfluidic chip)是当前微全分析系统(Miniaturized TotalAnalysis Systems)发展的热点领域。它的目标是把整个化验室的功能，包括采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等多个环节集成在微芯片上，且可以多次使用，但是以细胞(细菌)为操作对象的微流控芯片的一直以来没有系统可行的细胞破碎方案。常见的细胞破碎技术可分为机械法和非机械法，机械法包括：

高压匀浆破碎法(homogenization)、振荡珠击破碎法(Skaking Bead)、高速搅拌珠研磨破碎法(fine grinding)、超声波破碎法(ultrasonication)；非机械法包括：渗透压冲击破碎法(osmotic shock)、冻融破碎法(freezing and thawing)、酶溶破碎法(enzymelysis)、化学破碎法(chemical treatment)、去垢剂破碎法(detergents)。

目前细胞破碎方法应用于微流控芯片普遍存在几个问题：

1、破碎系统本身体积过大，没法与微流控系统进行结合。

2、引入化学杂质，污染细胞破碎物，影响实验的后续操作。

3、细胞的破碎程度无法调节，可能会造成细胞的过度破碎或者破碎不够。

4、破碎结构复杂，结构加工困难。

发明内容

技术问题：为了克服上述现有细胞破碎技术的不足，本发明提供了一种基于微流控芯片的新型细胞破碎结构，它能有效地破碎完整的细胞或者细菌，保证细胞内细胞器的完整性，为微流控芯片上后续实验的进行奠定了基础。

技术方案：为了实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

一种物理法细胞破碎的微结构装置，包括：

破碎腔室，用于收集细胞残留物，破碎腔室的顶部设有可盖合或打开的盖体；

细胞悬浮液输入管道，一端与所述破碎腔室的一侧腔壁连通连接，另一端与细胞悬浮液输送设备连接；

破碎板，设置在破碎腔室内位于细胞悬浮液输入管道出口处，破碎板上朝向细胞悬浮液输入管道出口端的一面上设有刺破结构；

高速载气输入管道，一端与所述细胞悬浮液输入管道连通连接，另一端与高压输气设备连接，用于将细胞悬浮液输入管道中的细胞悬浮液呈喷雾状的并且流速不低于200m/s的初速度撞向所述破碎板；压输气设备上设有用于调节高速载气流速的调节阀；

冲洗液输入口，开设于破碎腔室腔壁上位于破碎板上刺破结构的侧部，通过管道与冲洗液输送设备连接，用于对破碎腔室的内壁面、以及破碎板进行冲洗；

气体输出口，设置于盖体上，用于释放破碎腔室内的高压气；

目标液输出口，与提取模块连接，用于收集目标提取液。

所述细胞悬浮液输入管道包括两根直径不一样的细胞悬浮液输入管单元，分别是直径较细的第一细胞悬浮液输入管单元和直径较粗的第二细胞悬浮液输入管单元，其中，第一细胞悬浮液输入管单元的一端和破碎腔室的一侧腔壁直接连通设置，并且，第一细胞悬浮液输入管单元的轴线和所述破碎板上设有刺破结构的一侧侧壁相垂直；第二细胞悬浮液输入管单元和所述第一细胞悬浮液输入管单元之间呈一定角度的相交设置，并且在第一细胞悬浮液输入管单元和第二细胞悬浮液输入管单元的交汇处具有一交汇槽；

所述高速载气输入管道包括两根直径不一样的高速载气输入管道，分别是直径较细的第一高速载气输入管单元和直径较粗的第二高速载气输入管单元，其中，第一高速载气输入管单元的一端和所述交汇槽连接，并且，第一高速载气输入管单元和第一细胞悬浮液输入管单元共轴设置，第一高速载气输入管单元的另一端和第二高速载气输入管单元连接。

所述第一细胞悬浮液输入管单元的管径为5微米，第二细胞悬浮液输入管单元的管径为15微米。

所述第一高速载气输入管单元的管径为3微米，第二载气输入管单元的管径为10微米。

所述破碎板上刺破结构为尖锥阵列结构，每个尖锥之间的距离均为300nm。

一种基于所述物理法细胞破碎的微结构装置的细胞破碎方法，包括以下几个步骤：

S1、打开高压输气设备，高压输气设备通过高速载气输入管道向细胞悬浮液输入管道内输送高压载气，通过调节阀调节高压输气设备的气体流速至达到要求；

S2、打开细胞悬浮液输送设备，细胞悬浮液在高压载气的载送下呈喷雾状的送入破碎腔室，高速撞击破碎板，细胞或细菌得以破碎；

S3、细胞破碎结束后，提取模块通过目标液输出口收集目标提取液；

S4、目标提取液收集完毕后，通过洗液输送设备向破碎腔室内输送清洗液，以将破碎腔室的内壁面、以及破碎板进行冲洗。

所述高速载气为氮气。

所述高速载气的流速为200-300m/s。

所述物理法细胞破碎的微结构装置应用于微流控芯片的集成制造中。

一种如所述物理法细胞破碎的微结构装置的加工方法，采用有机聚合物模塑法加工出破碎腔室以及与其相连的流道，然后使用热键合实现破碎腔室的封接，在弹性印章上的凹槽内填满高分子预聚物，将其扣在基片上，固化后，移去模子，在基片上印有高分子材料构成的图形，将加工好的基片和相同材质的盖片洗净烘干对齐紧贴后平放在高温炉中，在基片和盖片上、下方各放一块抛光过的石墨板，在上面的石墨板上再压一块重0.5Kg的不锈钢块，在高温炉中加热键合，键合温度为1000℃以上。

本发明一种物理法细胞破碎的微结构装置及其细胞破碎方法的有益效果是：

本发明采用物理方法对细胞(细菌)进行破碎，该方法破碎的细胞具有以下特点：

第一.细胞破碎仅发生在与破碎板撞击的一瞬，细胞破碎较均匀，可避免细胞反复受力发生过度破碎现象；

第二.细胞破碎程度可通过无极调节载气压力(流速)控制，避免胞内结构的破坏，适用于细胞器的回收利用。

第三.本发明物理法细胞破碎的微结构装置结构简洁，设计加工方便，能够快速有效地实现对细胞的破碎，保证了微流控芯片上后续实验的进行，对促进高度集成化的微流控系统有很深远的意义。

附图说明

图1是本发明物理法细胞破碎的微结构装置未盖盖体的立体示意图；

图2是本发明物理法细胞破碎的微结构装置盖有盖体的立体示意图；

图3是细胞破碎板的结构示意图；

图4是本发明物理法细胞破碎的微结构装置的横截面示意图；

图5为本发明物理法细胞破碎的微结构装置加工步骤流程图；

在图中有：1、破碎板；2、细胞悬浮液输入管道；3、高速载气输入管道；4、破碎腔室；5、氮气与细胞液交汇口；6、细胞悬浮液输出口；7、冲洗液输入口；8、目标液输出口；9、废气排出口；10、气体输出口。

具体实施方式

下面结合说明书附图以及具体实施例对本发明物理法细胞破碎的微结构装置及其破碎方法的技术方案作进一步详细说明。

如图1～3所示，一种物理法细胞破碎的微结构装置，包括：

破碎腔室4，用于细胞破碎发生室，收集细胞残留物；

细胞悬浮液输入管道2，一端与所述破碎腔室的一侧腔壁连通连接，另一端与细胞悬浮液输送设备连接；

破碎板1，设置在破碎腔室4内位于细胞悬浮液输入管道出口处，破碎板1上朝向细胞悬浮液输入管道出口端的一面上设有刺破结构；

高速载气输入管道3，一端与所述细胞悬浮液输入管道2连通连接，另一端与高压输气设备连接，用于将细胞悬浮液输入管道中的细胞悬浮液呈喷雾状的并且流速不低于200m/s的初速度撞向所述破碎板。为实现喷雾状效果，细胞悬浮液输出口6采用小孔阵列结构，孔的直径大小约为5微米；压输气设备上设有用于调节高速载气流速的调节阀；

冲洗液输入口7，开设于破碎腔室腔壁上位于破碎板上刺破结构的侧部，通过管道与冲洗液输送设备连接，用于对破碎腔室的内壁面、以及破碎板进行冲洗；

气体输出口，用于释放破碎腔室内的高压气；

目标液输出口8，与提取模块连接，用于收集目标提取液。

进一步的，所述细胞悬浮液输入管道包括两根直径不一样的细胞悬浮液输入管单元，分别是直径较细的第一细胞悬浮液输入管单元和直径较粗的第二细胞悬浮液输入管单元，其中，第一细胞悬浮液输入管单元的一端和破碎腔室的一侧腔壁直接连通设置，并且，第一细胞悬浮液输入管单元的轴线和所述破碎板上设有刺破结构的一侧侧壁相垂直；第二细胞悬浮液输入管单元和所述第一细胞悬浮液输入管单元之间呈一定角度的相交设置，并且在第一细胞悬浮液输入管单元和第二细胞悬浮液输入管单元的交汇处具有一交汇槽；

所述高速载气输入管道包括两根直径不一样的高速载气输入管道，分别是直径较细的第一高速载气输入管单元和直径较粗的第二高速载气输入管单元，其中，第一高速载气输入管单元的一端和所述交汇槽连接，并且，第一高速载气输入管单元和第一细胞悬浮液输入管单元共轴设置，第一高速载气输入管单元的另一端和第二高速载气输入管单元连接。

实施例1

本发明所述第一细胞悬浮液输入管单元的管径为5微米，第二细胞悬浮液输入管单元的管径为100微米。目的是为了将细胞悬浮液打散成粒径为5微米的颗粒并撞向破碎板。所述第一高速载气输入管单元的管径为50微米，第二载气输入管单元的管径为100微米，目的是提高氮气的输出流速。因为该结构体积小，可将此结构加工集成到微流控芯片中。

实施例2

本发明所述第一细胞悬浮液输入管单元的管径为5微米，第二细胞悬浮液输入管单元的管径为100微米。目的是为了将细胞悬浮液打散成粒径为5微米的颗粒并撞向破碎板。所述第一高速载气输入管单元的管径为50微米，第二载气输入管单元的管径为100微米，目的是提高氮气的输出流速。在破碎腔室的输出端加入过滤装置，过滤出细胞残留物中的DNA或者RNA，然后将输出液流入PCR仪中进行复制，该实施案例可简化实验步骤，节约实验操作时间。

作为本发明技术方案的进一步优选方案，所述破碎板上刺破结构为尖锥阵列结构，每个尖锥之间的距离均为300nm-10μm。保证理论上撞向破碎板的每一个细胞(细菌)均可以被破碎。

本发明还进一步公开了一种基于所述物理法细胞破碎的微结构装置的细胞破碎方法，包括以下几个步骤：

S1、打开破碎腔室的气体输出口，然后打开高压输气设备，高压输气设备通过高速载气输入管道向细胞悬浮液输入管道内输送高压载气，通过调节阀调节高压输气设备的气体流速至达到要求；

S2、打开细胞悬浮液输送设备，细胞悬浮液在高压载气的载送下呈喷雾状的送入破碎腔室，高速撞击破碎板，细胞或细菌得以破碎；

S3、细胞破碎结束后，提取模块通过目标液输出口收集目标提取液；

S4、目标提取液收集完毕后，通过洗液输送设备向破碎腔室内输送清洗液，以将破碎腔室的内壁面、以及破碎板进行冲洗。

进一步的，所述高速载气为氮气。

进一步的，所述高速载气的流速为200-300m/s。

进一步的，所述物理法细胞破碎的微结构装置应用于微流控芯片的集成制造中。

如图4所示，本发明采用有机聚合物模塑法加工出破碎腔室以及与其相连的流道，然后使用热键合实现破碎腔室的封接。破碎系统采用的材料是单晶硅。具体加工工艺如下：在弹性印章上的凹槽内填满高分子预聚物，将其扣在基片上，固化后，移去模子，在基片上就印上了高分子材料构成的图形将加工好的基片和相同材质的盖片洗净烘干对齐紧贴后平放在高温炉中，在基片和盖片上下方各放一块抛光过的石墨板，在上面的石墨板上再压一块重0.5Kg的不锈钢块，在高温炉中加热键合。键合温度为1000℃以上。

细菌破碎系统利用物理碰撞的方法使细胞(细菌)发生破裂，提取细胞(细菌)中目标成分进行下一步实验。细胞悬浮液以喷雾状通过管道出口，喷雾颗粒的粒径大约为5微米。高速载气——氮气流速为200-300m/s，将喷雾状微粒子送入破碎腔室，高速撞击破碎板，得以破碎。然后在破碎腔室中收集细胞残留物并从出口输出进行后续微流控实验。

本发明制备的流体流道直径为微米级别，精度要求不高故可采用模塑法进行加工，破碎板的尖锥间距离为300纳米，可根据细胞大小进行调节设计。与现行的细胞破碎方法相比，本方法结构简洁，破碎均匀彻底，方便加工以及对细胞中相关成分进行后续实验，将应用于微流控芯片的集成制造中，实现自动化、一体化。